CN102168144A - 与鸡肠炎沙门氏菌病抗性密切相关的多态位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个与鸡肠炎沙门氏菌病抗性密切相关的多态位点及其应用，属于生物技术领域。该多态性位点为C162T，位于TLR15外显子TLR15E1序列的第162位，这个位点上携带T等位基因的个体为肠炎沙门氏菌抗性群体，特别是携带T等位基因的雄性对肠炎沙门氏菌抗性更强。此位点对于研究鸡TLR15抗肠炎沙门氏菌病的作用机制具有非常重要的意义。本发明可以简便快速的检测位于TLR15基因外显子TLR15E1序列第162位上的单核苷酸多态性位点C162T的基因型，通过T等位基因的有无来评判个体对鸡肠炎沙门氏菌病的抗性，从而有利于鸡抗病育种的筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一个与鸡肠炎沙门氏菌病抗性密切相关的抗性基因位点以及基于该多态位点突变特性筛选鸡肠炎沙门氏菌病抗性鸡群的方法，属于生物技术的基因领域。
背景技术
进入21世纪以来，禽类肉蛋产品的需求在我国肉食产品需求总量中呈刚性增长态势，与此同时，人们对禽产品质量的追求意识亦日益增强。禽沙门氏菌病的危害伴随养鸡业的全周期，对禽类生产造成无法估量的经济损失；尤其是沙门氏菌感染鸡群能通过食物链将病菌传递给人类，严重威胁人类食品安全(Foley & Lynne，2008；Callaway et al，2008；Suzuki，1994；Gantois et al，2009)，已经引起养禽界、公共卫生界和禽病防治界的高度重视。从长远发展考虑，寻求一种全新的预防与控制策略，采用遗传学方法，培育出抗病新品种(品系)，从遗传素质上永久性地提高鸡群对肠炎沙门氏菌的抵抗能力，培育高效、优质、抗性鸡种是实现养禽业可持续发展的迫切需要。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。SNP是疾病易感性、显现性、抵抗力、以及药物反应性等生物性状差异的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。SNP作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经多种发展成熟的检测技术，如DNA测序(Sanger测序法和焦磷酸测序法)、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。
Toll样受体(Toil-like receptor，TLR)家族被认为是目前哺乳动物和脊椎动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白(Gordon，2002；Nerren et al.，2009)，从源头为疾病机制的研究提供了方向，成为目前研究禽类抗病力的热门基因。ChTLR15是在2006年发现的一个鸡所特有的新的TLR类型，相关研究报道沙门氏菌敏感鸡的ChTLR15的表达水平低于不易感鸡的表达水平，说明ChTLR15是决定鸡是否是对沙门氏菌易感的一个重要因素，而它作为易感性评价的基础就是其SNP特性。
经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有chTLR15基因多态性位点与肠炎沙门氏菌病抗性相关性的报道。
发明内容
本发明的目的在于揭示与鸡肠炎沙门氏菌病抗性密切相关的TLR15基因多态位点，以及通过该抗性基因位点的遗传特性筛查抗鸡肠炎沙门氏菌病的抗性鸡群的方法和基于该方法提供一种鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种检测鸡TLR15基因外显子SNP分型的方法，其特征在于：
(a)通过特异性引物混合物TLR15P扩增TLR15基因TLR15E1序列；
(b)确定在鸡TLR15基因外显子的TLR15E1所示序列的第162位的核苷酸；
(c)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
所述的特异性引物混合物TLR15P表示的信息如下：
TLR15上游引物序列5′-TTAGCAGCCACGCTGAGG-3′，
TLR15下游引物序列5′-GGGCTTCAACGTCTATGTTG-3′。
步骤(a)中所述的扩增方法为：PCR反应体系为20μl∶1μl模板DNA(约50ng)，2μl扩增缓冲液(10×buffer)，0.8μl 2.5mM dNTP，0.8ul特异性引物混合物TLR15P(5uM)，0.1μl 5U/ul rTaq酶，加水补足20μl；PCR的反应条件为：94℃预变性4min，后94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸6min，4℃保存备用；扩增产物为257bp，2％琼脂糖检测扩增产物。
步骤(c)中所述的检测方法为取4ul扩增产物，加入8ul甲酰胺加样缓冲液，98℃变性10min，然后迅速冰浴10min后，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)，1×TBE电泳，室温下，先用220V电泳20分钟，便于单链DNA初步分离，后120V电泳12-14h，银染显色。
所述的单核苷酸多态性是在第162位存在T。
本发明的第二个目的，一种分离核酸，其特征在于：它具有TLR15E1所示序列，且第162位是T。
本发明的最后一个目的，一种鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒，其特征是所述的试剂盒由盒体，盒体内的衬垫，衬垫的各孔腔内分别置入的特异性引物混合物TLR15P，DNA Tag酶，扩增缓冲液，dNTP，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶和甲酰胺加样缓冲液组成。
本发明利用引物(TLR15P)对鸡的总DNA进行PCR扩增，TLR15只有一个外显子，用TLR15P可以扩增外显子的565-822片段(TLR15E1)，具体序列如下：
TLR15E1
ccagca gccacgctga ggcctgactt gtgtggagca
601 ccgatcaatg ggttgcttga cctatcaagg accaaactgt ctaatgaaga gctgacagca
661 aaattggatg cagacctctg ccaagctcag ctgggcactg ttttggagtt taacattagt
721 cacag
gacc tggagatgga tcttctatct ctgttcatcc tgtttttgcc gatgaaagat
781 atacagtccg ttgatgccag ctacaacaga ataacaatta ac
用单链构象多态性(SSCP)结合测序的方法，检测出一个多态位点C162T，位于TLR15E1所示序列的第162位，即上面用方框标出的位点。
取52只正常的和41只感染SE的白耳鸡的血液样本的基因型，用SPSS软件分析发现与正常对照组相比，感染组的C162T多为CC或CT基因型，差别具有统计学意义(p＜0.05，表1)。进一步性别分组分析表明，雄性组中其差别也具有统计学意义(p＜0.01，表2)。这些结果表明，TLR15基因C162T位点上携带T等位基因的个体抗肠炎沙门氏菌病的能力比较强。T等位基因是产生SE抗性的一个等位位点。
表1正常组和感染组TLR15基因的多态性及基因型频率的分布
表2雄性组中正常组和感染组TLR15基因的多态性及基因型频率的分布
本发明可以简便快速的检测位于TLR15基因上的单核苷酸多态性位点C162T的基因型，通过T等位基因的有无来评判个体对鸡肠炎沙门氏菌病的抗性，从而有利于鸡抗病育种的筛查。采用本发明提供的鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因及其多态位点的核酸序列，构建对鸡肠炎沙门氏菌病抗性进行遗传学诊断的试剂盒。采用本发明提供的引物可以特异、高效地检测出C162T位点的基因型。
附图说明
图1是TLR15基因TLR15E1片段PCR扩增产物检测结果图；
图2是TLR15基因不同基因型SSCP结果图；
图3是TLR15基因C162T位点的测序图；
图4是鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
结合附图和实施例进一步说明本发明。以下实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
一种检测鸡TLR15基因外显子SNP分型的方法，其特征在于：
(a)通过特异性引物混合物TLR15P扩增TLR15基因TLR15E1序列；
(b)确定在鸡TLR15基因外显子的TLR15E1所示序列的第162位的核苷酸；
(c)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
所述的特异性引物混合物TLR15P表示的信息如下：
TLR15上游引物序列5′-TTAGCAGCCACGCTGAGG-3′，
TLR15下游引物序列5′-GGGCTTCAACGTCTATGTTG-3′。
所述的单核苷酸多态性是在第162位存在T。
一种分离核酸，具有TLR15E1所示序列，且第162位是T。
1.检测鸡TLR15基因外显子SNP分型的方法
1.1样品采集和DNA抽提
产蛋初期的白耳鸡先经过肠炎沙门氏菌平板凝集试验鉴定后，将白耳鸡分为正常对照组和感染组，性别分布在对照组和感染组没有显著差异(见表3)，试验设计可靠。
表3对照组和感染组性别分布
每只鸡分别翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。
1.2PCR反应
PCR的反应体系为20μl∶1μl模板DNA(约50ng)，2μl扩增缓冲液(10×buffer)，0.8μl 2.5mM dNTP，0.8ul引物P(5uM)，0.1μl 5U/ul rTaq酶，加水补足20μl。
PCR的反应条件为：94℃预变性4min，后94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸6min，4℃保存备用。用2％琼脂糖检测PCR扩增产物，见图1。
1.3SSCP跑胶并测序
取PCR扩增产物4ul，加入8ul甲酰胺加样缓冲液，98℃变性10min，然后迅速冰浴10min后，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)，1×TBE电泳，室温下，先用220V电泳20分钟，便于单链DNA初步分离，后120V电泳12-14h，银染显色。根据电泳图谱，鉴定基因型，见图2。选取不同SSCP带型的PCR产物进行PCR产物双向测序，找出SNP位点，见图3。
2、数据统计和分析
建立SPSS SNP基因型分型数据库，应用卡方检验进行数据统计分析。对照组和感染组TLR15基因SNP的基因型频率分布信息见表1。
3、基于PCR-SSCP方法的检测试剂盒
如图4所示，一种鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒，其特征是所述的试剂盒由盒体1，盒体内的衬垫2，衬垫的各孔腔内分别置入的特异性引物混合物TLR15P 3，DNA Tag酶4，扩增缓冲液5，dNTP6，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶7和甲酰胺加样缓冲液8组成。
序列表
Claims (7)
1.一种检测鸡TLR15基因外显子SNP分型的方法，其特征在于：
(a)通过特异性引物混合物TLR15P扩增TLR15基因TLR15E1序列；
(b)确定在鸡TLR15基因外显子的TLR15E1所示序列的第162位的核苷酸；
(c)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的特异性引物混合物TLR15P表示的信息如下：
TLR15上游引物序列5′-TTAGCAGCCACGCTGAGG-3′，
TLR15下游引物序列5′-GGGCTTCAACGTCTATGTTG-3′。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中所述的扩增方法为：PCR反应体系为20μl∶1μl模板DNA，2μl扩增缓冲液，0.8μl 2.5mMdNTP，0.8ul特异性引物混合物TLR15P，0.1μl 5U/ul rTaq酶，加水补足20μl；PCR的反应条件为：94℃预变性4min，后94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸6min，4℃保存备用；扩增产物为257bp，2％琼脂糖检测PCR扩增产物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中所述的检测方法为取4ul扩增产物，加入8ul甲酰胺加样缓冲液，98℃变性10min，然后迅速冰浴10min后，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE电泳，室温下，先用220V电泳20分钟，后120V电泳12-14h，银染显色。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的单核苷酸多态性是在TLR15P序列的第162位存在T。
6.一种分离核酸，其特征在于：它具有TLR15E1所示序列，且第162是T。
7.一种鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒，其特征是所述的试剂盒由盒体(1)，盒体内的衬垫(2)，衬垫的各孔腔内分别置入的特异性引物混合物TLR15P(3)，DNATag酶(4)，扩增缓冲液(5)，dNTP(6)，10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(7)和甲酰胺加样缓冲液(8)组成。
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| CN114478776A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-13 | 天津农学院 | 一种抗鸡tlr15蛋白的多克隆抗体及制备方法 |
| CN117487935A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-02-02 | 四川省畜牧科学研究院 | 一种检测鸡nlrp3基因外显子snp分型的方法 |
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