CN103357025A - Brsk2在制备抑制胰腺癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药及基因工程领域，涉及神经分化相关基因BRSK2的新用途。本发明提供了BRSK2在制备胰腺癌药物中的作用。具体而言，BRSK2可以作为筛选和制备胰腺癌治疗药物的药靶。BRSK2能够促进胰腺癌生长，降低胰腺癌组织的坏死率；而抑制BRSK2能够明显抑制胰腺癌细胞增殖，大大提高胰腺癌组织的坏死率；因此，抑制BRSK2就能够有效抑制胰腺癌的发生发展。而且BRSK2在人脑和胰腺组织中高丰量特异性表达。因此，本发明为寻找有效的治疗胰腺癌的药物提供一种全新的、特异的、高效的、低副作用的方法和途径。

Description

BRSK2在制备抑制胰腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及神经极性分化相关基因——BRSK2的一种新用途。

背景技术

胰腺癌是由胰腺癌上皮恶变形成的恶性肿瘤，虽然其发病率仅排名恶性肿瘤的第13位，但是其致死率却在恶性肿瘤中位列第8位。根据世界卫生组织的统计，全世界每年有216 000多人确诊为胰腺癌。在我国该癌症发病率原很低，但近年也呈现逐年增多的趋势，近年来已经升至第5位。即使现在有化疗、放疗、手术等多种治疗方法，胰腺癌的生存率仍然不到5％。因为在出现初级症状时就已经伴有转移现象，所以被确认为胰腺癌时往往已经是临床晚期。因此只有10％的患者能够接受手术，而辅助疗法基本已经无能为力。造成胰腺癌的死亡率基本上与其发生率持平，五年生存率仅有5％。

AMP-活性相关激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一个高度保守的丝氨酸苏氨酸激酶，当细胞内能量下降时，AMPK经由其上游的激酶激活其催化区域的172位丝氨酸的磷酸化而被活化，因此又被称为能量变化感应器。根据AMPK激酶结构域氨基酸的保守性，Manning等人将BRSK1，BRSK2，AMPK等13个激酶归于AMPK亚家族。BRSK2是由申请人最早克隆出来的一个基因，刚开始认为其只在脑中表达，故起名为脑特异表达激酶2(Brain-specifickinase 2，BRSK2)，后来发现其不仅仅存在于脑里，在胰腺中也有表达。

BRSK2是申请人利用重要结构域同源筛选策略EST电子克隆技术，首先克隆并提交的新基因。前期对BRSK2的研究主要集中在它们在神经极化、突触形成以及递质释放等过程中起到的应用。小鼠中BRSK2的同源基因被命名为SAD-A以及SAD-B，单突变BRSK2的动物模型表型正常，但是双突变BRSK2的模型动物在出生后两个小时就死亡，解剖发现动物的大脑皮层比正常的要薄得多，并且神经元缺乏轴突以及树突。一个可能的机制是SAD通过磷酸化Tau，引起MAPs与微管蛋白结合不紧密，造成微管蛋白不能正常形成，最终对轴突形成造成影响。另外有研究表明，人的BRSK2是新的突触小泡和活动机制相关蛋白激酶，通过磷酸化其活动区蛋白和小泡引发因子RIM1，达到调节神经递质释放的功能。最新研究表明，除了在神经系统的中心起到调节神经极化、轴突树突形成等起到作用，BRSK2还能特异地定位于肌肉神经节点处，控制神经递质在周围神经系统的释放。

发明内容

本发明的目的是提供一种与神经分化极性相关的基因BRSK2的新作用，即其在制备胰腺癌药物中的作用。

本发明提供了神经元分化相关基因BRSK2(NCBI中氨基酸的序列号为AF533880，核苷酸的序列号为AAP97727)在制备胰腺癌药物中的应用。

实验表明，神经分化相关基因BRSK2可以作为体外筛选或者制备抑制胰腺癌的药物的药靶。

本发明通过对BRSK2的研究发现，BRSK2在正常人的脑和胰腺中有高表达，而通过免疫组化的方法对正常胰腺和胰腺癌组织的研究发现，BRSK2在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，组织芯片的结果进一步支持了该结论。采用蛋白质印迹技术在细胞学水平上检测多种胰腺癌癌细胞中BRSK2的表达，结果显示BRSK2在多株胰腺癌细胞中均有表达，该实验结果进一步证实了BRSK2在胰腺癌中有高表达。BRSK2能够促进胰腺癌生长，降低胰腺癌组织的坏死率；而抑制BRSK2能够抑制胰腺癌细胞增殖，大大提高胰腺癌组织的坏死率；因此，抑制BRSK2就能够有效抑制胰腺癌的发生发展，BRSK2可以作为筛选抑制胰腺癌的药物的药靶。

本发明还利用BRSK2成功的筛选到其抑制剂。以siRNA为例。选用有效干扰BRSK2蛋白表达的小RNA干扰PANC-1内源BRSK2之后，细胞在能量压力(糖饥饿)条件下的存活要低于对照组，裸鼠成瘤实验进一步证明了干扰BRSK2的PANC-1细胞的存活要低于未干扰BRSK2的细胞。由以上结果可认为BRSK2是胰腺癌细胞在恶劣条件下存活的重要调节基因，干扰BRSK2可以引起胰腺癌细胞在糖饥饿条件下的生长受到抑制。这进一步证明，BRSK2可以作为筛选抑制胰腺癌的药物的药靶。

所述的BRSK2的抑制剂，或者抑制胰腺癌的药物，包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的核酸、肽段或者小分子化合物。

所述的抑制胰腺癌的药物包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的DNA或者RNA。

相应的，本发明提供了一种筛选抑制胰腺癌的药物的试剂盒，所述的试剂盒含有神经分化相关基因BRSK2。该试剂盒还可含有检测蛋白活力所需的其他试剂，例如缓冲液、分子量标记等及使用说明。该试剂盒中还可以包含检测蛋白活性所用的底物等试剂。

本发明还提供了一种筛选抑制胰腺癌的药物的方法，即体外测定对神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的影响，抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的物质为抑制胰腺癌的药物或者抑制胰腺癌药物的候选药物。

所述的测定方法可以包括如下步骤：

(1)加入待测物质；

(2)检测神经分化相关基因BRSK2的表达量；

(3)降低神经分化相关基因BRSK2的表达量的待测物质为抑制胰腺癌药物的候选药物。

所述的测定方法也可以包括如下步骤：

(a)加入待测物质；

(b)检测神经分化相关基因BRSK2的活性；

(c)降低神经分化相关基因BRSK2的活性的待测物质为抑制胰腺癌药物的候选药物。

所述的待测物质可以是抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的核酸、肽段、小分子化合物或者其混合物。

本发明的BRSK2蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可将BRSK2基因表达为蛋白而得。

本发明的BRSK2基因可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的BRSK2基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的BRSK2核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

在本发明中，术语“神经元分化相关基因BRSK2”指编码具有BRSK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列号为AAP97727的序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出神经元分化相关基因BRSK2的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与AAP97727开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与AAP97727开放阅读框序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码序列号为AF533880氨基酸序列的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

获得了BRSK2基因序列后，就可以将BRSK2基因序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。一旦获得了含有BRSK2基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。

在本发明中，术语“BRSK2蛋白”指可促进胰腺癌生存或者生长的BRSK2多肽。该术语还包括各种BRSK2变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人BRSK2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人BRSK2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人BRSK2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人BRSK2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人BRSK2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人BRSK2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供人BRSK2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人BRSK2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明中，术语“活力”是指单位体积中，BRSK2促进胰腺癌生存或者生长的能力，亦可理解为单位体积BRSK2表达量与活性的乘积。

本发明的另一种试剂盒中，包括神经元分化相关基因BRSK2的扩增引物。它含有特异性扩增人BRSK2的引物对和使用说明。该试剂盒还可含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自BRSK2的序列，长度为15-35。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有BRSK2的核酸序列及其数量。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。

此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于BRSK2的基因组序列将不产生扩增产物。

本发明的另一种试剂盒中，包括神经元分化相关基因BRSK2的反义核酸。该试剂盒还可含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂及使用说明。

上述反义核酸可以是指一种用作探针的核酸分子，该分子通常具有人BRSK2多肽编码序列互补序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人BRSK2的核酸分子。用于检测人BRSK2核苷酸序列时，具体步骤包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人BRSK2多肽的编码序列互补序列，并可位于该编码序列互补序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

本发明的BRSK2可以作为靶标，筛选抑制BRSK2活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤：A选择候选化合物；B提供检测BRSK2表达或者活性的体系；C用BRSK2的检测体系选择候选化合物；D确定BRSK2表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。

所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反义寡核苷酸、核酶或者与BRSK2核苷酸序列互补的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗体、互作蛋白等；小分子化合物则包括天然和人工的合成的。

作为靶标的除了BRSK2蛋白，还可以是BRSK2基因、BRSK2的mRNA、BRSK2的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述“特异性片断”是指可以区别本发明的BRSK2与其它基因的片断。

利用本发明的BRSK2，通过各种常规筛选方法，可筛选出与其发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与BRSK2发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。

本发明的BRSK2及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人BRSK2蛋白的抑制剂为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人BRSK2可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的BRSK2还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人BRSK2蛋白抑制剂被用作药物时，可将治疗有效剂量的该抑制剂施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明中，所述的胰腺癌药物是由含有效治疗量的BRSK2抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。

本发明的另一种试剂盒中，包括神经元分化相关基因BRSK2的抗体。该试剂盒还可含有缓冲液、抗原抗体反应相关的其它试剂及使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中BRSK2蛋白的数量以及含有BRSK2蛋白的活性。

该试剂盒中含有BRSK2的特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人BRSK2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人BRSK2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人BRSK2蛋白活性的分子，也包括那些并不影响人BRSK2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人BRSK2基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人BRSK2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达BRSK2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人BRSK2功能的抗体以及不影响人BRSK2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人BRSK2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人BRSK2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明提供了的人BRSK2的新用途，即其在制备胰腺癌药物中的作用。具体而言，BRSK2可以作为筛选和制备胰腺癌治疗药物的药靶。BRSK2能够促进胰腺癌生长，降低胰腺癌组织的坏死率；而抑制BRSK2能够抑制胰腺癌细胞增殖，大大提高胰腺癌组织的坏死率；因此，抑制BRSK2就能够有效抑制胰腺癌的发生发展。

更重要的是，由本发明的获得的药物有高度的特异性。普通的胰腺癌的药物会有一系列的副作用，究其原因，在于该药物对于各种组织和细胞都有杀伤作用。而本发明的BRSK2在人脑和胰腺组织中高丰量特异性表达。这就意味着根据本发明获得的药物只对脑或者胰腺起作用，而且仅仅对与脑和胰腺中与BRSK2相关的信号途径有作用。众所周知，脑部有血脑屏障，大多数药物因为无法通过血脑屏障而无法对脑部产生作用。于是，本发明获得的药物在大多数情况下只对胰腺、尤其是胰腺中与BRSK2相关的分子起作用。

因此，本发明为寻找有效的治疗胰腺癌的药物提供一种全新的、特异的、高效的、低副作用的方法和途径。

附图说明

图1：BRSK2 western杂交图。

可见，BRSK2主要在脑及胰腺中表达。

图2：BRSK2在胰腺癌的免疫组化图。

可见，BRSK2在胰腺癌组织的表达高于癌旁组织。

图3：BRSK2的组织芯片图。

统计结果显示，BRSK2在胰腺癌芯片中的表达高于癌旁组织。

图4：多种胰腺癌细胞内源BRSK2蛋白western blot检测。

结果显示，BRSK2在多种胰腺癌细胞中有较高的表达量。

图5：有效消减BRSK2的片段的确定。

图6：无糖条件下用MTT检测过表达BRSK2的PANC-1细胞的存活。

图7-8：无糖条件下用MTT检测消减BRSK2的PANC-1细胞的存活。

可见，过量表达BRSK2的PANC-1细胞存活增多，消减BRSK2可以使胰腺导管癌细胞PANC-1在无糖条件下的存活下降。

图9：稳定消减BRSK2的小鼠成瘤实验。

可见，稳定表达BRSK2的小鼠成瘤的坏死率低于对照组，消减BRSK2的PANC-1在小鼠体内成瘤的坏死率要高于对照组。

具体实施方式

实施例1 Western检测小鼠各组织中BRSK2的内源表达

(1)配制SDS-PAGE分离胶和积层胶。

(2)凝胶的灌注(流程如下)

灌注分离胶-→加无水乙醇去气泡-→室温放置等待聚合-→倒去无水乙醇-→用蒸馏水洗干净凝胶顶部，吸干-→灌注积层胶-→马上在积层胶溶液中插入梳子-→等待聚合完全，拔出梳子-→将凝胶固定于电泳装置上，上下电极中加入电泳缓冲液。

(3)将准备好的样品上样。

(4)室温120V电压下进行电泳，至蛋白Marker内的染料前沿到达凝胶底部。

(5)卸胶，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜20分钟。

(6)在4℃下用湿式电转移仪恒压100V，2小时，每块凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

(7)硝酸纤维素膜在37℃下浸在5％脱脂奶粉溶液中缓慢摇动，封闭1小时。

(8)加入一抗，37℃温育1-2小时。

(9)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中轻轻摇动，洗涤10分钟，这样再重复两次。

(10)加入二抗，37℃温育1小时。

(11)同步骤9洗膜三次。

(12)用ECL系统进行发光。

(13)暗室压片、显影、定影。

Western的结果显示，BRSK2在小鼠中主要在脑和胰腺表达。

实施例2免疫组化分析BRSK2在胰腺癌组织的表达

1)样品处理：

取大小适中的组织块，一般为2.5cm×2.5cm×0.2cm。组织用4％多聚甲醛进行固定，固定时间最好在12小时内，一般固定时间不应超过24小时。

2)组织脱水、透明、浸蜡：

组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极

易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水1h×3次，二甲苯透明1h×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

3)切片：

将石蜡包埋后的组织块进行切片，用42℃水浴锅平铺后用铺有多聚左旋赖氨酸的载玻片捞出，70℃烘箱烘干2小时。

4)脱蜡染色：

将切片脱蜡水冲后，用PBS洗，5min/次×3，再用3％H2O室温处理5-10min，然后蒸馏水洗3次，用柠檬酸缓冲液中火微波2min进行抗原修复后，血清封闭30min，加一抗BRSK2或者PCTAIRE-1抗体室温孵育2h或者4℃孵育过夜。PBS清洗，5min×3，加生物素化兔二抗37℃孵育30min，PBS清洗5min×3，滴加生物素SABC，37℃孵育30min，PBS清洗5min×4后，用DAB显色液显色。

5)封片。

实施例3组织芯片分析BRSK2的在胰腺癌与正常胰腺组织的分布

将不同来源的胰腺癌样本以及正常胰腺样本制作成组织芯片，以细胞被染上棕黄色作为阳性标准。评分体系分为0～3分，无色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。以0，1分为阴性，2，3分为阳性。每组样本打3次分，按照阳性阴性分别计分。统计结果为27例肿瘤样本中有25例为BRSK2阳性(96.2％)，2例为BRSK2阴性(3.8％)；23例正常外分泌胰腺组织中，有2例为BRSK2阳性(8.7％)，21例为BRSK2阴性(91.3％)。Gradpad Prism软件卡方检验显示胰腺癌与BRSK2表达显著相关(P＜0.001)。

实施例4多种胰腺癌细胞内源BRSK2蛋白western blot检测

4.1各种胰腺癌细胞蛋白样本的收集

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。(PANC-1细胞培养在含10％Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养基中，Miapaca-2，Aspc-1培养在10％Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养基中，Bxpc-3培养在含10％PAA胎牛血清的1640培养基中)

(2)收集相同数目的胰腺癌细胞，加入适量1X蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min。

(5)4℃，12,000rpm离心5min，上清即可用于上样。

4.2Western检测各种胰腺癌细胞系中BRSK2的内源表达

(1)配制SDS-PAGE分离胶和积层胶。

(2)凝胶的灌注(流程如下)

灌注分离胶-→加无水乙醇去气泡-→室温放置等待聚合-→倒去无水乙醇-→用蒸馏水洗干净凝胶顶部，吸干-→灌注积层胶-→马上在积层胶溶液中插入梳子-→等待聚合完全，拔出梳子-→将凝胶固定于电泳装置上，上下电极中加入电泳缓冲液。

(3)将准备好的样品上样。

(4)室温150V电压下进行电泳，至蛋白Marker内的染料前沿到达凝胶底部。

(5)卸胶，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜20分钟。

(6)在4℃下用湿式电转移仪恒压100V，2小时，每块凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

(7)硝酸纤维素膜在37℃下浸在5％脱脂奶粉溶液中缓慢摇动，封闭1小时。

(8)加入一抗，37℃温育1-2小时。

(9)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中轻轻摇动，洗涤10分钟，这样再重复两次。

(10)加入二抗，37℃温育1小时。

(11)同步骤9洗膜三次。

(12)用ECL系统进行发光。

(13)暗室压片、显影、定影。

Western的结果与前面人体组织的western结果一致，BRSK2在多株胰腺癌细胞系中均有表达。

实施例5有效消减BRSK2的siRNA片段的确定

公司合成的siRNA，序列见下：

siRNA-1：5’-CAU CCG CAU CGC AGA CUU Udtdt-3’(sense)

5’-AAA GUC UGC GAU GCG GAU Gdtdt-3’(antisense)

siRNA-2：5’-GCU AGA GCA CAU UCA GAA Adtdt-3’(sense)

5’-UUU CUG AAU GUG CUC UAG Cdtdt-3’(antisense)

1)将PANC-1细胞以1×10⁵个/孔的密度接种在12孔板上，将细胞放入CO₂培养箱中37℃培养18-24小时，使细胞丰度达到70-80％。

2)用Invitrogen lipofectamine 2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染Nonsilence3μl(siRNA干扰的阴性对照)，siRNA-1 3μL、siRNA-2 3μL(每μl的浓度为20μM)。每种转染重复3个孔。

3)转染后16小时，换成完全培养基(DMEM高糖培养基+15％胎牛血清)继续培养24-48小时。

4)SDS Loading Buffer裂解细胞蛋白样本，western-blot检测内源BRSK2干扰程度，发现内源BRSK2干扰效果有70％以上，说明两个片段都是有效的。

实施例6无糖条件下用CCK-8检测不同BRSK2表达量的PANC-1细胞的存活

1)细胞按2×10³/孔的数量接种于96孔板上，每种细胞接种12个孔，6个用正常培养基培养，另外6个用无糖培养基培养，

2)在一定的时间点按1ml无血清培养基加100μl CCK-8试剂的比例配置CCK反应液，每孔加100μl混合溶液，37℃避光反应2h，酶标仪450nm检测细胞浓度，数据分析，

3)将无糖培养基培养细胞测量数值除以正常培养基中培养细胞测量数值，这一比例即为该细胞在该时间点在糖饥饿条件下的存活细胞比率。

实施例7稳定表达不同量的BRSK2小鼠的成瘤实验

1)大量培养检测过的稳定表达细胞株细胞，用胰酶消化细胞，离心1000rpm×5min。

2)无血清培养基洗一遍，用细胞计数板进行计数。

3)用PBS稀释细胞悬液至2x106cells/200μl。

(4)在裸鼠腋下进行皮下接种，一次注射200μl。裸鼠为4-6周龄。

(5)一周后肿瘤长出，接种的裸鼠长出细胞瘤，每隔两天测量肿瘤的长径和短径，按照公式体积＝0.5×长径×短径2，计算瘤体体积。

(6)约4～5周后，经颈椎处死裸鼠后取出瘤体，称量肿瘤重量。

本发明所用的实验材料及试剂

1.主要的仪器设备

SW-CJ-1FD型净化工作台(吴江市金晓空调净化有限公司)

TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂)

HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教器材厂)

FACS Calibur型流式细胞仪(BD公司)

微量加样器：1000μl/200μl/20μl(Gilson公司)

超速离心机(Heraeus和Beckman公司)

Microplate Reader(medel 550)(Bio-RAD公司)

2.胰腺癌细胞株

2.1 PANC-1

物种：人类

来源：ATCC

组织：胰腺导管癌

2.2胰腺癌细胞株Miapaca-2

物种：人类

来源：中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：胰腺癌

2.3胰腺癌细胞株Bxpc-3

来源：中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：胰腺癌

2.4胰腺癌细胞株Aspc-1

来源：中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：胰腺癌

2.5胰腺癌细胞株SW1990

来源：中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：胰腺癌

3.裸鼠实验用动物：

BALB/cA裸小鼠，日龄35-40天，体重18-22g，雌性，SPF级饲养，自由饮水，随意进食。由中国科学院上海药物研究所提供。

4.抗体：

Anti-β-actin monoclonal antibody(Sigma公司)

羊抗兔IgG-HRP(Calbiochem公司)

5.相关试剂

蛋白标准分子量(上海西巴斯生物技术开发公司)

硝酸纤维素膜(AMERSHAM公司)

新生小牛血清和胎牛血清(GIBICO公司)

胰蛋白酶(上海华美生物工程公司)

细胞培养基：RPIM1640(GIBICO)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(GIBICO公司)

G418(Sigma公司)

6.试剂盒

小鼠血清ELISA试剂盒(R&D公司)，进口分装

MTS试剂盒(PROMEGA公司)

ECL显色试剂盒：(Santa Cruze公司)

7.试剂配方

7.1 SDS-PAGE和western blotting

SDS-PAGE胶配方：

5×Tris-Gly电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g Gly，50ml 10％SDS，加水至1L。

2×SDS-PAGE上样缓冲液：2.0ml 0.5M Tris-HCl，2.0ml甘油，2.0ml，20％(W/V)SDS，0.5ml0.1％(W/V)溴酚蓝，1.0ml β-巯基乙醇，2.5ml ddH2O。

SDS-PAGE染色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250。

SDS-PAGE脱色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10ml冰乙酸。

TBS：12.1g Tris，9g Nacl用100ml水溶后调PH到7.4，定容到1L。

TBST(洗涤缓冲液)：含0.2％Tween-20的TBS。

封闭缓冲液：含5％的脱脂奶粉的洗涤缓冲液。

丽春红染色液：0.5g丽春红中加入1ml冰醋酸，溶解后再加入100ml水。

7.2细胞用：

1×PBS：Na2HPO4·12H2O 3.63g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO4 0.24g用0.1N NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1L，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

EDTA试剂：0.2g EDTA溶解于1×PBS中。

细胞冻存液：90％的完全培养基加5％的DMSO，10％相应血清。

裂解缓冲液(储备)：5×PBS 100ml；0.5M EDTA 5ml；Triton X-100 2.5ml用ddH2O定容至500ml。4℃储存。

裂解缓冲液(实际用液)：在裂解缓冲液(储备)中加入0.1mM的PMSF，10μM的pepstainA，10μM的leupeptin和25μg/ml aprotinin。

Claims (11)

1.神经分化相关基因BRSK2在制备抑制胰腺癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，神经分化相关基因BRSK2是体外筛选或者制备抑制胰腺癌的药物的药靶。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制胰腺癌的药物包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的核酸、肽段或者小分子化合物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抑制胰腺癌的药物包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的DNA或者RNA。

5.一种筛选抑制胰腺癌的药物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有神经分化相关基因BRSK2的活性或者表达量的指示剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的指示剂是包括BRSK2的抗体，或者与BRSK2保守型结合的核酸。

7.一种筛选抑制胰腺癌的药物的方法，其特征在于，体外测定对神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的影响，抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的物质为抑制胰腺癌的药物或者抑制胰腺癌药物的候选药物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测定的方法包括如下步骤：

(1)加入待测物质；

(2)检测神经分化相关基因BRSK2的表达量；

(3)降低神经分化相关基因BRSK2的表达量的待测物质为抑制胰腺癌药物的候选药物。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测定的方法包括如下步骤：

(a)加入待测物质；

(b)检测神经分化相关基因BRSK2的活性；

(c)降低神经分化相关基因BRSK2的活性的待测物质为抑制胰腺癌药物的候选药物。

10.如权利要求8或者9所述的方法，其特征在于，所述的待测物质包括抑制神经分化相关基因BRSK2的表达量或者活性的核酸、肽段、小分子化合物或者其混合物。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的测定在胰腺癌细胞中进行。

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