CN103536920A - 一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药及基因工程领域，提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物，抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物主要包括BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。本发明还提供了该药物组合物的应用。本发明的药物组合物能够明显抑制胰腺癌细胞增殖的存活，促进胰腺癌细胞的凋亡。而且BRSK2在人脑和胰腺组织中高丰量特异性表达，尤其在胰腺癌组织中比癌旁组织中表达量更高，故本发明的药物组合物有高度的特异性。本发明为寻找有效的治疗胰腺癌的药物提供一种全新的、特异的、高效的、低副作用的方法和途径。

Description

一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物，具体而言，该抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物主要涉及BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。本发明还提供了该药物组合物的应用。

背景技术

胰腺癌是由胰腺癌上皮恶变形成的恶性肿瘤，虽然其发病率仅排名恶性肿瘤的第13位，但是其致死率却在恶性肿瘤中位列第8位。根据世界卫生组织的统计,全世界每年有216 000多人确诊为胰腺癌。在我国该癌症发病率原很低,但近年也呈现逐年增多的趋势，近年来已经升至第5位。即使现在有化疗、放疗、手术等多种治疗方法，胰腺癌的生存率仍然不到5%。因为在出现初级症状时就已经伴有转移现象，所以被确认为胰腺癌时往往已经是临床晚期。因此只有10%的患者能够接受手术，而辅助疗法基本已经无能为力。造成胰腺癌的死亡率基本上与其发生率持平，五年生存率仅有5%。

化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一。肿瘤对化疗药物的耐药按照其耐药表型可分为原药耐药(primary drug resistance,PDR)和多药耐药(mutidrug resistance,MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性；后者则是指肿瘤细胞在接触一种化疗药物以后,不但对该药产生耐药性,而且对其它结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药性(M.M.Huycke,D.F.Sahm and M.S.Gi lmore,Emerg Infect Di s,4(1998)239).。而根据耐药产生的时间和机制不同，又可分为原发耐药(innate resistance)和继发耐药(acquired resistance)。有些肿瘤细胞在化疗开始时对化疗药物即有抗药性，称为原发耐药；另一些则开始时对化疗药物敏感，以后逐渐产生耐药，即继发耐药。据统计，肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性是化疗失败的主要原因，占化疗失败的90％以上(R.Perez-Tomas,CurrMed Chem,13(2006)1859.)。

肿瘤的MDR现象产生的途径较多，有其复杂的分子生物学基础，其中研究较多的几种机制为：①药物摄入减少或者药物外排增加（主要通过p-gp蛋白，mdr及mrp蛋白介导）；②药物作用的靶分子改变；③药物灭活酶表达增加；④药物代谢障碍；⑤DNA修复机制障碍或DNA多聚酶活性改变等；⑥表遗传的改变使得药物靶点在细胞内的活性和表达发生改变，从而产生耐药；⑦其它机理。在MDR的形成中，这些耐药机制可能单独或联合起作用(T.Ozben,FEBSLett,580(2006)2903.)。近几年来，如何克服MDR成为国内外研究热点。针对不同的耐药机制，药物学家已经研发出一系列逆转剂，如维拉帕米、奎尼丁、环孢霉素等。然而这些逆转剂由于所需浓度太高，毒性明显，不宜临床。所以寻求低毒高效的新型逆转剂成为药理学家孜孜以求的目标。

近几年来，如何克服MDR成为国内外研究热点。针对p-gp介导的耐药机制，人们已经研究了四分之一个世纪。第一代肿瘤增敏剂（维拉帕米，环孢素，右维拉帕米）都是基于他们于载体的竞争结合，从而增强抗癌药物。这些佐剂的主要缺点就是在所需增敏剂量下的高毒性。尝试去降低他们的毒性也没有得到预期效果。第二代的佐剂虽然没有发现毒性，但明显影响抗癌药剂的药代动力学。在目前新一代基于直接抑制载体的多药耐药佐剂（tariquidar,cyclopropyldibenzosuberane，zosuquidar）已经开发。此佐剂不表现出毒性，不和细胞色素P540反应，也不影响药物动力。目前，第三代佐剂已在临床试验，将解决部分耐药问题。然而这些逆转药都存在毒性大，活性低的问题(M.Susa,E.Choy,C.Yang,J.Schwab,H.Mankin,F.Hornicek and Z.Duan,J Biomol Screen,15287.S.S.Winter,D.M.Lovato,H.M.Khawaja,B.S.Edwards,I.D.Steele,S.M.Young,T.I.Oprea,L.A.Sklar and R.S.Larson,J Biomol Screen,13(2008)185.A.Katsman,K.Umezawa andB.Bonavida,Drug Resist Updat,10(2007)1.)

蒽环类药物是最有效的抗肿瘤的药物之一，包括柔红霉素（DNR或者DAU）和阿霉素（DOX）等，可以治疗多种癌症，包括白血病和实体瘤(Minotti,G.,et al.,Anthracyclines:molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity andcardiotoxicity.Pharmacol Rev,2004.56(2):p.185-229)，具有一个蒽环平面，可通过它嵌合于DNA碱基对之间并紧密地结合到DNA上，因而使核酸中含有相当高浓度的药物，这种嵌合可导致DNA空间结构的障碍，从而抑制DNA及DNA依赖的RNA合成，对RNA的影响尤为明显，并可选择性作用于嘌呤核苷。为细胞周期非特异性药物，对增殖细胞各期均有杀伤作用，但对G₂期作用更为显著。

在临床化疗治疗中，由于肿瘤细胞对蒽环类化合物的天然或获得性的耐受性以及药物对正常组织的毒性，尤其是心脏毒性(突发性心动过速，呼吸困难，心脏扩大，急性心力衰竭，肺水肿等，能迅速导致死亡，病检可见多灶性心肌退行性变，心脏毒性发生率为2%～10%。)使得蒽环类药物在临床应用上受到限制。DNR和阿霉素在体内会被代谢成为DNR醇和阿霉素醇，蒽环霉素使用时引起的急性和慢性的心脏毒性，也被认为主要是由蒽环类药物的羟基代谢物引起的。而且羟基代谢物的抗癌活性和药物原形相比，抗癌活性较弱。

AMP-活性相关激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一个高度保守的丝氨酸苏氨酸激酶，当细胞内能量下降时，AMPK经由其上游的激酶激活其催化区域的172位丝氨酸的磷酸化而被活化，因此又被称为能量变化感应器。根据AMPK激酶结构域氨基酸的保守性，Manning等人将BRSK1,BRSK2,AMPK等13个激酶归于AMPK亚家族。BRSK2是由申请人最早克隆出来的一个基因，刚开始认为其只在脑中表达，故起名为脑特异表达激酶2(Brain-specifickinase2,BRSK2)，后来发现其不仅仅存在于脑里，在胰腺中也有表达。

BRSK2是申请人利用重要结构域同源筛选策略EST电子克隆技术，首先克隆并提交的新基因。前期对BRSK2的研究主要集中在它们在神经极化、突触形成以及递质释放等过程中起到的应用。小鼠中BRSK2的同源基因被命名为SAD-A以及SAD-B，单突变BRSK2的动物模型表型正常，但是双突变BRSK2的模型动物在出生后两个小时就死亡，解剖发现动物的大脑皮层比正常的要薄得多，并且神经元缺乏轴突以及树突。一个可能的机制是SAD通过磷酸化Tau，引起MAPs与微管蛋白结合不紧密，造成微管蛋白不能正常形成，最终对轴突形成造成影响。另外有研究表明，人的BRSK2是新的突触小泡和活动机制相关蛋白激酶，通过磷酸化其活动区蛋白和小泡引发因子RIM1，达到调节神经递质释放的功能。最新研究表明，除了在神经系统的中心起到调节神经极化、轴突树突形成等起到作用，BRSK2还能特异地定位于肌肉神经节点处，控制神经递质在周围神经系统的释放。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种比较敏感的抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物。具体而言，该抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物主要涉及BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。本发明还提供了该药物组合物用于抑制体外胰腺癌细胞增殖的方法。

本发明通过对BRSK2的研究发现，该基因在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，组织芯片的结果进一步支持了该结论。采用蛋白质印迹技术在细胞学水平上检测多种胰腺癌癌细胞中BRSK2的表达，结果显示BRSK2在多株胰腺癌细胞中均有表达，该实验结果进一步证实了BRSK2在胰腺癌中有高表达。本发明还利用BRSK2成功的筛选到其抑制剂。利用有效干扰BRSK2蛋白表达的抑制剂胰腺癌细胞的内源BRSK2之后，细胞对蒽环类药物的敏感性显著增加。本发明在此基础上完成。

本发明提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物，该药物组合物包括神经分化相关基因BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。

所述的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂是BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的核酸、肽段或者小分子化合物。本发明的BRSK2抑制剂可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。

例如，所述的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂是神经分化相关基因BRSK2的siRNA。其中，神经分化相关基因BRSK2的siRNA与蒽环类药物的比例范围为：siRNAs:蒽环类药物=20~40nM:0.01μM~10μM，意即，siRNAs:Drugs=2:1—1:500，摩尔比。较好的，神经分化相关基因BRSK2的siRNA与蒽环类药物的比例范围为：2:1—1:250，摩尔比。神经分化相关基因BRSK2的siRNA与蒽环类药物的物质的量的比例可以是：2:1,1:10,1:5,1:20,1:50,1:100,1:200，等等。

所述的药物组合物含有药学上有效量的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂和药学上有效量的蒽环类药物以及药学上可接受的载体。

在本发明的实施例中，列举了蒽环类药物柔红霉素和阿霉素。

DNR是一种重要的蒽环类抗癌药物，分子式C27H29NO10，通常称为柔红霉素。中文别名：正定霉素，柔毛霉素，红比霉素，红保霉素，佐柔比星，红比脘。外文名：Daunorubicin,Daunomycin,Daunoblastin,Rubidomycin,Rubomycin,Ondena,Cerubidine.外文缩写：DNR，DRB，DM，F.I.6339,NSC-82151,13057R.P,本发明中也简称为DAU。化学名：（1S，3S）-3-乙酰基-1，2，3，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-10-甲氧基-6，11-二氧-1-1萘基-3-氨基-2，3，6-三去氧-a-L来苏六吡喃糖甙。DNR药物为橙红色针状结晶，易溶于水，其水溶液相当稳定，在0℃能保存3周，其活力不变，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、苯。是Str.peucetius或Str.coeruleorubidus菌种所产生的抗生素，是从我国河北正定县土壤中得到的放线菌菌株，故亦名正定霉素。

阿霉素（DOX）分子式为C27H29NO11，分子量543.49，化学名称：(2R,4S)-4-(3-Amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyloxy)-2-hydroxyacetyl-1,2,3,4-tetrahydro-2,5,12-trihydroxy-7-methoxynaphthacene-6,11-dione。通常为桔红色的冻干粉剂。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，不同程度的毛发脱落,心脏毒性，恶心、食欲减退,药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。

本发明提供了一种增强体外胰腺癌细胞对蒽环类药物敏感性的方法，即在胰腺癌细胞的培养基中加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

例如，在对胰腺癌细胞的培养基中加入蒽环类药物之前，加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

本发明的实施例中，列举了以siRNA作为神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

本发明还提供了上述药物组合物的应用，即将该药物组合物用于抑制胰腺癌细胞生长。

在胰腺癌细胞的培养基中加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂和蒽环类药物，能够明显抑制胰腺癌细胞增殖，尤其是明显促进胰腺癌细胞的凋亡进程。

本发明中，神经元分化相关基因即BRSK2（NCBI中氨基酸的序列号为AF533880，核苷酸的序列号为AAP97727）。

在本发明中，术语“神经元分化相关基因BRSK2”指编码具有BRSK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列号为AAP97727的序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出神经元分化相关基因BRSK2的序列。

获得了BRSK2基因序列后，就可以将BRSK2基因序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。一旦获得了含有BRSK2基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。

本发明的BRSK2可以作为靶标，筛选获得抑制BRSK2活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤：

A选择候选化合物；

B提供检测BRSK2表达或者活性的体系；

C用BRSK2的检测体系选择候选化合物；

D确定BRSK2表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。

所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反义寡核苷酸、核酶或者与BRSK2核苷酸序列互补的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗体、互作蛋白等；小分子化合物则包括天然和人工的合成的。

作为靶标的除了BRSK2蛋白，还可以是BRSK2基因、BRSK2的mRNA、BRSK2的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述“特异性片断”是指可以区别本发明的BRSK2与其它基因的片断。

利用本发明的BRSK2，通过各种常规筛选方法，可筛选出与其发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与BRSK2发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。

本发明的BRSK2及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人BRSK2蛋白的抑制剂为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人BRSK2可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的BRSK2还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人BRSK2蛋白抑制剂被用作药物时，可将治疗有效剂量的该抑制剂施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明中，所述的抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物包括有效治疗量的BRSK2抑制剂、有效治疗量的蒽环类化合物和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。

本发明还涉及BRSK2的特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人BRSK2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人BRSK2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人BRSK2蛋白活性的分子，也包括那些并不影响人BRSK2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人BRSK2基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人BRSK2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达BRSK2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人BRSK2功能的抗体以及不影响人BRSK2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人BRSK2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人BRSK2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明提供了一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物，所述的药物组合物包括神经分化相关基因BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。在神经分化相关基因BRSK2的抑制剂的作用下，加入蒽环类药物后，胰腺癌细胞的存活率降低，增殖速度减缓，凋亡细胞比例增加。

更重要的是，由本发明的获得的药物有高度的特异性。普通的胰腺癌的药物会有一系列的副作用，究其原因，在于该药物对于各种组织和细胞都有杀伤作用。而本发明的BRSK2在人脑和胰腺组织中高丰量特异性表达。这就意味着根据本发明获得的药物只在脑或者胰腺中起作用，而且仅仅对与脑和胰腺中与BRSK2相关的信号途径有作用。众所周知，脑部有血脑屏障，大多数药物因为无法通过血脑屏障而无法对脑部产生作用。于是，本发明获得的药物在大多数情况下只对胰腺、尤其是胰腺中与BRSK2相关的分子起作用。而BRSK2在胰腺癌中的表达量又明显高于癌旁组织，因此，本发明的药物将主要针对胰腺癌细胞起作用。

因此，本发明为寻找有效的治疗胰腺癌的药物提供一种全新的、特异的、敏感的、低副作用的方法和途径。

附图说明

图1：BRSK2western杂交图。

可见，BRSK2主要在脑及胰腺中表达。

图2：BRSK2在胰腺癌的免疫组化图。

可见，BRSK2在胰腺癌组织的表达高于癌旁组织。

图3：BRSK2的组织芯片图。

统计结果显示，BRSK2在胰腺癌芯片中的表达高于癌旁组织。

图4：多种胰腺癌细胞内源BRSK2蛋白western blot检测。

结果显示，BRSK2在多种胰腺癌细胞中有较高的表达量。

图5：有效消减BRSK2的片段的确定。

图6：siRNA作用下，加入阿霉素后PANC-1细胞的存活率。

图7：图6的折线图。siRNA-1与siRNA-2的折线趋势一致，几乎重合。

可见，siRNA作用下，PANC-1细胞对阿霉素的敏感性增加，存活率下降。

图8：siRNA作用下，加入柔红霉素后PANC-1细胞的存活率。

图9：图8的折线图。

可见，siRNA作用下，PANC-1细胞对柔红霉素的敏感性增加，存活率下降。

图10：siRNA作用下，加入阿霉素后Miapaca-2细胞的存活率。

图11：图10的折线图。

可见，siRNA作用下，Miapaca-2细胞对阿霉素的敏感性增加，存活率下降。

图12：siRNA作用下，加入柔红霉素后Miapaca-2细胞的存活率。

图13：图12的折线图。

可见，siRNA作用下，Miapaca-2细胞对柔红霉素的敏感性增加，存活率下降。

图14：siRNA作用下，加入柔红霉素后PANC-1细胞的凋亡图。

其中，左边的柱状图与右边三幅subG1的曲线图相对应。可见，siRNA作用下，加入柔红霉素后PANC-1细胞的subG1期细胞比例增加，凋亡细胞增加。

图15：siRNA作用下，加入阿霉素后PANC-1细胞的凋亡图。

其中，左边的柱状图与右边三幅subG1的曲线图相对应。可见，siRNA作用下，加入阿霉素后PANC-1细胞的subG1期细胞比例增加，凋亡细胞增加。

具体实施方式

实施例1BRSK2在胰腺中Northern杂交表达

具体步骤是：

1.1cDNA探针制备与纯化

(1)用BRSK2基因的特异的引物从构建好并已经测序的质粒中扩增得到PCR产物。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后，用GeneQuant II型紫外分光光度计测定纯化后DNA的浓度。

(2)DNA模板经100℃热变性2min后，用随机引物标记试剂盒以随机引物标记法掺入【α-32P】dCTP。标记反应结束后，加入EDTA至终浓度20mmol/L中止反应，100℃热变性5min，置于冰上。

(3)将探针用MicroSpin G-25纯化柱纯化。纯化前后分别取样1μl稀释100倍，取3μl稀释液点样在Whatman DE81滤纸上，用Monitor900型放射性检测仪测定其放射强度（cps）。将纯化后的放射性强度除以纯化前的放射性强度记为掺入率，掺入率大于30％则认为探针制备合格。

1.2Northern印迹膜杂交：

(1)将杂交膜用2×SSC液润湿后将膜带RNA的一面朝上放入杂交管中，每10cm2膜面积加入1ml甲酰胺预杂交液，预杂交液含50％甲酰胺，5×SSPE，10×Denhardt试剂，2％SDS,1000mg/L小牛胸腺DNA。42℃预杂交2-4小时。

(2)预杂交结束后，将纯化后的标记探针加入剩余的预杂交液中。42℃杂交48小时。

(3)杂交反应结束后，将杂交液弃去，加入杂交洗脱液1（2×SSC,0.05％SDS）室温洗涤3次，每次30min，其间不停晃动膜。然后加入杂交洗脱液2（0.1×SSC，0.1％SDS），50℃洗涤2次，每次30min。用Monitor900型放射性检测仪测定整张膜上的放射强度。如果背景的放射强度过高，可以适当提高洗膜温度再次洗涤。

(4)将洗涤完毕的膜放入保鲜袋中封口，进行放射自显影。

从Northern的结果中我们可以看到，BRSK2主要在脑和胰腺中表达，尤其以胰腺中的表达量为最高。

实施例2免疫组化分析BRSK2在胰腺癌组织的表达

1)样品处理：

取大小适中的组织块，一般为2.5cm×2.5cm×0.2cm。组织用4%多聚甲醛进行固定，固定时间最好在12小时内，一般固定时间不应超过24小时。

2)组织脱水、透明、浸蜡：

组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极

易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水1h×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

3)切片：

将石蜡包埋后的组织块进行切片，用42℃水浴锅平铺后用铺有多聚左旋赖氨酸的载玻片捞出，70℃烘箱烘干2小时。

4)脱蜡染色：

将切片脱蜡水冲后，用PBS洗，5min/次×3，再用3%H2O室温处理5-10min，然后蒸馏水洗3次，用柠檬酸缓冲液中火微波2min进行抗原修复后，血清封闭30min，加一抗BRSK2或者PCTAIRE-1抗体室温孵育2h或者4℃孵育过夜。PBS清洗，5min×3，加生物素化兔二抗37℃孵育30min，PBS清洗5min×3，滴加生物素SABC，37℃孵育30min，PBS清洗5min×4后，用DAB显色液显色。

5)封片。

结果显示，BRSK2在胰腺癌组织中的表达量较癌旁组织明显增加。

实施例3组织芯片分析BRSK2的在胰腺癌与正常胰腺组织的分布

将不同来源的胰腺癌样本以及正常胰腺样本制作成组织芯片,以细胞被染上棕黄色作为阳性标准。评分体系分为0～3分，无色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。以0,1分为阴性，2,3分为阳性。每组样本打3次分，按照阳性阴性分别计分。统计结果为27例肿瘤样本中有25例为BRSK2阳性（96.2%），2例为BRSK2阴性（3.8%）；23例正常外分泌胰腺组织中，有2例为BRSK2阳性（8.7%），21例为BRSK2阴性（91.3%）。Gradpad Prism软件卡方检验显示胰腺癌与BRSK2表达显著相关(P<0.001)。

结果显示，与实施例2的结果一致，BRSK2在胰腺癌组织中的表达量较癌旁组织明显增加。

实施例4多种胰腺癌细胞内源BRSK2蛋白western blot检测

4.1各种胰腺癌细胞蛋白样本的收集

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。(PANC-1细胞培养在含10%Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养基中，Miapaca-2，Aspc-1培养在10%Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养基中，Bxpc-3培养在含10%PAA胎牛血清的1640培养基中)

(2)收集相同数目的胰腺癌细胞，加入适量1X蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min。

(5)4℃,12,000rpm离心5min，上清即可用于上样。

4.2Western检测各种胰腺癌细胞系中BRSK2的内源表达

(1)配制SDS-PAGE分离胶和积层胶。

(2)凝胶的灌注（流程如下）

灌注分离胶-→加无水乙醇去气泡-→室温放置等待聚合-→倒去无水乙醇-→用蒸馏水洗干净凝胶顶部，吸干-→灌注积层胶-→马上在积层胶溶液中插入梳子-→等待聚合完全，拔出梳子-→将凝胶固定于电泳装置上，上下电极中加入电泳缓冲液。

(3)将准备好的样品上样。

(4)室温150V电压下进行电泳，至蛋白Marker内的染料前沿到达凝胶底部。

(5)卸胶，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜20分钟。

(6)在4℃下用湿式电转移仪恒压100V,1小时，每块凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

(7)硝酸纤维素膜在37℃下浸在5％脱脂奶粉溶液中缓慢摇动，封闭1小时。

(8)加入一抗，37℃温育1-2小时。

(9)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中轻轻摇动，洗涤10分钟，这样再重复两次。

(10)加入二抗，37℃温育1小时。

(11)同步骤9洗膜三次。

(12)用ECL系统进行发光。

(13)暗室压片、显影、定影。

Western的结果与前面Northern的结果一致，BRSK2在多株胰腺癌细胞系中均有表达。

实施例5有效消减BRSK2的siRNA片段的确定

siRNA（上海吉玛制药技术有限公司），序列见下：

siRNA-1:5'-CAU CCG CAU CGC AGA CUU Udtdt-3'(sense)（SEQ ID NO 1）

5'-AAA GUC UGC GAU GCG GAU Gdtdt-3'(antisense)（SEQ ID NO 2）

siRNA-2:5'-GCU AGA GCA CAU UCA GAA Adtdt-3'(sense)（SEQ ID NO 3）

5'-UUU CUG AAU GUG CUC UAG Cdtdt-3'(antisense)（SEQ ID NO 4）

1）将PANC-1细胞以3×10⁴个/孔的密度接种在12孔板上，将细胞放入CO₂培养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到30-40%。

2)用Invitrogen lipofectamine2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染Nonsilence3μl（siRNA干扰的阴性对照），siRNA-13μL、siRNA-23μL（每μl的浓度为20μM）。每种转染重复3个孔。

3)转染后16小时，换成完全培养基（DMEM高糖培养基+15%胎牛血清）继续培养24-48小时。

4)SDS Loading Buffer裂解细胞蛋白样本，western-blot检测内源BRSK2干扰程度，发现内源BRSK2干扰效果有70%以上，说明两个片段都是有效的。

在Miapaca-2细胞中重复上述实验，结果表明，siRNA-1和siRNA-2在Miapaca-2细胞中同样有效消减BRSK2。

实施例6消减BRSK2的胰腺癌细胞系在化疗药物阿霉素处理下的存活降低

两个不同siRNA片段（siRNA-1和siRNA-2）消减BRSK2的胰腺癌细胞PANC1，Miapaca-2以及对照组细胞以2000个每孔接种于96孔板，等细胞过夜贴壁完全后，加入不同剂量的化疗药物阿霉素同时各留出一组细胞只加正常培养基。处理48小时后，吸出培养基，加入CCK-8：无血清培养基=1：10的混合反应液，将细胞放入37度细胞培养箱培养2个小时后，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值。以加药组细胞的OD值除以正常培养基细胞的OD值，得出的比值即为该组细胞在阿霉素（Sigma-Aldrich公司，货号D1515）处理下的存活率。

结果显示，在siRNA片段（siRNA-1或者siRNA-2）消减了BRSK2的胰腺癌细胞PANC1中，加入阿霉素，胰腺癌细胞PANC-1的存活率明显降低。

在胰腺癌细胞Miapaca-2中，重复上述试验，即利用siRNA-1或者siRNA-2消减了BRSK2后，加入阿霉素，胰腺癌细胞Miapaca-2的存活率也明显降低。

实施例7消减BRSK2的胰腺癌细胞系在柔红霉素处理下的存活降低

按照实施例6的步骤，只是用柔红霉素（Sigma-Aldrich公司，货号D8809）代替阿霉素。

结果显示，在siRNA片段（siRNA-1或者siRNA-2）消减了BRSK2的胰腺癌细胞PANC1中，加入柔红霉素，胰腺癌细胞PANC1的存活率明显降低。

在胰腺癌细胞Miapaca-2中，重复上述试验，即利用siRNA-1或者siRNA-2消减了BRSK2后，加入柔红霉素，胰腺癌细胞Miapaca-2的存活率也明显降低。

实施例8细胞凋亡（Sub-G1期）测定

1)转染前一天，PANC-1以3-4×10⁴个/孔的密度种植在6孔板中，第二天运用脂质体转染方法将分别转染Nonsilence3μl（siRNA干扰的阴性对照），siRNA-13μL、siRNA-23μL（每μl的浓度为20μM）。每种转染重复3个孔，转染入换液后的PANC-1细胞。

2)转染后48小时后用胰酶消化细胞，收获细胞于流式细胞仪样品管中。

3)PBS清洗1-2次，室温离心1000rpm，5min，弃上清。

4)以-20℃预冷的75%乙醇-20℃固定2hr-24hr。

5)PBS清洗1-2次，室温离心1000rpm，5min，弃上清。

6)加入PI（终浓度50ug/ml）和RNAase（终浓度100ug/ml），细胞量多，用400μl重悬，细胞量少，用200μl重悬，室温暗处反应20min以上。

7)流式细胞仪分析（PI染色后3hr内完成）。

结果显示，在siRNA片段（siRNA-1或者siRNA-2）消减了BRSK2的胰腺癌细胞PANC1中，加入阿霉素，胰腺癌细胞PANC-1的凋亡率由15%左右上升到25%左右，明显增加，具有统计学差别。

同样的操作，加入柔红霉素胰腺癌细胞PANC-1的凋亡率由30%左右增加到50%左右，上升趋势明显。

本发明所用的实验材料、设备及试剂

1.胰腺癌细胞株PANC-1

物种:    人类

来源:    ATCC

组织：    胰腺导管癌

2.胰腺癌细胞株Miapaca-2

物种:    人类

来源:    中国科学院细胞库,上海岳阳路328号

组织：   胰腺癌

3.主要的仪器设备

SW-CJ-1FD型净化工作台(吴江市金晓空调净化有限公司)

TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂)

HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教器材厂)

FACS Calibur型流式细胞仪（BD公司）

微量加样器：1000μl/200μl/20μl(Gilson公司)

超速离心机(Heraeus和Beckman公司)

Microplate Reader（medel550）(Bio-RAD公司）

4.抗体：

Anti-β-actin monoclonal antibody(Sigma公司)

羊抗兔IgG-HRP（Calbiochem公司）

5.相关试剂

蛋白标准分子量(上海西巴斯生物技术开发公司)

硝酸纤维素膜(AMERSHAM公司)

新生小牛血清和胎牛血清（GIBICO公司）

胰蛋白酶（上海华美生物工程公司）

细胞培养基:RPIM1640(GIBICO)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）(GIBICO公司)

G418(Sigma公司)

6.试剂盒

小鼠血清ELISA试剂盒（R&D公司），进口分装

MTS试剂盒（PROMEGA公司）

ECL显色试剂盒：（Santa Cruze公司）

7.试剂配方

7.1SDS-PAGE和western blotting

SDS-PAGE胶配方：

5×Tris-Gly电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g Gly,50ml10%SDS,加水至1L。

2×SDS-PAGE上样缓冲液：2.0ml0.5M Tris-HCl，2.0ml甘油，2.0ml，20%(W/V)SDS，0.5ml0.1%（W/V）溴酚蓝，1.0mlβ-巯基乙醇，2.5mlddH2O。

SDS-PAGE染色液：90ml甲醇：水（1:1，V/V）；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250。

SDS-PAGE脱色液：90ml甲醇：水（1:1，V/V）；10ml冰乙酸。

TBS:12.1g Tris，9g Nacl用100ml水溶后调PH到7.4,定容到1L。

TBST（洗涤缓冲液）：含0.2%Tween-20的TBS。

封闭缓冲液:含5%的脱脂奶粉的洗涤缓冲液。

丽春红染色液：0.5g丽春红中加入1ml冰醋酸，溶解后再加入100ml水。

7.2细胞用：

1×PBS：Na2HPO4·12H2O3.63g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH2PO40.24g用

0.1N NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1L，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

EDTA试剂：0.2g EDTA溶解于1×PBS中。

细胞冻存液：90%的完全培养基加5%的DMSO,10%相应血清。

裂解缓冲液（储备）：5×PBS100ml；0.5M EDTA5ml；Triton X-1002.5ml用ddH2O定容至500ml。4℃储存。

裂解缓冲液（实际用液）：在裂解缓冲液（储备）中加入0.1mM的PMSF，10μM的pepstainA，10μM的leupeptin和25μg/ml aprotinin。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学

 

<120>  一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物及其应用

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

 

<210>  1

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成

 

 

<400>  1

cauccgcauc gcagacuuu                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成 

 

 

<400>  2

aaagucugcg augcggaug                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

gcuagagcac auucagaaa                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

uuucugaaug ugcucuagc                                                  19

Claims (10)

1.一种抑制胰腺癌细胞增殖的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括神经分化相关基因BRSK2的抑制剂和蒽环类药物。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂是BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂是神经分化相关基因BRSK2的siRNA。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，神经分化相关基因BRSK2的siRNA与蒽环类药物的比例范围为：siRNAs:蒽环类药物=2:1—1:500，摩尔比。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的蒽环类药物是柔红霉素或者阿霉素。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有药学上有效量的神经分化相关基因BRSK2的抑制剂和药学上有效量的蒽环类药物以及药学上可接受的载体。

7.一种增强体外胰腺癌细胞对蒽环类药物敏感性的方法，其特征在于，在胰腺癌细胞的培养基中加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在对胰腺癌细胞的培养基中加入蒽环类药物之前，加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂。

9.权利要求1所述的药物组合物的应用，其特征在于，将该药物组合物用于抑制胰腺癌细胞生长。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在胰腺癌细胞的培养基中加入神经分化相关基因BRSK2的蛋白表达量或者蛋白活性的抑制剂和蒽环类药物，能够明显促进胰腺癌细胞的凋亡进程。

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