CN102159556A - 1,4-苯并嗪化合物及其衍生物作为治疗药物用于治疗神经变性病状 - Google Patents
1,4-苯并嗪化合物及其衍生物作为治疗药物用于治疗神经变性病状 Download PDFInfo
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Abstract
本发明包括用于抑制激酶活性以防御神经变性的组合物和方法，其包括提供给对象治疗影响量的1，4-苯并嗪化合物及其衍生物的步骤，所述神经变性包括疾病，如阿耳茨海默病、帕金森病或杭廷顿舞蹈病；以及病状，如缺血性发作。
Description
技术领域
本发明大体涉及神经变性病领域，并且更具体而言，涉及新的组合物和方法以防御神经变性，所述神经变性包括疾病，如阿耳茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或杭廷顿舞蹈病；和病状，如缺血性发作(缺血性中风，ischemic stroke)和外伤性脑损伤。
背景技术
在没有限制本发明范围的情况下，本发明的背景被描述与充当神经保护剂抵御神经变性病理疾病(pathologies)的新治疗化合物有关，所述神经变性病理疾病包括阿耳茨海默病、帕金森病或杭廷顿舞蹈病；和病状，如缺血性发作。
疾病，如阿耳茨海默病、帕金森病、ALS、杭廷顿舞蹈病以及病状如缺血性发作和外伤性脑损伤每年影响着数百万的个体，并对社会施加巨大的财政负担。这些病状的特点是神经元的异常和过度损失。现在还没有防止这些病理疾病中神经元死亡的有效策略。
神经变性病，如阿耳茨海默病(AD)以神经元纤维缠结、神经炎性斑和神经元细胞死亡为特征。阿耳茨海默病是一种退行性疾病和致死性疾病并且以脑中斑和缠结为特征，没有针对阿耳茨海默病的已知的治愈方法。尽管也存在不太普遍的早发性形式，阿耳茨海默病以其最常见的形式折磨着65岁以上的个体。
发明内容
利用神经变性的组织培养范例，本发明者已经合成并针对预防神经元死亡的能力筛选了小分子化学化合物。这些研究已经引起了对作为具有有效神经保护活性的化合物的2-亚苄基-2H-1，4-苯并
嗪-3-(4H)-酮的识别。本文已经证明2-亚苄基-2H-1，4-苯并
嗪-3-(4H)-酮及其衍生物能够保护脑中的敏感神经元群，并因而代表了治疗神经变性病状的治疗途径。现在还没有治愈、减轻或治疗神经变性疾病的有效策略。以前并没有表明1，4-苯并
嗪-3-(4H)-酮类化合物防御神经变性。这些化合物代表了一种新的治疗工具。
本发明包括1，4-苯并
嗪化合物，如HSB13及其衍生物作为在治疗神经变性疾病中的新治疗工具，所述神经变性疾病包括、但不限于阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化，以及神经病状，如缺血性发作和外伤性脑损伤。本发明包括组合物以及制作和使用组合物的方法，所述组合物包括许多不同的1，4-苯并
嗪化合物及其衍生物。1，4-苯并
嗪化合物及其衍生物在神经变性的组织培养模型中被评价。这些化合物在神经变性的不同组织培养模型中是保护性的。
本发明描述了在神经变性的组织培养模型中高度神经保护性的1，4-苯并嗪类的几种化合物。借助假设并且绝不限制本发明，发现使用药理学抑制剂提出了这些化合物的作用机制不涉及Raf-MEK-ERK或PI 3激酶-Akt信号通路，也不涉及其它的存活促进分子，如蛋白激酶A(PKA)、钙-钙调蛋白激酶A(CaMK)和组蛋白脱乙酰酶(HDACs)。
1，4-苯并嗪化合物及其衍生物被发现在以化学方法诱导的杭廷顿舞蹈病的小鼠模型中减少纹状体变性(striatal degeneration)并改善行为特性。包括化合物如HSB-13、HSB-22和ASK-2的几种1，4-苯并
嗪保护培养的小脑颗粒神经元免于由低钾处理引起的死亡。HSB-13保护HT-22成神经细胞瘤细胞免于同型半胱氨酸(HCA)引起的神经毒性。也发现ASK-2保护原代皮层神经元免于HCA引起的神经毒性。HSB-13在杭廷顿舞蹈病的3-硝基丙酸小鼠模型中降低纹状体变性并改善行为特性。
本发明描述了对这些化合物中的一种——(Z)-6-氨基-2-(3，’5’-二溴-4’-羟基(hydrozy)亚苄基-2H-苯并[b][1，4]
嗪-3(4H)-酮，其被指定为HSB-13——在3-硝基丙酸(3-NP)诱导的杭廷顿舞蹈病小鼠模型中的研究。HSB-13在被给予3-NP的小鼠中减少了纹状体变性并改善了行为特性。发明者发现，化合物HSB-13在得到充分表征和接受的杭廷顿舞蹈病模型系统和淀粉样前体蛋白(APP)毒性果蝇(Drosophila)模型中是保护性的。本发明HSB-13化合物家族及其新产生的衍生物代表了神经变性疾病治疗中新的治疗工具。
本发明包括1，4-苯并
嗪化合物如HSB13及其衍生物，作为神经变性疾病治疗中新的治疗工具，所述神经变性疾病包括、但不限于阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化，以及神经病状，如缺血性发作和外伤性脑损伤。本发明描述的化合物在对象，例如人类、非人类灵长类动物、大鼠、小鼠和蝇(fly)中提供神经保护。本发明包括组合物以及制作和使用组合物的方法，所述组合物包括许多不同的1，4-苯并
嗪化合物及其衍生物。1，4-苯并
嗪化合物及其衍生物在神经变性的组织培养模型中被评价。令人惊奇的是，发现这些化合物在不同的神经变性组织培养模型中是保护性的。
通过调节对象中一个或更多个神经元的死亡、异常或过度损失，影响对象中的神经毒性、运动表现和/或淀粉样前体蛋白和其它部分的毒性效应，本发明的化合物提供神经病状的调节。
1，4-苯并
嗪化合物及其衍生物被发现在以化学方法诱导的杭廷顿舞蹈病小鼠模型中降低纹状体变性并改善行为特性。包括化合物如HSB-13、HSB-22和ASK-2的几种1，4-苯并
嗪保护培养的小脑颗粒神经元免于由低钾处理引起的死亡。HSB-13保护HT-22成神经细胞瘤细胞免于同型半胱氨酸(HCA)引起的神经毒性。它也保护皮层神经元免于β-淀粉样蛋白(Aβ)引起的神经元死亡——充分表征并通常使用的阿耳茨海默病组织培养模型。ASK-2保护原代皮层神经元(primary cortical neurons)免于HCA引起的神经毒性。HSB-13在3-硝基丙酸杭廷顿舞蹈病小鼠模型中降低纹状体变性并改善行为特性。
本发明包括下式的化合物：
其中，A和B选自：C、N、S、O。R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基、C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
通过识别需要调节神经病状的对象并为对象提供组分，本发明也提供防御、治疗、减少或调节对象中神经病状的方法。所述组分具有以下结构：
其中A选自：C、N、S、O；B选自C、N、S、O；R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基；C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
通过识别需要防御神经变性病状的对象并为对象提供治疗影响量的组分，本发明提供了减少、改进、治疗或防御对象中神经变性病状的方法，所述组分具有以下式：
其中A选自：C、N、S、O；B选自：C、N、S、O；R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基；C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
在另一个实施方式中，本发明也包括在对象中抑制激酶的组合物和方法，其包括以下步骤：识别需要防御增加的激酶活性的对象；提供对象有效降低对象中激酶活性的一定量的组合物，所述组合物包含以下式：
其中，A选自C、N、S、O；B选自C、N、S、O；R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基；C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
一方面，所述方法还包括测量对象中激酶活性水平的步骤。另一方面，需要防御激酶活性增加的所述对象具有神经病状，例如阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、中风或缺血性发作。一方面，病状包括病毒感染，例如反转录病毒感染如HIV。另一方面，激酶活性的降低防御神经病状，其包含一个或更多个神经元的死亡、一个或更多个神经元的丢失，预防一个或更多个神经元的毒性，改善的运动表现或防御淀粉样前体蛋白和其它部分的毒性效应。一方面，对象具有癌症。再一方面，被抑制的激酶包含GSK3α、GSK3β、p38β和B-Raf中的至少一种。另一个有关方面，被抑制的激酶包含CDK1、CDK2、ROCK1、JNK2、MLK3和c-Raf中的至少一种。抑制剂可以在例如100和500nM(纳摩尔)之间被提供。所述方法还可以包括在提供给对象化合物之前确定GSK3α、GSK3β、p38α、p38β、B-Raf、CDK1、CDK2、JNK2、JNK3和MLK3中至少一种的活性、并且然后在处理后确定活性的步骤。
本发明的另一个实施方式提供了用于治疗疾病的方法和组合物，所述疾病涉及细胞凋亡失调，包括癌症、自身免疫性疾病、AIDS和其它免疫系统疾病。同样地，本发明提供了用于治疗受激酶影响的病状的方法和组合物，例如其活化作用对神经元存活有害的激酶的抑制。本发明提供了用于影响例如GSK3α、GSK3β、p38β和B-Raf的激酶活化作用的方法和组合物。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优势，参考本发明的详细说明以及附图，并且其中：
图1是显示1，4-苯并
嗪化合物防御LK-引起的神经元死亡的图。小脑颗粒神经元的培养物被转换到HK培养基、LK培养基或含有五种1，4-苯并
嗪化合物——HSB-13、HSB-5、HSB-22、ASK-2a和HSB-20中的一种的LK培养基上。所有化合物以25μM的浓度被使用。生存力(生存能力)由相差显微术、DAPI-染色(凋亡神经元由压缩的或片段化的细胞核检测)或TUNEL-染色(凋亡细胞核被标记为绿色)在24小时之后评价。DAPI和TUNEL染色图来自相同的区域(field)。虽然HSB-13、HSB-5、HSB-22和ASK-2a是保护性的，但HSB-20不是；
图2是四种神经保护性苯并
嗪的一些结构的示意图。HSB-13、ASK-2、ASK-2a和HSB-13的结构被显示。如正文中所描述的，ASK-2a显示了比ASK2高得多的神经保护性。HSB-13显示了最高的神经保护性；
图3是显示抑制信号转导通路对1，4-苯并
嗪神经保护的效果的图。小脑颗粒神经元的培养物被转换到LK培养基、含有HSB-13的LK培养基或含有HSB-13和PD98059(40μM)、U0126(10μM)、渥曼青霉素(100nm)、Akt抑制剂-X(5μM)、KN-62(10μM)、H89(10μM)和TSA(1μM)中任意一种的LK培养基。生存力由DAPI染色在24小时后量化。结果针对对照培养物中的生存力进行标准化，所述对照培养物被转换到HK培养基；
图4是显示在用保护性1，4-苯并
嗪化合物处理的神经元培养物中信号蛋白的蛋白质印迹分析的图。小脑颗粒神经元的培养物被转换到HK培养基、LK培养基或含有HSB-13、HSB-22或ASK-2a的LK培养基上3小时。总细胞溶解产物被制备，并使用针对磷酸-Akt(Ser473)、磷酸-MEK、磷酸-ERK和磷酸-GSK3的抗体由蛋白质印迹法分析。针对α-微管蛋白的抗体也被使用，以显示相似量的细胞溶解产物被加入到每个泳道中；
图5是显示苯并嗪对c-jun和ATF-3表达的影响的图。小脑神经元培养物经HK培养基、LK培养基或含有25μM HSB-13、25μM ASK-2a或25μM HSB-22的LK培养基处理3小时。全细胞溶解产物然后被制备，并用针对c-jun和ATF-3的抗体进行蛋白质印迹分析。针对α-微管蛋白的抗体也被使用，以显示相似量的溶解产物被加入到每个泳道；
图6A和6B显示HSB-13对HT-22细胞的影响和细胞死亡的量化。图6A显示HSB-13对HT-22细胞抵御HCA引起的毒性的保护作用。不用添加剂(Un)、用1.5mM HCA或1.5mM HCA加上25μM HSB-13、25μM ASK-2a和25μM HSB-22处理HT-22细胞：在图6A中，由相差显微术(相)显现在处理之后24小时培养物的出现。用DAPI和TUNEL染色评价细胞死亡；图6B显示由DAPI染色量化神经元生存力。生存力表示为未处理培养物(对照)的百分比；
图7A和7B显示HSB-13在神经保护和运动活性中的作用。图7A是显示HSB-13抵御体内3-NP神经毒性的保护作用的图：在图7A中，组织学分析。来自对照、3-NP和3-NP+HSB-13处理小鼠的40μm冠状切片的甲酚紫染色。上图：显示纹状体中细胞的选择性损失的低放大倍率；下图：纹状体背外侧部分的高放大倍率图；图7B显示总结被给予生理盐水(对照)、3-NP和3-NP+HSB-13的小鼠的运动活性测量的图。给予的剂量和条件在方法中被详细描述。在15分钟的时间内测量活性。显示的是：a)总运动时间；b)总运动距离；c)每次运动的平均距离；d)平均速度；条表示均值±SD。*表示3-NP和3-NP+HSB-13值之间的统计显著性(P值＜0.05)。用非配对的、双尾学生T检验进行统计学分析；和
图8是显示HSB-13在果蝇中防御APP695引起的毒性的图。表达人类APP695的蝇存活与对照相比。用HSB-13处理显著地增加了APP表达蝇的存活率。n＝用15-20只蝇的组的独立研究的数目。条表示均值±SEM。图8是显示HSB-13保护HT-22细胞免于HCA引起的毒性的图。不用添加剂(对照)、用2mM HCA或2mMHCA+25μM HSB-13处理HT-22细胞。显示了处理之后24小时培养物的出现。
图9是显示HSB-13保护HT-22细胞免于HCA引起的毒性的图。不用添加剂(对照)、用2mM HCA或2mM HCA+25μM HSB-13处理HT-22细胞。显示了处理之后24小时培养物的出现。
图10A和10B是显示3-NP在体内防御3-NP神经毒性的图。图10A：组织学分析。来自对照、3-NP和3-NP+HSB-13处理的小鼠的50μm冠状切片的甲酚紫染色。给予的剂量和条件在方法中被详细描述。上图：显示纹状体中细胞选择性损失的低放大倍率；下图：纹状体背外侧部分的高放大倍率图。图10B：运动活性分析。被给予生理盐水(对照)、3-NP和3-NP+HSB13的小鼠的运动活性测量。给予的剂量和条件在方法中被详细描述。在15分钟的时间内测量活性。显示的是：A)总运动发作(事件，episodes)；B)总运动距离；C)平均速度；D)垂直平面进入。条表示均值±SD。
具体实施方式
虽然本发明的各种实施方式的制作和使用以下被详细论述，但应该理解，本发明提供了可以在很多种具体背景下体现的许多可应用的发明概念。本文所论述的具体实施方式对制作和使用本发明的具体方式仅是说明性的，而并非限定本发明的范围。
为了促进对本发明的理解，以下定义了一些术语。本文中定义的术语具有本发明相关领域技术人员一般所理解的意思。术语，如“一(a、an)”和“该(the)”并不意图仅仅指单数实体，而是包括可以用具体实施例来说明的其一般类别。本文的术语被用于描述本发明的具体实施方式，但其使用并不限定本发明，除非在权利要求书中有所列举。
神经变性疾病，如阿耳茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)，破坏患者的生活质量，给家庭看护者造成巨大的负担，并且每年花费社会数十亿美元。患神经变性疾病的最稳定的风险因子是衰老。因为寿命预期的明显提高，受衰老相关病折磨的个体的发生率正在上升，这代表了主要的健康问题。这种多样疾病之间的共性是某些神经元群的进行性和持续性损失。目前用于神经变性疾病的药物仅减轻与这些疾病有关的症状，但并不影响其基础病因，例如神经元的变性。因为神经元损失持续不减弱，这种姑息性治疗对疾病发展没有影响。识别神经元死亡的小分子抑制剂因而具有迫切的和重要的价值。
神经变性病，如阿耳茨海默病(AD)以神经元纤维缠结、神经炎性斑和神经元细胞死亡为特征。阿耳茨海默病是一种退行性疾病和致死性疾病并以脑中斑和缠结为特征，没有针对阿耳茨海默病的已知的治愈方法。尽管也存在不太普遍的早发性形式，阿耳茨海默病以其最常见的形式折磨着65岁以上的个体。神经变性病状每年侵袭越来越多的个体，而对于许多这些病状，常规治疗在治疗方式上贡献甚微。在一些情况中，神经变性病状尤其与特定疾病如多发性硬化有关，而在其它情况中，病状更常与衰老或身体的一些其它病状或过程，如，例如遗传病或自体免疫疾病有关。然而，这些病状的特征是虚弱和消弱的身体功能，而且有时候，也有消弱的脑功能。
发明者先前已经证明c-Raf的被称为GW5074{5-碘-3-[(3’，5’-二溴-4’-羟苯基)亚甲基]-2-吲哚满酮}的细胞渗透性化学抑制剂完全抑制由各种不同凋亡刺激物诱导的培养神经元的死亡(Chin et al.，2004)。在被给予3-硝基丙酸的小鼠内——通常使用的杭廷顿舞蹈病体内范例，GW5074也防止纹状体变性并改善行为特性。GW5074是3’取代的吲哚酮(Chin et al.，2004)。一些其它3-取代的吲哚酮也已被发现抑制神经元死亡(Johnson et al.，2005；Chen et al.，2008)。尽管是高度保护性的，但GW5074以及许多其它3-取代的吲哚酮在以较高浓度被使用时表现出毒性(Chin et al.，2004；Johnson et al.，2005；Chen et al.，2008)。结构-活性关系研究已经鉴定，虽然是神经保护性的，但额外的3-取代的吲哚酮即使在高剂量下对培养的神经元也是没有毒性的(Balderamos et al.，2008)。其它的研究者已经类似地识别了一些针对各种不同的促凋亡蛋白的神经元凋亡的化学抑制剂，所述促凋亡蛋白包括c-jun N-端激酶(JNK)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)、糖原合酶激酶(GSK3)和p53(D’Mello et al.，2005)。
本发明提供了几种1，4苯并嗪衍生物，所述1，4苯并
嗪衍生物是具有治疗价值的，并在撤钾诱导经历凋亡的培养小脑颗粒神经元中是神经保护性的。这些化合物中的一些也被检测抵御氧化应激和Aβ诱导的神经元死亡，并发现在无毒水平下是有效的。
被指定为HSB-13的这些化合物中的一种在杭廷顿舞蹈病3-硝基丙酸模型中被体内检测。HSB-13在小鼠中赋予显著的神经变性保护性，并改善了运动表现。HSB-13也在果蝇中防御淀粉样前体蛋白(APP)引起的毒性。这些研究将1，4-苯并
嗪化合物鉴定为具有治疗价值的抵御神经变性的新神经保护剂。
改善与一些神经变性疾病有关的症状的药物是可以获得的，然而，这些种类的治疗不减缓疾病发展，因为它们不阻止神经元的持续变性。现在还没有策略来停止神经变性病理疾病中神经元的异常损失。几种候选的化学化合物先前已经被识别，并且，这些化合物中的许多处于临床前实验中。有一些甚至已经在人类实验中被检测，但是不成功。2-亚苄基-2H-1，4-苯并
嗪-3-(4H)-酮化合物从未作为用于治疗神经变性病理疾病的候选药物而被检测过。
术语“烷基”、“链烯基”、“炔基”和“亚烷基”指通常在长度上范围从约1到约12个碳原子、优选为1到约6个原子的烃链，并且包括直链和支链。除非另有说明，本文指代的任意烷基或亚烷基的优选实施方式是C1-C6烷基(例如，甲基或乙基)。
“环烷基”指饱和的或不饱和的环状烃链，其包括桥连的、稠合的或螺环化合物，优选为包含3至约12个碳原子，更优选为3至约8个。
“芳基”意为一个或更多个芳香环，每个具有5或6个核心碳原子。多个芳环可以如在萘基中被稠合，或者如在联苯中不稠合。芳环也可以与一个或更多个环烃、杂芳基或杂环环稠合或不稠合。
“杂芳基”是含有从1到4个杂原子、优选为N、O或S或其组合的芳基基团，该杂芳基基团任选地在碳或氮原子(一个或更多个)处被C1-C6烷基、--CF3、苯基、苄基或噻吩基取代，或杂芳基基团中的碳原子与氧原子一起形成羰基基团，或者该杂芳基基团任选地与苯环稠合。杂芳环也可以与一个或更多个环烃、杂环、芳环或杂芳环稠合。杂芳基包括但不限于：具有一个杂原子的5元杂芳基(例如，噻吩、吡咯、呋喃)；在1、2或1、3位具有2个杂原子的5元杂芳基(例如，
唑、吡唑、咪唑、噻唑、嘌呤)；具有3个杂原子的5元杂芳基(例如，三唑、噻二唑)；具有3个杂原子的5元杂芳基；具有一个杂原子的6元杂芳基(例如，吡啶、喹啉、异喹啉、菲、5，6-环庚烯并吡啶)；具有2个杂原子的6元杂芳基(例如，哒嗪、噌啉、2，3-二氮杂萘、吡嗪、嘧啶、喹唑啉)；具有3个杂原子的6元杂芳基(例如，1，3，5-三嗪)：和具有4个杂原子的6元杂芳基。
“杂环”或“杂环的”意为5-12个原子、优选为5-7个原子的一个或更多个环，其具有或不具有不饱和或芳香特征，和不是碳的至少一个环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。多个环可以被稠合。
“杂原子”意为烃类似化合物中的任意非碳原子。例子包括氧、硫、氮、磷、砷、硅、硒、碲、锡和硼。
术语“亚烷基”指如上所定义的二价烷基基团，如亚甲基(-CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、氯亚乙基(-CHClCH2-)、2-硫代丁烯-CH2CH(SH)CH2CH2、1-溴代-3-羟基-4-甲基戊烯(-CHBrCH2CH(OH)CH(CH3)CH2-)和类似物。
术语“链烯基”表示含有一个或更多个碳-碳双键的分支或不分支烃链。
术语“炔基”指含有一个或更多个碳-碳三键的分支或不分支烃链。
术语“芳基”表示碳原子链，其形成具有优选为在约6-14个碳原子之间的至少一个芳香环，如苯基、萘基和类似物，而且其可以被一般与这样的链连接的一个或更多个官能团取代，所述官能团如羟基、溴、氟、氯、碘、巯基或硫代、氰基、氰基酰氨基(cyanoamido)、烷硫基、杂环、芳基、杂芳基、羧基、烷酯基(carbalkoyl)、烷基、链烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基和类似物，以形成芳基基团如，联苯、碘联苯、甲氧基联苯、蒽基、溴苯基、碘苯基、氯苯基、羟苯基、甲氧基苯基、甲酰苯基、乙酰苯基、三氟甲基苯硫基、三氟甲氧基苯基、烷基苯硫基、三烷基铵苯基、酰氨基苯基、噻唑基苯基、
唑基苯基、咪唑基苯基、咪唑基甲基苯基和类似物。
术语“烷氧基”表示--OR--，其中R为烷基。
术语“酰氨基”表示酰胺连接：--C(O)NHR(其中，R为氢或烷基)。
术语“氨基”表示胺连接：--NR--，其中R为氢或烷基。术语“羧基”表示--C(O)O--，以及术语“羰基”表示--C(O)--。
术语“烷基羧基”表示如上所定义的烷基基团，其被C(O)O基团取代，例如CH3C(O)O--、CH3CH2C(O)O-等。
术语“碳环”意为具有约5至约8个环碳的环状烃链，如环戊基、环己基等。这些基团可以任选地被一个或更多个如在上面“烷基”下所定义的官能团取代。
术语“卤素”包括氯、氟、溴、碘和其混合物。
术语“杂环”意为直链或环系统，其可以含有从0到4个选自N、O和S的杂原子，其中氮和硫原子任选地被氧化，以及氮原子(一个或更多个)任选地被季铵化。
术语“氨基甲酰基”指基团--C(O)NH2。
术语“羟烷基”意为被羟基基团取代的如上所定义的烷基基团。
术语“烷基羰基”，单独地或组合地，意为衍生自烷羧酸的酰基基团，即烷基-C(O)--，如乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、4-甲基戊酰基等。
除非另有说明，所有细胞培养基和试剂均购买自Invitrogen(Carlsbad，CA)，以及所有的化学药品均来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。无水溶剂购买自Fischer Scientific(Pittsburgh，PA)。PD98059、U0126、渥曼青霉素、Akt抑制剂-X、曲古抑菌素酸(trichostatin acid)A(TSA)、KN62、H89购买自Calbiochem(La Jolla，CA)。本文中使用的抗体如下：抗-磷酸-MEK(9121S)、抗-磷酸-AKT 473(9271S)、抗-磷酸-GSK3α/β(9331S)、c-Jun(2315S)购买自Cell Signaling Technology(Beverly，MA，USA)；抗ATF-3(C-19，sc-188)、抗-磷酸-ERK(E-40，sc-7383)、抗α-微管蛋白(TU-02sc-8035)购买自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA，USA)。所有的抗体均以1∶1000稀释被使用。
1，4-苯并
嗪化合物的合成。化合物HSB-1-7、HSB-11、HSB-12、HSB-14、HSB-15、ASK-1和ASK-2：适当的醛(15mmol)被加入到适当取代的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮(10mmol)、乙酸酐(4ml)和三乙胺(2ml)的混合物中。反应混合物被回流7小时，置于室温下过夜并倒入到碎冰中。通过过滤收集获得的固体并用乙腈洗涤(收率70-88％)。通过重结晶从乙醇中纯化粗产物。化合物HSB-8、HSB-11、HSB-12、HSB 14-19、HSB-24、ASK-1和ASK-2：适当的醛(15mmol)被加入到适当取代的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮(10mmol)、乙酸酐(4ml)和三乙胺(2ml)的混合物中。反应混合物被回流7小时，置于室温下过夜并倒入到碎冰中。通过过滤收集获得的固体并用乙腈洗涤(收率70-88％)。通过重结晶从乙醇中纯化粗产物。
HSB-13：在搅拌下将催化量的雷尼镍(Raney nickel)按份加入乙醇(20ml)中的HSB-1(2mmol)和水合肼(1ml)的混合物中。反应混合物被回流3小时，然后被过滤。滤液在减压下被蒸发至干燥。通过重结晶从乙醇中纯化粗产物(70％收率)。
HSB-23、HSB-25和Ask-2a：用碳酸钾(3mmol)在0℃，在甲醇(10ml)中处理这些化合物(HSB-2、HSB-24和ASK-2)(1mmol)各自的酯，并在室温下搅动3小时，得到各自的醇HSB-23、HSB-25和ASK-2a(70-75％收率)。
HSB-22：1份甲醇钠被加入到无水DMF(10ml)中的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮(10mmol)和吡咯-2-甲醛(16mmol)的混合物中。反应混合物被回流48小时，然后冷却到室温并倒入到碎冰中，并且置于4℃下过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用水洗涤并干燥。用乙醇(150ml)煮沸沉淀物并过滤同时加热以去除杂质。滤液在减压下被蒸发至干燥，而且，使用(95∶5)甲苯∶醋酸乙酯作为流动相在硅胶柱上对残余物进行色谱(21％收率)。
HSB-9和HSB-10：1份甲醇钠被加入到无水DMF(10ml)中的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮(10mmol)和4-二甲基氨基苯甲醛(16mmol)的混合物中。反应混合物被回流过夜，然后冷却到室温并倒入到碎冰中，并且置于冰箱中过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用水洗涤并干燥。通过重结晶分别从乙醇(30％收率)和DMF-乙醇(40％收率)中纯化粗产物(40％收率)。
HSB-20和HSB-21：1份甲醇钠被加入到无水DMF(10ml)中的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮(10mmol)和吲哚-3-甲醛(16mmol)的混合物中。反应混合物被回流24小时，然后冷却到室温并倒入到碎冰中，并且置于冰箱中过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用水洗涤并干燥。使用(9∶1)甲苯∶醋酸乙酯在硅胶柱上对粗产物进行色谱(25-30％收率)。
ASK-8、ASK-9和ASK-11：在无水苯(10ml)中含有2H-1，4-苯并噻嗪(benzothazin)-3(4H)-硫酮(2.7mmol)、适当的醛(3.3mmol)和催化量的哌啶的反应混合物于90℃被搅动4小时，然后冷却到室温。在冷却过程中沉淀的粗产物通过真空过滤被收集，用苯洗涤，干燥并通过柱色谱应用醋酸乙酯-己烷(1∶4v/v)在硅胶上纯化(86-90％收率)。
实施例1。反应-1：
(Z)-2，6-二溴-4-((3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]
嗪-2-亚基)甲基)乙酸苯酯：(0.5g，3.35mmol)的2H-1，4-苯并
嗪-3(4H)-酮、1.4g的4-羟基-3，5-二溴苯甲醛、1.68mL(17.729mmol)的乙酸酐和0.7mL(5mmol)的三乙胺的搅拌混合物被回流7小时，置于室温下过夜并倒入到碎冰中。通过过滤收集沉淀的固体，并用乙腈洗涤。通过重结晶从DMF：乙醇中纯化粗产物。
实施例2。反应-2：(Z)-2-(3，5-二溴亚苄基)-2H-苯并[b][1，4]
嗪-3(4H)-酮
(Z)-2-(3，5-二溴亚苄基)-2H-苯并[b][1，4]
嗪-3(4H)-酮。化学合成与实施例1，反应-1相同。
小脑颗粒神经元的培养和处理：颗粒神经元培养物如前所述地从6-7天大的Wistar大鼠的解离小脑中获得(D’Mello et al.，1993)。细胞以1×106细胞/孔的密度被铺在Basal Eagle′s培养基(BME)包被的24-孔平皿中，所述培养基补充有聚-L-赖氨酸中的10％胎牛血清(FCS)、25mM KCl、2mM谷氨酰胺(Invitrogen)和100μg/ml庆大霉素。在铺板后18-22小时，胞嘧啶阿拉伯呋喃糖苷(10μM)被加入到培养基中，以防止非神经元细胞复制。由我们实验室和其它研究者先前进行的免疫细胞化学分析已经表明，这些培养物具有含有超过95％颗粒神经元的高纯度(Thangnipon et al.，2003；Kingsbury et al.，2005)。
在处理之前，神经元培养物被保持7-8天。对于处理，细胞被漂洗一次，然后被保持在低K+培养基(无血清BME培养基；被称为LK)中，或者在对照培养物的情况下，被保持在高K+培养基(无血清BME培养基，其补充有20mM KCl；被称为HK)中。对于处理，化学化合物(溶于二甲亚砜中)以1、5或25μM的浓度在从HK转换时被直接加入到LK培养基中。通过4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI)染色(参考以下)评估24小时生存力。每个化合物被重复检测两次(在每种浓度下)，而且该试验重复至少3次。
用HK、LK或补充有各种化合物的LK培养基处理的神经元培养物的生存力状况由相差显微术评价，并通过用如前所述的DAPI染色细胞核来量化(Yalcin et al.，2003；Morrison et al.，2006；Majzadeh et al.，2007)。简单来说，细胞于4℃被固定在4％低聚甲醛中20分钟。在磷酸缓冲盐水中洗涤之后，二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI；磷酸缓冲盐水中1μg/ml)于室温下被加入15分钟，并在紫外光(260nm)下观察。具有压缩或片段化的细胞核的细胞被记为死亡。生存力已经被表示为对照培养物的百分比，所述对照培养物被转换到HK培养基。用非配对的、双尾学生T检验进行统计学分析，与接受LK处理的对照培养物的平均神经元存活相比。
小鼠HT-22成神经细胞瘤细胞系购买自ATCC(Manassas，VA，USA)，并被培养在Dulbecco改进的Eagle’s培养基(DMEM)上，其具有4.5g/L葡萄糖(没有丙酮酸钠)，补充有10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。培养物以～30％的汇合被铺板，用于HCA处理。HCA被制备为150mM储藏液，其被调至pH7.5并以终浓度1.5mM被使用。
皮层神经元的原代培养物培养自胚胎18天的大鼠。1-2天后，用5μM的老化的Aβ肽(Aβ25-35；购买自Sigma-Aldrich)处理培养物。24小时之后检验神经元生存力。
用来自Promega(Madison，WI)的DEADENDTM Fluorometric TUNEL System、根据生产商指示，在处理培养物后24小时，进行神经元培养物的TUNEL检验。对于活性胱天蛋白酶3的免疫细胞化学分析，神经元培养物细胞被固定，并用0.2％Triton处理5分钟。在用含有PBS中5％BSA和5％山羊血清的PBS封闭30之后，用活性胱天蛋白酶-3一抗于4℃将盖玻片温育过夜。在用磷酸缓冲盐水(PBS)进行3次洗涤之后，用二抗于25℃将细胞温育45分钟，其后，用PBS洗涤细胞。为了显现细胞核，用DAPI于25℃将细胞染色15分钟。
培养基被去除，并且细胞用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并于裂解液[1％Triton、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mMEGTA、2.5mM焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸盐、1mM Na3VO4、1μg/mL亮抑蛋白酶肽和1蛋白酶抑制剂混合物]中裂解。蛋白质浓度被测量，并用Bradford蛋白质检验试剂(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)标准化。在标准化之后，40μg的蛋白质被进行蛋白质印迹分析。免疫反应性由增强的化学发光测验(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ，USA)。
3-硝基丙酸给予和行为评价在8周龄C57BL/6雄性小鼠(Charles River Laboratories，Inc，Wilmington，MA)上进行，所述小鼠以10次腹膜内注射被给予3-NP(50mg/kg，5天，一天两次)，具有或不具有HSB-13(2mg/kg)。在3-NP给予之前30分钟进行HSB-13注射。对照动物接受盐水注射。在注射5天后的那天，用TRU-SCAN
活性监控系统(Coulborn Instruments，PA)如前所述地(Chin et al.，2004；Chen et al.，2008b)评估运动活性。以下行为参数被选择：(1)总运动时间、(2)总运动距离：在地平面(floor plane)所有矢量X-Y坐标变化的总和、(3)每次运动的平均距离、(4)平均速度：所有X-T坐标变化定义的运动的平均速度。在行为评价之后，小鼠被深度麻醉，并且脑被去除。脑被固定于0.1M磷酸盐缓冲液中的4％低聚甲醛中，并于0.1M磷酸盐缓冲液中的20％蔗糖中被低温保护。以40微米在恒冷切片机上切割冠状切片，并用甲酚紫(Sigma-Aldrich)如前所述地染色(Chin et al.，2004；Chen et al.，2008b)。
使用UAS/GAL4体系(Brand and Perrimon，1993)，通过将携带UAS-APP695构建物(Fossgreen et al.，1998)的转基因蝇与含有肌动蛋白-GAL4启动子的蝇杂交，人类APP695的表达被普遍地诱导。蝇于25℃，在黑暗中，在含有不同浓度HSB-13(0、2.5、5和50μM)的10％酵母浆上被饲养。通过将其与在相同杂交中获得的并因而在如前所述的同一条件下被饲养的不携带启动子构建物的对照后代相比，确定存活APP695表达后代的百分比(Greeve et al.，2004)。
当培养的小脑颗粒神经元从HK被转换到LK培养基上时，约50％的细胞在24小时内经历了凋亡(D’Mello et al.，1993)。发明者利用这种广泛使用并公认的模型来检测总共20种不同1，4-苯并
嗪衍生物防御LK引起的神经元死亡的能力。每种化合物以三种不同的剂量——1μM、5μM和25μM被检测，并且由DAPI染色量化生存力。最高剂量被包括在内，以检测化合物可能的毒性效应。使用TUNEL染色确认关键结果，所述TUNEL染色是对凋亡的另一种可靠检验(图1)。如表1和图1所示，本发明识别了具有显著神经保护作用的几种化合物。两种最具保护性的化合物是HSB-13和HSB-22，它们均具有Ar＝3’，5’-二溴-4’-羟苯基(图1)。这些化合物在1μM下提供有力的保护，并且在本研究使用的两种更高剂量下，保护作用被保持。显示高水平神经保护性的另一种化合物是ASK-2a(Ar＝3’，5’-二溴-4’-羟苯基)。用该化合物的保护性低于在两种较低剂量下用HSB-13和HSB-22所观察到的保护性。包括HSB-4、HSB-9、ASK-8和ASK-9的一些化合物在1μM剂量下显示最大或接近最大的功效。为了测验较高水平的保护是否能在低于1μM的剂量下被观察到，这些化合物的分析被延伸到0.5、0.25和0.1μM的剂量。在所有的情况中，在这些剂量下保护性低于在1μM剂量下观察到的保护性。因此，1，4-苯并
嗪化合物保护培养的神经元免于凋亡。
基于化合物的结构和其提供的神经保护的范围，可以得出以下结论：(a)在与ASK-2a相比时，用HSB-13和HSB-22观察到的稍高水平的保护，这可能与6位上取代基团的缺乏有关，(b)HSB-13和HSB-22中4’-OH的重要性通过ASK2的降低的保护性(图2)和3’，5’-二溴(ASK-1)以及3’，4’，5’-三甲氧基(HSB-6)衍生物的神经保护缺失显现出来，所述ASK2具有4’-OAc基团而非4’-OH基团，(c)除了在5μM是保护性的HSB-7(吡啶-2-基)之外，杂环衍生物，即HSB-11(噻吩-2-基)、HSB-12(噻吩-3-基)、HSB-4(噻吩-3-基)是无活性的，和(d)4’-OH到4’-OCOCH3酯的转换产生混合的结果。例如，化合物HSB-2(6-Cl)、HSB-5(6-F)和HSB-3(6-甲基)在25μM是高度保护性的，而HSB-1(6-硝基)在5μM是有效的、但在其它两种检测浓度下是无效的。相比之下，4’-OH化合物HSB-13(6-NH2)、HSB-22(6-Cl)和ASK-2a(6-H)在所有3中浓度下均是有效的。
先前用3-取代的吲哚酮进行的研究揭示，在2位上C＝S对C＝O的取代完全地破坏了神经保护活性(Balderamos et al.，2008)。然而，在包含于本发明中的苯并嗪的情况下，ASK-9(吡咯-2-基和N-Me)和ASK-11(2’，5’-二甲氧苯基)显示了显著水平的保护。然而，ASK-8(噻吩-2-基)是无活性的。
表1：21种化合物各自在3种浓度(1、5和25μM)下被检测，并被加入到LK培养基。存活以接受HK培养基的对照培养物中的存活百分比来表示。数据代表至少3种研究的平均值，每种研究被重复2次进行。在LK培养基中没有任何添加剂，平均存活为48％。
*p＜0.01与接受LK的培养物的生存能力相比
Raf-MEK-ERK和PI-3激酶-Akt信号转导是哺乳动物细胞中两个充分确立的和强大的抗凋亡通路，其介导一些神经营养多肽、药剂和神经保护性化合物的保护作用(D’Mello and Chin，2005；Hetman et al.，2006)。为了确定这些通路中的任意一种是否涉及1，4-苯并
嗪的神经保护性作用，发明者研究了这些通路的药理学抑制是否影响它们的神经保护功效。如图3所示，两个结构上不同但高度选择性的MEK抑制剂PD98059和U0125都没有降低借助HSB-13的神经保护性。相似地，检测的化合物(PI-3激酶抑制剂、渥曼青霉素、Akt抑制剂X或商业上可购买的Akt抑制剂)均没有降低HSB-13保护神经元免于LK引起的凋亡的能力(图3)。在这些研究中使用的剂量下，这些抑制剂完全地抑制由HK处理导致的ERK或Akt刺激。如对于HSB-13所观察到的，MEK-ERK和PI-3K-Akt通路的药理学抑制对于ASK-2a或HSB-22的神经保护作用没有影响。
进行蛋白质印迹分析，以确定通过1，4-苯并嗪的神经保护不涉及MEK-ERK或PI3激酶-Akt信号转导的活化作用。MEK、ERK和Akt的活化作用需要它们的磷酸化，所述磷酸化可以用磷酸-特异性抗体检测。如本发明者和其它人先前所报道的(Chin et al.，2004；Johnson et al.，2005；Majdzadeh et al.，2008)，在小脑颗粒神经元的LK处理后，MEK和ERK磷酸化减少。这种减少并不被HSB-13、HSB-22或ASK-2a所阻止(图4)。在Ser473上的Akt磷酸化在LK处理6小时时也稍微地减少(Chin et al.，2004；Johnson et al.，2005；Majdzadeh et al.，2008)。这也不受用ASK-2a或HSB-22处理的影响(图4)。然而，HSB-13抑制Akt(Ser473)磷酸化，甚于在LK中所观察到的。HSB-13和两种其它神经保护性化合物之间磷酸化方式明显的差异表明，HSB-13与HSB-22和ASK-2a不同地影响信号分子。
因为Raf-MEK-ERK和PI-3激酶-Akt通路不是通过HSB-13的神经保护所需的，已知促进神经元存活的其它信号分子的包含得以确定。GSK3β是促凋亡分子，其在许多神经或非神经系统中的凋亡过程中被激活。在促进存活的条件下，通过在抑制位点的磷酸化，GSK3β被保持失活，所述在抑制位点的磷酸化是一种可以被Akt以及其它激酶诱导的修饰。如图4所示，GSK3β的去磷酸化不被HSB-13抑制。相比之下，HSB-22和ASK-2a抑制GSK3β的去磷酸化。
用HK对小脑颗粒神经元的处理激活钙-钙调蛋白激酶(CaMK)，以及用药理学抑制剂如KN-62对CaMK的抑制抑制HK介导的存活(See et al.，2001；Linseman et al.，2003；Morrison et al.，2006)。然而，通过HSB-13的神经保护没有被KN-62处理降低(图3)。本发明者认识到，几个研究者已经证明环AMP类似物和蛋白激酶A的药理学激活剂在其它促进存活刺激物不存在的情况下促进小脑颗粒神经元以及其它神经元型的存活(Rydel and Greene，1988；D’Mello et al.，1993；Hanson et al.，1998)。PKA介导的神经元存活被用H89的处理阻断，H89是有效的和选择性的PKA抑制剂(Li et al.，2000；Bhave and Hoffman，2004)。如图3所示，用H89的处理对HSB-13介导的神经保护没有影响。发明者先前已经报道过，组蛋白脱乙酰酶抑制剂如曲古抑菌素A阻断HK维持小脑颗粒神经元存活的能力(Salminen et al.，1998；Boutillier et al.，2002；Morrison et al.，2006)。然而，TSA处理也没有显著地抑制HSB-13的神经保护功效(图3)。
C-jun表达在各种组织培养物和神经元凋亡的体内范例中被诱导(Schenkel et al.，2004)。该转录因子的活化作用已经被证明对于LK引起的小脑颗粒神经元以及其它神经元死亡模型中的神经元死亡是必需的(Estus et al.，1994；Ham et al.，1995；Watson et al.，1998)。如图5所示，LK对c-jun表达的诱导被HSB-13、HSB-22和ASK-2a抑制。用HSB-13的处理抑制了c-jun表达，甚至低于在HK处理的培养物中所观察到的。其表达在凋亡过程中在神经元中被刺激的另一个转录因子是ATF-3，其是CREB蛋白质家族的一个成员，其已经被证明在不同的模型中促进神经元死亡(Hai et al.1999；Vlug et al.2005；Chen et al.，2008a)。使用siRNA对ATF-3表达的阻抑抑制LK介导的小脑颗粒神经元死亡，这已经被本发明者先前描述过(Chen et al.，2008a)。如图5所示，LK介导的ATF-3增加被所有三种神经保护性苯并
嗪所抑制。如用c-jun所观察到的，用HSB-13的阻抑是最有力的。结果，这些组合物能抑制c-jun和ATF-3的活性，这进而在治疗癌症和癌蛋白如c-jun中发挥作用。
用同型半胱氨酸(HCA)对小鼠成神经细胞瘤HT-22细胞系的处理通过谷胱甘肽缺乏失和氧化应激诱导凋亡(Murphy et al.1990；Ratan et al.1994a，1994b)。发明者研究了HSB-13、HSB-22和ASK-2a在此氧化应激引起的神经元死亡范例中是否是保护性的。如图6A和6B所示，HSB-13防止HCA引起的细胞死亡。尽管最高保护性在25μM的浓度下被观察到，但在5μM下，HSB-13也提供有力的保护。令人惊奇的是，鉴于它们的结构相似性，在这三种测验的剂量的任意一种下，ASK-2a和HSB-22不能进行保护(数据未显示)。所有三种苯并
嗪防御LK介导的神经元死亡、但仅HSB-13是防御HCA引起的凋亡的发现表明，这两个范例中潜在的凋亡分子机制是不同的。此外，该结果表明，在6位的氨基(参考图2)是防御HCA毒性所必需的。我们也发现，HSB-13保护原代培养物或皮层神经元免于Aβ毒性。因此，HSB-13而非ASK-2a和HSB-22对于氧化应激引起的神经元死亡是保护性的。
小脑颗粒神经元培养物和HT-22细胞显示，HSB-13在组织培养范例中具有强大的和多样的神经保护功效。在啮齿动物和非人类灵长类动物中给予硝基丙酸(3-NP)复制包括选择性纹状体变性、自发性舞蹈病和张力障碍性运动的HD临床和病理生理学特点中的大多数。这一神经毒素的给予因此作为HD的有用的模式(Brouillet et al.，1999)。本发明者研究了在该体内范例中的HSB-13功效。如图7A所示，被给予3-NP的小鼠显示广泛的纹状体损害。在2mg/kg体重的浓度下给予HSB-13时，这种变性被HSB-13充分地降低(图7A)。通过HSB-13防御3-NP引起的纹状体神经变性的保护与运动表现的显著改善相关(图7B)。尤其地，均通过3-NP给予而被消弱的总运动时间、总运动距离、每次运动的平均距离和运动的平均速度在接受HSB-13的动物中明显较高，证明了HSB-13在杭廷顿舞蹈病(HD)的体内模型中是神经保护性的。
通过使用普遍表达APP695的蝇模型，本发明者也研究了HSB-13对APP引起的毒性的有利作用(Greeve et al.，2004)。如图8所示，与不表达APP695的在相同条件下被饲养的对照蝇相比，未处理的蝇显示仅约5％的存活率。与被同样处理的对照蝇相比，在含有增加的HSB-13浓度的食物上饲养这些蝇导致APP表达蝇的存活率的显著增加，其范围从50μM下的65％到50μM下的44％。与未处理的蝇相比，这些存活率约高10倍(所有P值＜0.05)，这说明HSB-13在果蝇体内模型中也防御APP引起的毒性。
因此，本发明描述了防御LK引起的小脑颗粒神经元凋亡的几种新的化合物。本发明的重点是这些化合物中的三种——HSB-13、HSB-22和ASK-2a。尽管在结构上是相似的，但这些化合物中仅一种——HSB-13是防御HCA引起的海马成神经细胞瘤HT22细胞毒性的。ASK-2a和HSB-22在原代颗粒神经元中提供深刻的(impressive)神经保护，表明它们在氧化应激不是关键成分的其它神经元死亡范例中有可能有效。除了LK和HCA引起的细胞死亡之外，HSB-13也保护原代皮层神经元免于Aβ引起的毒性和HCA毒性。HSB-13增加的多功能性可以归因于单个取代基团——6位上氨基基团的存在。
本文提供的数据也说明，HSB-13在神经变性的两个单独的体内模型中也是保护性的。事实上，HSB-13在以化学方法诱导的杭廷顿舞蹈病小鼠模型中降低纹状体变性并改善行为特性，而且，它在蝇中防御APP毒性。它在组织培养物以及神经变性的体内范例中的有效性表明，HSB-13或其衍生物在治疗人类神经变性病状中可以具有作为治疗药物的价值。
本发明者所进行的研究表明，PI-3激酶-Akt和Raf-MEK-ERK信号通路或者牵涉HK介导的神经元存活的其它分子，如CaMK、PKA和HDACs，与这些化合物的发挥保护作用的能力无关，这表明作用的不同机制。然而，这些研究表明这些化合物抑制ATF-3和c-jun的活化作用，尽管调节所述抑制的上游机制还有待描述。如由其防御HCA引起的毒性能力所观察到的，HSB-13对一些信号分子的作用在性质上不同于由HSB-22或Ask-2a处理引起的作用。例如，与用HSB-22和ASK-2a所观察到的阻抑相比，用HSB-13对ATF-3和c-jun的阻抑有力得多。HSB-13也是在Ser473抑制Akt磷酸化的唯一化合物。而如由去磷酸化作用所判断的，用HSB-13对GSK3活化作用的范围高于HSB-22和ASK-2a。有可能这些不同中的一些可以解释，为什么HSB-13而不是HSB-22或ASK-2a防御HCA引起的毒性。
为了更好地理解本发明化合物的作用机制，而绝非限制本发明，HSB-13和ASK-2a对20种不同激酶的作用在体外被测验。该研究的结果表现在表2和3中。在500nM浓度下，ASK-2a充分地抑制了GSK3α、GSK3β、p38α、p38β、JNK3、MLK3和B-Raf的激酶活性。除了抑制上述激酶之外，在500nM下被使用时，HSB-13也抑制了CDK1、CDK2、CDK5以及ROCK1。两种化合物均显示了针对p38β的最强抑制。如上所述，ASK-2a保护小脑颗粒神经元免于LK引起的死亡，但对抵御HCA引起的HT-22细胞毒性是无效的。相反，HSB-13在两个范例中均是保护性的。这表明HSB-13在HCA处理的HT-22培养物中的保护作用是由于其对CDKs的抑制作用。先前的研究已经确定，CDK抑制剂能保护神经元抵御一些不同的凋亡刺激物。
在100nM下，在抑制GSK3α、GSK3β、p38β和B-Raf中，HSB-13相当地更具选择性。具有强神经保护作用的3-取代的吲哚酮——GW5074也抑制B-Raf。尽管GW5074微弱地抑制GSK3β，B-Raf被结构上不同的神经保护化合物抑制的发现暗示，对该激酶的抑制是神经保护潜在分子机制中的关键事件。
表2：在500nM下，ASK-2a对20种不同的体外测量的激酶的作用。激酶活性被表示为对照检验(没有ASK-2a)中的激酶活性的百分比。数值是重复两次进行的检验的均值。对激酶活性的大量抑制(＞20％)以粗体显示。
表2：在100nM和500nM下，ASK-2a对20种不同的体外测量的激酶的作用。
在100nM或在500nM ASK-2a存在的情况下，体外测量每种激酶的活性。激酶活性被表示为对照检验(没有ASK-2a)中的激酶活性的百分比。数值是重复两次进行的检验的均值。对激酶活性的大量抑制(＞20％)以粗体显示。
发现用HSB-13：GSK3α、GSK3β、p38β和B-Raf被有效地抑制(在100nM浓度下)。同样被抑制的是：CDK1、CDK2、ROCK1、JNK2、MLK3和c-Raf(所有这些均在500nM下被抑制)。使用ASK2a发现：GSK3α、GSK3β、p38α、p38β、JNK3和B-Raf被有效地抑制(在100nM下)，而MLK3被较低效地抑制。因此，为1，4-苯并
嗪目标的激酶包括：GSK3α、GSK3β、p38α、p38β、B-Raf、CDK1、CDK2、JNK2、JNK3和MLK3。
表3：在500nM下，HSB-13对20种不同的体外测量的激酶的作用。激酶活性被表示为对照检验(没有HSB-13)中的激酶活性的百分比。数值是重复两次进行的检验的均值。对激酶活性的大量抑制(＞20％)以粗体显示。
表3：在100nM和500nM下，HSB-13对20种不同的体外测量的激酶的作用。
发现1，4-苯并
嗪化合物保护培养的神经元免于凋亡。当培养的小脑颗粒神经元被转换到LK培养基上时，在24小时内，约50％的细胞经历凋亡。在该研究中，具有在图1中所示结构的总共20种不同的1，4-苯并
嗪衍生物被检测其防御LK引起的小脑颗粒神经元死亡的能力。每种化合物均在3中不同的剂量——1μM、5μM和25μM下被检测。由DAPI染色量化神经元生存力，所述DAPI染色是一种普通的和可靠的凋亡细胞死亡的检验。对神经元死亡的作用的结果已经被汇集到表4中。在一些情况中，从DAPI染色获得的结果由两种其它的凋亡检验——TUNEL染色和活性胱天蛋白酶-3免疫细胞化学方法来确定。
表4
表4提供了20种化合物，其各自在3种浓度(1、5和25μM)下被检测并被加入到LK培养基。存活被表示为接受HK培养基的对照培养物中存活的百分比。数据代表至少3个试验的平均值，每个试验被重复2次进行。在LK培养基中没有任何添加剂，平均存活为48.16±8.44％。化合物具有带有表4所列的取代基的以下列出的基本结构。
尽管没有进行详细的结构-活性关联，我们对20种化合物的分析表明以下事项：(1)母体化合物(核心结构参考表4)，最有效的神经保护化合物是ASK-2(Ar＝3，5-二溴-4-羟苯基)。如表4所示，ASK-2在25μM(102.5％)和5μM(92.1％)下是高度保护性的，但在1μL(80.3％)下仅有中等的保护性。4-OH的重要性通过被3’，5’-二溴(ASK-1)以及3’，4’，5’-三甲氧基(HSB-6)衍生物缺失的神经保护显现出来。除了在5μM下是中等活性(88％)的HSB-7(吡啶-3-基)之外，母体杂环衍生物，即ASK-9(噻吩-2-基)、HSB-4(噻吩-3-基)是无活性的。(2)在6位上ASK-2由氨基基团[HSB-13]或氯原子[HSB-22]取代导致在某些浓度下提高的活性。例如，HSB-22在所有的浓度下是高度保护性的，即在1μM、5μM和25μM下分别为92％、97％和90.6％。在5μM下，化合物HSB-13(100.8％)显著地比ASK-2(92.2)有效，而在25μM下，几乎与ASK-2(102.5)一样有效(99.5)。(3)与6位取代相比，在7位的取代对标题化合物神经元保护能力的显著性少得多。仅有一种浓度是高度活性的。例如，在25μM溶液中，化合物HSB-2(7-Cl)、HSB-5(7-F)和HSB-(7-甲基)是高度保护性的(～97％)，而HSB-1(7-硝基)在5μM下是有效的。在其它两种检测溶液下，这所有四种均不是有效的。(4)由C＝S对C＝O的取代产生混合的结果。在该研究中，在1μM下，ASK-9(吡咯-2-基和N-Me)是中等活性的(84.5％)，而ASK-11(2，5-二甲氧苯基)在5μM下是高度活性的(90.7％)。然而，ASK-8(噻吩-2-基)是无活性的。
在培养的小脑颗粒神经元中的分析将HSB-13识别为具有强神经保护功效的一种物质。我们因此选择HSB-13来测验其保护作用是否延伸到其它神经元型和凋亡刺激物。用同型半胱氨酸(HCA)对海马衍生的成神经细胞瘤细胞系——HT-22的处理引起了氧化应激，其归因于谷胱甘肽缺乏，导致凋亡(Murphy et al.，1990；Ratan et al.，1994a and 1994b)。如图9所示，用2mM HCA的处理导致在24小时几乎完全的细胞死亡，所述细胞死亡在25μM浓度下被HSB-13阻止。当在该范例中以5μM被使用时，HSB-13是没有保护性的。
HSB-13在杭廷顿舞蹈病(HD)体内模型中是神经保护性的。在啮齿动物和非人类灵长类动物中给予硝基丙酸(3-NP)复制了包括选择性纹状体变性、自发性舞蹈病和张力障碍性运动的HD临床和病理生理学特点中的大多数。该神经毒素的给予因此作为HD的有用模型(评论于Brouillet et al.，1999中)。HSB-13的功效被确定。如图10A所示，被给予3-NP的小鼠显示了广泛的双侧纹状体损害。在2.5mg/kg体重的浓度下给予HSB-13时，这种变性被HSB-13充分的降低(图10)。通过HSB-13防御3-NP引起的纹状体神经变性的保护作用与运动性能的有力改善相关。具体地，均通过3-NP给予而被消弱的总运动发作、总运动距离和运动平均速度在接受HSB-13的动物中明显更高(图10B)。
3-硝基丙酸给予和行为评价。8周龄的C57BL/6雄性小鼠(Charles River Laboratories，Inc，Wilmington，MA)以10次腹膜内注射(50mg/kg，5天，一天两次)被给予3-NP，具有或不具有HSB-13(92.5mg/kg)。在3-NP给予之前～30分钟进行HSB-13注射。对照动物接受盐水注射。在注射5天后的那天，用TRU-SCAN
活性监控系统(Coulborn Instruments，PA)如前所述地(Chin et al.，2004)评估运动活性。以下行为参数被选择：(i)总运动发作：在地平面的每次运动是针对至少一个样品间隔没有停止的一系列坐标变化，(2)总运动距离：在地平面所有矢量X-Y坐标变化的总和，和(3)平均速度：所有X-T坐标变化定义的运动的平均速度。在行为评价之后，小鼠被深度麻醉，并且脑被去除。脑被固定于0.1M磷酸盐缓冲液中的4％低聚甲醛中，并被低温保护于0.1M磷酸盐缓冲液中的20％蔗糖中。以50微米在恒冷切片机上切割冠状切片，并用甲酚紫(Sigma)染色。
本发明是对1，4苯并嗪作为神经保护剂的第一次证明，并提出了令人兴奋的可能性：即这类化合物代表了用于人类神经变性病治疗的一种新的治疗剂。
化学化合物对细胞c-Raf和/或B-Raf活性的作用的评价。在从细胞溶解产物的免疫沉淀之后，评价c-Raf或B-Raf活性。简单而言，用1.0μg的一抗(针对c-Raf或者B-Raf)和12μL的蛋白A/G PLUS琼脂糖珠温育约250μg蛋白质过夜。通过以6000rpm离心30秒，并用裂解缓冲液洗涤两次、用补充有350mM NaCl的裂解缓冲液洗涤两次、以及用激酶缓冲液(25mM HEPES pH 7.4和10mM MgCl2)洗涤两次，来收集免疫沉淀物。纯化的重组GST-MEK1 K97M蛋白作为底物于30℃被加入到补充有85μM ATP的激酶缓冲液35分钟。对于体外激酶检验，在通过ATP加入启动激酶反应之前，化合物被加入到激酶缓冲液中并于30℃温育5分钟。通过加入6×SDS样品缓冲液并煮沸5分钟，激酶反应被终止。蛋白质被SDS-PAGE解析，并进行蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹分析之后，激酶活性水平通过磷酸-MEK抗体进行检测。
从昆虫细胞中纯化的化学化合物c-Raf和B-Raf的作用。使用纯化的激酶(由Sf9昆虫细胞中的杆状病毒表达)和合成的底物，利用Upstate Biotechnology的激酶分析(Kinase Profiling)服务，在标准条件下，进行体外激酶检验。简单而言，对于每个检验，用化学化合物(0.1-1μM浓度)将5-10mU纯化的激酶在含有8mMMOPS pH 7.2、0.2mM EDTA、10mM醋酸镁和[γ-33P-ATP]的缓冲液中于室温下温育40分钟。MBP被用作底物。通过在P30滤器上放置(spotting)等分试样、在50mM磷酸中洗涤和闪烁计数来测量33P结合而量化激酶活性。
在一些情况中，由SignalChem如下检验对c-Raf和B-Raf的作用。在25μL终体积中，于环境温度下进行蛋白激酶检验(重复两次或三次进行)20-40分钟。通过加入33P-ATP发起所述检验，并且，根据蛋白激酶目标，反应混合物于环境温度下温育20-40分钟。在温育阶段之后，通过将10μl反应混合物置于Multiscreen磷酸纤维素P81平板上终止检验。Multiscreen磷酸纤维素P81平板在1％磷酸溶液中被洗涤3次，每次约15分钟。在闪烁液存在于Trilux闪烁计数器中的情况下，计算P81平板上的放射活性。为每个蛋白激酶目标建立空白对照，所述空白对照包括所有检验组分，除了加入适当的底物(用相同体积的检验稀释缓冲液替换)之外。通过去掉空白对照值，确定每个蛋白激酶目标的校正活性。
预期该说明书论述的任何实施方式相对于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言可以被实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以被使用以实现本发明的方法。
应该理解，本文所描述的具体实施方式是通过说明的方式被显示的，而并不作为对本发明的限制。本发明的主要特征可以被用于各种实施方式中而不偏离本发明的范围。本领域的技术人员应该理解或能够确定仅仅使用常规试验、本文所描述的具体程序的许多相等物。这样的相等物被认为在本发明的范围内并被权利要求书所包括。
说明书中提到的所有出版物和专利申请对本发明所属领域的技术人员的水平是指示性的。所有的出版物和专利申请被并入本文作为参考，并入的程度与具体地和单独地指出每一单独的出版物或专利申请被并入作为参考一样。
在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含(comprising)”一起使用时，用语“一(a或an)”可以表示为“一”，但是它与“一或更多”、“至少一”和“一或多于一”的意思是一致的。尽管公开内容支持指仅两者之一和“和/或”的定义，术语“或”在权利要求书中的使用用于表示“和/或”，除非被明确地表示仅指两者之一或者两个选项是相互排斥的。贯穿本申请，术语“约”用于表示数值包括设备、被用于确定该数值的方法的固有误差变异、或存在于研究对象中的变异。
如本说明书和权利要求所使用的，用语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式(如“comprise”和“comprises”))、“具有(having)”(以及具有的任何形式(如“have”和“has”))、“包括(including)”(以及包括的任何形式(如“includes”和“include”))或“含有(containing)”(以及含有的任何形式(如“contains”和“contain”))是包含性的或开放式的，而不排除另外的、没有陈述的要素或方法步骤。
本文所使用的术语“或其组合”指在所述术语前列出的项目的所有置换和组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括：A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且，如果在特定上下文中顺序是重要的，也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，尤其包括的是含有一个或更多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员会理解，除非上下文显然地另有说明，对处于任意组合的项目或术语的数目通常没有限制。
根据本公开内容，在没有过度试验的情况下，可以制备并执行本文公开并请求保护的所有组合物和/或方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方式而被描述，对于本领域的技术人员显然的是，改变可以被应用到本文所描述的组合物和/或方法以及方法步骤或方法步骤的顺序中，而不偏离本发明的概念、精神和范围。对于本领域技术人员来说显然的所有这样的类似替换和修饰被认为在所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (24)
1.式(I)的化合物：
其中
A选自C、N、S、O；
B选自C、N、S、O；
R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和
R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基、C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
2.权利要求1所述的化合物，其中
A选自O；
B选自N；
R2-R6独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R7为氧代基团；
R8为C1链烯基基团；
R9和R13为卤素；
R10-R12为氢；和
R11为乙酰氧基基团。
3.所述化合物包含(Z)-2，6-二溴-4-((3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]
嗪-2-亚基)甲基)乙酸苯酯和(Z)-2-(3，5-二溴亚苄基)-2H-苯并[b][1，4]
嗪-3(4H)-酮。
4.防御对象中神经病状的方法，其包括下列步骤：
识别需要防御所述神经病状的对象；和
提供给所述对象组合物，所述组合物包括：
其中
A选自C、N、S、O；
B选自C、N、S、O；
R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和
R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基、C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
5.权利要求4所述的方法，其中
A选自O；
B选自N；
R2-R6独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R7为氧代基团；和
R8为C1链烯基基团；
R9和R13为卤素；
R10-R12为氢；和
R11为乙酰氧基基团。
6.权利要求4所述的方法，其中所述神经病状包括但不限于阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、中风和缺血性发作。
7.权利要求4所述的方法，其中所述对象选自人类、非人类灵长类动物、狗、猫、马、母牛、公牛、大鼠、小鼠和蝇。
8.权利要求4所述的方法，其中所述防御神经病状包括：一个或更多个神经元的死亡、一个或更多个神经元的损失、防止一个或更多个神经元中的毒性、改善的运动性能、或防御淀粉样前体蛋白和其它部分的毒性效应。
9.保护对象免于神经病状的方法，包括下列步骤：
提供给所述对象治疗影响量的(Z)-2，6-二溴-4-((3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]嗪-2-亚基)甲基)乙酸苯酯、(Z)-2-(3，5-二溴亚苄基)-2H-苯并[b][1，4]嗪-3(4H)-酮。
10.保护对象免于神经病状的方法，包括下列步骤：
识别需要防御所述神经病状的所述对象；
提供给所述对象治疗影响量的组合物，所述组合物具有下式：
其中
A选自C、N、S、O；
B选自C、N、S、O；
R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和
R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基、C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
11.权利要求10所述的方法，其中所述神经病状包括但不限于阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、中风和缺血性发作。
12.权利要求10所述的方法，其中所述对象选自人类、非人类灵长类动物、狗、猫、马、母牛、公牛、大鼠、小鼠和蝇。
13.权利要求4所述的方法，其中所述防御神经病状包括：一个或更多个神经元的死亡、一个或更多个神经元的损失、防止一个或更多个神经元中的毒性、改善的运动性能、或防御淀粉样前体蛋白和其它部分的毒性效应。
14.抑制对象中激酶的方法，包括下列步骤：
识别需要防御增加的激酶活性的对象；
提供给所述对象有效降低所述对象中激酶活性的一定量的组合物，所述组合物包含以下式：
其中，
A选自C、N、S、O；
B选自C、N、S、O；
R1-R7独立地选自：H、C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、C1-C6醚基团、C1-C6酯基团、C1-C6烷基链烷酸酯基团、C1-C6烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；
R8为C1-C6烷基基团、C1-C6链烯基基团、卤基团、取代的C1-C6烷基基团、取代的C1-C6链烯基基团、羰基基团、碳酸酯基团、醚基团、酯基团、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团；和
R9-R13独立地选自：H、C1-C6烷基、C1-C6链烯基、卤、取代的C1-C6烷基、取代的C1-C6链烯基、羰基、碳酸酯、乙酰氧基基团、乙酰基基团、醚、酯、烷基链烷酸酯基团、烷氧基基团、酮基基团和氧代基团。
15.权利要求14所述的方法，还包括测量所述对象中激酶活性水平的步骤。
16.权利要求14所述的方法，其中需要防御激酶活性增加的所述对象具有神经病状。
17.权利要求16所述的方法，其中所述神经病状包括阿耳茨海默病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、中风或缺血性发作。
18.权利要求14所述的方法，其中所述激酶活性的降低防御神经病状，所述防御神经病状包括：一个或更多个神经元的死亡、一个或更多个神经元的损失、防止一个或更多个神经元中的毒性、改善的运动性能、或防御淀粉样前体蛋白和其它部分的毒性效应。
19.权利要求14所述的方法，其中所述对象具有癌症。
20.权利要求14所述的方法，其中被抑制的所述激酶包含GSK3α、GSK3β、p38β和B-Raf中的至少一种。
21.权利要求14所述的方法，其中被抑制的所述激酶包含CDK1、CDK2、ROCK1、JNK2、MLK3和c-Raf中的至少一种。
22.权利要求14所述的方法，其中所述抑制剂在100和500nM之间被提供。
23.权利要求14所述的方法，还包括在提供给所述对象所述化合物之前确定GSK3α、GSK3β、p38α、p38β、B-Raf、CDK1、CDK2、JNK2、JNK3和MLK3中至少一种的活性、并且然后在治疗后确定所述活性的步骤。
24.权利要求14所述的方法，其中所述病状包括病毒感染。
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