CN102181463A - 基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系。本发明提供了一种将选择标记基因通过诱导予以删除，培育无标记转基因植物的方法，包括如下步骤：(1)用重组质粒转化出发植物，通过所述筛选基因筛选得到同时含有所述筛选基因和所述外源目的基因的转基因植物；重组质粒包括特异DNA片段甲和特异DNA片段乙；特异DNA片段乙含有外源目的基因的表达盒；DNA片段甲中将Cre基因置于alcA-min35S嵌合启动子下游，诱导前Cre基因不表达，不发生删除，乙醇存在时，转录因子AlcR构象改变，结合到alcA-min35S上，激活下游Cre基因的表达，Cre重组酶识别2个同向loxP位点，剔除位点之间的DNA片段。本发明可以解决因标记基因可能产生的潜在安全性隐患。

Description

基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系

技术领域

本发明涉及一种基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系。

背景技术

自1983年首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了飞速的发展，转基因作物的种类、产量都迅速增加。然而，随着商业化转基因植物新品种的不断出现，人们对转基因植物的食用安全性和环境安全性也提出了质疑(Natarajan S，TurnaJ.Excision of selectable marker genes from transgenic crops as a concern forenvironmental biosafety[J].Journal of the Science of Food andAgriculture，2007，87(14)：2547-2554.)。究其原因是由于目前几乎所有的植物遗传转化都要使用选择标记基因，一般是抗除草剂或抗生素抗性基因，以提高筛选效率。但转基因植株一旦获得，选择标记基因便不再有用，甚至有可能有不良影响。争论最多的是选择标记基因的存在是否会干扰邻近基因的表达(李晓兵，陈彩艳，翟文学.培育具有安全性选择标记基因或无选择标记基因的转基因植物.遗传，2003，25(3)：345-349.)，是否会影响人畜的健康(Kuiper HA，Kleter GA，Noteborn HP etal.Assessment of food safety issues related to genetically modifiedfoods.Plant J，2001，27：503-528.)，转基因植物中的外源优势基因可能会带来基因逃逸，引发超级杂草(Stewart CN Jr，Richards HA 4th，Halfhill MD.Transgenicplants and biosafety：science misconceptions and publicperceptions[J].Biotechnicques，2000，29(4)：832.)，使害虫产生抗性等安全性问题(Kai Guo-yin，Zhang Lei，Zhang Hong-yu，et al，Marker-free：a novel tendencyof transgenic plants.Acta Botanica Sinica，2002，44(8)：883-888.)。

为了避免上述问题，国内外研究者发展了多种有效的策略培育安全的转基因植物。主要包括利用生物安全标记基因和无选择标记基因的转化系统，及获得转基因植株后去除选择标记基因的三种方法。其中获得转基因植株后去除选择标记基因方法主要包括共转化法(SUN L，ZHANG Q X，ZHOU L，LU M，CAI M.Generating marker-free transgenicchrysant hemum by agrobacterium mediated transformation with twin T-DNA binaryvectors[J].Acta Horticulturae Sinica，2008，35(5)：727-734.；ZHU L，FU Y P，LIUW Z，HU G C，SI H M，TANG K X AND SUN Z X.Rapid generation of selectablemarker-free transgenic rice with three target genes by co-transformation andanther culture[J].Rice Science，2007，14(4)：239-246.)，利用Cre/loxP、FLP/frt、R/RS等位点特异性重组酶系统(宋洪元，任雪松，司军，李成琼，宋明，雷建军.利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草.西北植物学报，2010，30(1)：21-29.；Hongge Jia，Yongqi Pang，Xiaoying Chen，RongxiangFang. Removal of the selectable marker gene from transgenic tobacco plants byexpression of Cre recombinas

来源于噬菌体P1的Cre/loxP位点特异性重组系统，是培育无选择标记基因植物研究中最为详细、应用最广的技术之一(宋洪元，任雪松，司军，李成琼，宋明，雷建军.利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草.西北植物学报，2010，30(1)：21-29.；Hongge Jia，Yongqi Pang，Xiaoying Chen，RongxiangFang.Removal of the selectable marker gene from transgenic tobacco plants byexpression of Cre recombinase from a Tobacco Mosaic Virus vector throughagroinfection.Transgenic Research(2006)15：375-384.；Yong Wang，BojunChen，Yuanlei Hu，Jingfu Li.Zhongping Lin.Inducible excision of selectablemarker gene from transgenic plants by the Cre/lox site-specific recombinationsystem.Transgenic Research，2005，14：605-614.；YUAN Yuan，LIU Yun-Jun，WANGTao.A New Cre/lox System for Deletion of Selectable Marker Gene.Acta BotanicaSinica 2004，46(7)：862-866.)。Cre/loxP系统中的Cre重组酶专一性地识别由34个碱基对组成的特异序列(loxP位点)。若2个loxP位点方向相同，loxP位点之间的DNA片段(如选择标记基因)重组后被剔除。Cre重组酶不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA(Trinh K R，Morrison SL.Site-specific and directional gene replacement mediated by Crerecombinase.Journal of Immunological Methods，2000，244：185-193.；Yang X，HuangP T，Huang C F.Progress of gene targeting in mouse.Chinese ScienceBulletin，2001，46：265-271.)。

人们最初利用Cre/loxP系统是和其他去除选择标记基因方法一样，需要通过二次转化或有性杂交引入重组酶，然后通过自交进一步去除重组酶基因及其所带入的另一个选择标记基因，使得选育过程复杂，周期过长，且不适于无性繁殖作物。因此，研究者在此基础上发展了化学诱导表达的位点特异性重组系统，利用受化学诱导的启动子控制重组酶表达。这样就可以一次性将目的基因、选择标记基因和重组酶基因转入受体植株中，然后在适当的时候诱导重组酶表达，去除选择标记基因和重组酶基因本身。Zuo等(Zuo J R，Niu Q W，Moller S G，Chuan N H.Chemical-regulated，site-specific DNA excision in transgenic plants.Nature Biotechnology，2001.19：157-161.)开发了一套化学诱导启动子控制位点特异重组酶表达的系统，以受β-雌二醇诱导的转录因子XVE控制Cre基因的表达，从而剔除loxP序列之间的选择标记基因，获得了高频率的无选择标记的转基因拟南芥。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系。

本发明提供了一种在植物生长的特定时期，通过诱导将转基因植物的标记基因删除，获得无筛选基因的转基因植物(可诱导删除筛选基因的转基因植物)的方法，包括如下步骤：

(1)用重组质粒转化出发植物，通过所述筛选基因(筛选标记基因)筛选得到同时含有所述筛选基因和所述外源目的基因的转基因植物；所述重组质粒包括特异DNA片段甲和特异DNA片段乙；所述特异DNA片段甲和所述特异DNA片段乙在所述重组质粒上没有重叠区域；

所述DNA片段甲的两端各具有一个同向的LoxP位点，两个LoxP位点间包括表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；所述表达盒甲为筛选基因的表达盒，所述筛选基因为组成型表达；所述表达盒乙为AlcR转录因子的编码基因的表达盒，所述AlcR转录因子的编码基因为组成型表达；所述表达盒丙为Cre重组酶的编码基因的表达盒，所述Cre重组酶的编码基因由alcA-mini35S嵌合启动子启动表达；所述表达盒丙位于所述表达盒甲和所述表达盒乙的下游；所述AlcR转录因子为序列表的序列2所示的蛋白质；所述Cre重组酶为序列表的序列3所示的蛋白质；所述alcA-mini35S嵌合启动子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示；

所述特异DNA片段乙含有表达盒丁；所述表达盒丁为外源目的基因的表达盒；

(2)将步骤(1)得到的转基因植物在施加乙醇的条件下培养，得到含有所述外源目的基因且不含有所述筛选基因的目的转基因植物。

所述LoxP位点可如序列表的序列1自5’末端第91-124位核苷酸所示。所述AlcR转录因子的编码基因可如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示。所述Cre重组酶的编码基因可如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示(第5003-5172位核苷酸为内含子)。

所述表达盒乙中，所述AlcR转录因子的编码基因可由G_10-90启动子启动表达，由35S终止子终止表达。所述G_10-90启动子可如序列表的序列1自5’末端第1429-1574位核苷酸所示。所述35S终止子可如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示。

所述表达盒丙中，所述Cre重组酶编码基因可由Nos终止子丙终止表达。所述Nos终止子丙可如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示。

所述表达盒甲中，所述筛选基因可由35S启动子甲启动表达，由Nos终止子甲终止表达。所述35S启动子甲可如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示。所述Nos终止子甲可如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示。所述筛选基因优选为序列表的序列1自5’末端第577-1128位核苷酸所示的Bar基因。

所述特异DNA片段甲具体可如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示。

所述重组质粒具体可为在质粒pBBR1MCS-2的骨架上插入所述DNA片段甲和所述DNA片段乙得到的重组质粒。所述DNA片段乙具体可如序列表的序列4所示。所述重组质粒具体可为将序列表的序列4所示DNA插入中间质粒的ScaI和SpeI酶切位点之间得到的重组质粒；所述中间质粒为将序列表的序列1所示DNA插入质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间得到的重组质粒。

所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物，如拟南芥等。

本发明还保护一种双链DNA片段，包括两个同向的LoxP位点以及位于两个所述LoxP位点间的表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；所述表达盒甲为筛选基因的表达盒，所述筛选基因为组成型表达；所述表达盒乙为AlcR转录因子的编码基因的表达盒，所述AlcR转录因子的编码基因为组成型表达；所述表达盒丙为Cre重组酶的编码基因的表达盒，所述Cre重组酶的编码基因由alcA-mini35S嵌合启动子启动表达；所述表达盒丙位于所述表达盒甲和所述表达盒乙的下游；所述AlcR转录因子为序列表的序列2所示的蛋白质；所述Cre重组酶为序列表的序列3所示的蛋白质；所述alcA-mini35S嵌合启动子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示。

所述LoxP位点可如序列表的序列1自5’末端第91-124位核苷酸所示。所述AlcR转录因子的编码基因可如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示。所述Cre重组酶的编码基因可如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示(第5003-5172位核苷酸为内含子)。

所述表达盒乙中，所述AlcR转录因子的编码基因可由G_10-90启动子启动表达，由35S终止子终止表达。所述G_10-90启动子可如序列表的序列1自5’末端第1429-1574位核苷酸所示。所述35S终止子可如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示。

所述表达盒丙中，所述Cre重组酶编码基因可由Nos终止子丙终止表达。所述Nos终止子丙可如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示。

所述表达盒甲中，所述筛选基因可由35S启动子甲启动表达，由Nos终止子甲终止表达。所述35S启动子甲可如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示。所述Nos终止子甲可如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示。所述筛选基因优选为序列表的序列1自5’末端第577-1128位核苷酸所示的Bar基因。

所述双链DNA片段具体可如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示，优选为序列表的序列1所示DNA。

含有所述双链DNA片段的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为在质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒。

所述双链DNA片段或所述重组质粒均可用于培育转基因植物，特别是通过诱导删除标记基因的无筛选标记基因的转基因植物。

基于AlcR蛋白调控的乙醇诱导系统相对于其他的化学诱导系统因其经济、易用和高效性的特点，在农业上显现出极高的应用价值。本发明提供的基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系(重组表达载体)由两个转录单位组成，第一个转录单位是由一个强组成型启动子(如CaMV35S)转录对乙醇敏感的AlcR转录因子，第二个转录单位含有alcA-min35S嵌合启动子，调控下游Cre基因的表达。诱导前Cre基因不表达，不发生删除作用。当在乙醇存在时，转录因子AlcR构象改变，结合到alcA-min35S上，激活下游Cre基因的表达。Cre重组酶识别2个同向loxP位点，剔除位点之间的DNA片段，包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统，而loxP位点之外的目的基因在诱导前后始终表达。应用本发明提供的重组表达载体制备转基因植物，能够在植物生长发育的特定时期将筛选基因(甚至整个外源插入片段)通过诱导删除，解决转基因植物给环境带来的安全隐患。

附图说明

图1为各个重组质粒的结构示意图。

图2为诱导前后植物中保留的功能元件。

图3为植株Cre表达框的PCR检测；1-3：阳性植株；4：野生型；5：阳性对照；6：空白对照；7：100bp marker。

图4为FRB区段的鉴定结果；1：空白对照；2、以野生株cDNA为模板；3、以阳性单株cDNA为模板；4：以阳性单株基因组DNA为模板；5：100bp marker。

图5为alcR基因的鉴定结果；1：100bp marker；2：空白对照；3：野生株；4：阳性对照；5：阳性单株。

图6为叶片GUS组织化学染色结果；A、B：阳性单株，C：野生株。

图7为FRB区段的鉴定结果；1：空白对照；2：以未诱导的野生株cDNA为模板；3：以未诱导的转基因植株cDNA为模板；4：以乙醇诱导的转基因单株cDNA为模板；5：以未诱导转基因单株基因组DNA为模板；6：100bp marker

图8为cre基因的鉴定结果；1：空白对照；2：未诱导的野生株cDNA；3：未诱导的转基因植株cDNA；4：乙醇诱导的转基因植株cDNA；5：未诱导的转基因植株基因组DNA；6：100bp marker。

图9为表型观察；A-E分别为乙醇诱导的5个纯合株系植株的幼苗，F为未诱导的1个纯合株系植株幼苗。

图10为转基因植株乙醇诱导后LB-loxP-35S-GUS片段的PCR检测；1、2：转基因植株；3：100bp marker；4：野生株；5：空白对照。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Columbia生态型拟南芥(Col-0，野生株)：购自ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center，Columbus，OH，USA)。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，购自Tiangen公司。内切酶、去磷酸化酶、连接酶等购自Takara公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Axygen公司。人工寡核苷酸引物合成及测序由北京三博远志生物技术公司完成。载体pBluescript II KS+：Stratagene公司(目录编号：212207)。载体pBI121：北京拜尔迪生物技术有限公司，(产品目录编号为8023-01)；参考文献：GenBank AF485783 Complete sequence of the binary vector pBI121 and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.(2003)Mol.Breed.11，287-293。构巢曲霉(Aspergillus nidulans)：中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：CICC 2438。载体pUC18：Fermentas公司(产品目录编号为SD0051)。载体pGEM-T Easy：Promega(产品目录号为A1360)。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101pMP90：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Koncz，C.and Schell，J.(1986)The promoterof TL-DNA gene 5controls the tissue-specific expression of chimeric genescarried by a novel type of Agrobacterium binary vector.Mol.Gen.Genet.204，383-396。

质粒pX7-GFP：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Guo H S，Fei J F，Xie Q，Chua N H.A chemical-regulated inducible RNAi system in plants.The Plant Journal，2003，34(3)：383-392。

质粒pRT103：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：A set ofplant expression vectors for transcriptional and translational fusions，Nucleic Acids Research，1987，(15)：5890。

质粒pDHB321.1(pGSFR280派生质粒)：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Block MD，Botterman J，Vandewiele M，Dockx J，Thoen C，GosseléV，Movva NR，Thompson C，Montagu MV，Leemans J.Engineering herbicide resistancein plants by expression of a detoxifying enzyme.EMBO J.1987Sep；6(9)：2513-8.。

质粒pBBR1MCS-2：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：KovachME，Elzer PH，Hill DS，Robertson GT，Farris MA，Roop RM 2nd，Peterson KM.Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes.Gene.1995Dec 1；166(1)：175-6.。

实施例1、质粒的构建

一、植物表达载体pBBBH的构建

1、用SacI酶切质粒pDHB321.1，回收约2100bp的片段(含LB-bar表达框-RB)。

2、用SspI酶切质粒pBBR1MCS-2，回收约4440bp的片段(含卡那霉素抗性基因的骨架)。

3、将步骤1回收的约2100bp的片段补平，与步骤2回收的约4440bp的片段连接，获得植物表达载体pBBB(抗除草剂Basta)。

4、以植物表达载体pBBB为模板，用上游引物(下划线标注AgeI酶切位点)和下游引物(下划线标注EcoRI酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，用限制性内切酶AgeI和EcoRI酶切PCR扩增产物，回收约500bp的酶切产物。

上游引物：5’-TAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATA-3’；

下游引物：5’-CGAATTCGATATCAAGCTTATCGCGATACCGTCGGCGGccgggggatccactagttc-3’。

5、用限制性内切酶AgeI和EcoRI酶切植物表达载体pBBB，回收约6080bp的载体骨架。

6、将步骤4的酶切产物与步骤5的载体骨架连接，得到植物表达载体pBBBH。

植物表达载体pBBBH的结构见图1A，含有35S启动子甲、Bar基因和Nos终止子甲组成的表达盒甲。植物表达载体pBBBH抗除草剂Basta，将植物表达载体pBBB的SmaI酶切识别位点改造成了HindIII酶切识别位点。

二、重组质粒pUGRA的构建

1、重组质粒pUG的构建

以质粒pRT103为模板，用上游引物G_10-905’(下划线标注EcoRI酶切位点)和下游引物G_10-903’(下划线标注SbfI酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(G_10-90启动子)。

G_10-905’：5’-GGAATTCGCCACGTGCCGCCACGTGCCGCCACGTGCCGCCACGTGCCCATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC-3’；

G_10-903’：5’-GGGCCTGCAGGAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’。

用限制性内切酶EcoRI和SbfI酶切PCR扩增产物，得到酶切产物。

用限制性内切酶EcoRI和SbfI酶切载体pUC18，得到载体骨架(约2646bp)。

将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到重组质粒pUG。

2、重组质粒pUGA的构建

以质粒pRT103为模板，用上游引物PolyA5’(下划线标注SbfI酶切位点)和下游引物PolyA3’(下划线标注

和EcoRI酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(35S终止子)。

PolyA5’：5’-GGGCCTGCAGgcaaatcaccagtctctctctacaaatc-3’；

PolyA3’：5’-CCC

GAATTCcactggattttggttttaggaattagaaat-3’。

用限制性内切酶HindIII和SbfI酶切PCR扩增产物，得到酶切产物。

用限制性内切酶HindIII和SbfI酶切重组质粒pUG，得到载体骨架(约2780bp)。

将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到重组质粒pUGA。

3、重组质粒pUGRA的构建

参考NCBI中AlcR基因的序列(GenBank AF496548.1)设计上游引物AlcR5’(下划线标注SbfI酶切位点)和下游引物AlcR3’(下划线标注SbfI酶切位点)。

AlcR5’：5’-GGGCCTGCAGGATGGCAGATACGCGCCGACGCCAGAATC-3’；

AlcR3’：5’-GGGCCTGCAGGCTACAAAAAGCTGTCAACTTTCCCATTCAAACCTCTC-3’。

提取构巢曲霉的RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，用AlcR5’和AlcR3’组成的引物对进行PCR扩增。用限制性内切酶SbfI酶切PCR扩增产物，得到酶切产物。用限制性内切酶SbfI酶切重组质粒pUGA，得到载体骨架(约2995bp)。将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到重组质粒pUGRA(AlcR基因表达框载体)。重组质粒pUGRA中，G_10-90启动子、AlcR基因和35S终止子组成G_10-90:AlcR:35S_T片段(表达盒乙)。

三、重组质粒pBSK-alcA的构建

参考NCBI中alcA启动子的序列(GenBank DQ076245.1)设计上游引物alcA5’(下划线标注HindIII酶切位点)和下游引物alcA3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。

alcA5’：5’-CGCAAGCTTgggatagttccgacctaggattgg-3’；

alcA3’：5’-GGAATTCtttgaggcgaggtgataggattgg-3’。

提取构巢曲霉的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用alcA5’和alcA3’组成的引物对进行PCR扩增。用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切PCR扩增产物，得到酶切产物。用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pBluescript II KS+，得到载体骨架(约2949bp)。将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到重组质粒pBSK-alcA(alcA启动子载体)。

四、重组质粒pAC的构建

1、alcA-mini35S片段的扩增

以重组质粒pBSK-alcA为模板，用上游引物alcA_P5’(下划线标注HindIII酶切位点)和下游引物mini35S3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(alcA-mini35S片段)。

alcA_P5’：5’-CGCAAGCTTGGGATAGTTCCGACCTAGGATTGG-3’；

mini35S3’：5’-gtcgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagatgttcagctatgcgg-3’

PCR扩增体系(20ul)：10×Taq Buffer 2ul，10mM dNTP 0.8ul，10μM上、下游引物各0.25ul，Tag酶0.5U，ddH₂O补至20ul。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、64℃40s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

电泳去除剩余引物，回收PCR扩增产物。

2、mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段的扩增

以质粒pX7-GFP为模板，用上游引物mini35S5’和下游引物NosLoxP3’(下划直线标注SpeI酶切位点，下划曲线标注ScaI位点，方框标注LoxP位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段)。mini35S5’和mini35S3’为部分反向互补序列。

mini35S5’：5’-TCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC-3’；

NosLoxP3’：5’-GACTAGT

CGATCTAGTAACATAGATGACACC-3’。

PCR扩增体系同步骤1。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、64℃40s、72℃120s，35个循环；72℃延伸10min。

电泳去除剩余引物，回收PCR扩增产物。

3、重组质粒pAC的构建

将alcA-mini35S片段和mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段同时作为模板，用alcA_P5’和NosLoxP3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(alcA-mini35S片段与mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段的融合片段)。

PCR扩增体系同步骤1。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃40s、72℃120s，10个循环(不加引物)；94℃30s、64℃40s、72℃150s，35个循环(加入引物)72℃延伸10min。

电泳回收PCR扩增产物，并连接到载体pGEM-T Easy上，得到重组质粒pAC(含右侧LoxP位点的alcA-mini35S:Cre:Nos_T:LoxP表达载体)。重组质粒pAC中，含有alcA-mini35S嵌合启动子，Cre重组酶编码基因和Nos终止子丙组成的表达盒丙和右侧LoxP位点。

五、重组质粒pBBB-LB:LoxP的构建

植物表达载体pBBBH的LB与选择标记Bar基因表达框间有一个Cla I酶切位点，表达框外侧靠近Nos终止子的多克隆位点为EcoRI酶切位点。

以植物表达载体pBBBH为模板，用上游引物LoxP-35S5’(下划线标注Cla I位点，方框标注LoxP位点)和下游引物35S-Bar-Nos3’(下划线标注EcoRI位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(LoxP:35S_P:Bar:Nos_T片段)。

LoxP-35S5’：5’-CCATCGAT

AAGCTAGAGATCCGTCAACATGGTGG-3’；

35S-Bar-Nos3’：5’-GCAGGAATTCGATATCAAGCTAGAGATC-3’。

PCR扩增体系同步骤1。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、62℃40s、72℃120s，35个循环；72℃延伸10min。

电泳去除剩余引物，回收PCR扩增产物。

用限制性内切酶Cla I和EcoRI双酶切PCR扩增产物得到酶切产物。用限制性内切酶Cla I和EcoRI双酶切植物表达载体pBBBH，回收载体骨架(约5109bp)。将所述酶切产物和所述载体骨架连接，得到重组质粒pBBB-LB:LoxP(在pBBBH的LB:35S启动子之间添加了LoxP位点)。重组质粒pBBB-LB:LoxP的结构示意图见图1B。

六、重组质粒pBBB-GRA的构建

用限制性内切酶EocRI酶切重组质粒pUGRA，回收约2800bp的G_10-90:AlcR:35S_T片段。用限制性内切酶EocRI酶切重组质粒pBBB-LB:LoxP，回收载体骨架(约6448bp)。将所述G_10-90:AlcR:35S_T片段和所述载体骨架连接，得到重组质粒pBBB-GRA。重组质粒pBBB-GRA的结构示意图见图1C。

七、重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的构建

用限制性内切酶HindIII和SpeI双酶切重组质粒pAC，回收约2000bp的alcA-mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段。用限制性内切酶HindIII和SpeI双酶重组质粒pBBB-GRA，回收载体骨架(约9274bp)。将所述alcA-mini35S:Cre:Nos_T:LoxP片段和所述载体骨架连接，得到重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP。重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的结构示意图见图1D。

重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP就是在载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒。序列表的序列1中，自5’末端第1-84位核苷酸为T-DNA的左边界(LB)，自5’末端第85-90位核苷酸为Cla I位点，第91-124位核苷酸为LoxP位点，第125-576位核苷酸为35S启动子甲，第577-1128位核苷酸为Bar基因，第1129-1422位核苷酸为Nos终止子甲，第1423-1428位核苷酸为EcoR I位点，第1429-1574位核苷酸为G_10-90启动子，第1575-4040位核苷酸为AlcR基因，第4041-4249位核苷酸为35S终止子，第4250-4255位核苷酸为EcoR I位点，第4262-4267位核苷酸为HindIII位点，第4268-4568位核苷酸为alcA-mini35S嵌合启动子，第4569-5770位核苷酸为Cre重组酶编码基因(第5003-5172位核苷酸为内含子)，第5771-6201位核苷酸为Nos终止子丙，第6202-6235位核苷酸为LoxP位点，第6236-6241位核苷酸为Sea I位点，第6242-6247位核苷酸为Spe I位点，第6248-6452位核苷酸为T-DNA的右边界(RB)。

重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP含有两个同向LoxP位点，LoxP位点间包含Bar基因表达盒(表达盒甲，组成型表达Bar基因)、AlcR转录因子编码基因的表达盒(表达盒乙，组成型表达，但只有在有乙醇的条件下才能得到活性AlcR转录因子)、受AlcR转录因子调控的Cre基因表达盒(表达盒丙，受活性AlcR转录因子诱导表达)。重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP是一种基于乙醇诱导，位点专一重组识别标记基因删除系统。

八、重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的构建

1、用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切载体pBI121，回收约3033bp的35S:GUS:Nos片段。用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切载体pBluescript II KS+，回收载体骨架(约2949bp)。将所述35S:GUS:Nos片段和所述载体骨架连接，得到重组质粒pBSK-GUS。

2、用限制性内切酶ScaI和SpeI双酶切重组质粒pBSK-GUS，回收约2800bp的35S:GUS:Nos片段(表达盒丁)。用限制性内切酶ScaI和SpeI双酶切重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP，回收载体骨架(约11300bp)。将所述35S:GUS:Nos片段和所述载体骨架连接，得到重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS。重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的结构示意图见图1E。重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的报告基因为GUS基因，GUS基因表达框位于LoxP位点外侧，当选择标记Bar基因表达框及整套诱导系统被删除后，做为目的基因GUS仍将保留并表达。

重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS中，自上游至下游依次具有如下元件：T-DNA的左边界(LB)、LoxP位点、表达盒甲、表达盒乙、表达盒丙、LoxP位点、表达盒丁和T-DNA的右边界(RB)。表达盒甲包括35S启动子甲(组成型启动子)、Bar基因(筛选基因)、Nos终止子甲。表达盒乙包括G_10-90启动子、AlcR基因、35S终止子。表达盒丙包括alcA-mini35S嵌合启动子、Cre重组酶编码基因、Nos终止子丙。表达盒丁包括35S启动子丁、GUS基因和Nos终止子丁。

重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS中，在重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP的ScaI和SpeI位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA。序列表的序列4中，自5’末端第1-662位核苷酸为35S启动子丁，第663-2474位核苷酸为GUS基因，第2475-2799位核苷酸为Nos终止子丁，第2800-2805位核苷酸为EcoR I位点。

重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS导入出发植物后得到转基因植物，转基因植株诱导前删除系统不表达，当施加乙醇时，由活性的AlcR转录因子结合到alcA-mini35S嵌合启动子上激活Cre基因的表达，Cre重组酶识别2个同向loxP位点，剔除位点之间的DNA片段(包括选择标记基因表达框、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统)，而目的基因GUS将始终表达(参见图2)。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、抗性植株的获得

用重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS转化根癌农杆菌GV3101pMP90，得到重组农杆菌。

将重组农杆菌通过花序浸渍法(Steven J.Clough and Andrew F.Bent.Floraldip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.The Plant Journal.1998，16(6)：735-743.)侵染Columbia生态型拟南芥。

收获的种子即为T₀代种子；T₀代种子发芽后喷洒0.1％-0.2％Basta除草剂2-3次，非转基因苗不能继续生长，逐渐枯黄死亡，转基因苗长势茁壮，叶片保持绿色。T1代苗自交留种，得到T2代种子；T2代种子发芽后喷洒0.1％-0.2％Basta除草剂2-3次；T2代幼苗存活/死亡约为3∶1的初步确定其T1代为单拷贝植株，并单株自交留种。种子播于盛有营养土的苗盘中。播种的种子和幼苗的培养在人工气候室进行培养；培养条件：温度为22℃(昼)/18℃(夜)，光周期为16h(光)/8h(暗)。

共获得103个T₁代抗性植株(单拷贝植株)。

二、T₁代抗性植株的鉴定

1、Bar基因表达框的鉴定

随机抽取24个T₁代抗性植株单株提取基因组DNA，用LoxP-35S 5’和35S-Bar-Nos3’组成的引物对进行PCR扩增，靶序列为Bar基因表达框(约1300bp)。

24个单株全部为阳性结果。

2、Cre表达框的鉴定

将步骤1为阳性的24个单株分别提取基因组DNA，用alcA5’和NosLoxP3’组成的引物对进行PCR扩增，靶序列为Cre表达框(约2000bp)。设置Columbia生态型拟南芥作为阴性对照。设置水作为模板的空白对照。设置重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS为阳性对照。

反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、67℃40s、72℃150s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。19个单株为阳性结果，扩增出与阳性对照一致的条带，符合预期大小(2kb)。野生株或空白对照则不能扩增出相应条带(图3)。部分结果见图3。

3、alcR基因的鉴定

将步骤2为阳性的19个单株(以Columbia生态型拟南芥作为对照)分别采用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA。将步骤2为阳性的19个单株分别提取基因组DNA。

以TOR基因(At1g50030)的FRB区段为内参，检测cDNA翻转是否成功及有无基因组DNA污染。用FRB5’和FRB3’组成的引物对进行PCR鉴定，以cDNA为模板应扩增出300bp条带，以基因组DNA为模板应扩增出700bp条带。

FRB5’：5’-AGGGTTGCCATACTTTGGCATG-3’；

FRB3’：5’-TGGCTAGCTGTTTGTCAATCCG-3’。

结果表明所有cDNA均没有基因组DNA污染。部分样本的电泳图见图4。

分别以cDNA和基因组DNA为模板，用alcR-5’和alcR-3’组成的引物对进行PCR鉴定，靶序列为alcR基因片段(约600bp)。以重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS为阳性对照，以水为空白对照。

alcR-5’：5’-CGACGCCAGAATCATAGC-3’；

alcR-3’：5’-CCATCTTGAGCGACCTGTTG-3’。

反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、50℃40s、72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。以cDNA为模板，19株单株均得到与阳性对照一致的625bp条带，野生株和空白对照不能扩增出相应条带，证明alcR基因是组成型表达。部分样本的电泳图见图5。

4、表型鉴定

在没有加入Basta除草剂的正常环境中培养步骤2为阳性的19个单株和Columbia生态型拟南芥，19株单株和野生株相比生长正常，表明alcR基因组成型表达对拟南芥生长无影响。

5、GUS组织化学染色

分别将步骤2为阳性的19个单株的叶片为材料，进行GUS组织化学染色(Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：β-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J，1987，6：3901-3907.)。以Columbia生态型拟南芥作为阴性对照。结果表明：19个单株均呈蓝色，GUS表达活性很强；而野生型未观察到蓝色。部分结果见图6。

三、T₃代转基因植株的鉴定

1、T₃代转基因植株的获得

分别将步骤二的2鉴定为阳性的19个T₁代单株中连续自交，得到19个纯合的转基因纯合株系，将各个转基因株系的T₃代转基因植株进行步骤三的鉴定。

2、乙醇诱导表达前后Cre基因的检测

(1)乙醇诱导表达

分别将19个纯合的转基因纯合株系的T₃代转基因植株(种子)和Columbia生态型拟南芥(种子)进行如下两组处理：

第一组：点播于9cm培养皿(内含1/2MS培养基)上，约25粒种子，均匀滴加2-3滴无水乙醇(总约10-15ul)；

第二组：点播于9cm培养皿(内含1/2MS培养基)上，约25粒种子，不滴加无水乙醇。

(2)Cre基因的检测

7天后将种子萌发的小苗进行Cre基因的检测。

分别采用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA。分别提取基因组DNA。

分别以cDNA和基因组DNA为模板，用cre5’和cre 3’组成的引物对进行PCR鉴定，靶序列为Cre基因。以TOR基因FRB区段为内参，检测cDNA反转录是否成功，及有无基因组DNA污染(同步骤二的3)。以水为空白对照。

cre5’：5’-ATGTCCAATTTACTGACCGTACA-3’；

cre 3’：5’-CTAATCGCCATCTTCCAGCA-3’。

本发明构建质粒时，Cre重组酶的编码基因中插入了一个170bp的拟南芥KORRIGAN(KOR)基因第5内含子，所以以基因组DNA为模板，产物应为1202bp，以cDNA为模板，产物应为1032bp。

反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

FRB区段的检测结果：所有cDNA均没有基因组DNA污染。部分样本的电泳图见图7。FRB区段在乙醇诱导前后没有差异。

Cre基因的检测结果：乙醇诱导后，各转基因植株的cDNA均能扩增出符合预期大小的1032bp条带，野生株的cDNA没有得到相应条带；说明诱导后转基因植株Cre基因表达，野生型没有表达。1032bp条带大小说明PCR检测的模板来源于cDNA，而非基因组DNA。乙醇诱导前，各转基因植株和野生株的cDNA均不能扩增出符合预期大小的1032bp条带；说明诱导前转基因植株和野生型均没有Cre基因表达。乙醇诱导前，各转基因植株的基因组DNA均能扩增出1202bp条带，野生株的的基因组DNA没有得到相应条带，说明Cre基因已经整合到转基因植株的基因组，1202bp条带大小说明PCR检测的模板来源于基因组DNA，与cDNA模板有差异。部分结果见图8。结果表明转基因植株的Cre基因是受AlcR蛋白调控的诱导型表达，由乙醇严格控制“开”和“关”；并且Cre基因中的KOR内含子能在拟南芥RNA转录中正常剪切，加工成正确的mRNA。

3、删除效果的表观检测

(1)乙醇诱导表达

从19个纯合的转基因纯合株系中随机选取5个株系。分别将5个株系的T₃代转基因植株(种子)和Columbia生态型拟南芥(种子)进行如下两组处理：

第一组：点播于9cm培养皿(内含1/2MS培养基和草铵膦，草铵膦的浓度为50mg/L)上，约25粒种子，均匀滴加2-3滴无水乙醇(总约10-15ul)；

第二组：点播于9cm培养皿(内含1/2MS培养基和草铵膦，草铵膦的浓度为50mg/L)上，约25粒种子。

(2)表型观察

第一组和第二组的野生株均在长出2片子叶后陆续变黄死亡。

在经乙醇诱导后，5个株系的转基因植株(第一组)仍能继续长出绿色真叶，但随着诱导时间的持续延长，转化株停止生长，叶片失绿，逐渐死亡。

未经乙醇诱导的5个株系的转基因植株(第二组)可以持续生长。

处理30天各株系部分植株的照片见图9。

4、删除效果的分子检测

转入重组质粒pBBB-GRA-Cre/LoxP-GUS的拟南芥，诱导前T-DNA左边界附近序列是LB-loxP-35S-Bar，乙醇诱导后删除两个loxP位点间之间的DNA片段(包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统)，而留下一个loxP位点和目的基因GUS表达框，因此左边界附近序列应是LB-loxP-35S-GUS。为在分子水平上检测乙醇诱导删除效果，设计引物进行PCR扩增检测。在LB区段内设计上游引物LB-loxP5’，在GUS基因区段内设计下游引物35S-gus3’，经乙醇诱导后，提取基因组DNA进行PCR检测，应扩增出约945bp的片段。

LB-loxP5’：5’-GTAAAAATGAGGGCAATCG-3’；

35S-gus3’：5’-AAAGACTTCGCGCTGATACCA-3’。

(1)乙醇诱导表达

从19个纯合的转基因纯合株系中随机选取2个株系。分别将2个株系的T₃代转基因植株(种子)和Columbia生态型拟南芥(种子)进行如下处理：点播于9cm培养皿(内含1/2MS培养基和草铵膦，草铵膦的浓度为50mg/L)上，约25粒种子，均匀滴加2-3滴无水乙醇(总约10-15ul)。

(2)PCR鉴定

处理17天后，提取小苗的基因组DNA为模板，用LB-loxP5’和35S-gus3’组成的引物对进行PCR扩增。以水为空白对照。

PCR扩增的反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、49℃30s、72℃60s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。经乙醇诱导后，5个株系的转基因植株均扩增出约945bp的片段，野生型拟南芥或空白对照则不能扩增出相应条带。部分结果见图10。

(3)测序鉴定

将步骤(2)的PCR扩增产物进行测序，5个株系的转基因植株的测序结果一致，均如序列表的序列5所示。结果表明，乙醇诱导后，删除了两个loxP位点之间的DNA片段。

Claims (10)

1.一种培育无筛选基因的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(1)用重组质粒转化出发植物，通过所述筛选基因筛选得到同时含有所述筛选基因和所述外源目的基因的转基因植物；所述重组质粒包括特异DNA片段甲和特异DNA片段乙；所述特异DNA片段甲和所述特异DNA片段乙没有重叠区域；

所述DNA片段甲的两端各具有一个同向的LoxP位点，两个LoxP位点间包括表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；所述表达盒甲为筛选基因的表达盒，所述筛选基因为组成型表达；所述表达盒乙为AlcR转录因子的编码基因的表达盒，所述AlcR转录因子的编码基因为组成型表达；所述表达盒丙为Cre重组酶的编码基因的表达盒，所述Cre重组酶的编码基因由alcA-mini35S嵌合启动子启动表达；所述表达盒丙位于所述表达盒甲和所述表达盒乙的下游；所述AlcR转录因子为序列表的序列2所示的蛋白质；所述Cre重组酶为序列表的序列3所示的蛋白质；所述alcA-mini35S嵌合启动子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示；

所述特异DNA片段乙含有表达盒丁；所述表达盒丁为外源目的基因的表达盒；

(2)将步骤(1)得到的转基因植物在施加乙醇的条件下培养，得到含有所述外源目的基因且不含有所述筛选基因的目的转基因植物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LoxP位点如序列表的序列1自5’末端第91-124位核苷酸所示；所述AlcR转录因子的编码基因如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示；所述Cre重组酶的编码基因如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达盒乙中，所述AlcR转录因子的编码基因由G_10-90启动子启动表达，由35S终止子终止表达；所述表达盒丙中，所述Cre重组酶编码基因由Nos终止子丙终止表达；

所述G_10-90启动子如序列表的序列1自5’末端第1429-1574位核苷酸所示；所述35S终止子如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示；所述Nos终止子丙如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲中，所述筛选基因由35S启动子甲启动表达，由Nos终止子甲终止表达；所述35S启动子甲如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示；所述Nos终止子甲如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示；

所述筛选基因优选为序列表的序列1自5’末端第577-1128位核苷酸所示的Bar基因。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述特异DNA片段甲如序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示。

6.双链DNA片段，包括两个同向的LoxP位点以及位于两个所述LoxP位点间的表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；所述表达盒甲为筛选基因的表达盒，所述筛选基因为组成型表达；所述表达盒乙为AlcR转录因子的编码基因的表达盒，所述AlcR转录因子的编码基因为组成型表达；所述表达盒丙为Cre重组酶的编码基因的表达盒，所述Cre重组酶的编码基因由alcA-mini35S嵌合启动子启动表达；所述表达盒丙位于所述表达盒甲和所述表达盒乙的下游；所述AlcR转录因子为序列表的序列2所示的蛋白质；所述Cre重组酶为序列表的序列3所示的蛋白质；所述alcA-mini35S嵌合启动子如序列表的序列1自5’末端第4268-4568位核苷酸所示。

7.如权利要求6所述的双链DNA片段，其特征在于：所述表达盒甲中，所述筛选基因由35S启动子甲启动表达，由Nos终止子甲终止表达；所述表达盒乙中，所述AlcR转录因子的编码基因由G_10-90启动子启动表达，由35S终止子终止表达；所述表达盒丙中，所述Cre重组酶编码基因由Nos终止子丙终止表达；

所述LoxP位点如序列表的序列1自5’末端第91-124位核苷酸所示；所述AlcR转录因子的编码基因如序列表的序列1自5’末端第1575-4040位核苷酸所示；所述Cre重组酶的编码基因如序列表的序列1自5’末端第4569-5770位核苷酸所示；所述G_10-90启动子如序列表的序列1自5’末端第1429-1574位核苷酸所示；所述35S终止子如序列表的序列1自5’末端第4041-4249位核苷酸所示；所述Nos终止子丙如序列表的序列1自5’末端第5771-6201位核苷酸所示；所述35S启动子甲如序列表的序列1自5’末端第125-576位核苷酸所示；所述Nos终止子甲如序列表的序列1自5’末端第1129-1422位核苷酸所示；

所述双链DNA片段优选为序列表的序列1自5’末端第91-6235位核苷酸所示的DNA，最优选为序列表的序列1所示的DNA。

8.含有权利要求6或7所述双链DNA片段的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。

9.如权利要求8所述的重组质粒，其特征在于：所述重组表达载体为在质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒。

10.权利要求6或7所述双链DNA片段，或权利要求8或9所述重组质粒在培育转基因植物中的应用。

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