CN102191244B - 一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子,所述的siRNA分子靶点分别为GTTTGAGGCAGCTCCTTAA(66-84bp),GAGGCAGCTCCTTAAATGA(70-88bp),GCAGCTCCTTAAATGAACA(73-91bp)。所述的siRNA分子靶点位于PRDM1β mRNA的5’非翻译区(5’UTR)。所述的siRNA分子能够有效下调淋巴瘤细胞中PRDM1 β的表达。通过该siRNA分子下调PRDM1 β后,淋巴瘤细胞对化疗药物阿霉素的敏感性增加。该siRNA分子可以逆转淋巴瘤耐药,提高淋巴瘤的治疗效果,并可应用于淋巴瘤的靶向治疗。
Description
【技术领域】
本发明涉及一组siRNA分子,具体地说,是关于一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子及其应用。
【背景技术】
淋巴瘤是原发于淋巴结或结外淋巴组织的恶性肿瘤。在我国,淋巴瘤发病率约为3-4/10万,每年新发患者约4.5万人,死亡人数超过2万人,发病率占男性恶性肿瘤的第9位,占女性恶性肿瘤的第10位。并且发病率呈逐年升高趋势,严重威胁人类健康。
淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)两大类,其中,以NHL为主,大约占到80-90%。淋巴瘤常采用联合化疗、放疗、免疫靶向治疗及骨髓移植等综合方案治疗。尽管淋巴瘤的治疗取得了很大进步,能使近一半患者长期无病生存,但仍有约半数以上的患者对治疗反应差,预后不理想,影响淋巴瘤预后的因素很多,但主要与病理亚型、分期、国际预后指征(IPI)和病变特殊部位有关。
淋巴瘤是一个高度异质性疾病,平衡易位导致的BCL6,BCL2,c-MYC等基因表达异常,基因扩增,非随机染色体缺失以及异常的体细胞超突变是常见的发病机制,但也有部分患者未发现已知突变。这些发病因素中有些会直接影响淋巴瘤的预后,也有一些因素通过影响下游靶分子的表达,间接影响淋巴瘤的预后。因此,那些在B细胞及T/NK细胞发育、分化、增殖中起关键作用的基因的表达变化,可能对判断淋巴瘤的预后具有重要意义。PRDM1β就是一种与淋巴瘤预后相关的转录因子。
PRDM1(PR domain containing 1,with ZNF domain)是一个含有5个锌指结构的转录抑制因子,又名B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B-lymphocyteinduced maturation protein-1,BLIMP-1)。PRDM1基因定位于人类染色体6q21-q22.1,有两种转录本,即PRDM1α和PRDM1β。
最初人们只认识到PRDM1α,发现它在正常B淋巴细胞中具有重要生理功能,不但能够抑制细胞增殖,也可以促进细胞分化,在B细胞分化为成熟浆细胞中具有重要作用。因此,PRDM1被界定为一种肿瘤抑制基因。随后也有研究-证实,在弥漫大B细胞性淋巴瘤中,约20%左右的患者可以检出PRDM1基因突变,主要是点突变,绝大多数位于第二外显子/第二内含子连接处,导致产生功能缺失或降低的只含有少部分氨基端的截短型PRDM1蛋白。Pasqualucci等的研究还发现,在DLBCL患者中,不仅部分患者存在PRDM1基因突变,且85%以上的患者同时不表达PRDM1蛋白。越来越多的研究表明,大部分DLBCL患者不表达PRDM1蛋白,除基因突变导致的PRDM1表达降低外,表观遗传学因素如DNA甲基化、组蛋白乙酰化等因素可能也参与下调PRDM1表达,导致淋巴瘤发生。
而在研究PRDM1蛋白表达与预后关系时,Garcia等惊奇地发现,PRDM1表达阳性患者的无失败生存率明显低于PRDM1阴性患者,两者之间有统计学差异,提示PRDM1表达可能与淋巴瘤患者预后差有关。这一结论违背了传统意义上人们对PRDM1蛋白的认识,倘若PRDM1是一个肿瘤抑制基因,那么表达PRDM1患者的治疗效果应该比不表达PRDM1的患者好。
进一步的研究才发现,人类PRDM1基因有两种转录本,即PRDM1α和PRDM1β,分别编码由789个氨基酸构成的PRDM1α和由690个氨基酸构成的PRDM1β。PRDM1α蛋白主要由5个结构域构成,即氨基端酸性区、PR结构域、脯氨酸富集区、5个锌指结构和羧基端酸性区。PRDM1β与PRDM1α相比,缺失了氨基端101个氨基酸,包含氨基端酸性区和部分PR结构域。PR结构域在进化上高度保守,与SET结构域高度同源,对于PRDM1α发挥转录抑制作用非常重要,参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用及染色质介导的基因表达。PRDM1α通过其PR结构域募集组蛋白去乙酰化酶、Groucho家族蛋白、组蛋白甲基转移酶G9a到其靶基因的启动子区,抑制靶基因的转录。PRDM1α抑制的靶基因主要有c-myc,MHC II类分子反式激活蛋白(MHC class II trans-activator,CIITA),CD23b,B细胞特异性激活蛋白(B cell lineage-specific activator protein,BSAP)/Pax-5,Spi-B和Id3等。
由于PRDM1β缺失了氨基端101个氨基酸,造成部分PR结构域缺失,导致其与PRDM1α蛋白具有截然不同的功能,也很好的解释了前期研究中相悖的结论。目前认为PRDM1α是一个肿瘤抑制基因,而PRDM1β可能参与淋巴瘤的发病或与淋巴瘤耐药相关。研究证实,在弥漫大B细胞性淋巴瘤中,PRDM1β表达阳性患者对传统化疗相对不敏感,并且预后较差,提出PRDM1β表达可能与DLBCL预后差相关;在T细胞性淋巴瘤的研究中,也得出相同结论。上述研究均提示PRDM1β有可能与淋巴瘤耐药及预后差相关。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。由于这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),它是生物体抵御病毒感染及防止重复序列和突变引起基因组不稳定性的细胞保护机制。
当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应,其胞质中RNaseIII核酶家族的Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21~23bp),即小干扰RNA(siRNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。
2002年,Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA(smallhairpin RNA,shRNA)表达载体pSUPER,并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达,为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。
RNAi技术目前主要应用于基因功能的研究,病毒感染性疾病以及肿瘤的基因治疗。在肿瘤的治疗中,对具有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或TEL/AML1融合基因的白血病细胞,通过RNAi技术下调BCL/ABL或TEL/AML1融合基因后,肿瘤细胞可以发生凋亡。通过使用针对某些抗凋亡分子如survivin或与耐药相关分子如MDR1的siRNA或shRNA,可以特异性杀伤肿瘤细胞或提高肿瘤细胞对药物的敏感性。
由于临床研究表明PRDM1β有可能是淋巴瘤预后不良因素之一,它的表达可能引起肿瘤细胞对化疗药物不敏感。本发明旨在寻找能够下调PRDM1β表达的小干扰RNA序列,探讨通过RNAi技术下调PRDM1β表达后,淋巴瘤细胞是否对药物的敏感性增加,为逆转淋巴瘤耐药以及淋巴瘤分子靶向治疗提供理论依据。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子。
本发明的再一的目的是,提供一组siRNA分子的用途。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子,所述的siRNA分子靶点位于PRDM1β mRNA的5’非翻译区。
所述的siRNA分子靶点选择位点为第66-84bp的碱基序列:GTTTGAGGCAGCTCCTTAA(见SEQ ID NO.1所示)。
所述的siRNA分子靶点选择位点为第70-88bp的碱基序列:GAGGCAGCTCCTTAAATGA(见SEQ ID NO.2所示)。
所述的siRNA分子靶点选择位点为第73-91bp的碱基序列:GCAGCTCCTTAAATGAACA(见SEQ ID NO.3所示)。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一组siRNA分子在制备治疗淋巴瘤药物中的应用。
所述的淋巴瘤是T细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
所述的siRNA分子和化疗药物在制备治疗淋巴瘤药物中的应用。
所述的化疗药物选择阿霉素。
本发明优点在于:通过使用本发明的siRNA分子,可以有效下调淋巴瘤细胞中PRDM1β基因表达,同时不影响PRDM1α基因的表达。PRDM1β表达下调后,淋巴瘤细胞对化疗药物阿霉素的敏感性增加。使用本发明可以克服淋巴瘤耐药,提高淋巴瘤的治疗效果和预后,使用方便且易被患者接受。
【附图说明】
图1:PRDM1β-siRNA干扰活性鉴定的共转染模式图。
图2:PRDM1 β1和PRDM1 β2 PCR扩增结果,均出现目的条带,PRDM1β1长1104bp,PRDM1β2长1154bp,①、②、③为相同体系。
图3:PRDM1β1-T-easy酶切鉴定结果,用EcoR I酶切后,10号和13号克隆有插入片段,大小与目的条带一致。
图4:PRDM1 β2-T-easy酶切鉴定结果,用EcoR I酶切后,1号、4号、6号、8号和10号克隆有插入片段,大小与目的条带一致。
图5:全长PRDM1β扩增结果,出现特异性条带,与目的条带2213bp相符。
图6:PRDM1 β1-669-pEGFP-N2酶切鉴定结果,用NheI和Hind III双酶切后,所有克隆都有插入片段。
图7:PRDM1β-pEGFP-N2酶切鉴定结果,用Hind III和EcoR I双酶切后,1号、2号、3号和10号克隆有插入片段。
图8:荧光显微镜检测293T细胞荧光强度,曝光时间1/7秒,荧光主要位于核内,PRDM1β-siRNA1的干扰效果最好。
图9:流式细胞仪及免疫印迹结果鉴定PRDM1β-siRNA的干扰活性,显示PRDM1β-siRNA1的干扰活性最强。
图10:PRDM1β-siRNA1在淋巴瘤细胞H9和Namalwa中的干扰活性。
图11:在淋巴瘤细胞H9和Namalwa中,PRDM1β下调后肿瘤细胞对药物敏感性增加。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
(一)细胞株及细胞培养
多发性骨髓瘤细胞株8226,T细胞性淋巴瘤细胞株H9,B细胞性淋巴瘤细胞株Namalwa均购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。所有细胞均采用含10%胎牛血清的1640培养液,在5%CO2-95%空气,饱和湿度以及37℃的条件下培养。细胞的存活率采用苔盘兰拒染实验检测,细胞形态学观察采用瑞氏染色法。
(二)试剂
RNA抽提试剂Trizol及RNA逆转录试剂盒购自Invitrogen公司,pEGFP-N2Vector购自BD Biosciences Clontech公司,pSlencer 4.1-H1 neo Vector购自Ambi on公司,KOD Plus高保真DNA聚合酶购自TOYOBO公司,T-easy购自Promega公司,限制性内切酶Nhe I,EcoR I,Bam H1,Hind III及T4 DNA连接酶购自Takara公司,抗-β-actin及抗-GFP单克隆抗体购自Sigma公司。
(三)RNA的抽提及逆转录
收集2×106个细胞,PBS洗一遍后,加入400μL Invitrogen公司Trizol,剧烈震荡,使完全溶解,再加入80μL氯仿,剧烈震荡,静置5分钟后,10000rpm离心15分钟,取上清,加入等体积异丙醇,震荡后放置5分钟,再10000rpm离心15分钟,沉淀即为RNA,用75%乙醇洗两遍,风干后加入约50μL DEPC水,4度溶解2小时,测OD值,计算浓度。RNA逆转录按照Invitrogen公司SuperScriptTM II Reverse Transcriptase Kit进行,20μL体系逆转录2μgRNA。
(四)构建PRDM1β-pEGFP-N2真核表达载体
1.引物设计
PRDM1β序列包含编码区及5’非翻译区,插入pEGFP-N2载体中EGFP编码序列上游。为了保证能够表达PRDM1β-GFP融合蛋白,设计引物时去掉PRDM1β编码序列的终止密码子,并保证其后到GFP编码序列之间的核苷酸数目为3的整数倍。PRDM1β序列全长分两段扩增,引物由Invitrogen公司合成,5’端加Nhe I限制性酶切位点,3’端加EcoR I限制性酶切位点,具体如下:
PRDM1β1F | attgctagc CATCGCCCATTTGCCATTCACTG |
PRDM1β1R | GCTGCCCCCACCGAGGAGATT |
PRDM1β2F | CCGAGGCTGTGCCCTGTCTACAGCAATCTC |
PRDM1β2R | cggaattc AGGATCCATTGGTTCAAC |
2.PCR扩增PRDM1β基因
由于骨髓瘤细胞株8226中PRDM1β表达水平高,我们以其cDNA为模板,用KOD plus高保真DNA聚合酶分两段分别扩增PRDM1β1和PRDM1β2,具体扩增条件如下:
3.PCR产物加A尾及连接到pGEM-T-easy载体
PCR产物电泳后,在紫外灯下切取目的条带,进行纯化,具体步骤按照Axygen公司胶回收纯化试剂盒操作。然后,使用普通Taq DNA聚合酶,对纯化的PCR产物3’末端加上“A”尾,体系如下:
10×PCR buffer 1.0μl
MgCl2 0.6μl
2.5mM dATP 0.4μl
Taq DNA polymerase 1.0μl
PCR产物 7.0μl
10.0μl 72℃ 30分钟
将加了“A”尾的PCR产物连接至pGEM-T-easy载体中,其连接体系如下:
2×Rapid ligation buffer 7.5μl
pGEM-T-Easy vector(25ng) 0.5μl
加“A”尾的PCR product 6.0μl
T4 DNA ligase 1.0μl
15.0μl 4℃过夜
4.感受态细菌的制备
Top10细菌涂板活化后,挑一个比较饱满的克隆,加入5mL LB培养液中,在37℃、300rpm条件下摇15小时,再取1mL菌液加入100mL LB培养液中,37℃、300rpm条件下摇2小时左右,测OD值在0.3-0.4之间时,冰上放置30分钟,4000rpm离心5分钟,弃上清,加入20mL过滤除菌后的CCMB(10mM KOAc,80mMCaCl2,20mM MnCl2,10mM MgCl2,10%甘油,PH=6.4)液,重悬细菌,冰上放置30分钟,再4000rpm离心5分钟,弃上清,加入冰冷的CCMB 5mL,分装,-80度保存。
5.细菌转化
连接产物7.5μL加入100μL感受态细菌中,冰上放置30-45分钟,再42℃水浴热激90秒,冰上放置2分钟后,把所有菌液加入800μL LB培养液中,在37℃、150rpm条件下摇1小时,再3000rpm离心5分钟,弃上清,剩余约100-200μL左右菌液,均匀涂在氨苄抗性半固体LB培养板上,37℃温箱培养15小时左右,挑10-20个克隆,加入5mL氨苄抗性的LB培养液中,在37℃、300rpm条件下摇15小时。
6.质粒小量抽提及酶切鉴定
按照Axygen公司质粒小抽试剂盒操作。简言之,菌液在3000rpm离心后,弃上清,加入250μL P1充分混匀,再加入250μL P2上下颠倒混匀6-8次,再加入350μL P3上下颠倒混匀6-8次,冰上放置5-10分钟,10000rpm离心15分钟后,上清加入过滤柱离心,再用700μL W1洗两遍,500μL W2洗一遍,加入30μL水,10000rpm离心2分钟。再用酶切鉴定是否有插入片段,由于pGEM-T-easy载体在插入片段两端都有一个EcoR I酶切位点,因此采用EcoR I单酶切鉴定,体系如下:
10×buffer M 1.0μl
EcoR I 1.0μl
pGEM-T-easy-PRDM1β 1.0μl
H2O 7.0μl
10.0μl 37℃过夜
然后酶切产物进行琼脂糖电泳,判断是否插入目的片段。
7.PCR扩增全长PRDM1β序列
分别以pGEM-T-easy-PRDM1β1为模板扩增PRDM1β1,以pGEM-T-easy-PRDM1β2为模板扩增PRDM1β2,退火温度均为55℃,延伸时间为2分钟,总共30个循环。将PRDM1β1和PRDM1β2 PCR产物混合,并以此为模板,用PRDM1β1前向引物和PRDM1β2反向引物扩增全长PRDM1β。退火温度为55℃,延伸时间为2分30秒,总共30个循环。
8.将全长PRDM1β序列插入pEGFP-N2载体
PRDM1β插入序列总长2213bp,中间在第669bp处有一Hind III酶切位点,因此,分两步把全长PRDM1β基因片段插入到pEGFP-N2载体中。首先插入1-669bp,然后再插入670-2213bp。先分别用Nhe I和Hind III双酶切pEGFP-N2载体及pGEM-T-easy-PRDM1β1载体,体系如下:
10×buffer M 2.0μl
Nhe I 1.0μl
Hind III 1.0μl
pEGFP-N2 vector(or
pGEM-T-easy-PRDM1β1) 2.0μl
H2O 140μl
20.0μl 37℃过夜
酶切产物进行琼脂糖电泳,紫外灯下分别切取载体及PRDM1β1-669,纯化后进行连接,具体连接体系如下:
10×ligation buffer 1.5μl
pEGFP-N2回收产物 2.0μl
PRDM1β1-669回收产物 6.0μl
T4 DNA ligase 1.5μl
H2O 4.0μl
15.0μl 16℃水浴过夜
连接产物转化细菌,涂在卡那霉素抗性半固体LB培养板上,37℃温箱培养15小时,挑18个克隆,37℃、300rpm条件下摇15小时左右,进行质粒小量抽提,再用Nhe I和Hind III双酶切鉴定,确定有插入片段后,再把后半段插入PRDM1β1-669-pEGFP-N2载体中。具体如下,先用Hind III和EcoR I双酶切PRDM1β1-669-pEGFP-N2载体及全长PRDM1β,体系如下:
10×buffer M 2.0μl
Hind III 1.0μl
EcoR I 1.0μl
PRDM1β1-669-pEGFP-N2 vector
(或全长PRDM1β PCR回收产物) 1.0μl(或16.0μl)
H2O 15.0μl(或0μl)
20.0μl 37℃过夜
酶切产物进行琼脂糖电泳,紫外灯下分别切取载体及PRDM1β670-2213片段,纯化后进行连接,具体连接体系如下:
10×ligation buffer 1.5μl
PRDM1β1-669-pEGFP-N2回收产物 3.0μl
PRDM1β670-2213回收产物 9.0μl
T4 DNA ligase 1.5μl
15.0μl 16℃水浴过夜
连接产物转化细菌,涂在卡那霉素抗性半固体LB培养板,37℃温箱培养15小时,挑10个克隆,37℃、300rpm条件下摇15小时左右,进行质粒小量抽提,酶切鉴定确定有插入片段后,再送上海桑尼生物有限公司测序。
(五)构建PRDM1β-siRNA-pSilencer小干扰RNA载体
1.siRNA序列设计
siRNA序列按照Promega公司siRNA Target Designer软件进行设计,小干扰RNA序列长19bp,插入片段总长63bp,形成发夹状结构,包括5’酶切位点、干扰序列、发夹结构、干扰序列反向互补序列、保护碱基序列及3’酶切位点。我们同时设计正义链和反义链两条互补的DNA序列,并在5’端加上BamH1限制性酶切位点,3’端加上Hind III酶切位点,si RNA序列由Ivitrogen公司合成,具体序列如下
β1S | gatcc GTTTGAGGCAGCTCCTTAAtctcttgaaTTAAGGAGCTGCCTCAAAC TTTTTGGAAA a |
β1A | agctt TTTCCAAAAAGTTTGAGGCAGCTCCTTAA ttcaagagaTTAAGGAGCTGCCTCAAAC g |
β2S | gatcc GAGGCAGCTCCTTAAATGA tctcttgaaTCATTTAAGGAGCTGCCTC TTTTTGGAAA a |
β2A | agctt TTTCCAAAAAGAGGCAGCTCCTTAAATGA ttcaagagaTCATTTAAGGAGCTGCCTC g |
β3S | gatcc GCAGCTCCTTAAATGAACA tctcttgaaTGTTCATTTAAGGAGCTGC TTTTTGGAAA a |
β3A | agctt TTTCCAAAAAGCAGCTCCTTAAATGAACA t t caagagaTGTTCATTTAAGGAGCTGC g |
2.互补DNA序列的复性
合成好的两条互补DNA序列分别加水稀释到100μM浓度,然后各取1μl正义链和1μl反义链混合,加水补足25μl体系,具体如下
100μM浓度 正义链 1.0μl
100μM浓度 反义链 1.0μl
H2O 23.0μl
25.0μl 95℃ 5分钟,缓慢冷却到室温
3.复性的DNA片段插入pSilencer 3.1-H1 neo载体
pSilencer 3.1-H1 neo载体用Bam H1和Hind III双酶切,体系如下
10×buffer M 2.0μl
Bam H1 1.0μl
Hind III 1.0μl
pSilencer vector 1.0μl
H2O 15.0μl
20.0μl 37℃过夜
然后双酶切产物进行琼脂糖电泳,紫外灯下切取载体片段,纯化后与复性的DNA片段连接,连接体系如下:
10×ligation buffer 1.5μl
pSilencer vector回收产物 1.0μl
PRDM1β-siRNA片段 0.5μl
T4 DNA ligase 1.5μl
H2O 11.5μl
15.0μl 16℃水浴过夜
连接产物转化细菌,涂在氨苄抗性半固体LB培养板,37℃温箱培养15小时,每一干扰序列挑三个克隆,37℃、300rpm条件下摇15小时左右,进行质粒小量抽提,送上海桑尼公司直接测序。
(六)PRDM1β-siRNA干扰活性的鉴定
1.设计方案
如图1所示,PRDM1β-siRNA载体和PRDM1β-GFP载体共转染293T细胞,培养48小时后根据GFP荧光强度判断PRDM1β-siRNA的干扰活性,GFP阳性细胞的平均荧光强度越小,PRDM1β-siRNA的干扰活性越强。
2.质粒大量抽提
在进行共转染293T细胞之前,先把PRDM1β-GFP载体和3个PRDM1β-siRNA载体进行质粒大量抽提,具体按照天根公司质粒大抽试剂盒操作。
3.共转染293T细胞
通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞,首先接种5个培养皿(6cm)293T细胞,每皿接种6×105个细胞,培养16-20小时后换液,然后配转染体系,具体如下,
β-siRNA1 | β-siRNA2 | β-siRNA3 | β-pEGFP-N2 | |
β-pEGFP-N2 | 6μg | 6μg | 6μg | 6μg |
β-siRNA | 6μg | 6μg | 6μg | 6μg(pSilencer) |
CaCl2 | 37μL | 37μL | 37μL | 37μL |
H2O | 补至300μL | 补至300μL | 补至300μL | 补至300μL |
然后,一边振荡,一边缓慢加入300μL 2xHepes缓冲液,静置30分钟后,加入相应的293T细胞中,混匀,再培养48小时后荧光显微镜下拍照,流式细胞仪检测GFP阳性细胞平均荧光强度以及收蛋白用于免疫印迹检测GFP。
4.荧光显微镜检测GFP
采用Olympus倒置荧光显微镜观察并拍照,曝光时间均为1/7秒。
5.流式检测GFP
293T细胞用胰酶消化后,取1×106个细胞,用PBS洗一遍,加PBS至500μL,流式细胞仪检测每组GFP阳性细胞的平均荧光强度。
6.免疫印迹
每2×106个细胞用100μL Laemmli裂解液(0.5M Tris-HCl,pH 6.8,2mMEDTA,10%甘油,2% SDS and 5% β-巯基乙醇)进行裂解,室温放置15分钟后,沸水煮10分钟。蛋白裂解物(20μg)用于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,再转印至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用5%脱脂牛奶(TBS/0.1% Tween 20溶解)封闭2小时,之后与一抗在室温下孵育2小时或在4℃孵育过夜,用TBS/0.1%Tween 20洗三遍,每次5min,再室温孵育二抗2小时,再用TBS/0.1%Tween 20洗三遍,每次5min,用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。
(七)PRDM1β-siRNA在淋巴瘤中的干扰效果评价
1.PRDM1β-siRNA-lentivirus慢病毒载体的构建、病毒颗粒的包装及浓缩
通过上述共转染实验,我们根据荧光、流式细胞仪及Western结果选择一个干扰活性最高的序列,同时再设计一个无关序列作为对照(NC),把两个序列分别插入到Lentivirus慢病毒载体。Lentivirus载体在pU6启动子下,可以转录小发夹RNA(shRNA),进而发挥干扰活性,同时Lentivirus载体还带有GFP标记,可以用来筛选转染阳性细胞。PRDM1β-siRNA慢病毒载体的构建、病毒颗粒的包装及浓缩均按Protocol进行。
2.PRDM1β-siRNA-Lentivirus转染淋巴瘤细胞
病毒载体转染T细胞性淋巴瘤细胞株H9和B细胞性淋巴瘤细胞株Namalwa,同时设立无关序列对照转染组。待细胞稳定表达GFP后,通过流式分选的方法分选出GFP阳性转染细胞。
3.半定量RT-PCR检测PRDM1α、PRDM1β的表达
半定量RT-PCR的引物设计如下
(八)MTT实验检测PRDM1β表达下调后淋巴瘤细胞对药物敏感性变化
在96孔板中,每孔接种190μL细胞悬液,细胞总数为2×104,同时接种PRDM1β-siRNA-Lentivirus转染的细胞及无关序列NC-siRNA-Lentivirus转染的细胞。药物选择阿霉素。阿霉素的终浓度选用0、12.5、25、50、100和200ng/mL,每一剂量组设3个平行孔,每孔加入10μL药物,0剂量组用含10%胎牛血清的1640培养液代替。培养72小时后,向每孔中加入20μL MTT(5mg/ml),继续培养4小时,离心后每孔吸去上清,再加入200μL DMSO,轻轻震荡20分钟后,分光光度计测量492nm下每孔的吸光度值,根据结果分别计算出各种药物对PRDM1β-siRNA-Lentivirus转染细胞及无关序列NC-siRNA-Lentivirus对照转染细胞的半数抑制剂量(IC50值)。
(九)统计分析
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示,用t检验来比较差异。P<0.05认为具有统计学差异。所有数据采用SAS8.2软件分析。
结果:
2.3.1 PRDM1β-pEGFP-N2真核表达载体的构建
2.3.1.1以骨髓瘤细胞株8226细胞cDNA为模板PCR扩增PRDM1β
我们把全长PRDM1β序列分成前后两段,分别扩增出前半部分PRDM1β1和后半部分PRDM1β2,如图2所示。
PRDM1β1和PRDM1β2 PCR产物先分别连接到pGEM-T-easy载体,PRDM1β1-T-easy酶切鉴定结果如图3所示,第10号和第13号克隆可见有插入片段,并且大小与目的片段一致,测序发现13号克隆序列完全正确。
PRDM1β2-T-easy酶切鉴定如图4所示,第1号、4号、6号、8号及10号克隆插入片段大小与目的条带一致,1号克隆测序后证实序列完全正确。
然后以PRDM1β1-pGEM-T-easy为模板扩增PRDM1β1,以PRDM1β2-pGEM-T-easy为模板扩增PRDM1β2,再以它们的PCR产物混合物为模板扩增出全长PRDM1β,结果如图5所示
2.3.1.2 PRDM1β插入到pEGFP-N2载体
全长PRDM1β序列插入到pEGFP-N2载体的过程也是分两步进行,由于PCR扩增的全长PRDM1β基因序列在第669bp处有一个Hind III限制性酶切位点,并且设计引物时在PRDM1β基因序列的5’端添加了一个Nhe I酶切位点序列,在3’端添加了一个EcoR I限制性酶切位点序列。这一酶切位点排列顺序刚好与pEGFP-N2载体三个酶切位点的顺序相同,因此我们先把PRDM1β1-669插入到pEGFP-N2载体,酶切鉴定结果如图6所示,所有18个克隆都有插入片段,插入片段大小与实际片段669bp相符。
然后再把PRDM1β670-2213片段插入到PRDM1β1-669-pEGFP-N2载体,酶切鉴定结果如图7所示,第1号、2号、3号和10号克隆有插入片段,与目的片段大小一致。
酶切鉴定有4个克隆正确,我们把1号克隆测序,经过比对序列完全正确。
2.3.2 PRDM1β-siRNA-pSilencer载体的构建
PRDM1β小干扰RNA载体pSlencer 3.1-H1 neo全长4.3kb,干扰序列插入以后,在人H1启动子下,在真核细胞内可以表达一个短发夹状小干扰RNA,进而发挥干扰功能。每一干扰序列同时挑3个克隆,由于插入片段长度较小,只有63bp,因此我们通过直接测序的方法判断是否有插入片段及插入片段是否正确,测序结果显示,9个克隆都有插入片段,并且9个克隆序列经比对后都完全正确,并且用它进行下一步干扰活性的鉴定。
2.3.3 PRDM1β-siRNA干扰活性的鉴定
PRDM1β小干扰RNA的干扰活性通过共转染实验进行鉴定,把表达PRDM1β-GFP融合蛋的PRDM1β-pEGFP-N2载体与表达小干扰RNA的PRDM1β-siRNA-pSilencer载体同时转染293T细胞,由于PRDM1β与GFP蛋白融合,并且位于GFP蛋白的氨基端,因此,当PRDM1β表达被干扰以后,GFP就表达减弱或不表达,通过检测GFP的强弱可以间接反映PRDM1β-siRNA的干扰活性。培养48小时后,如图8所示,通过倒置荧光显微镜发现pSilencer空载对照组的GFP阳性细胞最多,且荧光强度较强。而同时转染β-siRNA组的GFP阳性细胞数与对照组相比明显减少,并且阳性细胞荧光强度也较对照组明显减弱,其中PRDM1β-siRNA1的干扰效果最好,其次为PRDM1β-siRNA2和PRDM1β-siRNA3。
GFP阳性细胞比例及阳性细胞平均荧光强度通过流式细胞仪检测,实验结果显示,pSilincer空载对照组GFP阳性细胞高达49.1%,并且平均荧光强度为1.38×104,而PRDM1β-siRNA组GFP阳性细胞数及平均荧光强度均有不同程度明显降低,以PRDM1β-siRNA1组的降低最明显,GFP阳性细胞只有21.0%,并且GFP阳性细胞平均荧光强度也只有1.79×103,其次分别为PRDM1β-siRNA2和PRDM1β-siRNA3(如图9A,B所示),与荧光显微镜观察结果一致。我们通过平均荧光强度计算了每个干扰序列的干扰活性,如图9C所示,所设计的3个干扰序列都能明显抑制GFP表达,其中以PRDM1β-siRNA1的干扰活性最强,达到87%以上。免疫印迹GFP结果示,pSlencer对照组GFP水平非常高,而PRDM1β1-siRNA组看不到清楚的条带,PRDM1β-siRNA2组及PRDM1β-siRNA3组也仅见弱条带(图9D),与上述荧显微镜及流式细胞仪检测结果完全一致。以上结果表明3条干扰序列都能有效的干扰PRDM1的表达,并且以PRDM1β-siRNA1干扰序列的干扰活性最好。
2.3.4 PRDM1β-siRNA在淋巴瘤细胞中的干扰效果评价
根据以上共转染实验结果,我们发现PRDM1-β1-siRNA的干扰活性最好,那么它在淋巴瘤细胞中是否还具有很强的干扰活性,需要进一步验证。由于普通载体转染淋巴瘤细胞的效率都很低,而Lentivirus慢病毒能够有效转染包括淋巴瘤细胞在内的各种细胞,并且还带有GFP标记,可用于阳性转染细胞的筛选,因此,我们把PRDM1β-siRNA1序列插入Lentivirus病毒载体,经过测序比对后证实序列完全正确。
PRDM1β-siRNA1-Lentivirus慢病毒载体构建好以后,然后进行病毒颗粒的包装、纯化,再转染T细胞性淋巴瘤H9细胞,根据流式分选筛选出GFP阳性细胞。RT-PCR结果显示(图10),在T细胞性淋巴瘤H9细胞B细胞性淋巴瘤Namalwa细胞中,与对照组相比,PRDM1-β-siRNA1能够明显抑制PRDM1β表达,与此同时PRDM1α表达水平未受影响。
2.3.5 PRDM1β表达下调后淋巴瘤细胞对药物敏感性的变化
通过MTT实验,根据淋巴瘤细胞对药物阿霉素的IC50值,我们判断淋巴瘤细胞对药物的敏感性差异,如图11所示,在H9细胞和Namalwa细胞中,NC组细胞对阿霉素的IC50分别为129.33ng/mL和50.00ng/mL;而PRDM1-β1-siRNA-1组肿瘤细胞对阿霉素的IC50分别只有81.65ng/mL和30.20ng/mL。与NC对照组肿瘤细胞相比,PRDM1β-siRNA组肿瘤细胞对阿霉素的IC50值明显降低,两组之间有统计学差异(p<0.05),说明下调PRDM1β后,淋巴瘤细胞对药物更加敏感。
我们通过分析PRDM1α和PRDM1β的mRNA序列,发现在PRDM1βmRNA的5’端有154个碱基的特殊序列,只有这部分碱基序列与PRDM1αmRNA不重复,其余3’端所有碱基序列都与PRDM1αmRNA完全重复,因此,我们从这154个碱基中设计了干扰序列,通过RNA干扰技术特异性沉默PRDM1β表达,研究PRDM1β下调后淋巴瘤细胞对药物敏感性的变化及可能机制。
由于PRDM1β的这154bp特殊序列中有146bp位于5’UTR,只有9bp位于编码区,而文献报道,siRNA序列位于靶基因起始密码子AUG下游50~100个核苷酸时,基因沉默效果越好,越靠近靶基因的3’端,其基因沉默效果可能越好。5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)及起始密码子附近序列通常含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),不适合在此设计siRNA序列,因为调节蛋白可与RISC竞争结合,降低RNAi效应。但Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中,5’UTR是一个高度保守区,运用RNAi技术作用于5’UTR或3’UTR序列,同样可引起靶基因沉默,这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。本发明发现,以5’UTR区设计的3个干扰序列,都具有明显的干扰活性,最高干扰效率达到87%以上,最低的干扰效率也大于65%,表明作用于5’UTR的干扰序列也能够很有效的沉默目的基因表达。
由于文献没有只干扰PRDM1β表达方面的研究报道,因此,我们自己设计了3条干扰序列,从中筛选出一条具有明显干扰活性的序列。首先,我们必须把表达干扰序列的载体转染到表达PRDM1β的淋巴瘤细胞中,然后才能判断每一条干扰序列的干扰活性。真核细胞的转染可以通过多种方法获得,例如磷酸钙沉淀、脂质体转染、电穿孔以及病毒方法。由于淋巴瘤细胞呈悬浮生长方式,磷酸钙沉淀、脂质体转染、电穿孔的转染效率都很低,例如电转染效率通常只有1-2%,最高也不会超过10%,虽然通过抗性药物筛选可以提高阳性率,但需时较长,不能保证是否还具有很好的干扰活性。缺陷病毒载体具有转染效率高、表达稳定的特点,常用的为腺病毒载体和Lentivirus慢病毒载体,但病毒的包装以及转染要求很高,而且成本较高,也不适于筛选干扰序列的干扰活性。由于贴壁细胞具有转染效率高的特点,我们可以通过共转染的方法,把PRDM1β表达载体与表达干扰序列的载体同时转染到293T细胞,根据顺转实验结果判断干扰序列的干扰活性。同时由于PRDM1β蛋白融合了GFP蛋白,因此,通过检测GFP表达及荧光强度就可以很方便的鉴定干扰序列的干扰活性。我们的结果显示,共转染了干扰序列载体的293T细胞,其GFP阳性细胞比例及GFP阳性细胞平均荧光强度都明显降低,以PRDM1β-siRNA1的降低最明显,达到87%以上,表明它的干扰活性最强。经过把该序列插入病毒载体,转染淋巴瘤细胞,RT-PCR结果显示,在T细胞淋巴瘤H9和B细胞淋巴瘤Namalwa中,PRDM1β-siRNA1能够明显下调PRDM1β表达,与此同时,不影响PRDM1α的表达,与共转染实验结果完全符合。表明在淋巴瘤细胞中,共转染实验可以用来筛选干扰序列的干扰活性,并且具有简便、稳定可靠的优点。
本实验通过RNA干扰的方法,特异性沉默了PRDM1β的表达,发现表达PRDM1β的T细胞淋巴瘤H9细胞和表达PRDM1β的B细胞淋巴瘤Namalwa细胞在PRDM1β表达下调后对化疗药物阿霉素的敏感性都明显增加,进一步证实PRDM1β表达确实与淋巴瘤细胞耐药相关。下调PRDM1β可以逆转淋巴瘤耐药,PRDM1β可作为淋巴瘤治疗的新靶点,通过RNA干扰进行分子靶向治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120>一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子及其应用
<130>/
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
gtttgaggcagctccttaa 19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
gaggcagctccttaaatga 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gcagctccttaaatgaaca 19
Claims (4)
1.一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子,其特征在于,所述的siRNA分子选自下列中的一种或几种:
a)正义链:5’-GTTTGAGGCAGCTCCTTAAtctcttgaaTTAAGGAGCTGCCTCAAACTTTTTGGAAA-3’
反义链:5’-TTTCCAAAAAGTTTGAGGCAGCTCCTTAAttcaagagaTTAAGGAGCTGCCTCAAAC-3’
b)正义链:5’-GAGGCAGCTCCTTAAATGAtctcttgaaTCATTTAAGGAGCTGCCTCTTTTTGGAAA-3’
反义链:5’-TTTCCAAAAAGAGGCAGCTCCTTAAATGAttcaagagaTCATTTAAGGAGCTGCCTC-3’
c)正义链:5’-GCAGCTCCTTAAATGAACAtctcttgaaTGTTCATTTAAGGAGCTGCTTTTTGGAAA-3’
反义链:5’-TTTCCAAAAAGCAGCTCCTTAAATGAACAttcaagagaTGTTCATTTAAGGAGCTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的siRNA分子在制备治疗淋巴瘤药物中的应用,所述的淋巴瘤是T细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
3.根据权利要求1所述的siRNA分子和化疗药物在制备治疗淋巴瘤药物中的联合应用,所述的淋巴瘤是T细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
4.根据权利要求3所述的应用,所述的化疗药物选择阿霉素。
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Gina M.PRDM1/BLIMP-1 modulates IFN-γ-dependent control of the MHC class I antigen-processing and peptide loading pathway.《The Journal of Immunology》.2007,第179卷7614-7623. * |
刘艳艳.PRDM1在弥漫大B细胞淋巴瘤中表达和预后意义的研究.《河南医学研究》.2008,第17卷(第1期),16-19. * |
黄慧强.恶性淋巴瘤分子靶向治疗进展.《实用肿瘤杂志》.2004,第19卷(第5期),373-375. * |
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