CN102168011B

CN102168011B - 一种液滴阵列pcr芯片及其应用

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Publication number: CN102168011B
Application number: CN2010106203641A
Authority: CN
Inventors: 姚波; 方群; 张云霞; 祝莹
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102168011A

Abstract

本发明公开了一种液滴阵列PCR芯片，所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO₂氧化层、由SiO₂氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述亲水坑阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。并公开了所述芯片应用于实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。本发明提供的检测系统将反应体积大为降低，而且检测灵敏度和商品化定量PCR仪相当。检测体系简单易操作，成本低，可应用于商业化。

Description

一种液滴阵列PCR芯片及其应用

一、技术领域：

本发明涉及一种实时定量PCR芯片及其荧光检测系统，特别是涉及一种基于液滴阵列的PCR芯片和荧光成像检测系统。

二、背景技术：

实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术。由于qPCR技术具有准确度高，线性范围宽等优势，因此，已经广泛地用于分子诊断，疾病研究，临床医学等领域。qPCR技术通常遵循传统PCR的扩增原理，不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时定量检测，而溶液中模板的原始拷贝数的对数与检测阈值(Ct)存在线性关系。

在过去的十几年间，传统仪器的微型化和便携化已经成为生物、化学及医药行业的一个重要的发展方向，其中，微型化的传统PCR装置已经成为研究的热点之一，尤其是微型化的qPCR技术由于其具有低成本，高灵敏度和高通量的，有希望成为大规模基因表达分析和药物筛选领域的重要工具平台而逐渐成为研究者关注的焦点。最近，Hua等[Zhishan Hua，

Jeremy L.Rouse，

Allen E.Eckhardt，

VijaySrinivasan，

Vamsee K.Pamula，Wiley A.Schell，Jonathan L.Benton，Thomas G.Mitchell，§and Michael G.Pollack，Multiplexed Real-Time Polymerase ChainReaction on a Digital Microfluidic Platform Anal.Chem.2010，82，2310-2316]提出了一种基于电润湿驱动的数字微流控qPCR系统，包裹着不同模板分子的液滴在四个平行环形通道中分别经过不同温区，进行扩增和检测。该系统的缺点是通量太低，而且每条环形通道都必须配备一套荧光检测系统，过于复杂。

国外一些公司也开发了一些微型化PCR产品，例如，STMicroelectronics的In-Check^TM系统和美国佳能生命科学的数字多重PCR芯片[I.T.奈特，井上裕司，用于数字多重PCR测定的装置和方法，公开号CN 101583724A，]。两种产品都是基于微流控芯片技术，In-Check^TM芯片是在进行PCR扩增后，将产物与微阵列芯片进行杂交反应，采用端点检测技术对基因表达进行分析的一种技术。而后者是将芯片得到的PCR产物做溶解度曲线分析，通过荧光强度不同输出0或1信号作为阴性或阳性的阈值，进行SNP分析。另一些公司很早就将研究重点放在了qPCR技术上，其中，比较典型的例子是美国ABI公司的

芯片和Fluidigm的BioMark^TM微流控数字PCR芯片系统。芯片是在不锈钢材料上加工出三千个纳升级孔阵列，并采用化学修饰技术将孔内外表面进行不同处理，以每个纳米孔位基本单位，进行平行qPCR检测分析。该芯片的缺点是加工工艺比较复杂，成本较高。而BioMark^TM数字微流控芯片采用的材料是价格便宜的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，采用软刻蚀技术在芯片上加工了几千个微泵阀结构，可以实现自动化添加样品和试剂功能，样品通量最高达到487700。

事实上液滴阵列也是一种非常适合进行微型化qPCR分析的技术，美国TTPLabTech公司开发了一套纳升级液滴阵列生成装置，用于高通量蛋白结晶筛选。但是，该系统并没有被用于qPCR系统，可能由于在液滴生成过程中不可避免地会伴随水分蒸发以及PCR热循环过程中极易导致液滴之间相互融合易位等问题。然而，液滴阵列技术无论从成本，芯片设计，还是操作的容易程度等方面都是一种理想的用于微型化qPCR分析的平台和技术。

三、发明内容

本发明提供了一种可实时定量进行PCR检测的反应芯片，以及包括芯片的荧光检测系统。

本发明采用的技术方案是：

一种液滴阵列PCR芯片，所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO₂氧化层、由SiO₂氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述微型亲水阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。

进一步，所述光刻胶工艺刻蚀形成的微型亲水阵列为按如下步骤得到：将单晶硅片或玻璃片在1000-1300℃氧化反应表面生成SiO₂氧化层，然后使SiO₂氧化层上硅烷化生成硅烷层，在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90℃加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0.5-0.7％NaOH溶液中显影2～8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出单晶硅片或玻璃片，用去离子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列。

所述芯片优选以单晶硅片为基材。

更具体的，本发明所述的护栏由环形玻璃制成。

本发明所述光刻的时间通常为30秒～1分钟。

更进一步，本发明所述芯片按如下方法制得：以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到：单晶硅片或玻璃片在1000-1300℃高温炉内氧化反应2-4小时，表面生成SiO₂氧化层，SiO₂氧化层约1μm厚，然后置于1％的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2-4小时，使SiO₂氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90℃加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0.5-0.7％NaOH溶液中显影2-8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/LHNO₃，然后取出硅片，用去离子水清洗，除去表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在芯片表面的阵列区域周围作为护栏，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片。

最优选的，本发明所述芯片是以单晶硅片为材料，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到：单晶硅片在1100℃高温炉内氧化反应2小时，表面生成SiO₂氧化层，然后置于1％的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2小时，使SiO₂氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于90℃加热坚膜10分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片加入0.7％NaOH溶液中显影2-8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出单晶硅片，用去离子水清洗，除去硅片表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，再将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在阵列区域周围，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片。

所述掩膜的阵列点的形状没有特定要求，通常为圆点，其他各种形状的点也都适用本发明，阵列点为圆点时，点的直径大小通常为50um-300um。

所述掩膜通常采用菲林胶片，用激光照排机输出，可以事先设计透光阵列点的形状或排列方式，然后通过激光照排打印在胶片上，从而得到透光阵列点。在光刻的时候，透光区域处的光刻胶被曝光，除去，不透光的区域保留。

所述掩膜上的透光阵列点可以布置成多个阵列单元，每个阵列单元直接相隔一定的距离。然后经光刻、显影、刻蚀、除去光胶之后，在同一芯片上形成多个亲水坑阵列单元，然后可用玻璃刀将硅片或玻璃片上的上面多个阵列单元分别切割开来，再分别将一环形玻璃片用环氧树脂胶粘在每个阵列区域周围，即可同时制得多个液滴阵列PCR芯片。这种处理方式应当是本领域人员根据实际情况能够想到并实施的。

本发明提供的液滴阵列PCR芯片可应用于实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。

具体的，所述应用采用包括以下装置的检测系统：液滴阵列PCR芯片、覆盖于芯片阵列区域上方的光学透明的加热盖，用于加热芯片的热循环装置、置于芯片阵列区域上方45度方向的激发光源，置于芯片阵列区域正上方方向的CCD检测器，所述激发光源包括发光二极管、发光二极管前端依次设有15度透镜和带通激发光滤光片，所述CCD检测器包括可变焦镜头(0.3-1X)、CCD相机以及设于两者之间的带通荧光滤光片；所述发光二极管中心波长473nm，所述带通激发光滤光片的中心波长470nm、带宽10nm，所述带通荧光滤光片的中心波长535nm，带宽40nm。所述激发光源通常为2个发光二极管(3W，中心波长473nm)。

所述系统中，优选发光二极管和CCD相机均受控于一使两者同步开启的控制器。

所述加热盖优选由氧化铟锡玻璃制成。

所述应用的方法为：向液滴阵列PCR芯片的阵列区域滴加足量的分子生物学级别液体石蜡油，用移液器向芯片上的亲水坑阵列位置滴加反应溶液，生成液滴阵列，再进行实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。

所述系统进行实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测时，大功率发光二极管经过15度透镜聚焦以及带通激发光滤光片过滤，从芯片上方45度斜射均匀照射在芯片上。斜射光路可有效降低激发光散射背景，提高荧光检测的灵敏度。芯片上的液滴内部的荧光被激发，被上方的可变焦镜头收集，经带通荧光滤光片过滤后进入CCD相机采集荧光图片。为了防止连续照射造成的荧光漂白，采用计算机来同步发光二极管的开启与相机的采集。非采集状态下发光二极管保持关闭状态。

本发明提供的液滴阵列芯片的材料采用具有较高导热性能的单晶硅基片，保证了有效的热量传导。采用玻璃片为基材时，玻璃芯片的导热性能不如硅片材料，但是可以降低玻璃芯片的厚度来保证有效的热量传导。而且，对于等温扩增反应而言，不存在循环温度程序，因此玻璃芯片不会影响反应温度。

本发明提供的液滴阵列PCR芯片表面经过硅烷化处理，并通过光刻胶工艺刻蚀得到局部亲水和疏水区域，从而可以使加入的液滴在芯片表面有序排列，并且在加热升温过程中不会存在几个液滴融合或易位的问题。

本发明的检测系统中，采用氧化铟锡(ITO)玻璃作为加热盖，一方面可以防止PCR过程中液滴的蒸发，另一方面由于ITO具有光学透明性质，不会妨碍每个循环荧光信号的采集。

本发明提供的液滴阵列PCR芯片在进行实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测时，先加入液体石蜡油，再加入反应溶液，生成液滴阵列，则液滴被包裹在液体石蜡油中，在PCR过程中不会因蒸发引起溶液反应体积和浓度发生变化。此外，由于芯片表面进行了局部亲水和疏水处理，液滴在PCR热循环过程中不会因温度变化而发生随机移动和液滴融合现象，降低了液滴间的相互污染，以及避免对数据采集和定量分析产生干扰。

本发明采用的荧光检测系统包括激发和发射光滤光片组件，两个大功率发光二极管(LED)和一个普通CCD检测器，与现有商品化qPCR系统相比，成本大为降低，具有较好的商业化前景。

与现有技术相比，现有普通的实时定量PCR仪器使用PCR管或96/384孔板作为反应容器，一般的反应体积为15uL+20uL(反转录+PCR)，体积大所消耗的试剂和样品量就大。本发明提供的实时定量聚合酶链式反应检测系统将反应体积降低到500nL以下。而反应体积虽然很小，但是检测灵敏度和商品化定量PCR仪相当，从而降低了试剂消耗和样品用量，节约成本。

四、附图说明：

图1液滴阵列PCR芯片制备过程示意图

图2实时定量聚合酶链式反应检测系统组成示意图

图3荧光素溶液液滴阵列

图4液滴体积对qPCR影响

图5芯片qRT-PCR分析mir-122(a)荧光图像；(b)标准曲线；(c)扩增曲线

图6细胞中mir-122表达分析(a)总RNA加入量；(b)五种细胞系中mir-122表达量

图7不同剂量SYBR Green组液滴的荧光变化曲线图

图8RCA凝胶电泳图

图9扩增曲线和标准曲线

五、具体实施方式：

实施例1

制备芯片：

6寸单晶硅片在1100℃高温炉内氧化反应2小时，表面生成SiO₂氧化层，然后置于1％的十八烷基三氯硅烷(溶剂为甲苯)溶液中常温反应2小时，使SiO₂氧化层表面硅烷化，取出后分别用甲苯，异丙醇和无水乙醇清洗一次，最后用去离子水清洗，晾干。接下来将硅片置于甩胶机中，在表面滴少量AZ光刻胶，于2000rpm转速下甩胶1分钟，，再将硅片置于烤胶机中90℃加热坚膜10分钟，冷却后，在光胶表面覆盖一片印有透光阵列点的掩膜，掩膜上的透光阵列点为直径300um尺寸的圆点，形成6×6的方形阵列，阵列中相邻两孔的最小间距为500um，每个6×6的方形阵列为一个阵列单元，共布置有10个阵列单元。然后在250～350nm的紫外光下进行光刻1分钟，移除掩膜后，将单晶硅片浸入0.7％NaOH溶液中显影2分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出单晶硅片，用去离子水清洗。用蘸有丙酮溶液的棉花轻轻除去硅片表面剩余AZ光刻胶，用去离子水清洗，烘干，然后用玻璃刀将硅片上面多个阵列分别切割开来，将一片环形玻璃片用环氧树脂胶分别粘在每个阵列区域周围，露出阵列区域，制得10个液滴阵列PCR芯片，备用。

制得的芯片上滴加100uL体积的分子生物学级别液体石蜡油，用如附图2所示的实时定量聚合酶链式反应检测系统，进行下列检测。

具体的，实时定量聚合酶链式反应检测系统包括：液滴阵列聚合酶链式反应芯片、覆盖于芯片阵列区域上方的光学透明的由氧化铟锡玻璃制成的加热盖，用于加热芯片的热循环装置、置于芯片阵列区域上方45度方向的激发光源，置于芯片阵列区域正上方方向的CCD检测器，所述激发光源为2个发光二极管(3W，中心波长473nm)、发光二极管前端依次设有15度透镜和带通激发光滤光片，所述CCD检测器包括可变焦镜头(0.3-1X)、CCD相机以及设于两者之间的带通荧光滤光片；所述带通激发光滤光片的中心波长470nm、带宽10nm，所述带通荧光滤光片的中心波长535nm，带宽40nm。发光二极管和CCD相机均受控于一使两者同步开启的控制器。

实施例2多步加入试剂稳定性和重现性考察

以荧光素染料溶液为样品，用0.1-2.5μL量程的移液器，在6×6阵列芯片上依次加样三次，第一次生成100nL浓度为10^-6mol/L的荧光素溶液液滴阵列(如附图3a所示)，接着在生成的液滴中分别加入100nL浓度为10^-5mol/L的荧光素溶液(如附图3b所示)，最后加入300nL浓度为10^-5mol/L的荧光素溶液(如附图3c所示)。附图3中，上排为明场照片(用普通钨灯光源照射，直接拍照)，下排为荧光照片。用数据处理程序分析荧光强度，根据36个液滴的荧光强度的平均值，可以计算得到相对标准偏差小于8％。同时，还考察了不同液滴体积对qPCR结果的影响，发现在100nL到500nL范围内，液滴体积对qPCR结果无显著性影响(如附图4所示)。

实施例3microRNA定量分析

对于以RNA为模板的大多数RT-PCR反应体系，逆转录反应和PCR扩增都需要分开两步分别进行操作。为了展示该系统进行两步法实时定量RT-PCR检测分析的适用性，以人工合成的mir-122为样品，考察了该系统的检测灵敏度和线性范围。首先，在芯片上生成6×6个100nL液滴(芯片阵列与附图3一致)，每列6个液滴内含有相同浓度的mir-122样品，6列液滴中mir-122的加入量分别为(从右到左)空白，9.6×10³，9.6×10⁴，9.6×10⁵，9.6×10⁶，9.6×10⁷个拷贝，跨越了5个数量级。接着，向每个液滴中加入100nL反转录试剂预混液(反转录预混液体积为10uL，其中含有dNTP混合液浓度为1mM，Multiscribe^TM反转录酶50U，1×RT缓冲液，核酸酶抑制剂3.8U，以及3μL RT引物)，然后将芯片置于PCR仪上面进行反转录反应(16℃进行30分钟，42℃进行30分钟，85℃进行5分钟)。反应完毕后，再向液滴中加入PCR预混合液300nL(其中包括150nL2×TaqMan试剂，15nL探针和引物混合液)。PCR程序为95℃，预反应10分钟；46个循环包括95℃，15秒和60℃，1分钟。本实验所用试剂包括引物、探针均为ABI商品化microRNA检测试剂盒(No.4366596和No.4324018)。荧光检测系统在PCR程序终每个循环的60℃时采集一次数据(CCD拍摄一次)，整个反应结束后得到46个荧光图片，附图5a给出了其中8个循环的荧光图片。采用数据处理程序对每个循环的荧光图片中液滴的荧光强度进行数据提取和处理，得到附图5c的PCR扩增曲线，其中相同颜色的几条曲线代表具有相同模版浓度的液滴。每条扩增曲线都会与荧光阈值(c图中虚线)有个交点，对应横坐标得到一个Ct值。Ct值与液滴中最初加入的模版拷贝数的对数存在线性关系，因而可以得到定量标准曲线(附图5b)。该标准曲线可以作为mir-122表达分析的定量依据。从图中可得mir-122的加入量的对数与C_t值具有良好的线性关系(R²＝0.999)。芯片实时定量PCR扩增的效率为86.32％，无论是灵敏度还是线性范围都达到了商品化实时定量PCR仪的水平，样品和试剂的用量与常规qRT-PCR相比降低了至少70倍。

进一步将该系统应用于测定五种细胞中mir-122的含量。首先，我们采用Trizol试剂(DP405，天根公司)提取Huh-7，MCF-7，HepG-2，HL-60及HeLa五种细胞中的总RNA，用分光光度计对所提取的总RNA含量和纯度进行分析。以上述细胞中提取的总RNA为样品，按照上述方法进行芯片RT-PCR实验。对于Huh-7细胞，在总RNA加入量为3pg-3000pg的范围内，总RNA加入量与得到的CT值呈现出良好的线性关系(附图6a)。这说明样品量在这个范围内可以得到准确地定量分析，因为通常认为每个细胞中总RNA的量在15-25pg，也显示了该系统在单细胞分析水平的潜力。附图6b显示了五种细胞中mir-122的表达量，将本系统与商品化实时定量PCR仪(ABI 7500)的测定数据进行比较，得到比较一致的结果。

实施例4SYBR Green法qPCR

实施例3采用的是TaqMan探针试剂盒进行的qRT-PCR检测系统，除了TaqMan探针以外，SYBR Green染料法也是非常普遍应用的qPCR分析技术，发明人进一步将该系统用于SYBR Green法qPCR。发明人选择商品化的

Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara)，液滴生成方法同实施例3。实验中所用模板为pre-mir-21及其反转录产物，pre-mir-21为mir-21的前体，长度为72nt，采用体外转录技术合成，其序列和反转录、PCR引物分别见表1。

表1引物序列

发明人在实验中发现商品化试剂所得到的扩增产物荧光强度很低，推测液滴芯片由于使用了石蜡油，可能会与SYBR Green染料发生相互作用，抑制了其对双链DNA产物的荧光标记。因此，发明人在该试剂盒中加入不同浓度的SYBR Green染料，qPCR结果如附图7所示。不添加SYBR Green染料时，荧光强度较弱，不足以进行定量分析，SYBR Green染料添加量在0.1-0.5μL每5μL反应体系之间变化时都可以得到较高的荧光强度。

实施例5实时定量滚环扩增分析DNA

实施例3和实施例4均为qPCR分析体系，本发明还适用于等温扩增体系，例如，环介导恒温扩增(LAMP)，滚环核酸扩增(RCA)，依赖核酸序列扩增(NASBA)技术等。

以RCA技术为例，演示该系统对于等温扩增定量分析的适用性。引物序列见附表1。首先，取5μL5’端磷酸化的122-circle(50μM)加到离心管中，再加DNA-1223.5μL和10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，在PCR仪上从95℃开始退火，-2℃/min到15℃。所得产物加如下试剂配成25μl反应体系：10×T4DNA Ligase缓冲液1.5μl；DEPC水12μl；Taq Ligase 2μl。混匀，在PCR仪上16℃反应1.5h，再升温到65℃使酶变性20min，得到连接产物。配制25μlRCA反应体系：上述连接产物1μl，10×Thermopol缓冲液2.5μl，2.5μM dNTP 1μl，primer1和2(100μM)各0.5μl，20×SYBR Green I(厦门百维信生物科技)0.3μl，BST大片段DNA聚合酶(NEB)0.8μl，再用DEPC水补充至25uL。在PCR仪上65℃反应1h，然后反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如附图8所示。图中从左至右各泳道分别为DL2000DNAmarker，空白对照，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷和10¹¹拷贝样品。。

将芯片浸泡在含有2％固相RNase清除剂溶液中5min后，冲洗干净，放在表面皿中，在50℃烘箱中烘干。在6×6孔芯片上第一列前两个孔中分别加0.5μlDEPC水作为空白和定位，加入200μl石蜡油，在第一列剩下的四个孔中加0.5μl空白溶液，其余五列加25μlRCA反应体系，每个样品平行试验六次。加样完毕后，芯片放入事先搭好的用于荧光检测的温控装置中，调好位置，启动控制程序，在65℃进行反应，开始RCA反应同时每隔30s采集一次图像，1.5h后停止反应。结果如附图9所示，其中a是PCR扩增曲线，b是标准曲线，数据处理方法与实例3相同。标准曲线的线性相关系数R²为0.9976，最低检测拷贝数已到10³/液滴，线性范围在10³-10⁷拷贝数。

Claims

1.一种液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO₂氧化层、由SiO₂氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述亲水坑阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接；所述光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列为按如下步骤得到：将单晶硅片或玻璃片在1000-1300℃氧化反应表面生成SiO₂氧化层，然后使SiO₂氧化层上硅烷化生成硅烷层，在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90℃加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0.5-0.7%NaOH溶液中显影2～8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出单晶硅片或玻璃片，用去离子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列；将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在芯片表面的阵列区域周围作为护栏，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片；所述掩膜上的阵列点为圆点，阵列点的直径大小为50um-300um。

2.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述的护栏由环形玻璃制成。

3.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述芯片按如下方法制得：以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到：单晶硅片或玻璃片在1000-1300℃高温炉内氧化反应2-4小时，表面生成SiO₂氧化层，然后置于1%的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2-4小时，使SiO₂氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90℃加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0.5-0.7%NaOH溶液中显影2-8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出硅片，用去离子水清洗，除去表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在芯片表面的阵列区域周围作为护栏，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片。

4.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述芯片是以单晶硅片为材料，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到：单晶硅片在1100℃高温炉内氧化反应2小时，表面生成SiO₂氧化层，然后置于1%的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2小时，使SiO₂氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于90℃加热坚膜10分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250～350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片加入0.7%NaOH溶液中显影2-8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为：1mol/L HF、0.5mol/L NH₄F和0.75mol/L HNO₃，然后取出单晶硅片，用去离子水清洗，除去硅片表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，再将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在阵列区域周围，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片。

5.如权利要求1～4之一所述的液滴阵列PCR芯片的应用，其特征在于应用于实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用采用包括以下装置的检测系统：液滴阵列PCR芯片、覆盖于芯片阵列区域上方的光学透明的加热盖，用于加热芯片的热循环装置、置于芯片阵列区域上方45度方向的激发光源，置于芯片阵列区域正上方方向的CCD检测器，所述激发光源包括发光二极管、发光二极管前端依次设有15度透镜和带通激发光滤光片，所述CCD检测器包括可变焦镜头、CCD相机以及设于两者之间的带通荧光滤光片；所述发光二极管中心波长473nm，所述带通激发光滤光片的中心波长470nm、带宽10nm，所述带通荧光滤光片的中心波长535nm，带宽40nm。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述系统中，发光二极管和CCD相机均受控于一使两者同步开启的控制器。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述加热盖为氧化铟锡玻璃制成。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：向液滴阵列PCR芯片的阵列区域滴加足量的分子生物学级别液体石蜡油，用移液器向芯片上的亲水坑阵列位置滴加反应溶液，生成液滴阵列，再进行实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。