CN102199632A - 一种转化dl-乳酸制备丙酮酸的方法 - Google Patents

一种转化dl-乳酸制备丙酮酸的方法 Download PDF

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本发明属于丙酮酸的制备方法的技术领域，涉及一种采用来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸，既提高了产物转化率又保持了产物稳定性。

Description

一种转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法
技术领域
本发明属于丙酮酸的制备方法的技术领域，涉及一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。
背景技术
丙酮酸（Pyruvate）是一种重要的医药、化工产品，它不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且可作为多种有用化合物的前体。传统的化学合成丙酮酸的方法是以酒石酸为原料，通过和硫酸氢钾高温下反应得到丙酮酸，这个反应过程中还需要引入氰化钠和乙酰卤化物合成乙酰氰化物，并进一步水解乙酰氰化物，这种工艺原料成本较高，产率也较低。
发酵法制取丙酮酸转化率也往往较低，这是因为丙酮酸在糖代谢中处于最活跃的中心节点，在细胞中很容易转化为其他化合物,因此很难累积，而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的，从复杂的发酵液中分离提取丙酮酸，一般是难以进行的，费用也较昂贵。
酶法生产丙酮酸是近期研究多采用的技术，乳酸脱氢酶能使乳酸（Lactate）一步生成丙酮酸，该酶催化反应如下：
Lactate + NAD+ ←→Pyruvate + NADH + H+
该反应是可逆反应，反应平衡倾向于乳酸一边；辅酶NAD+为小分子化合物，很难固定，不易再生，而且价格昂贵，这些因素限制了乳酸脱氢酶的应用。
乳酸氧化酶作为一种黄素蛋白，是以FMN或FAD作为辅因子，其电子转移的形式不同于经典的电子传递链，而是直接以氧作底物, FMN或FAD和酶蛋白结合非常牢固,整个反应过程不需要游离的外源辅酶参与,这就解决了辅酶再生的问题。细菌细胞内乳酸氧化酶催化的生化反应式为：
CH3CH2OHCOOH（乳酸） + O2
Figure 201110092393X100002DEST_PATH_IMAGE001
CH3COCOOH（丙酮酸） + H2O2
该反应生成的过氧化氢继续与丙酮酸进行无酶催化反应生成乙酸和二氧化碳。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。
本发明采用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸。
本发明的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细步骤为：
(1)菌种选择：选用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌(Psendomonasfluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；
(2)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2.0％的琼脂糖并加有1.0-2.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35℃培养20-30小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25-35℃ 条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以3-5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以3-5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.1-0.5% 葡萄糖、1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，培养6-8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0.2-0.3 mL/min，培养10-15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）方法检测丙酮酸生成量；
(6)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000-8000??g离心10-15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；
(7)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5-10分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30-60 分钟（30,000-35,000??g），取上清即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；
(8)转化实验：将步骤(7)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的终浓度达到5.54-1,080mM，加入终浓度为0-1.0 mM的乙二胺四乙酸钠（EDTA），粗酶液蛋白浓度达到70-300 mg/L，37-42℃，pH7.2条件下，150-200转/分钟振荡5-160小时；每间隔10分钟-15小时取样检测底物消耗量和产物生成量；
(9)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50-60%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000-8000??g离心10分钟，得到上清液即为样品；
(10)样品检测：待步骤(9)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。
液体基本培养基(LLM)配方组成为（为重量百分比）：磷酸氢二钾 0.05%，氯化钠 0.05%，硫酸镁 0.05%，硫酸亚铁 0.001%，酵母膏0.1%，余量为水。
乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）共同催化转化DL-乳酸制备丙酮酸的反应式如下：
Figure 771908DEST_PATH_IMAGE002
本发明具有以下特点：
(1) 荧光假单胞菌菌株酶液中的乳酸氧化酶对乳酸具有较强的专一性，不仅能催化L型乳酸，而且能作用于D型乳酸；
(2) 酶催化的最适反应温度为39-40℃；
(3) 在35℃放置30 min酶活力基本不受影响；
(4) 50℃时，酶活的半衰期也超过30 min；
(5) 酶催化的最适pH为pH7.2；
(6) 在pH从6.0到8.5之间，酶的稳定性良好；
(7) Michaelis 常数Km 和最大酶反应速度rmax 分别为9.53 mM 和 2.46 mM·min·mg 酶蛋白，但当底物浓度超过16.6 mM 时，出现了酶反应速度的底物抑制。
本发明的有益效果为：本发明的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，从乳酸氧化酶和过氧化氢酶着手，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力的微生物菌株—荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)，培养获得大量菌体后，分离提取其胞内酶，形成高效的生物催化剂，以乳酸为底物，进行生物转化，获得产物丙酮酸，并且过氧化氢酶却能防止过氧化氢继续与丙酮酸进行无酶催化反应的发生，从而既提高了产物转化率又保持了产物稳定性。
具体如下：
(1)菌株粗酶液的乳酸氧化酶对底物DL-乳酸的转化能力较强，70 mg/L粗酶液酶蛋白3 h能转化92%的5.54 mM的DL-乳酸。粗酶液不仅能催化L型乳酸，而且能作用于D型乳酸，这在丙酮酸的酶法转化应用上是非常有价值的。
(2)低浓度的乙二胺四乙酸钠（EDTA）可以络合该荧光假单胞菌粗酶液中的对丙酮酸转化不利的其它丙酮酸代谢酶催化所必需的金属离子，从而抑制这些酶的活性，增加产物稳定性，提高酶转化效率。
(3)酶液本身具有的过氧化氢酶较高，足够以分解乳酸氧化酶催化生成的过氧化氢，避免了过氧化氢对产物丙酮酸的影响，从而增加了生成丙酮酸的稳定性。
附图说明
图1图示了荧光假单胞菌酶液酶蛋白（70 mg/L）对初浓度为5.54 mM的DL-乳酸的转化过程，为底物DL-乳酸和产物丙酮酸的变化曲线；
图2图示了荧光假单胞菌酶液酶蛋白（70 mg/L）对初浓度为5.54 mM的DL-乳酸的转化过程，为转化率曲线（产物丙酮酸浓度对初始底物DL-乳酸浓度的比率）；
图3图示了荧光假单胞菌酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为116 mM的DL-乳酸的转化过程，为底物DL-乳酸和产物丙酮酸的变化曲线；
图4图示了荧光假单胞菌酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为116 mM的DL-乳酸的转化过程，为转化率曲线（产物丙酮酸浓度对初始底物DL-乳酸浓度的比率）；
图5图示了荧光假单胞菌酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为1,080 mM的DL-乳酸的转化过程，为底物DL-乳酸和产物丙酮酸的变化曲线；
图6图示了荧光假单胞菌粗酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为1,080 mM的DL-乳酸的转化过程，为转化率曲线（产物丙酮酸浓度对初始底物DL-乳酸浓度的比率）；
图7图示了不加EDTA与加入EDTA对荧光假单胞菌酶液转化DL-乳酸生成的丙酮酸的影响结果；不加EDTA荧光假单胞菌酶液转化DL-乳酸生成的丙酮酸浓度迅速降低（图中的实线，（a）代表丙酮酸浓度，（c）代表DL-乳酸浓度），而加入1 mmol/L的EDTA后，转化DL-乳酸生成的丙酮酸在较长时间内却无太大变化（图中的虚线，（b）代表丙酮酸浓度，（d）代表DL-乳酸浓度）。该结果表明低浓度的EDTA能增加酶催化反应过程中，酶转化乳酸生成的丙酮酸的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
实施例1：荧光假单胞菌粗酶液酶蛋白（70 mg/L）对初浓度为5.54 mM的DL-乳酸的转化。
(1)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株（ATCC948）接种于含有2.0％的琼脂糖并加有1.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养22小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，30℃ 条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得一级种子；
(3)扩大培养：以5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得二级种子；
(4)发酵罐培养：以5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.2% 葡萄糖、1.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，培养7小时补料，补料液为20%的乳酸钠溶液，补料速度为0.24 mL/min，培养12.5小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）检测丙酮酸生成量；
(5)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000转/分离心10分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；
(6)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30 分钟（30,000转/分），取上清液即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；
(7)转化实验：将步骤(6)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL -乳酸钠混合，使混合物中DL -乳酸钠的终浓度达到5.54mM，粗酶液蛋白浓度达到70 mg/L，39℃，pH7.2条件下，200转/分钟振荡5小时；每间隔10～30分钟取样检测底物消耗量和产物生成量；
(8)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000转/分离心10分钟，得到上清液即为样品；
(9)样品检测：待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。
70 mg/L粗酶液酶蛋白3 h能转化92%的5.54 mM的DL-乳酸生成5.10 mM丙酮酸。
实施例2：荧光假单胞菌粗酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为116 mM的DL-乳酸的转化。
(1)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有2.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养29小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有2.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，30℃ 条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得一级种子；
(3)扩大培养：以3％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有2.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养20小时，制得二级种子；
(4)发酵罐培养：以5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.5% 葡萄糖、2.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，培养7小时补料，补料液为25%的乳酸钠溶液，补料速度为0.2 mL/min，培养15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）检测丙酮酸生成量；
(5)收集菌体：取步骤(4)的发酵液8000转/分离心15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；
(6)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心60 分钟（30,000转/分），取上清液即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；
(7)转化实验：将步骤(6)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL -乳酸钠混合，使混合物中 DL -乳酸钠的终浓度达到116mM，粗酶液蛋白浓度达到300 mg/L，加入终浓度为1.0 mM的乙二胺四乙酸钠（EDTA），39℃，pH7.2条件下，200转/分钟振荡75小时；每间隔5～20小时取样检测底物消耗量和产物生成量。
(8)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000转/分离心10分钟，得到上清液即为样品；
(9)样品检测：待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。300 mg/L的粗酶液18 h内能将66%的116 mM DL-乳酸转化为丙酮酸。
实施例3：荧光假单胞菌粗酶液酶蛋白（300 mg/L）对初浓度为1,080 mM的DL-乳酸的转化。
(1)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有2.0％的琼脂糖并加有1.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，30℃ 条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得一级种子；
(3)扩大培养：以5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得二级种子；
(4)发酵罐培养：以5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.2% 葡萄糖、1.0％DL -乳酸钠的LLM中，30℃条件下，培养7小时补料，补料液为20%的乳酸钠溶液，补料速度为0.3 mL/min，培养12.5小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）检测丙酮酸生成量；
(5)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000转/分离心10分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；
(6)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30 分钟（30,000转/分），取上清液即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；
(7)转化实验：将步骤(6)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL -乳酸钠混合，使混合物中 DL -乳酸钠的终浓度达到1,080mM，粗酶液蛋白浓度达到300 mg/L，加入终浓度为0.5 mM的乙二胺四乙酸钠（EDTA），39℃，pH7.2条件下，200转/分钟振荡160小时；每间隔15～24小时取样检测底物消耗量和产物生成量。
(8)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000转/分离心10分钟，得到上清液即为样品；
(9)样品检测：待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。300 mg/L的粗酶液114 h内能将41%的1,080 mM DL-乳酸转化为丙酮酸。

Claims (3)

1.一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，ATCC948)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸。
2.如权利要求1所述的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细操作步骤为：
(1)菌种选择：选用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；
 (2)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2.0％的琼脂糖并加有1.0-2.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35℃培养20-30小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25-35℃ 条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以3-5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子； 
(5)发酵罐培养：以3-5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.1-0.5% 葡萄糖、1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，培养6-8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0.2-0.3 mL/min，培养10-15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）方法检测丙酮酸生成量；
(6)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000-8000转/分离心10-15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；
(7)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5-10分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30-60 分钟（30,000-35,000转/分），取上清液即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；
(8)转化实验：将步骤(7)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的终浓度达到5.54-1,080mM，加入终浓度为0-1.0 mM的乙二胺四乙酸钠（EDTA），粗酶液蛋白浓度达到70-300 mg/L，37-42℃，pH7.2条件下，150-200转/分钟振荡5-160小时；每间隔10分钟-15小时取样检测底物消耗量和产物生成量；
(9)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50-60%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000-8000转/分离心10分钟，得到上清液即为样品；
(10)样品检测：待步骤(9)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。
3.如权利要求1所述的转化DL -乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：液体基本培养基(LLM)组成为按重量计的下述组分：磷酸氢二钾 0.05%，氯化钠 0.05%，硫酸镁 0.05%，硫酸亚铁 0.001%，酵母膏0.1%，余量为水。
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