CN102199200A

CN102199200A - 一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法

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Publication number: CN102199200A
Application number: CN2010101306020A
Authority: CN
Inventors: 严宇媛; 赵波; 赵文杰; 那可; 魏晓东; 顾敏
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: CN102199200B

Abstract

一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法，包括：预处理发酵技术培养物及固液分离得到滤液或乳酸链球菌素产品预处理液；向滤液或产品预处理液中加入其体积的40～80％体积的萃取剂，充分混匀后，用碱调节pH至6.0～8.0，静置分层取萃取相；用与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液洗涤萃取相三次，随后加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0，静置分层，取水相；取水相作为料液，重复以上萃取循环至少一次；再将萃取后的乳酸链球菌素水溶液浓缩，浓缩液喷雾干燥得到乳酸链球菌素，其纯度为70％以上。该方法简便、耗时短，有机溶剂可重复利用，适合大规模的工业化生产过程。

Description

一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物产物的分离纯化方法，特别是涉及乳酸链球菌素的分离纯化方法，特别是一种用有机溶剂萃取的方法从乳酸链球菌素的发酵技术培养物以及乳酸链球菌素产品中分离纯化乳酸链球菌素的方法。

背景技术

乳酸链球菌素是由一些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)在代谢过程中合成和分泌的具有很强抑菌作用的多肽，分子量约为3510Da。由于它对许多革兰氏阳性菌，尤其对引起食品腐败的芽孢杆菌、梭菌、葡萄球菌、李斯特氏菌等有强烈抑制作用，加之其可被消化道中酶降解，是一种对人体无毒的天然食品防腐剂，已被广泛应用于乳制品、罐装食品、肉制品和饮料的防腐保鲜剂。

乳酸链球菌素的产品是由可生产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌经发酵生产所获得的发酵液，再经分离、提取、纯化、干燥而得。在大规模生产过程中其分离、提取、纯化制备一直是一个棘手的问题，乳酸链球菌素纯品的效价为40000IU/mg，市场上的产品为乳酸链球菌素与氯化钠的复配品，效价≥900IU/mg，纯度为2.5％左右。目前乳酸链球菌素制备工艺主要为吸附分离法和膜分离法。

中国专利00129928.X公布了一种从乳酸乳球菌的发酵液中分离提取乳链菌肽(即乳酸链球菌素)的方法，具体地公布了采用释放乳链菌肽、吸附、解吸附及干燥的方法，从乳酸乳球菌的发酵液中提取乳链菌肽。该方法生产工艺复杂，耗时长，成本较高，得到的乳酸链球菌素纯度较低。

中国专利200510066481公布了一种从乳酸乳球菌的发酵液中分离乳酸链球菌素的方法。该方法包括释放乳酸链球菌素，分离和喷雾干燥，在温度10～55℃和压力0.5～2.5MPa条件下，采用孔径10-60万的管式膜过滤从发酵液中去除菌体和分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质；用孔径为0.2-4万的卷式膜超滤从发酵液中去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到发酵液浓缩物。由于发酵技术培养物成分复杂，采用膜分离的方法，在操作过程中膜面易发生污染，使膜性能降低，还要配以工艺相应的膜面清洗方法，而且单采用膜分离技术效果有限，得到的产品纯度较低。

文献《 Development of Purification Method Identification of a PeptideAntibiotic Produced by Lactococcus la

发明内容

本发明的目的在于提供一种用有机溶剂从乳酸链球菌素发酵技术培养物以及乳酸链球菌素产品中分离纯化乳酸链球菌素的方法。该方法操作简便、耗时短、制备的乳酸链球菌素纯度较高，克服了现有技术的缺点。

本发明的目的是这样实现的：一种从乳酸链球菌素发酵技术培养物以及市售乳酸链球菌素产品中分离纯化乳酸链球菌素的方法，包括发酵技术培养物的预处理与固液分离或乳酸链球菌素产品的预处理、萃取和干燥过程，其中，采用有机溶剂作为萃取剂进行萃取，所用的有机溶剂为C4～C8的烷基醇，或者是烷基醇与烷基酸所形成的C4～C8的酯。

优选地，所述有机溶剂选自正丁醇、异丁醇、正戊醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯，其中，更优选正丁醇。

优选地，从乳酸链球菌素发酵技术培养物以及市售乳酸链球菌素产品中分离纯化乳酸链球菌素，可以通过如下步骤进行：

a.预处理与固液分离：

发酵技术培养物预处理：用酸调节发酵技术培养物的pH至2.0～3.0，优选用盐酸、硫酸或草酸，加热发酵技术培养物至70～100℃，维持10～60分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵技术培养物中并迅速钝化蛋白酶，确保乳酸链球菌素的稳定性，得到发酵技术培养物预处理液。

发酵技术培养物预处理液的固液分离：发酵技术培养物预处理液通过固液分离得到澄清的滤液。

乳酸链球菌素产品预处理：

用pH 2.0～3.0的盐酸溶液将乳酸链球菌素产品溶解，得到乳酸链球菌素产品预处理液。

b.萃取：

向滤液(或产品预处理液)中加入滤液(或产品预处理液)体积的40～80％(体积百分数)的萃取剂，萃取剂可以为C4～C8的烷基醇或烷基醇与烷基酸形成的C4～C8的酯，优选正丁醇，异丁醇，正戊醇，乙酸乙酯或乙酸丁酯，特别优选正丁醇；充分混匀后，用碱调节pH至6.0～8.0，优选用氢氧化钠调节pH，优选调节pH至7，静置分层，乳酸链球菌素从滤液(或产品预处理液)转移到萃取相中。取萃取相，用与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液洗涤至少三次，将萃取相中的部分杂质反萃取至萃取剂饱和水溶液中，随后加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0，优选用盐酸、硫酸或磷酸，然后静置分层，乳酸链球菌素从萃取剂中转移至水相中。取水相作为料液，重复以上萃取循环至少一次即可得到较纯的乳酸链球菌素水溶液。

c.干燥：

将萃取后的乳酸链球菌素水溶液在温度为40～70℃，-0.08至-0.1MPa的真空度下浓缩，浓缩至原体积的10～30％。浓缩液进行喷雾干燥，获得纯度70％以上粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法(参考QB2394-2007中的琼脂扩散法)测定的效价为28000IU/mg以上。

本发明的效果及优点：通过此方法制备的乳酸链球菌素纯度在70％以上，以及经琼脂扩散法测定的效价为28000IU/mg以上。萃取后的有机溶剂可以回收重复利用。本发明工艺方法安全、简便、实用，可用于大规模的工业化生产过程中。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的方法和效果进行较为详细的说明。

实施例1

a.预处理与固液分离：

发酵技术培养物预处理：取乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC1.1936(中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，经常规物理化学诱变手段和培养基优化使效价提高至6000IU/mL左右)发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液，效价为6380IU/mL，用盐酸调节pH至2.0，加热发酵技术培养物至80℃，维持30分钟，得到乳酸链球菌素预处理液。

发酵技术培养物预处理液的固液分离：预处理液通过离心去除发酵技术培养物中的菌体碎片等固型物，得到澄清的滤液，取1L滤液用于萃取。

b.萃取：

向滤液中加入460mL的正丁醇，充分混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，静置分层，乳酸链球菌素从滤液转移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇饱和的水溶液洗涤三次，将萃取相中的部分杂质反萃取至萃取剂饱和的水溶液中，随后加入460mL正丁醇饱和的水溶液，充分混匀后，用盐酸调节pH至2.0，静置分层，乳酸链球菌素从正丁醇相转移至水相中。取水相作为料液，重复以上萃取循环一次即可得到较纯的乳酸链球菌素水溶液。

c.干燥：

将萃取后的乳酸链球菌素水溶液在温度为50℃，-0.1MPa的真空度下浓缩，浓缩至50mL。浓缩液进行喷雾干燥，获得纯度78.6％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为31443IU/mg。

实施例2

a.乳酸链球菌素产品预处理：

乳酸链球菌素产品为市售的含乳酸链球菌2.5％左右的乳酸链球菌素产品，其来源：郑州奇泓生物科技有限公司生产，品名为乳酸链球菌素，效价为1094IU/mg。

称取5.0g乳酸链球菌素产品用1L pH 2.0的盐酸水溶液溶解，得到乳酸链球菌素产品预处理液，效价为5470IU/mL。

b.萃取：

向产品预处理液中加入产品预处理液体积的460mL的正丁醇，充分混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，静置分层，乳酸链球菌素从产品预处理液转移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇饱和的水溶液洗涤三次，将萃取相中的部分杂质反萃取至正丁醇饱和的水溶液中，随后加入460mL正丁醇饱和的水溶液，充分混匀后，用盐酸调节pH至2.0，静置分层，乳酸链球菌素从正丁醇相转移至水相中。取水相作为料液，重复以上萃取循环步骤一次即可得到较纯的乳酸链球菌素水溶液。

c.干燥：

将萃取后的乳酸链球菌素水溶液在温度为50℃，-0.1MPa的真空度下浓缩，浓缩至50mL。浓缩液进行喷雾干燥，获得纯度83.9％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为33561IU/mg。

实施例3

所用方法同实施例1，不同之处在于发酵技术培养物为乳酸链球菌素发酵浓缩液，浓缩液效价为5160IU/mL，获得纯度74.8％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为29923IU/mg。

a.预处理与固液分离：

发酵技术培养物预处理：取乳酸乳球菌CGMCC1.2030(从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，并经常规物理化学诱变手段使效价提高至1000IU/mL左右)发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液，效价为1030IU/mL，将发酵液浓缩至效价为5160IU/mL，用盐酸调节pH至2.0，加热发酵技术培养物至80℃，维持30分钟，得到乳酸链球菌素预处理液。

b.萃取：

向滤液中加入460mL的正丁醇，充分混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，静置分层，乳酸链球菌素从滤液转移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇饱和的水溶液洗涤三次，将萃取相中的部分杂质反萃取至正丁醇饱和的水溶液中，随后加入460mL正丁醇饱和的水溶液，充分混匀后，用盐酸调节pH至2.0，静置分层，乳酸链球菌素从正丁醇相转移至水相中。取水相作为料液，重复以上萃取循环一次即可得到较纯的乳酸链球菌素水溶液。

c.干燥：

将萃取后的乳酸链球菌素水溶液在温度为50℃，-0.1MPa的真空度下浓缩，浓缩至50mL。浓缩液进行喷雾干燥，获得纯度74.8％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为29923IU/mg。

实施例4

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于用酸调节发酵技术培养物的pH至2.0～3.0，所用酸为硫酸，向滤液中加入滤液体积40％(体积百分数)的正丁醇，获得纯度72.6％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为29043IU/mg。

实施例5

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于用酸调节发酵技术培养物的pH至2.0～3.0，所用酸为草酸，向滤液中加入滤液体积40％(体积百分数)的正丁醇，氢氧化钠溶液调节pH至8.0，获得纯度70.1％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28040IU/mg。

实施例6

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积80％(体积百分数)的正丁醇，在加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0，所用酸为硫酸，获得纯度70.3％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28120IU/mg。

实施例7

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积46％(体积百分数)的乙酸乙酯，在加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0，所用酸为磷酸，获得纯度71.2％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28483IU/mg。

实施例8

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积46％(体积百分数)的正戊醇，获得纯度70.5％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28201IU/mg。

实施例9

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积46％(体积百分数)的异丙醇，获得纯度71.6％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28640IU/mg。

实施例10

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积46％(体积百分数)的乙酸丁酯，获得纯度71.4％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为28562IU/mg。

对比例1

以乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC1.1936发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液为原料，重复中国专利00129928.X的实施例1，获得的乳酸链球菌素纯度为15.3％，即经琼脂扩散法测定的效价为6123IU/mg。

对比例2

以乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC1.1936发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液为原料，重复中国专利200510066481的实施例1，获得的乳酸链球菌素纯度为10.1％，即经琼脂扩散法测定的效价为4031IU/mg。

对比例3

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积100％(体积百分数)的正丁醇，获得纯度15.2％粉末状的乳酸链球菌素，乳酸链球菌素的效价为6081IU/mg。

对比例4

所用方法和发酵技术培养物同实施例1，不同之处在于向滤液中加入滤液体积15％(体积百分数)的乙酸乙酯，获得纯度37.5％粉末状的乳酸链球菌素，即经琼脂扩散法测定的效价为15011IU/mg。

通过以上实施例和对比例可以看出，通过本发明的方法制备的乳酸链球菌素纯度在70％以上，经琼脂扩散法测定的效价为28000IU/mg以上。该方法中，萃取后的有机溶剂可以回收重复利用。本发明工艺方法安全、简便和实用，可用于大规模的工业化生产过程中。

虽然以上通过具体实施例进行了说明，但不仅仅限于这些实施例，在不脱离本发明构思的前提下，还可以有更多变化或改进的其他实施例，而这些变化和改进都属于权利要求所要求的范围。

Claims

1.一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法，包括发酵技术培养物预处理及固液分离或乳酸链球菌素产品预处理，萃取和干燥过程，其特征在于，采用有机溶剂作为萃取剂进行萃取；所述有机溶剂为C4～C8的烷基醇，或者是烷基醇与烷基酸所形成的C4～C8的酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是正丁醇、异丁醇、正戊醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯。

3.如权利要求1或2所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述发酵技术培养物的预处理中，用酸调节发酵技术培养物的pH至2.0～3.0，加热至70～100℃，维持10～60分钟，得到发酵技术培养物预处理液；发酵技术培养物预处理液通过固液分离得到澄清的滤液。

4.如权利要求1所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述乳酸链球菌素产品预处理中，用pH 2.0～3.0的盐酸溶液将乳酸链球菌素产品溶解，得到乳酸链球菌素产品预处理液。

5.如权利要求1～4任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，在萃取过程中，向所述滤液或乳酸链球菌素产品预处理液中加入滤液或产品预处理液体积的40～80％体积的有机溶剂作为萃取剂，充分混匀后，用碱调节pH至6.0～8.0，静置分层；取萃取相，用与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液洗涤至少三次，随后加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0，静置分层，取水相；取水相作为料液，重复以上萃取循环至少一次，得到乳酸链球菌素水溶液。

6.如权利要求1～5任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，在干燥过程中，将萃取后的乳酸链球菌素水溶液浓缩，浓缩液喷雾干燥后获得纯度70％以上粉末状的乳酸链球菌素，其经琼脂扩散法测定的效价为28000IU/mg以上。

7.如权利要求书1～6任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述乳酸链球菌素发酵技术培养物为乳酸链球菌素发酵液，或乳酸链球菌素发酵液通过浓缩得到的乳酸链球菌素发酵浓缩液。

8.如权利要求书1～6任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述乳酸链球菌素产品为含乳酸链球菌素重量百分数2.5％左右的产品。

9.如权利要求书1～8任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述萃取剂是正丁醇。

10.如权利要求1～9任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述萃取剂体积为滤液或产品预处理液体积的46％。

11.如权利要求5～10任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，所述碱为氢氧化钠，调节pH为7。

12.如权利要求5～11任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，在加入与萃取相等体积的萃取剂饱和水溶液，充分混匀后，用酸调节pH至2.0～3.0中，所用酸为盐酸、硫酸或磷酸。

13.如权利要求3～12任一所述的高纯度乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于，用酸调节发酵技术培养物的pH至2.0～3.0中，所用酸为盐酸、硫酸或草酸。