CN102191222B - 一株人子宫内膜样腺癌细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株人子宫内膜样腺癌细胞。该人子宫内膜样腺癌细胞，其名称为LHY-821，保藏登记号为CGMCC№.4066。本发明的LHY-821细胞系细胞形态均一，生长良好，具有贴壁能力强、生长倍增时间44-48h、生物学及遗传学特性稳定的优点。在体内外可用作肿瘤细胞生物学、分子生物学、基因及表观遗传学等方面的研究，以及抗肿瘤新药临床前期的药物疗效研究等，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株人子宫内膜样腺癌细胞。
背景技术
子宫内膜癌是女性生殖道三大肿瘤之一，近年来其发病率不断上升。女性对生命期望值的延长及不断增高的发病率都提示我们揭示其致病机理是亟待解决的问题。人子宫内膜腺癌细胞的分离和纯化，以及其特性的研究，可以为肿瘤机理方面的研究和化疗耐药机制相关研究等做出贡献。相对于子宫内膜癌表型的多样性及肿瘤异质性，目前已建立的细胞系仍然十分有限。如Ishikawa，RL95-2，HEC-1A及KLE等。因此，我们有必要建立较为完备的子宫内膜癌细胞系库，为研究肿瘤异质性提供合适的体外模型。分离出具有形态均一，贴壁性好，细胞倍增时间长，及高致瘤性等稳定生物学特点并具有独特性状的人子宫内膜腺癌细胞将更适合该肿瘤的相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一株人子宫内膜样腺癌细胞。
本发明所提供的人子宫内膜样腺癌细胞，名称为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821。
人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821已于2010年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.4066。
本发明从未经治疗的中分化的子宫内膜癌患者原发灶分离并建立了一株新的细胞系LHY-821。该细胞系具有典型的子宫内膜癌细胞系形态，并具有较好的贴壁性。其细胞倍增时间较长，适合需要长时间处理的内膜癌相关的体外研究，与其他如Ishikawa、HEC-1A及KLE等相比具有侵袭性很弱的独特表型。对于激素受体的检测显示，LHY-821的雌激素受体阴性，孕激素受体阳性，这点与HEC-1-A相似。I型内膜癌的CTNNB1的突变率16.3-77.8％不等，CTNNB1在LHY-821中具有稳定的阳性表达，提示该细胞系可以作为相关机制的研究模型。此外，我们检测了LHY-821对卡铂及紫杉醇的药物敏感性，结果与患者在临床化疗效果一致。但随着代数增加，LHY-821对卡铂产生抗药性，这为化疗抗药性的研究提供了有效的模型；而其对紫杉醇具有稳定的敏感性。鉴于克服化疗抵抗仍是子宫内膜癌治疗中面临的重大难题之一，作为迄今该方面特性鉴定比较全面独特的细胞系，LHY-821有助于新的治疗方法的建立从而提高内膜癌患者的疗效及预后。
总之，本发明的LHY-821细胞系细胞形态均一，生长良好，具有贴壁能力强、生长倍增时间44-48h、生物学及遗传学特性稳定的优点。人子宫内膜腺癌细胞LHY-821形态均一，具有较好的贴壁性，与Ishikawa细胞系相比，细胞倍增时间较长，更适宜进行需要长周期作用的体外研究；其中多条染色体发生异常，12号三体多见，可以进行相应区域基因的研究。与HEC-1A相似，该细胞系ER(-)，PR(+)。LHY-821具有较高的致瘤性，虽然在成瘤实验中见到肌层浸润，但其体外侵袭能力非常弱，其侵袭力远弱于HEC-1A，更适于肿瘤转移机理等方面的研究；LHY-821的P53表达阴性，其可能发生突变或表观遗传学改变，适合做相关方面的研究；LHY-821传到80代出现顺铂耐药性，可以做化疗耐药机制相关研究；而其在培养过程中对紫杉醇一直具有较好的敏感性。
本发明的LHY-821细胞系在体内外可用作肿瘤细胞生物学、分子生物学、基因及表观遗传学等方面的研究，以及抗肿瘤新药临床前期的药物疗效研究等，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066光镜观察结果
图2人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066电镜观察结果
图3人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066生长曲线
图4为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821细胞遗传学染色体核型分析
图5为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第14代细胞DNA含量分析
图6为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第12代细胞免疫组化分析结果
图7为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066致瘤性检测结果照片
图8为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066细胞侵袭力检测结果照片
图9为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代细胞PR蛋白水平检测结果
图10为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代细胞激素敏感性检测结果
图11为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代细胞激素敏感性检测结果
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066的建立及鉴定
一、人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066的建立
临床采集内膜癌患者肿瘤进行子宫内膜癌原代细胞培养，经过14例内膜癌患者肿瘤的消化培养，发现一株能够连续传代的内膜癌细胞系，目前传至82代。该患者为中分化内膜样腺癌，临床病历资料如下所示：
患者病历资料：女50y
冰冻+石蜡：
(右卵巢)中分化内膜样腺癌卵管无显著变，淋巴结未见转移。
ER++，PR+++，EMA+，VIM+，P53-，CA125-。
全子宫及部分阴道切除标本；
免疫组化：ER-，PR散在+，CA125-，Ki67：50％，P53-，bcl_2+。
宫体内膜样腺癌伴坏死：8.3x5cm，侵宫壁＜1/2，侵宫颈1.2cm(2.4)，无脉管癌栓，余净，壁间多发肌瘤。
治疗过程：手术加TP化疗加甲羟孕酮160mg qd，其中TP化疗：卡铂600mg，特素270mg。
原代培养方法：将无菌的子宫内膜癌标本放入培养皿，剪碎，用不含钙、镁的胶原酶I(购自Sigma-Aldrich)于37℃水浴约90分钟，每10分钟震荡；消化产物用100/400μm尼龙细胞筛过滤，以分离子宫内膜癌腺体细胞和间质细胞；子宫内膜癌腺体细胞随后经Ficoll离心去除红细胞；获得的细胞以合适的密度接种于含10％(体积百分含量)胎牛血清、1％(体积百分含量)双抗(青霉素和链霉素，尚柏生物医学技术(北京)有限公司)的DMEM/F12培养基(DMEM/F12培养基购自Sigma-Aldrich，货号：56495C)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，1.5-2小时后取上层液体移入另一培养瓶。当细胞生长至80-90％融合时，用终浓度为0.25％(质量百分含量)胰酶(Trypsin)和0.02％(质量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)1∶4(体积比)混合进行消化25-60秒，用培养液(DMEM/F12购自Sigma-Aldrich，货号：56495C)终止消化，吹打制成细胞悬液，以105个细胞/ml培养液的浓度接种到25cm2的培养瓶中得到人子宫内膜癌细胞原代细胞。人子宫内膜癌细胞原代细胞传代培养方法为：1)取对数生长期的细胞，PBS冲洗；2)终浓度为0.25％(质量百分含量)胰酶消化50秒；3)DMEM/F12培养基终止消化，吸管吹打细胞；4)将消化下的细胞转至离心管，1000rpm，5分钟；5)弃上清，加入含10％FBS的培养基(DMEM/F12购自Sigma-Aldrich，货号：56495C)，重悬细胞按1∶3接种。目前内膜癌原代细胞培养可成功培养至第82代，细胞状态良好、稳定。
将上述人子宫内膜癌细胞原代细胞命名为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821。人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821已于2010年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.4066。
二、人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066的性状检测
1、对该细胞系的某些性状进行检测：
I.细胞形态：
将人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066进行光镜观察，结果表明，细胞排列有显著特征，细胞贴壁生长，以梭形，多角形为主。呈现各细胞不规则纠集在一起，如片状或漩涡状排列。细胞核异形性明显，大小不一，呈多形性，核深染，核仁清晰，不规则膨大和增多。显示肿瘤细胞的特性(见图1)。图1中A为放大倍数10×的照片，B为放大倍数20×的照片。
将人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066进行电镜观察，结果表明，细胞形状不规则，细胞核异型性明显。细胞表面见较多微绒毛突起，部分细胞间见发育不良的细胞连接。细胞器中等量，为线粒体、粗面内质网、溶酶体及少量脂滴；个别细胞质内见多量空泡；胞质内较多核糖体。细胞核圆形，较大、不规则，常染色质丰富。超微结构显示腺上皮细胞特点(见图2)。图2中A为放大倍数1000×的照片，B为放大倍数2000×的照片。
II.生长曲线及细胞倍增时间：
细胞生长曲线的绘制根据存活细胞数量与吸光度值成正比的原理，采用MTT法(Mosmann Tim，Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays，Journal of immunologicalmethods 1983，65(1-2)：55-63)绘制细胞生长曲线(见图3(P15是人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066传代培养15代的细胞，P71是人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066传代培养71代的细胞，IK30是对照细胞Ishikawa；其中LHY-821传代培养的方法同步骤一)。以Ishikawa(ECACC货号：99040201)做对照，把旺盛生长人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066的第15代和第71代细胞制备成细胞悬液，以每孔2×104细胞，接种至24孔板，次日起每天取一块板做MTT，连续8d，根据Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间(Td)。
P15：Td＝1.99 d(T2＝2.063，T3＝1.819，T4＝2.905，T5＝1.673)
P71：Td＝1.86 d(T2＝1.768，T3＝1.96，T4＝1.847，T5＝2.193)
IK30：Td＝1.47 d(T2＝1.1，T3＝1.39，T4＝1.55)
结果显示：LHY-821较Ishikawa的细胞倍增时间长，生长速度慢；随着代数的增加，LHY-821细胞的倍增时间变短，但变化不大，相对稳定。
III.细胞遗传学染色体核型分析：
方法：
取人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066生长旺盛第14代细胞消化(按照步骤一中所述的方法用终浓度为0.25％(质量百分含量)胰酶(Trypsin)和0.02％(质量百分含量)乙二胺四乙酸(EDTA)1∶4(体积比)混合进行消化)，使其浓度为每毫升105个细胞，培养至细胞融合约80％，加入秋水仙素，浓度为10μg/ml，混匀，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养4小时后，用0.25％胰酶消化制备单细胞悬液，1500rpm/min离心10min，弃上清。加入0.075M浓度的KCl溶液4-5ml，轻柔吹匀后，37℃水浴箱低渗30min。加入甲醇/冰醋酸(体积比3∶1)0.5-1.5ml预固定，1500rpm/min离心10min，弃上清，加甲醇/冰醋酸(体积比3∶1)5ml第一次固定，轻柔吹匀，1500rpm/min离心10min，弃上清；再重复固定一次。在预冷的洁净载玻片上滴片，70℃烤片2～3小时，自然冷却，胰酶消化分带，Giemsa染色10min，显微镜下计数、分析。
结果分析：
见表1和图4(A.分裂像，B.核型分析)，该人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC№.4066细胞系染色体核型为近二倍体，其中6q-，10p-，Xq-，13q+，17p+，20p+为常见染色体异常；12号三体多见；符合恶性肿瘤的染色体畸变特征。
表1.染色体核型分析情况
IV.DNA含量分析：
人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第14代和第83代细胞经PI染色，以人正常淋巴细胞(取自本院血液常规检查的正常患者)做对照，用流式细胞仪检测DNA含量，根据DI＝1.1，其为二倍体细胞。第14代细胞中，PI＝57.62±2.19，SPF＝46.61±1.65。第83代细胞中，PI＝49.62±2.13，SPF＝36.77±1.25(图5，A.淋巴细胞，B.人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821第14代)。
V.细胞免疫组化：
取人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第12代，接种制作细胞爬片，待细胞到一定密度，用小鼠PV两步免疫组化试剂盒测定(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6002)。试剂盒具体步骤如下(一抗角蛋白CK20、CTNNB1、波形蛋白为中杉c金桥生物有限公司分装，P53，雌孕激素受体ER、PR为DAKO公司；二抗为试剂盒中携带)：
1)PBS(磷酸盐缓冲溶液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml超纯水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加超纯水定容至1L即可)冲洗，2分钟x3次；
2)3％(质量百分含量)H2O2去离子水孵育10分钟；
3)滴加小鼠来源一抗，4度冰箱过夜，PBS冲洗，2分钟x3次；
4)滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育20分钟，PBS冲洗，2分钟x3次；
5)用DAB显色；
6)自来水充分冲洗；
7)树胶封片。
上述小鼠来源一抗为角蛋白CK20、CTNNB1(β-catinin)、波形蛋白、P53、裸鼠成瘤检测雌激素受体ER或孕激素受体PR的小鼠来源一抗，山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体是上述一抗相应的山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体。
图6中A为B的阴性对照，C为D的阴性对照.A、C为LHY-821细胞，一抗为PBS，其余步骤试剂相同；E.为F.所对应阴性对照(阴性对照同为LHY-821成瘤切片，一抗为5％BSA，其余步骤同前)。
结果表明，角蛋白CK20(+++)，CTNNB1(β-catinin)(+)，波形蛋白(-)，P53(-)；裸鼠成瘤检测雌激素受体ER(-)，孕激素受体PR(++)。部分结果如图6所示。上述括号内“+”表示阳性表达，“+++”表示强阳性，“-”为阴性表达。图6中，A.阴性对照，B.CK20，C.阴性对照，D.CTNNB-1，E.阴性对照，F.PR。
VI.致瘤性检测：
取第18代细胞制成细胞悬液，接种到6只T细胞缺陷型4周龄BALB/C雌性裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，3只皮下注射，其中一只右侧腋下注射0.2ml，两只右侧臀部注射，0.1ml细胞密度为1.3×107个cells/ml；3只尾静脉注射0.2ml，细胞密度3.24x106cells/ml。6天后皮下注射裸鼠腋下可触及肿块，13天后处死检查肿瘤情况。尾静脉注射裸鼠未有可触性肿块，30天后处死，未见肝肺转移。
皮下注射裸鼠荷瘤情况如表2(第13天处死前测量)所示，图7中A为皮下荷瘤，B为臀部有肌层浸润的荷瘤。
表2.裸鼠荷瘤情况表(皮下注射)
VII.细胞侵袭力检测
用Transwell小室(美国costar公司，货号NO.3422)对该细胞系的侵袭力进行检测，1：10的matrigel(DMEM/Ham’s F-12培养液稀释，公司及货号同上)，接种密度为3x104/室，37℃孵育24h，固定染色，重复三次。以Ishikawa细胞系为对照。
结果分析：
结果显示该人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代培养细胞系侵袭力相对较弱。Ishikawa侵袭力约为58.23‰，该细胞系为8.47‰(见图8)。图8中，A为为放大倍数10×的照片，B为为放大倍数20×的照片，C为为放大倍数40×的照片。
VIII.Western blot
以Ishikawa细胞系做阳性对照，对人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代细胞PR进行蛋白水平检测。以GAPDH为内参；GAPDH及其一抗和二抗均购自美国santa cruze公司；PR及其一抗和二抗均购自美国Abcam公司，Western blot具体步骤：
1)提取人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC蛋白；
2)10％分离胶，5％积层胶，80V电泳30分钟，120V电泳2小时；
3)转膜，80V(10mA)，1.5小时；
4)取出膜平皿摇，5分/3次；
5)加入终体积百分浓度5％牛奶封闭，45分-1小时；
6)PR或GAPDH一抗(4℃)过夜；
7)PBST(磷酸盐缓冲溶液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，1mLTween-20溶于800ml双蒸水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加双蒸水定容至1L即可)快速摇洗，150rpm，5分/次，3次；
8)PR或GAPDH二抗，保鲜膜封闭，慢速摇1-2h；
9)PBST洗3次，5分/次；
10)显影定影，扫描分析。
结果如图9所示，结果分析：该原代培养细胞系PRA、PRB较Ishikawa表达量高。
IX.激素敏感性检测
通过MTT法对该人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066细胞系的激素敏感性进行检测，其中MPA(醋酸甲羟孕酮，美国Sigma Aldrich公司)、E2(17β-雌二醇，美国Sigma Aldrich公司)分别取不同浓度(10-9M、10-8M、10-7M)。MPA使用的溶剂为乙醇，MPA使用的溶剂为DMSO。图10中A为对E2的敏感性测定结果，B为对MPA的敏感性测定结果，其中A和B中control为空白对照(正常培养基与胎牛血清未加任何其他试剂)，图10.A中conE2为添加与10-7M E2组药物相同体积的乙醇溶剂，图10.B中的control-MPA为与浓度为10-7M MPA组药物相同体积的DMSO溶剂。
结果如图10所示，结果显示：该人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066原代培养细胞系对孕激素敏感性较高，10-9M浓度能明显抑制该细胞的增殖作用。
X.化疗药物敏感性测定
通过MTT法(Mosmann Tim，Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival：Application to proliferation and cytotoxicity assays，Journal ofimmunological methods 1983，65(1-2)：55-63)对人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821CGMCC №.4066第22代和第82代细胞同时进行化疗药物敏感性的检测，其中卡铂(Carboplatin)美国Sigma Aldrich公司(1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000μg/ml)和紫杉醇(Paclitaxel)美国Sigma Aldrich公司分别取不同浓度(1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml)。
结果如图11所示，结果显示：卡铂和紫杉醇能抑制该细胞系的增殖作用，并具有浓度和时间依赖性。随着细胞代数的增高，该细胞系对卡铂产生耐药性，在1000μg/ml作用72h后未可见明显抑制作用；而对紫杉醇保持了较好的敏感性。图11中A为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第22代对卡铂的敏感性检测；B为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第22代对紫杉醇的敏感性检测；C为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第82代对卡铂的敏感性检测；D为人子宫内膜样腺癌细胞LHY-821 CGMCC №.4066第82代对紫杉醇的敏感性检测。
Claims (1)
1.人子宫内膜样腺癌细胞，其特征在于：其名称为LHY-821，保藏登记号为CGMCC №.4066。
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