CN102198313B - 食品级微生物益生菌在降解双酚a中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用，所述益生菌为瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌中的任意一种或多种。进一步的，所述益生菌优选采用短乳杆菌。本发明的优点在于：采用食品级益生菌株降解包装材料中迁移进食品中的具有雌激素效应的双酚A，其降解周期短，降解效率高，产物安全，对于食品安全方面具有显而易见的好处，并可为双酚A的降解提供一个新的途径。

Description

食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及到食品级微生物益生菌降解菌株等在降解包装材料或环境污染物中的双酚A的应用。

背景技术

双酚A是从食品包装材料中发现的一种“内分泌干扰物”(EndocrineDisrupting Chemicals，ECD)，具有某些雌激素特性。双酚A简称BPA，主要是用于制造高分子材料如聚碳酸酯(简称PC)。许多日常消费品如食品包装器、婴儿奶瓶等都可能含有双酚A。双酚A在加热过程中会析出到食物中去，会干扰人体正常的荷尔蒙分泌功能，刺激人体雌激素的分泌，抑制雄性激素分泌。如果长时间大量摄入，可能会导致心血管疾病甚至癌症，会影响儿童的发育进程，特别是发育中的胎儿、婴儿和儿童。数以百计的研究证明了与BPA相关的疾病越来越多，如心血管疾病、肠道疾病、免疫系统等，也证明了双酚A对干扰人体内分泌系统造成的重大危害。

2008年加拿大宣布在所有食品包装和容器(包括奶瓶)上禁用双酚A，成为第一个全面禁止双酚A的国家；澳大利亚也从2010年7月1日起逐渐淘汰含双酚A的婴儿奶瓶；美国的一些州县也规定儿童护理品中不得含有双酚A。据悉，欧洲食品安全局在2010年9月发布了针对双酚A的规定：每人每天对双酚A的摄入量必须小于0.05m g/kg。而对双酚A可能对婴儿造成一些其他影响的问题，当时欧洲食品安全局的专家表示需要进一步的研究。

日前，欧盟宣布，其成员国自2011年3月1日起禁止使用含双酚A的塑料生产婴儿奶瓶，并从6月1日起禁止进口此类塑料婴儿奶瓶。我国塑料奶瓶多以PC材质为主，而PC奶瓶多含双酚A。而我国尚没有专门针对婴儿奶瓶的双酚A标准，目前只有一份适用于所有P C品的现行国家标准，就是1994年颁布的《食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准》(标准号：GB14942-1994)，其中对双酚A用量规定：一升蒸馏水中所含双酚A须不大于0.05毫克。双酚A的问题目前受到了方方面面的关注。

我国卫生部目前正在清理食品包装材料，并出台征求意见稿，其中规定双酚A将不能再用于接触婴幼儿的食品。卫生部监督局2011年2月1日发布《关于公开征求拟批准食品包装材料用添加剂和树脂意见的函》，规定PC塑料中双酚A最大残留量为0.6mg/kg，备注同时要求不能用于接触婴幼儿食品。

根据2010/8/17发布的一份关于加拿大人的尿液研究报告称，平均每10人中有9个以上的人体内含有BPA(双酚A)。其中年龄为6岁的加拿大儿童，尿液中含有BPA占79％到91％。这些数据表明，加拿大儿童和青少年体内含有的BPA含量比以往任何时候都要高。调查还发现，几乎每一位加拿大民众体内都含有一定数量的BPA。美国纽约州最近通过《禁止儿童和婴幼儿产品使用双酚A法令》，禁止生产、分销和销售含有双酚A的某些儿童护理产品。《华盛顿邮报》报道说，93％的6岁以上美国人的尿液中，可以检测到双酚A成分。

双酚A的降解方法可分为物理降解、化学降解和生物降解。双酚A有一定的吸附性能，在物理降解方法中，自然界污泥和活性炭的双酚A吸附有较多的研究。有研究报道，活性炭对50mg/L的双酚A的吸附速度很快，1小时即可取得较好的处理效果。经过厌氧处理的污泥堆双酚A吸附很快，15min的吸附力可达最大吸附量的89.1％，而双酚A在厌氧污泥的吸附是可逆的，对处理后期可能会产生一定的影响。双酚A的化学降解主要为光降解。现研究多以二氧化钛为催化剂，双酚A可以得到矿化。用紫外光代替太阳光，双酚A有较高的降解率，可达到97％。对于生物方法降解双酚A的方法亦有较多报道，但目前生物降解方面的研究局限于自然界筛选的菌种和部分真菌的降解，但此类菌株对双酚A的降解一般都需经过较长的时间，且在1到3个月的时间的降解效率也仅在20％到40％左右，效率较为低下。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降解包装污染物双酚A的新途径，即应用食品级微生物益生菌来降解双酚A，其降解效率高、降解周期短、产物安全，从而克服了现有方法的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用，所述益生菌为瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌中的任意一种或多种。

进一步地，所述益生菌优选采用短乳杆菌。

所述益生菌的活化菌株在双酚A培养基中的接种量在0.1％(体积百分比，下同)以上。

针对现有降解双酚A的生物方法的不足，本案发明人经长期研究，通过对现有已知的所有食品级微生物进行筛选，并通过将其在双酚A培养基中培养，再检测其培养基中双酚A含量的变化，从而判断菌种对双酚A的降解情况。

以下以对实验室可得的三十多种食品级菌种进行筛选的过程为例进行说明：

以600ppb的BPA浓度为原始浓度和实验对照，选取前述三十多中食品级菌种进行探索，筛选出对双酚A有一定降解效果的菌种，其过程具体如下：

(1)益生菌的活化培养：

针对不同菌种选定合适条件分别配制培养基，再按0.2％的量接种，培养24小时为一代，培养两代为活化培养结束。

(2)双酚A培养基的培养

I.双酚A培养基的配制

用无菌水配制90％的乙醇溶液100ml，称取一定量的双酚A标准物，配制成双酚A溶液。配制好的双酚A溶液经过0.22um的微孔滤膜过滤备用。称取培养基配方的各化学物质，溶解，调节相应pH值，封装，121℃灭菌20min。在灭菌台把经微孔滤膜过滤的双酚A溶液按照5％的体积比加入到已灭菌的培养基中，最终配制成双酚A浓度为600ppb的双酚A培养基。前述的培养基可选用LB培养基和MRS培养基。

LB培养基：蛋白胨10.0克、酵母粉5.0克、氯化钠10.0克、蒸馏水1.0升，调节pH值到7.5。MRS培养基：葡萄糖20.0克、蛋白胨10.0克、牛肉浸取物(牛肉膏)10.0克、酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸氢二胺2.0克、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0克、无水硫酸镁0.283克、一水合硫酸锰0.189克、蒸馏水1.0升，调节pH值到6.5。

双酚A培养基的培养，按0.2％的接种量接种，37℃摇床120r/min培养4天的时间。待处理。其中纳豆枯草芽孢杆菌用LB培养基，其余菌种用MRS培养基。

II.菌种双酚A培养基的降解培养

按0.2％的接种量将活化后的菌种接种至双酚A培养基中，37℃摇床120r/min培养4天的时间。待处理。

(3)培养液的萃取浓缩

将培养4天后的双酚A培养基取出离心，离心条件为4℃、8000rpm、10min，转移上清液，备用。

培养基上清液采用固相萃取的方式进行HPLC进样前处理。选取C 18小柱进行固相萃取，首先分别用6ml甲醇和6ml去离子水对萃取柱进行活化。取20ml培养基上清液以5ml/min的流速通过萃取柱。接着用6ml 20％的甲醇淋洗萃取柱，洗去可能存在的杂质。淋洗完毕，真空抽干萃取柱水分。最后，用2*3ml的甲醇以5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用甲醇定容为2ml，并以HPLC检测其中双酚A的残留量，该HPLC检测条件可在本领域技术人员熟知的各种条件中选取。经过重复实验，可以筛选得到6种菌种对双酚A有不同程度的降解性能，分别是瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌，具体可参阅下表1：

表1食品级微生物益生菌及其对双酚A的降解效率

事实上，本案发明人还发现，若采用前述的菌种双酚A培养基的降解培养条件，其降解平衡点一般在24h左右，而在此24h降解过程中，瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种和干酪乳杆菌培养基的pH值持续下降，最终达到4.7左右，而纳豆枯草芽孢杆菌在降解24h过程中，pH值略有上升，最终达到8.2左右。这可进一步说明，采用本发明的技术方案，可有效实现双酚A的高效、安全的生物降解。

总之，与现有技术相比，本发明的优点在于：采用食品级益生菌株降解包装材料中迁移进食品中的具有雌激素效应的双酚A，这为双酚A的降解方面提供了一个新的途径，对于食品安全方面具有显而易见的好处，且其降解周期短，降解效率高，产物安全。

具体实施方式

以下结合一较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

(1)选取短乳杆菌作为实验菌种，并按本领域技术人员习知的方式选取合适的短乳杆菌培养基和培养条件，而后按0.2％的量接种，培养24小时为一代，培养两代为活化培养结束。

(2)用无菌水配制90％(体积比)的乙醇溶解，并加入双酚A标准品，配制成浓度为12ppm的双酚A乙醇溶液，再取适量的双酚A溶液混合于市售酸奶中(伊利牌风味酸乳，生产日期2010年11月05日，生产批号20101105/040103:12:57c)，配制成含双酚A 600ppb的酸奶作为菌种降解基质。

(3)将前述活化好的菌种按0.2％的接种量于接种前述菌种降解基质中，37℃摇床120r/min培养4天，取适量样品过0.22um的微孔滤膜，滤去酸奶中的菌体，再选取C18小柱进行固相萃取，首先分别用6ml甲醇和6ml去离子水对萃取柱进行活化。取20ml过滤过的酸奶样品以5ml/min的流速通过萃取柱。接着用6ml 20％的甲醇淋洗萃取柱，洗去可能存在的杂质。淋洗完毕，真空抽干萃取柱水分。最后，用2*3ml的甲醇以5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用甲醇定容为2ml，再以HPLC检测(检测条件为：色谱仪：WATERS ACQUITY UPLC；检测器：WATERS ACQUITY PDA；分析柱：BEH C182.1X100mm 1.7um；流动相：70％0.1％甲酸30％甲醇----7min---100％甲醇；柱温：45℃；检测波长：280nm；流速：0.3ml/min；进样量：1μL)。

检测结果表明，菌种在酸奶中对双酚A的降解是明显的，4天的时间降解率达到35％。由此，可以说明该菌种在实际应用中有较高的可行性。

另，本案发明人还在未添加短乳杆菌的情况下，仅以前述含双酚A 600ppb的酸奶在同等试验条件下进行了培养，检测结果表明，该样品中双酚A含量几乎未发生变化。

同样的，通过在类似条件下的实验发现，瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌对双酚A亦具有较高降解效率。

以上列举了本专利菌种的一个应用实例，但本专利菌种并非仅限于专利中所举事例，菌种对于其他食品中降解包装材料及环境污染物的双酚A的应用在包括在本发明专利中。

Claims (3)

1.食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用，所述益生菌为瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种和干酪乳杆菌中的任意一种或多种。

2.根据权利要求1所述的食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用，其特征在于，所述益生菌优选采用短乳杆菌。

3.根据权利要求1所述的食品级微生物益生菌在降解双酚A中的应用，其特征在于，所述益生菌的活化菌株在双酚A培养基中的接种量在0.1％V/V以上。