CN102180712B

CN102180712B - 垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪草矿质营养上的应用

Info

Publication number: CN102180712B
Application number: CN 201110037029
Authority: CN
Inventors: 多立安; 赵树兰; 王晶晶
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-02-14
Also published as: CN102180712A

Abstract

本发明公开了生活垃圾复合菌剂在制备提高草坪植物体内矿质营养需求方面的应用；其中采用的复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体喷撒完成。喷洒堆肥复合微生物菌剂后，植株体内几种大量元素(Na、K、Ca、Mg)随菌剂稀释倍数的增加的变化趋势基本相同，但堆肥复合微生物菌剂对草坪植物生长影响因宿主植物种类、和环境因子而有明显差异，这有利于草坪植物对矿质元素的吸收和利用。

Description

垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪草矿质营养上的应用

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种为原料，配制高效堆肥复合菌剂。更具体的说是采用微生物的菌剂，研究对黑麦草和高羊茅初期生长的影响及应用。

背景技术

堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance，HS)转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与地球表面的物质和能量循环。

在人为控制条件下，通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost)，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，并且对环境的危害甚小。因此，堆肥化是固体废物，尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今，已经历了漫长的历史，对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析，可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。

陈世和等（1989）采用垃圾培养基，在城市生活垃圾堆肥处理过程中，温度达45℃和55℃时，对堆肥菌株进行分离，发现在45℃时：曲霉菌[ Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]和芽孢乳杆菌属[Sporolactobacillus]等是堆肥中的优势菌群。而到55℃时则有所不同，除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属[Pseudomonas]仍然为优势菌群外，乳酸杆菌属[Lactobacillus]、链球菌属[Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群，替代了其它种微生物，表明在堆肥化过程中，微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。

从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物，经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属，乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌；曲霉属，毛霉属、红曲霉属，青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌；链霉菌属1属放线菌；酵母菌属，裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen（2001）对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现，分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化，使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少，而产芽孢的杆菌大量存在，在堆肥过程中，高温阶段初期和中文阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌，嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。

从城市生活垃圾中有机物的组成来看，而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的，不同温度下（中温、高温）堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。

近期的相关文献及实际生产表明：目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量，一直是相关科研人员所重点关注的研究内容；在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂，已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中，合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果，于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂，从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物（细菌、放线菌、真菌等）或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程，是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。

研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和Pérez-Piqueres 等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究，Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面，相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂，对草坪植物生长、生理特性的影响方面的研究还未见报道。

城市垃圾堆肥中含有丰富的有机质和植物营养元素，对多种作物均有增产效果分别对堆肥中有机质和营养需求进行了研究，发现堆肥中的有机质和营养物质可以改善土壤理化性质，提高作物产量。

顾文杰等（2009）研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供依据。Ivone V M等（2008）对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，而有关将堆肥微生物菌剂应用于草坪植物对其体内矿质营养的需求和影响，相关研究也鲜为报道。

发明内容

本发明选择城市固体废弃物（生活垃圾）为研究对象，探讨其垃圾堆肥内部微生物组分和营养成分，筛选出有益的微生物菌种（枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母菌），配制成不同浓度的复合微生物菌剂喷洒到建植的草坪植物体系中。研究堆肥复合微生物菌剂对草坪植物幼苗生长和营养成分的影响，以及Ca²⁺、K⁺、Mg^2-和Na⁺离子的吸收和分布状况，为筛选有益配比的微生物菌剂在生产中应用提供依据。

为实现上述目的本发明提供了如下的技术方案：

复合菌剂在制备提高草坪植物体内矿质营养需求方面的应用；其中采用的复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体喷撒完成。

本发明所述的应用，其中3菌种的菌落数在2.44×10⁹-2.47×10⁹/ml之间；草芽孢杆菌的OD₆₀₀值为0.567，酵母菌的OD₅₆₀值为0.545。本发明所述的应用，其中的矿质营养指的是:Ca²⁺、K⁺、Mg^2-和Na⁺离子的吸收和分布状况。

本发明所述的应用，其中的草坪植物为黑麦草和高羊茅。

本发明所述的应用，其中复合菌剂在种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施；白天植物能接受到光照的时间为7—8 h,室温平均温度为18 ℃，平均最高温度为21.8 ℃，最低温度为15.6℃,平均湿度为35.1%，平均最大湿度为52.7%，平均最小湿度34%,平均光量子密度为600—800μmol·m^-2·s^-1，持续处理35天测定各项指标。

接种复合微生物菌剂后，茎叶部分矿质元素的累积量都有显著性差异。高羊茅在稀释倍液为200的浓度时，茎叶部分积累的4种大量元素（Ca、K、Mg和Na）含量最高，与对照相比分别超过86.49%、63.41%、79.49%和28.16%。而对于黑麦草，复合菌剂1倍液下，茎叶部分积累的矿质营养最高，与没菌剂相比分别高出76.27%、68.75%、76.92%和84.54%。

本发明进一步公开了高效堆肥复合菌剂,其中3菌种的筛选方法如下:

(1) 富集：将采集的堆肥样品称取10g置于无菌三角瓶中，加入100ml无菌水和玻璃珠振荡均匀后，取10ml悬浮液于盛有100ml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度，摇床振荡培养3天；

(2)初筛：将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛；

(3)复筛：将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线；

(4)合微生物菌剂的制备: 将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上，具体步骤为：

①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；

②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃、180r／min培养12h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃、220 r／min培养48 h得到种子液；

③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液。按体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 配制复合微生物菌液。

本发明更加详细的制备方法如下:

杆菌(保藏号CCTCCM207094)、放线菌(保藏号CPCC260118)、酵母菌(保藏号CGMCCNO.1147)均由市售,但根据需要也可以采用下述的方法制备得到3个菌株。其得到的3个菌株的生化特性与市售的相同。

研制材料与方法

1.1 材料

选用我国北方比较常见多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和高羊茅(Festuca arundinacea L.)为试验材料。

方法

1.2.1 菌株的筛选方法

富集：将采集的堆肥样品称取10g置于无菌三角瓶中，加入100ml无菌水和玻璃珠振荡均匀后，取10ml悬浮液于盛有100ml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度下摇床振荡培养3—5天。初筛：将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛。复筛：生长曲线的绘制：将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。

复合微生物菌剂的制备

菌种培养：将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养，具体步骤：①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃，180r／rain培养12 h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃，220 r／rain培养48 h得到种子液；③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液。按以下处理配制复合微生物菌液。

植物的无土培养和复合微生物菌剂的应用

植物的无土培养草坪植物种子经1%H₂O₂溶液消毒3-5min，然后用蒸馏水冲洗干净，把种子放进离心管中，在饱和的CaSO₄溶液中浸泡4h后，培养皿中加少许CaSO₄溶液，其中垫上一层滤纸，把浸泡4h后的种子放在滤纸上，选取浸种后籽粒饱满、大小一致的草坪植物种子100粒，用蒸馏水冲洗干净后播种于其中，试验中每一处理设置3次重复，早晚各加一次蒸馏水来补充由蒸发而散失的水分。

复合微生物菌剂的应用：处理1加入原菌剂，简称CM₁；处理2加入100倍液的，简称CM₂；处理3加入200倍液的，简称CM₃；处理4加入300倍液的，简称CM₄；处理5加入400倍液的，简称CM₅；处理6不接菌剂，简称CK。每天统一定量给水，试验盆随机排列。种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施。每天植物能接受到光照的时间为7—8 h。室温平均温度为18 ℃，平均最高温度为21.8 ℃，最低温度为15.6℃。平均湿度为35.1%，平均最大湿度为52.7%，平均最小湿度34%。平均光量子密度为600—800μmol·m^-2·s^-1。持续处理35天测定各项指标。

指标测定

株高，采用厘米刻度尺每个培养皿随机测5个株高，以及萌发率的测定。叶绿素的测定参考李合生（2000）。生物量的测定，将植物分地上与地下两部分放至烘箱，80℃烘至恒重。采用SpectrAA-2000原子吸收光谱仪，测定草坪植物地上部分的大量元素。数据分析采用EXCEL和SPSS11.5分析软件进行处理。

研制结果分析

2.1 菌种筛选

2.1.1 初筛

通过平板分离筛选，得到透明圈/菌落直径比值较大且生长较快的菌落。将所得的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌分别进行划线分离、编号并保藏于固体斜面培养基上。

复筛

通过测定初筛菌种的生长曲线、OD值和菌落数，来研究堆肥中各类微生物的数量变化和活性大小，筛选出生长活性最高和繁殖能力最好时期的菌种，配制成各种不同浓度的堆肥复合微生物菌剂，接种到草坪植物建植体系中。

表1 微生物菌剂所富含的菌落数

2.2 微生物菌剂对草坪植物种子发芽率和幼苗生长的影响

接种不同稀释浓度的CM菌剂有利于增进草坪植物种子发芽和幼苗的生长（见表2）。随着稀释浓度的增加，草坪植物发芽率也表现出的不同的趋势变化。高羊茅和黑麦草与对照相比都差异显著（P<0.05），都分别高出27.75%和27.15%。高羊茅和黑麦草株高分别比对照高出47.50%和42.67%。对生物量的积累而言，高羊茅在200倍液下差异较显著，地上干重和单单株干重，分别高出对照66.67%和30.56%。而对于黑麦草，100倍液时黑麦草的地上干重最高，超出对照59.09%。

表2 不同倍液的复合菌剂对草坪植物发芽率、株高和生物量的影响

2.3 不同倍液的CM对草坪植物根系生长的影响

堆肥复合微生物菌剂能明显增加草坪植物根系的生长（见表3）。当稀释浓度为200时，高羊茅根重、根长及须根数都达到最高值，分别超过对照50%、68.90%和46.19%。对于黑麦草来说，100倍液时，最能促进根系的生长，在此浓度下，根重超出对照78.95%，根长和须根数分别超过对照47.06%和58.81%，均和对照差生显著差异（P<0.05），根冠比也高于对照16.67%，和对照产生显著差异（P<0.05）。

表3 不同倍液的复合微生物菌剂对草坪植物根系生长的

2.4不同倍液的（CM)对草坪植物叶绿素的影响

不同稀释浓度的复合微生物菌剂能明显增加草坪植物叶绿素的含量，高羊茅在稀释浓度为200时，叶绿素a含量、叶绿素b含量及总叶绿素含量都最高，分别比对照高出36.99%、27.12%和 33.72%。而稀释浓度为100时，黑麦草体内的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量最高，分别比对照高出30.01%、22.80%和27.55%。分别在此浓度梯度下，黑麦草和高羊茅叶绿素的含量与对照相比都有显著的差异（P<0.05）。

统计检验在5%水平，用于不同处理内进行比较，不同字母代表差异显著。

2.5不同倍液的（CM)对草坪植物矿质营养的影响

在本试验设定的复合微生物菌剂范围内，无论是黑麦草还是高羊茅，接种复合微生物菌剂后，茎叶部分矿质元素的累积量都有显著性差异高羊茅在稀释倍液为200的浓度时，茎叶部分积累的4种大量元素（Ca、K、Mg和Na）含量最高，与对照相比分别超过86.49%、63.41%、79.49%和28.16%。而对于黑麦草，复合菌剂1倍液下，茎叶部分积累的矿质营养最高，与没菌剂相比分别高出76.27%、68.75%、76.92%和84.54%。随着复合微生物菌剂稀释倍数的增加，对矿质元素的吸收能力也随之减弱。但都与对照没接复合菌剂产生明显差异（P<0.05）。统计检验在5%水平，于不同处内进行比较，不同字母代表差异显著。

3讨论与结论

在陆地生态系统中，80%以上的高等植物都能和微生物菌种处于共生关系，微生物可以通过在土壤中形成庞大的菌丝网络来增加植物根系的吸收面积，从而增加根系对营养元素的吸收并且促进植物生长，但是菌种的生长及其对植物吸收养分的影响又受到多种因素的影响，如土壤养分，尤其是矿质营养以及宿主植物种类等。本试验表明，喷洒堆肥复合微生物菌剂后，植株体内几种大量元素(Na、K、Ca、Mg)随菌剂稀释倍数的增加的变化趋势基本相同，但堆肥复合微生物菌剂对草坪植物生长影响因宿主植物种类、和环境因子而有明显差异，这有利于草坪植物对矿质元素的吸收和利用。

根系系统的形态和植物的生物量积累能够影响植物对水分和养分的吸收，而施氮水平、环境因素以及土壤理化性质等也显著的影响根系形态特征。试验表明，复合微生物菌剂对促进高羊茅和黑麦草根系生长都很明显，而尤其对黑麦草的根系生长状况影响比较大。叶绿素质量分数是影响光合作用强度的主要因素之一，叶绿素质量分数与光合速率通常具有显著的正相关性，光合作用的增强意味着同化物的积累增加，进而促进营养生长。杜安楠等（2009）研究表明，接种菌剂后有利于植物叶绿素的合成和生长发育。本试验表明，接种复合微生物菌剂后，草坪植物与对照都有显著差异，说明堆肥微生物菌剂有利用草坪植物叶绿素的合成和积累。

堆肥微生物菌剂可显著改善植株对矿质营养的吸收，促进草坪植物生长发育。本试验结果表明，堆肥复合微生物菌剂喷洒到草坪植物幼苗后，可促进植株根系对大量矿质元素的吸收，这与微生物促进植物对矿质元素的吸收、改善植物营养状况、促进植物生长发育、影响植物代谢活动有关，这种促进程度因寄主微生物的不同种类及接种量而异。植物根系接种复合物微生物菌剂后，微生物外生菌丝的生长、延伸增加了与土壤的接触位点，同时根外菌丝数量、长度的增加，减少了矿质元素的扩散距离，微生物空间分布的扩展扩大了根际范围，增加了植株对矿质营养的吸收表面积，进而增加蛋白质的积累和原生质的水合程度，减少植物体内的可溶性氮含量，降低其黏性，提高抗旱、抗寒性。叶面喷洒堆肥复合微生物菌剂不仅有利于草坪植物的蛋白质的积累和原生质的渗透能力。而且能够提高植物细胞体内的叶绿素的合成和积累能力，有利于草坪植物吸收和充分利用矿质营养，从而能够提高草坪植物自身抵抗外界胁迫的抗逆境的能力。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌均由市售。也可以采用实施例1的方法加以制备。

实施例1

菌株的筛选方法

(2) 复合微生物菌剂的制备

菌种培养：将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养，具体步骤：①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃，180r／rain培养12 h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃，220 r／rain培养48 h得到种子液；③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液。

实施例2

植物的无土培养：草坪植物种子经1%H₂O₂溶液消毒3-5min，然后用蒸馏水冲洗干净，把种子放进离心管中，在饱和的CaSO₄溶液中浸泡4h后，培养皿中加少许CaSO₄溶液，其中垫上一层滤纸，把浸泡4h后的种子放在滤纸上，选取浸种后籽粒饱满、大小一致的草坪植物种子100粒，用蒸馏水冲洗干净后播种于其中，试验中每一处理设置3次重复，早晚各加一次蒸馏水来补充由蒸发而散失的水分。

复合微生物菌剂的应用：处理1加入原菌剂，简称CM₁；处理2加入100倍液的，简称CM₂；处理3加入200倍液的，简称CM₃；处理4加入300倍液的，简称CM₄；处理5加入400倍液的，简称CM₅；处理6不接菌剂，简称CK。每天统一定量给水，试验盆随机排列。种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施。每天植物能接受到光照的时间为8h。室温平均温度为18℃，平均最高温度为21.8 ℃，最低温度为15.6℃。平均湿度为35.1%，平均最大湿度为52.7%，平均最小湿度34%。平均光量子密度为600μmol·m^-2·s^-1。持续处理35天测定各项指标。

Claims

1. 复合菌剂在提高黑麦草和高羊茅植物体内矿质营养方面的应用，是采用生活垃圾堆肥制备的复合菌剂喷撒完成的，其中所述的复合菌剂是体积比例为枯草芽孢杆菌CCTCCM 207094：放线菌CPCC 260118：酵母菌CGMCC NO.1147=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体，所述的3菌种的菌落数在2.44×10⁹-2.47×10⁹个/ml之间；枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀值为0.567，酵母菌的OD₅₆₀值为0.545；所述的矿质营养指的是：Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺和Na⁺离子的吸收和分布状况；其中复合菌剂的制备过程如下:

将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养：

②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃、180r／min培养12h得到种子液，放线菌和酵母菌在28℃、220 r／min培养48 h得到种子液；

③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液，按体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 混合，稀释100-200倍配制复合菌剂。

2.权利要求1的应用，其中复合菌剂在种子萌发生长到分蘖期时，在叶面施加不同的处理方式，采用浸蘸的方法替代液面喷施；白天植物能接受到光照的时间为7—8 h,室温平均温度为18 ℃，平均最高温度为21.8 ℃，最低温度为15.6℃,平均湿度为35.1%，平均最大湿度为52.7%，平均最小湿度34%,平均光量子密度为600—800μmol·m^-2·s^-1，持续处理35天测定指标。