KR20110050649A

KR20110050649A - 신경퇴화성 질환의 치료를 위한 치료제로서의 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체

Info

Publication number: KR20110050649A
Application number: KR1020117004419A
Authority: KR
Inventors: 산토스 알. 드멜로; 에드워드 에이. 바이엘
Original assignee: 보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 서던 메소디스트 유니버시티
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2011-05-16
Also published as: EP2328877A2; EP2328877A4; JP2012500220A; WO2010019911A2; CN102159556A; CA2734305A1; US8680094B2; WO2010019911A3; US20120094991A1; BRPI0917412A2; AU2009281748A1

Abstract

본 발명은 키나제 활성을 저해하여 알츠하이머병 (Alzheimer's desease), 파킨슨씨병 (Parkinson's disease), 또는 헌팅턴씨병 (Huntington's disease)과 같은 질환, 및 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)과 같은 상태를 포함하는 신경퇴화 (neurodegeneration)에 대항하는 보호작용을 하는 조성물, 또한 1,4-벤즈옥사진 (1,4-benzoxazine) 화합물 및 그의 유도체의 치료적 유효량을 개체에게 제공하는 단계로 이루어진 그의 방법을 포함한다.

Description

신경퇴화성 질환의 치료를 위한 치료제로서의 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체 {1,4-Benzoxazine compounds and derivatives thereof as therapeutic drugs for the treatment of neurodegenerative conditions}

본 발명은 일반적으로 신경퇴화성 질병의 분야에 관한 것이고, 보다 상세하게는 알츠하이머병 (Alzheimer's desease), 파킨슨씨병 (Parkinson's disease), 근위축 측삭 경화증 (Amyotropic lateral sclerosis, ALS), 또는 헌팅턴씨병 (Huntington's disease)과 같은 질환, 그리고 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke) 및 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury)과 같은 상태를 포함하는 신경퇴화 (neurodegeneration)에 대항하여 보호작용을 하는 새로운 조성물 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 그의 배경은 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅턴씨병, 및 허혈성 뇌졸중과 같은 상태를 포함하는 신경퇴화성 병리학에 대항하는 신경보호 제제로서 작용하는 새로운 치료적 화합물과 연관시켜 기술된다.

알츠하이머병, 파킨슨씨병, ALS, 헌팅턴씨병과 같은 질환, 그리고 허혈성 뇌졸중 및 외상성 뇌손상과 같은 상태는 매년 수백만 명의 사람들을 고생시키고 사회에 막대한 재정적 부담을 안겨준다. 이들 상태의 진단 표지 (hallmark)는 뉴런의 비정상적이고 과다한 소실 (loss)이다. 현재까지는 이들 병리학에서 뉴런의 사망 (neuronal death)을 예방하는 효과적인 전략이 전혀 없다.

알츠하이머병 (AD)과 같은 신경퇴화성 질환은 신경섬유 매듭 (neurofibrillary tangles), 신경염 플라그 (neuritic plaques), 및 뉴런 세포 사망이라는 특징을 나타낸다. 알츠하이머병은 알려진 치료법이 전혀 없는 퇴화적인 최종적 질환이고 뇌 속에 플라그와 매듭이라는 특징을 나타낸다. 이는 그의 가장 보편적인 형태에서, 조기 발생 (early-onset)이 적은 빈도로 존재하기도 하지만 65세 이상의 환자가 주로 시달리고 있다.

본 발명자들은 신경퇴화의 조직 배양 패러다임 (paradigm)을 사용하여 뉴런의 사망을 예방하는 능력을 가진 소분자 (small-molecule) 화학적 화합물을 합성하고 검색하여 왔다. 이들 연구들은 강력한 신경보호 활성을 가지는 화합물로서 2-벤질리덴-2H-1,4-벤즈옥사진-3-(4H)-온 [2-benzylidene-2H-1,4-benzoxazine-3-(4H)-one]의 동정을 가능하게 하였다. 본 명세서에서는 2-벤질리덴-2H-1,4-벤즈옥사진-3-(4H)-온 및 그의 유도체가 뇌에서 민감한 (susceptible) 뉴런 집단을 보호할 수 있고, 따라서 신경퇴화성 상태를 치료하는 치료적 접근법을 의미하는 것으로 기술하고 있다. 지금까지 신경퇴화성 질환을 치유시키거나, 완화시키거나 치료하는 효과적인 전략은 전혀 없다. 1,4-벤즈옥사진-3-(4H)-온 부류의 화합물은 이전에 신경퇴화에 대항하여 보호작용을 하는 것으로 보고된 적이 없었다. 이들 화합물은 새로운 치료적 도구임을 의미한다.

본 발명은 이에 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅턴씨병, 및 근위축 측삭 경화증뿐만 아니라 허혈성 뇌졸중 및 외상성 뇌손상과 같은 신경학적 상태를 포함하는 신경퇴화성 질환의 치료에서의 새로운 치료적 도구로서 HSB13 및 그의 유도체와 같은 1,4-벤즈옥사진 화합물을 포함한다. 본 발명은 수많은 서로 다른 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체를 포함하는 조성물 그리고 이를 제조하고 사용하는 방법을 포함한다. 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체는 신경퇴화의 조직 배양 모델에서 평가되었다. 이들 화합물은 신경퇴화의 서로 다른 조직 배양 모델에서 보호작용을 한다.

본 발명은 신경퇴화의 조직 배양 모델에서 매우 신경보호적인 1,4-벤즈옥사진 부류의 몇 가지 화합물을 기술하고 있다. 가설을 통하여 또한 본 발명을 전혀 제한하지 않으면서, 약제학적 저해제를 사용하여 이들 화합물의 작용 기작이 단백질 키나제 A (protein kinase A, PKA), 칼슘 캐모듈린 키나제 A (calcium calmodulin kinas A, CaMK) 및 히스톤 탈아세틸라제 (histone deacetylase, HDACs)와 같은 다른 생존 증진 분자 (survival promoting molecules)뿐만 아니라 Raf-MEK-ERK 또는 PI 3 키나제 - Akt 신호전달 경로에도 관여하지 않다고 제시하는 것을 발견하였다.

1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체는 선조체 퇴화 (striatal degeneration)를 감소시키고 헌팅턴씨병의 화학적으로-유도된 마우스 모델에서 행동적 성적을 개선시키는 것이 밝혀졌다. HSB-13, HSB-22, 및 ASK-2와 같은 화합물을 포함하는 몇 가지의 1,4-벤즈옥사진은 배양된 소뇌 입자 뉴런 (cerebellar granule neurons)을 낮은 포타슘 처리에 의해 유발된 사망으로부터 보호하였다. HSB-13은 HT-22 신경모세포종 (neuroblastoma) 세포를 호노시스테인산 (HCA) 유도성 신경독성 (neurotoxicity)으로부터 보호하였다. 또한 ASK-2는 일차 피질 뉴런을 HCA-유도성 신경독성으로부터 보호하는 것이 밝혀졌다. HSB-13는 선조체 퇴화를 감소시켰고 헌팅턴씨병의 3-니트로프로피온산 (3-nitropropionic acid) 마우스 모델에서 행동적 성적을 개선시킨다.

본 발명은 헌팅턴씨병의 3-니트로프로피온산 (3-NP)-유도성 마우스 모델에서 HSB-13 이라고 명명되는 이들 화합물의 하나, (Z)-6-아미노-2-(3',5'-디브로모-4'-하이드록지벤질리덴)-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온에 관한 연구를 기술하고 있다. HSB-13는 선조체 퇴화를 감소시켰고 3-NP가 투여된 마우스에서 행동적 성적을 개선시켰다. 본 발명자들은 HSB-13 화합물이 잘-특성분석되고 인정된 헌팅턴씨병의 모델 시스템 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 독성의 초파리 (Drosophila) 모델에서 보호작용을 하는 것을 밝혔다. 본 발명의 HSB-13 패밀리의 화합물 및 새로이 만들어진 그의 유도체는 신경퇴화성 질환의 치료에서 새로운 치료적 도구임을 의미한다.

본 발명은 이에 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅턴씨병, 및 근위축 측삭 경화증뿐만 아니라 허혈성 뇌졸중 및 외상성 뇌손상과 같은 신경학적 상태를 포함하는 신경퇴화성 질환의 치료에서의 새로운 치료적 도구로서 HSB13 및 그의 유도체와 같은 1,4-벤즈옥사진 화합물을 포함한다. 본 발명에서 기술되는 화합물은 개체, 예로 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스 및 파리에서 신경보호 작용 (neuroprotection)을 제공한다. 본 발명은 수많은 서로 다른 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체를 포함하는 조성물 그리고 이를 제조하고 사용하는 방법을 포함한다. 1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체는 신경퇴화의 조직 배양 모델에서 평가되었다. 놀랍게도, 이들 화합물은 신경퇴화의 서로 다른 조직 배양 모델에서 보호작용을 하는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 화합물은 신경독성 (neurotoxicity), 개체에서 운동 성적 (locomotor performance), 및/또는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein) 및 기타 분체 (moieties)의 독성 효과에 영향을 주어 개체에서 하나 이상 뉴런의 사망, 비정상적 또는 과다한 소실을 조정하는 것에 의한 신경학적 상태의 조절을 제공한다.

1,4-벤즈옥사진 화합물 및 그의 유도체는 선조체 퇴화를 감소시키고 헌팅턴씨병의 화학적으로 유도된 마우스 모델에서 행동적 성적을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. HSB-12, HSB-22, 및 ASK-2와 같은 화합물을 포함하는 몇 가지의 1,4-벤즈옥사진은 배양된 소뇌 입자 뉴런을 낮은 포타슘 처리에 의해 유발되는 사망으로부터 보호하였다. HSB-13은 HT-22 신경모세포종을 호모시스테인산 (HCA) 유도된 신경독성으로부터 보호하였다. 또한 이것은 잘-특성분석되고 보편적으로 사용되는 알츠하이머병의 조직 배양 모델에서 피질 뉴런을 베타-아밀로이드 (Aβ) - 유도성 뉴런의 사망으로부터 보호한다. ASK-2는 일차 피질 뉴런을 HCA-유도성 신경독성으로부터 보호한다. HSB-13은 선조체 퇴화를 감소시켰고 헌팅턴씨병의 3-니트로프로피오산 마우스 모델에서 행동적 성적을 개선시켰다.

본 발명은 하기 화학식의 화합물을 포함한다:

여기에서

A 및 B 는 C, N, S, O 로부터 선택된다. R₁-R₇ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆ 에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. R⁸ 은 C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. R₉-R₁₃ 은 H, C₁-C₆ 알킬; C₁-C₆ 알케닐, 할로, 치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환된 C₁-C₆ 알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.

또한 본 발명은 신경학적 상태의 조절을 위한 필요가 있는 개체를 확인하고; 및 상기 개체에게 조성물을 제공하는 것에 의해 상기 개체에서 신경학적 상태에 대항하는 보호작용을 하고, 이를 치료하고, 감소시키고 또는 조절하는 방법을 제공한다. 본 조성물은 하기 구조를 가진다:

여기에서

A 는 C, N, S, O 로부터 선택되고; B 는 C, N, S, O 로부터 선택되고; R1-R7 는 H, C1-C6 알킬 그룹, C1-C6 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C1-C6 알킬 그룹, 치환된 C1-C6 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C1-C6 에테르 그룹, C1-C6 에스테르 그룹, C1-C6 알킬 알카노에이트 그룹, C1-C6 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R8 은 C1-C6 알킬 그룹, C1-C6 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C1-C6 알킬 그룹, 치환된 C1-C6 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 또한 R9-R13 은 H, C1-C6 알킬; C1-C6 알케닐, 할로, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.

본 발명은 신경학적 상태에 대항하는 보호작용의 필요가 있는 개체를 확인하고 상기 개체에게 하기 화학식을 가지는 조성물의 치료적 유효량을 제공하는 것에 의해 상기 개체에서 신경학적 상태를 감소시키고, 개선시키고, 치료하고 또는 이에 대항하는 보호작용을 하는 방법을 제공한다:

여기에서

또 다른 구현예에서, 또한 본 발명은 하기 화학식을 포함하는 조성물, 증가된 키나제 활성에 대항하는 보호작용을 필요로 하는 개체를 확인하고; 상기 개체에서 키나제 활성을 감소시키는 유효량의 조성물을 상기 개체에게 제공하는: 단계로 이루어진 상기 개체에서 키나제를 저해하는 방법을 제공한다.

여기에서

한 가지 관점에서, 본 방법은 상기에 더하여 개체에서 키나제 활성의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 또 다른 관점에서, 키나제 활성에서의 증가에 대항하는 보호작용을 필요로 하는 개체는 신경학적 조건, 예로 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅턴씨병, 뇌졸중, 또는 허혈성 뇌졸중을 가진다. 한 가지 관점에서, 상기 상태는 바이러스 감염, 예로 HIV와 같은 레트로바이러스 감염을 포함한다. 또 다른 관점에서, 키나제 활성에서의 감소는 하나 이상 뉴런의 사망, 하나 이상 뉴런의 소실, 하나 이상 뉴런에서 독성의 예방, 개선된 운동 성적, 또는 아밀로이드 전구체 단백질 및 기타 분체의 독성 효과에 대항하는 보호작용을 포함하는 신경학적 상태에 대항하는 보호작용을 한다. 한 가지 관점에서 개체는 암을 가진다. 보다 또 다른 관점에서 저해된 키나제는 GSK3α, GSK3β, p38β, 및 B-Raf의 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 관련된 관점에서, 저해된 키나제는 CDK1, CDK2, ROCK1, JNK2, MLK3, 및 c-Raf의 적어도 하나를 포함한다. 상기 저해제는 예로 100 및 500 nM 사이의 농도로 제공될 수 있다. 본 발명은 상기에 더하여 상기 개체에게 상기 화합물을 제공하기 이전에 GSK3α, GSK3β, p38α, p38β, B-Raf, CDK1, CDK2, JNK2, JNK3, 및 MLK3의 적어도 하나의 활성을 측정한 다음 처리 이후에 상기 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 암 (cancer), 자가면역 질환 (autoimmunodiseases), AIDS 및 기타 면역 시스템의 질환을 포함하는 세포사멸 (apoptosis)의 탈조절 (deregulation)이 관여하는 질환을 치료하는 데 사용되는 방법 및 조성물을 제공한다. 유사하게는, 본 발명은 키나제에 의해 영향을 받는 상태를 치료하기 위해, 예로 그의 활성화가 뉴런의 생존에 해로운 키나제의 저해에 사용되는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 키나제, 예로 GSK3α, GSK3β, p38β, 및 B-Raf의 활성에 영향을 주기 위해 사용되는 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예들을 만들고 사용하는 것이 하기에 상세히 논의되어 있는 한편, 본 발명은 광범위하게 다양한 특정한 문맥으로 구체화될 수 있는 많은 응용가능한 발명적 개념을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 논의된 특정한 구현예는 본 발명을 만들고 사용하는 특정한 방식을 단순히 설명하는 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 많은 용어가 하기에서 정의된다. 본 명세서에서 정의되는 용어는 본 발명과 관련된 분야에서 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어는 단지 단수 실체를 말하려고 의도하지 않고, 특정한 실시예를 설명하는 데 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함한다. 본 명세서에서 용어학 (terminology)은 본 발명의 특정한 구현예를 기술하기 위해 사용되지만, 그들의 사용이 청구항에서 설명된 바를 제외하고는 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

알츠하이머병 (Alzheimer's desease), 파킨슨씨병 (Parkinson's disease), 및 근위축 측삭 경화증 (amyotropic lateral sclerosis, ALS)과 같은 신경퇴화성 질환은 환자에게 삶의 질을 파괴시키고, 가족 내 간호인에게 막대한 부담을 지우며, 사회가 매년 수조 달러의 비용을 지불해야 한다. 발생되는 신경퇴화성 질환의 가장 변함없는 위험 요인은 노화이다. 기대 수명의 급작스런 증가 때문에, 노화-연관된 질병으로 고생하는 개인의 발생 빈도 (incidence)가 주요한 건강 문제가 되면서 증가하고 있다. 다양한 세트의 질병 중에서 공유되는 보편성은 소정의 뉴런 집단의 급진적이고 가차 없는 소실이다. 신경퇴화성 질환에 대한 현재의 약물 처치법은 단지 이들 질환과 연관된 증상을 완화시키는 것이고 근본이 되는 원인, 예로 뉴런의 퇴화에는 영향을 주지 못한다. 뉴런의 소실은 줄어들지 않고 계속되기 때문에, 이러한 완화적 치료법은 질환의 진전에 효과가 전혀 없다. 따라서 뉴런 사망의 소분자 저해제의 동정 (identification)은 긴급하고도 결정적인 중요성을 가진다.

알츠하이머병 (AD)과 같은 신경퇴화성 질환은 신경섬유 매듭, 신경염 플라그, 및 뉴런 세포 사망이라는 특징을 나타낸다. 알츠하이머병은 알려진 치료법이 전혀 없는 퇴화성 및 최종적 질환이고 뇌 속에 플라그와 매듭이라는 특징을 나타낸다. 이는 그의 가장 보편적인 형태로, 조기 발생도 적은 빈도로 존재하기는 하지만 65세 이상의 환자가 앓고 있다. 신경퇴화성 상태 (neurodegenerative conditions)는 환자의 숫자가 매년 증가하고 있고, 이들 상태의 많은 경우에 통상적인 치료법은 치료 과정에서 거의 제공되지 않는다. 일정 경우에서, 신경퇴화성 상태는 다발성 경화증 (multiple sclerosis)과 같은 특정한 질환과 특이적으로 연관되어 있는 반면, 다른 경우에서는 이 상태가 보다 일반적으로 노화 또는 일정 다른 상태 또는 예를 들어 유전적 질병 또는 자가면역 질환과 같은 신체의 프로세스와 연관되어 있다. 그러나 이들 상태도 마찬가지로 허약함 및 손상된 신체적 기능, 그리고 때때로 손상된 정신적 기능으로 특징이 지워진다.

본 발명자들은 GW5074 {5-이오도-3-[(3',5'-디브로모-4'-하이드록시페닐) 메틸렌]-2-인돌리논}이라고 불리는 c-Raf의 세포-투과성 화학적 저해제가 다양한 서로 다른 세포 사멸 자극에 의해 유발된 배양된 뉴런의 사망을 완벽히 저해하는 것을 기술하였다 (Chin et al ., 2004). GW5074는 또한 선조체 퇴화를 예방하고 헌팅턴씨병의 생체내 패러다임에 보편적으로 사용되는 3-니트로프로피온산이 투여된 마우스에서 행동적 성적을 개선시킨다. GW5074는 3' 치환된 인돌론 (indolone)이다 (Chin et al., 2004). 수많은 다른 3-치환된 인돌론도 역시 뉴런의 사망을 저해하는 것으로 밝혀졌다 (Johnson et al., 2005; Chen et al., 2008). 높은 보호작용을 하긴 하지만, 많은 다른 3-치환된 인돌론뿐만 아니라 GW5074 도 높은 농도로 사용될 때 독성을 나타낸다 (Chin et al., 2004; Johnson et al., 2005; Chen et al., 2008). 구조-활성 관련성 연구는 추가적인 3-치환된 인돌론이 신경보호 작용을 하면서도 배양된 뉴런에 대해서 높은 용량에서도 역시 유독하지 않았던 점을 확인하였다 (Balderamos et al., 2008). 다른 연구자들은 유사하게 c-jun N-말단 키나제 (JNK), 사이클린-의존성 키나제 (CDKs), 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK3), 및 p53을 포함하는 다양한 서로 다른 전-세포사멸 단백질 (pro-apoptotic proteins)을 표적하는 뉴런 사망의 수많은 화학적 저해제를 확인한 바 있었다 (D'Mello et al., 2005).

본 발명은 치료적 가치를 가지면서 포타슘 결핍에 의해 세포 사멸을 겪도록 유도된 배양된 소뇌 입자 뉴런에서 신경보호 작용을 하는 몇 가지 1,4-벤즈옥사진 유도체를 제공한다. 이들 화합물의 몇 가지도 역시 산화적 스트레스 및 Aβ-유도성 뉴런의 사망에 대항하는 테스트가 실시되었고 비-독성 수준에서 효과적인 것으로 밝혀졌다.

HSB-13이라고 명명되는 이들 화합물의 하나는 헌팅턴씨병의 3-니트로프로피온산 모델에서 생체내 테스트되었다. HSB-13는 신경퇴화에 대항하여 유의한 보호작용을 제공하였고 마우스에서 운동 성적을 개선시켰다. HSB-13도 역시 초파리 (Drosophila)에서 독성을 유발하는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에 대항하여 보호작용을 하였다. 이들 연구는 신경퇴화에 대항하는 치료적 가치를 가지는 새로운 신경보호적 제제로서의 1,4-벤즈옥사진 화합물을 확인하고 있다.

몇 가지의 신경퇴화성 질환과 연관된 증상을 개선시키는 약물 처치법 (mediactions)이 사용 가능하지만, 이들 종류의 치료법 (therapies)은 뉴런의 가차 없는 퇴화를 정지시키지 못하기 때문에 질환의 진행을 늦추지 못한다. 현재까지는 신경퇴화적 병리학에서 뉴런의 비정상적 소실을 정지시키는 전략이 전혀 없다. 몇 가지의 후보 화학적 화합물이 이전에 동정되어 왔고 이들 중 많은 수가 전-임상 시험 중에 있다. 몇 가지는 인간 임상시험에 테스트 되었지만 성공적이지는 못했다. 2-벤질리덴-2H-1,4-벤즈옥사진-3-(4H)-온 화합물이 신경퇴화적 병리학의 치료법을 위해 후보 약물로서 테스트된 적은 전혀 없었다.

용어 "알킬 (alkyl)", "알케닐 (alkenyl)", "알키닐 (alkynyl)" 및 "알킬렌 (alkylene)"은 전형적으로 길이가 약 1개로부터 약 12개까지의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 약 6개의 원자에 이르는 탄화수소 사슬을 말하고, 직선상 및 가지상 사슬을 포함한다. 달리 언급되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 언급되는 알킬 또는 알킬렌의 바람직한 구현예는 C1-C6 알킬 (예로, 메틸 또는 에틸)이다.

"사이클로알킬 (cycloalkyl)"은 연결된 (bridged), 융합된 (fused), 또는 회전된 (spiro) 사이클릭 화합물을 포함하는, 바람직하게는 3개 내지 약 12개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3개 내지 약 8개를 포함하는 포화되거나 포화되지 않은 사이클릭 탄화수소 사슬을 말한다.

"아릴 (aryl)"은 각각 5개 또는 6개의 중심 탄소 원자인 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 다수의 아릴 고리는 나프틸에서와 같이 융합되거나, 이중페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합되거나 융합되지 않을 수 있다.

"헤테로아릴 (heteroaryl)"은 한 개로부터 네 개까지의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S, 또는 그의 조합을 포함하는 아릴 그룹이고, 이 헤테로아릴 그룹은 선택사양으로 탄소 및 질소 원자(들)에서 C1-C6 알킬, --CF3, 페닐, 벤질, 또는 티에닐로 치환되거나, 산소 원자와 함께 있는 헤테로아릴 그룹에서의 탄소 원자는 카르보닐 그룹을 형성하거나, 이 헤테로아릴 그룹은 임의적으로 페닐 고리와 융합된다. 또한 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다. 헤테로아릴은 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나의 헤테로 원자 (예로, 티오페넨, 피롤, 퓨란)를 가지는 5개-구성원으로 된 헤테로아릴; 1,2 또는 1,3 자리에서 두 개의 헤테로 원자 (예로, 옥사졸, 피라졸, 이미다졸, 티아졸, 퓨린)를 가지는 5개-구성원으로 된 헤테로아릴; 세 개의 헤테로 원자 (예로, 트리아졸, 티아디아졸)를 가지는 5개-구성원으로 된 헤테로아릴; 3개의 헤테로 원자를 가지는 5개-구성원으로 된 헤테로아릴; 하나의 헤테로 원자 (예로, 피리미딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 페난트린, 5,6-사이클로헵테노피리딘)를 가지는 6개-구성원으로 된 헤테로아릴; 두 개의 헤테로 원자 (예로, 피리다진, 시놀린, 프탈라진, 피라진, 피리미딘, 퀴나졸린)를 가지는 6개-구성원으로 된 헤테로아릴; 세 개의 헤테로 원자 (예로, 1,3,5-트리아진)를 가지는 6개-구성원으로 된 헤테로아릴; 및 네 개의 헤테로 원자를 가지는 6개-구성원으로 된 헤테로아릴을 포함한다.

"헤테로사이클 (heterocycle)" 또는 "헤테로사이클릭 (heterocyclic)"은 불포화 또는 방향족 특성 그리고 탄소가 아닌 적어도 하나의 고리를 가지거나 가지지 않은 5-12개 원자, 바람직하게는 5-7개 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로 원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다. 복수의 고리는 융합될 수 있다.

"헤테로 원자 (heteroatom)"는 탄화수소 유사체 화합물에서의 비-탄소 원자 모두를 의미한다. 예로는 산소, 황, 질소, 인, 비소, 실리콘, 셀레늄, 텔륨, 주석, 및 붕소를 들 수 있다.

용어 "알킬렌 (alkylene)"은 상기에 정의된 바와 같이, 메틸렌 (-CH₂-), 프로필렌 (-CH₂ CH₂ CH₂-), 클로로에틸렌 (-CHClCH₂-), 2-티오부텐 -CH₂ CH(SH)CH₂ CH₂, 1-브로모-3-하이드록실-4-메틸펜텐 (-CHBrCH₂ CH(OH)CH(CH₃)CH₂-) 등과 같은 이가 (divalent) 알킬 그룹을 말한다.

용어 "알케닐(alkenyl)"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 가지상 또는 비가지상 탄화수소 사슬을 말한다.

용어 "알키닐 (alkynyl)"는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 가지상 또는 비가지상 탄화수소 사슬을 말한다.

용어 "아릴 (aryl)"은 바람직하게는 페닐, 나프틸 등과 같은 탄소 원자를 약 6-14개 사이로 가지는 적어도 하나의 방향족 고리를 형성하고, 하이드록실, 브로모, 플루오로, 클로로, 이오도, 머캅토 또는 티오, 시아노, 시아노아미도, 알킬티오, 헤테로사이클릭, 아릴, 헤테로아릴, 카복실, 카바알코일 (carbalkoyl), 알킬, 알케닐, 니트로, 아미노, 알코옥실, 아미도 등과 같은 이 사슬에 보편적으로 부착되는 하나 이상의 기능적 그룹으로 치환되어 바이페닐 (biphenyl), 이오도바이페닐 (iodobiphenyl), 메톡시바이페닐 (methoxybiphenyl), 안트릴 (anthryl), 브로모페닐 (bromophenyl), 이오도페닐 (iodophenyl), 클로로페닐 (chlorophenyl), 하이드록시페닐 (hydroxyphenyl), 메톡시페닐 (methoxyphenyl), 포르밀페닐 (formylphenyl), 아세틸페닐 (acetylphenyl), 트리플루오로메틸티오페닐 (trifluoromethylthiophenyl), 트리플루오로메톡시페닐 (trifluoromethoxyphenyl), 알킬티오페닐 (alkylthiophenyl), 트리알킬암모니움페닐 (trialkylammoniumphenyl), 아미도페닐 (amidophenyl), 티오졸일페닐 (thiazolylphenyl), 옥사졸일페닐 (oxazolylphenyl), 이미다졸일페닐 (imidazolylphenyl), 이미다졸일메틸페닐 (imidazolylmethylphenyl) 등과 같은 아릴 그룹을 형성할 수 있는 탄소 원자의 사슬을 말한다.

용어 "알콕시 (alkoxy)"는 --OR--을 말하고, 여기에서 R은 아릴이다.

용어 "아미도 (amido)"는 아마이드 연결: --C(O)NHR (여기에서 R은 수소 또는 알킬이다.)을 말한다.

용어 "아미노 (amino)"는 아민 연결: --NR--을 말하고, 여기에서 R은 수소 또는 알킬이다. 용어 "카복실 (carboxyl)"은 --C(O)O-- 를 말하고, 용어 "카보닐 (carbonyl)"은 --C(O)--을 말한다.

용어 "알킬카복실 (alkylcarboxyl)"은 상기에서 정의된 바와 같이 C(O)O 그룹, 예를 들어 CH₃ C(O)O--, CH₃ CH₂ C(O)O-- 등으로 치환된 알킬 그룹을 말한다.

용어 "카보사이클 (carbocycle)"은 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등과 같은 약 5개 내지 약 8개의 고리 탄소를 가지는 사이클릭 탄화수소 사슬을 의미한다. 이들 그룹은 상기 "알킬" 하에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 기능적 그룹을 사용하여 임의적으로 치환될 수 있다.

용어 "할로겐 (halogen)"은 염소, 불소, 브롬, 요오드 및 그의 혼합물을 포함한다.

용어 "헤테로사이클 (heterocycle)"은 N, O, 및 S로부터 선택되는 제로 개부터 네 개까지의 헤테로 원자를 포함할 수 있는 직선상 사슬 또는 고리 시스템을 의미하고, 여기에서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화되고, 질소 원자(들)은 임의적으로 사중화된다 (quaternized).

용어 "카바모일 (carbamoyl)'은 --C(O)NH₂ 그룹을 말한다.

용어 "하이드록시알킬 (hydroxylalkyl)"은 상기에서 정의된 바와 같이 하이드록시 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 의미한다.

용어 "알킬카보닐 (alkylcarbonyl)"은 단독 또는 조합으로, 알칸카르복실산, 예로 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴 (valeryl), 4-메틸발레릴 (4-methylvaleryl) 등과 같은 알킬-C(O)--로부터 유래하는 아실 그룹을 의미한다.

달리 표시되지 않는 경우라면, 모든 세포 배양 배지와 반응용액은 인비트로겐사 (Invitrogen; Carlsbad, CA)로부터 구입되었고, 모든 화합물은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)로부터 구입되었다. 무수화 용매는 피셔 사이언티픽 (Fischer Scientific; Pittsburgh, PA)로부터 구입되었다. PD98059, U0126, 워트마닌 (wortmannin), Akt 저해제-X, 트리코스타틴산 (trichostatin acid A, TSA), KN62, H89는 캘바이오켐사 (Calbiochem, La Jolla, CA)으로부터 구입되었다. 본 서류에서 사용되는 항체는 하기에 기술된 바와 같았다: 항-포스포-MEK (9121S), 항-포스포-AKT 473 (9271S), 항-포스포-GSK3α/β (9331S), c-Jun (2315S)은 셀 시스널링 테크놀로지사 (Cell Signaling Technology; Beverly, MA, USA)로부터 획득되었고; 항-ATF-3 (C-19, sc-188), 항-포스포-ERK (E-40, sc-7383), 항-α-튜불린 (TU-02 sc-8035)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, USA)로부터 획득되었다. 모든 항체는 1 : 1000으로 희석하여 사용되었다.

1,4-벤즈옥사진 화합물의 합성. 화합물 HSB -1-7, HSB -11, HSB -12, HSB -14, HSB-15, ASK -1 and ASK -2: 적절한 알데하이드 (15 mmol)가 적절한 치환된 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온 (10 mmol), 아세트 안하이드라드 (4 ml) 및 트리에틸아민 (2 ml)의 혼합물에 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 7시간 동안 환류되었고, 상온에서 하룻밤 동안 방치되었으며 깨진 얼음 속에 넣어두었다. 이 획득된 고체는 여과하여 수집되었고 아세토니트릴을 사용하여 세척되었다 (70-88% 수율). 이 조산물 (crude product)은 에탄올로부터 재결정화 (recrystallisation)에 의해 정제되었다. 화합물 HSB -8, HSB -11, HSB -12, HSB 14-19, HSB -24, ASK -1 및 ASK -2: 적절한 알데하이드 (15 mmol)가 적절한 치환된 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온 (10 mmol), 아세트 안하이드라드 (4 ml) 및 트리에틸아민 (2 ml)의 혼합물에 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 7시간 동안 환류되었고, 상온에서 하룻밤 동안 방치되었으며 깨진 얼음 속에 넣어두었다. 이 획득된 고체는 여과하여 수집되었고 아세토니트릴을 사용하여 세척되었다 (70-88% 수율). 이 조산물은 에탄올로부터 재결정화에 의해 정제되었다.

HSB -13: 촉매적 양의 라니 니켈 (Raney nickel)을 에탄올 (20 ml)에 녹인HSB-1 (2 mmol) 및 하이드라진 수화물 (1 ml)의 혼합물에 조금씩 (portion-wise) 저으면서 첨가하였다. 이 반응 혼합물은 3시간 동안 환류된 다음 여과되었다. 여과물은 감압 하에서 증발시켜 건조되었다. 이 조산물은 에탄올로부터 재결정화에 의해 정제되었다 (70% 수율).

HSB -23, HSB -25 및 Ask -2a: 이들 화합물 (HSB-23, HSB-25 및 Ask-2a)의 에스테르 (1 mmol) 각각은 메탄올에 녹인 포타슘 카보네이트 (3 mmol)로 0℃에 처리되었고 상온에서 3시간 동안 저어주어 각각의 알콜 HSB-23, HSB-25 및 Ask-2a을 획득하였다 (70-75% 수율).

HSB -22: 소듐 메톡사이드가 건조 DMF (10 ml)에 넣은 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온 (10 mmol) 및 피롤-2-카복시알데하이드 (16 mmol)의 혼합물에 일정 분량 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 48시간 동안 환류된 다음 상온으로 식혀주었고 깨진 얼음 내에 넣어두었으며 하룻밤 동안 4℃에서 방치하였다. 침전된 고체는 여과에 의해 수집되었고 물로 세척되었으며 건조시켰다. 이 침전물은 에탄올 (150 ml)로 끓여주었고 뜨거운 상태로 여과시켜 불순물을 제거하였다. 이 여과물은 감압 하에서 증발시켜 건조되었고, 잔여물은 이동상으로서 톨루엔 : 에틸 아세테이트(95 : 5)를 사용하여 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그래피로 분석되었다 (21% 수율).

HSB -9 및 HSB -10: 소듐 메톡사이드가 건조 DMF (10 ml)에 넣은 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온 (10 mmol) 및 4-디메틸아미노 벤즈알데하이드 (16 mmol)의 혼합물에 일정 분량 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 하룻밤 동안 환류된 다음 상온으로 식혀주었고 깨진 얼음 내에 넣어두었으며 하룻밤 동안 냉장고 내에 방치하였다. 침전된 고체는 여과에 의해 수집되었고 물로 세척되었으며 건조시켰다. 이 조산물은 에탄올 (30% 수율) 및 DMF-에탄올 (40% 수율)로부터 각각 재결정화에 의해 정제되었다 (40% 수율).

HSB -20 및 HSB -21: 소듐 메톡사이드가 건조 DMF (10 ml)에 넣은 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온 (10 mmol) 및 인돌-3-카복시알데하이드 (16 mmol)의 혼합물에 일정 분량 첨가되었다. 이 반응 혼합물은 24시간 동안 환류된 다음 상온으로 식혀주었고 깨진 얼음 내에 넣어두었으며 하룻밤 동안 냉장고 내에 방치하였다. 침전된 고체는 여과에 의해 수집되었고 물로 세척되었으며 건조시켰다. 이 조산물은 톨루엔 : 에틸 아세테이트(9 : 1)를 사용하여 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그래피로 분석되었다 (25-30% 수율).

ASK -8, ASK -9 및 ASK -11: 건조 벤젠 (10 ml)에 넣은 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-티온 (2.7 mmol), 적절한 알데하이드 (3.3 mmol) 및 촉매적 양의 피페리딘을 포함하는 반응 혼합물은 90℃에서 저어준 다음 상온으로 식혔다. 이 조산물이 식히는 동안 침전되었고, 진공 여과에 의해 수집되었으며 벤젠으로 세척하였고 건조시켜 에틸 아세테이트-헥산 (1 : 4 v/v)를 사용하여 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다 (86-90% 수율).

본 명세서에서 논의된 구현예 모두는 본 발명의 방법, 키트, 반응용액, 또는 조성물 모두를 고려하여 시행될 수 있고 그 역도 가능한 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 기술된 상세한 구현예는 묘사적 기술을 통해 나타나고 본 발명의 제한이 되지는 않는다. 본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이도 다양한 구현예에서 적용될 수 있다. 당업자라면 본 명세서에 기술된 특정한 과정에 대한 수많은 동등물을 인식하고 있을 것이고 또는 단지 일상적인 실험을 사용하여 규명할 수 있다. 이러한 동등물은 본 발명의 범위 내에서 고려되고 청구항에 의해 통합된다.

본 명세서에서 언급된 모든 출판물 및 특허 출원은 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 표시한다. 모든 출판물 및 특허 출원은 본 명세서에서 각 개별 출판물 또는 특허 출원이 상세하게 또는 개별적으로 참고문헌에 의해 통합되는 것을 표시한 것처럼 동일한 정도로 참고문헌에 의해 통합된다.

단어 "하나 (a)" 또는 하나 (an)"의 사용은 청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는 (comprising)"과 연결되어 사용될 때 "하나 (one)"를 의미할 수 있지만, "하나 이상 (one or more)", "적어도 하나 (at least one)", 및"하나 또는 하나 이상 ("의 의미와 일치하기도 한다. 청구항에서 용어 "또는 (or)"의 사용은 단지 대안만을 말하는 것으로 분명히 표시되지 않거나 대안이 상호 배타적이지 않는 경우라면 기재 내용이 단지 대안 그리고 "및/또는"만을 언급하는 정의를 지지하지 않더라도 "및/또는 (and/or)"을 의미하는 데 사용된다. 본 명세서를 통해서, 용어 "약 (about)"은 값이 장치에 대한 본질적으로 오차를 포함하는 것을 표시하는 데 사용되고 이 방법은 이 값, 또는 연구 개체 중에서 존재하는 오차를 결정하는데 적용된다.

본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 바, 단어 "포함하는 (comprising)" [및 "포함하는 (comprise)" 및 "포함하는 (comprises)"과 같은 포함하는 모든 형태], "가지는 (having)" [및 "가진다 (have)" 및 "가진다 (has)"과 같은 가지는의 모든 형태], "포함하는 (including)" [및 "포함한다 (includes)" 및 "포함한다 (include)"과 같은 포함하는의 모든 형태) 또는 "포함하는 (containing)" [및 "포함한다 (contains)" 및 "포함한다 (contain)"과 같은 포함하는의 모든 형태]는 함축적이거나 개방적이고 또한 부가적인, 재언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.

용어 "또는 그의 조합 (or combination thereof)"는 본 명세서에서 사용되는 바 이 용어를 선행하는 나열된 항목의 순열 및 조합 모두를 말한다. 예를 들어 " A, B, C, 또는 그의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 또한 특정한 문맥에서 순서가 중요한 경우라면, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB의 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 사례와 연속하여, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합이 분명히 포함된다. 당업자라면 일반적으로 문맥으로부터 달리 명시되지 않는 경우라면 모든 조합에서 항목 또는 용어의 숫자에 제한이 전혀 없는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 기재되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두는 본 기재에 비추어 부당한 실험 없이 작성되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예에 의하여 기재되었는 한편, 당업자라면 다양한 변형이 조성물 및/또는 방법에 그리고 본 명세서에서 기술된 방법의 단계 또는 단계의 서열에서 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 적용될 수 있는 점이 명백하게 여겨질 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 유사한 치환 및 변형 모두는 첨부된 청구항에서 정의되는 바와 같이 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명의 특징 및 장점의 보다 완벽한 이해를 위하여, 참고문헌이 지금 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명에 기술되고, 도면은 다음과 같다:
도 1은 LK-유도성 뉴런의 사망에 대항하여 보호작용하는 1,4-벤즈옥사진 화합물을 보여주는 영상이다. 소뇌 입자 뉴런의 세포배양은 HK 배지, LK 배지, 또는 다섯 가지의 1,4-벤즈옥사진 화합물 - HSB-13, HSB-5, HSB-22, ASK-2a, 및 HSB-20의 하나를 포함하는 LK 배지로 교환되었다. 모든 화합물은 25μM 농도로 사용되었다. 생존도 (viability)는 24시간 이후에 위상차 현미경 (phase contrast microscopy), DAPI-염색 [사포사멸성 뉴런 (apoptotic neurons)은 응축되거나 분획화된 핵에 의해 검출된다.], 또는 TUNEL-염색 (세포사멸성 핵은 녹색으로 표지된다.)에 의해 평가되었다. DAPI 및 TUNEL 염색 사진은 동일한 영역 (field)으로부터 나온다. HSB-13, HSB-5, HSB-22 및 ASK-2a은 보호작용을 하는 반면, HSB-20는 그렇지 않았다;
도 2는 네 가지 신경보호 작용을 하는 벤즈옥사진의 몇 가지 구조의 모식도이다. HSB-13, ASK-2, ASK-2a, 및 HSB-13의 구조를 나타낸다. 본 명세서 내용에서 기술된 바와 같이, ASK-2a는 ASK-2 보다 훨씬 더 높은 신경보호 작용을 보여주었다. HSB-13은 가장 높은 신경보호 작용을 보여주었다;
도 3은 1,4-벤즈옥사진에 의한 신경보호 작용에 주는 신호전달 경로의 저해 효과를 나타내는 그림이다. 소뇌 입자 뉴런의 세포배양은 LK 배지, HSB-13을 포함하는 LK 배지, 또는 HSB-13 그리고 PD98059 (40μM), U0126 (10μM), 워트마닌 (Wortmannin) (100 nM), Akt 저해제-X (5μM), KN-62 (10μM), H89 (10μM) 및 TSA (1μM)를 포함하는 LK 배지로 교환되었다. 생존도 (viability)는 DAPI 염색에 의해 24시간 이후에 정량되었다. 그 결과는 HK 배지로 교환되었던 대조군 세포배양에서의 생존도로 정상화되었다;
도 4는 보호작용을 하는 1,4-벤즈옥사진 화합물로 처리된 뉴런의 세포배양에서 신호전달 단백질의 웨스턴 블럿 분석을 보여주는 영상이다. 소뇌 입자 뉴런의 세포배양은 HK 배지, LK 배지, 또는 HSB-13, HSB-22, 또는 ASK-2a를 포함하는 LK 배지로 3시간 동안 교환되었다. 전체 세포 용출액이 준비되었고 포스포-Akt (세린 473자리), 포스포-MEK, 포스포-ERK, 및 포스포-GSK3에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 분석되었다. α-튜불린 (α-tubulin)에 대한 항체도 역시 유사한 양의 용출액이 각 레인에 로딩되는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
도 5는 c-jun 및 ATF-3 발현에 주는 벤즈옥사진의 효과를 보여주는 영상이다. 소뇌 뉴런 세포배양은 HK, LK, 또는 25μM HSB-13, 25μM ASK-2a, 또는 25μM HSB-22를 포함하는 LK 배지로 3시간 동안 처리되었다. 그 다음 전체 세포 용출액이 준비되었고 c-jun 및 ATF-3에 대한 항체를 사용하는 웨스텐 블럿 분석에 사용되었다. α-튜불린에 대한 항체도 역시 유사한 양의 용출액이 각 레인에 로딩되는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
도 6A 및 6B는 HT-22 세포에 주는 HSB-13의 효과 그리고 세포 사망의 정량을 나타낸다. 도 6A는 HCA-유도성 독성에 대항하여 HT-22에 미치는 HSB-13의 보호적 효과를 나타낸다. HT-22 세포는 첨가물 없음 (Un), 1.5 mM HCA, 또는 1.5 mM HCA + 25μM HSB-13, 25μM ASK-2a, 및 25μM HSB-22로 처리되었다: 도 6A에서, 처리 이후 24시간에 세포배양의 모습은 위상차 현미경 (Phase)에 의해 영상화되었다. 세포 사망은 DAPI 및 TUNEL 염색을 사용하여 평가되었다; 도 6B는 DAPI 염색에 의한 뉴런의 생존도 (neuronal viability)의 정량을 나타낸다. 생존도 (viability)는 처리되지 않은 세포배양 (대조군)의 %로서 표시되었다.
도 7A 및 7B는 신경보호 작용 및 운동 활성에서 HSB-13의 효과를 나타낸다. 도 7A는 생체내 (in vivo)에서 3-NP 신경독성에 대항하는 HSB-13의 보호적 효과를 나타내는 그림이다: 도 7A에서 조직학적 분석법. 대조군, 3-NP, 및 3-NP + HSB-13-처리된 마우스로부터 나온 40μm의 관상 섹션 (coronal sections)의 크레실 바이오렛 염색 (cresyl violet staining). 상부 패널: 선조체 (striatum)에서 세포의 선택적 소실을 보여주는 낮은 확대 영상; 하부 패널: 선조체의 배측면 부위의 영상을 보여주는 높은 확대 영상. 도 7B는 식염수 (대조군), 3-NP 및 3-NP + HSB-13가 투여된 마우스의 운동 활성 측정 (locomotor activity measurements)을 정리한 그래프를 나타낸 것이다. 투여 용량 및 조건은 방법에 상세히 기술되어 있다. 활성은 15분 이상의 기간 동안 측정되었다. a) 전체 이동 시간 (total movement time); b) 전체 이동 거리 (total movement distance); c) 이동 당 평균 거리 (average distance per movement); d) 평균 속도:를 보여준다; 막대는 평균 ± SD를 표시한다. *는 3-NP 및 3-NP + HSB-13 값 (P-값 < 0.05) 사이의 통계학적 유의성을 표시한다. 통계학적 분석은 비쌍의, 두 개 테일드 스튜던트 T 테스트 (unpaired, two-tailed Student's T test)를 사용하여 수행되었다; 또한
도 8은 HSB-13가 초파리 (Drosophila)에서 APP₆₉₅-유도성 독성에 대항하여 보호작용하는 것을 보여주는 영상이다. 대조군과 비교한 인간 APP₆₉₅를 발현하는 파리의 생존. HSB-13으로의 처리는 APP 발현하는 파리의 생존율을 유의하게 증가시켰다. n = 15-20개의 파리 그룹을 사용한 독립적인 연구의 숫자. 막대는 평균 ± SEM을 표시한다. 도 8은 HSB-13가 HCA-유도성 독성에 대항하여 HT-22 세포를 보호하는 것을 보여주는 영상이다. HT-22 세포는 첨가물 없음 (대조군), 2 mM HCA, 또는 2 mM HCA + 25μM HSB-13로 처리되었다. 처리 이후 24시간에서 세포배양의 모습을 보여준다.
도 9는 HSB-13이 HCA-유도성 독성에 대항하여 HT-22 세포를 보호하는 것을 보여주는 영상이다. HT-22 세포는 첨가물 없음 (대조군), 2 mM HCA, 또는 2 mM HCA + 25μM HSB-13로 처리되었다. 처리 이후 24시간에서 세포배양의 모습을 나타낸다.
도 10A 및 10B은 3-NP가 생체내 에서 3-NP 신경독성에 대항하여 보호작용을 하는 것을 보여주는 영상이다. 도 10A: 조직학적 분석법. 대조군, 3-NP, 및 3-NP + HSB-13-처리된 마우스로부터 나온 50μm의 관상 섹션의 크레실 바이오렛 염색. 투여 용량 및 조건은 방법에 상세히 기술되어 있다. 상부 패널: 선조체에서 세포의 선택적인 소실을 보여주는 낮은 확대 영상; 하부 패널: 선조체의 배측면 부위의 영상을 보여주는 높은 확대 영상. 도 10B: 운동 활성의 분석법. 식염수 (대조군), 3-NP 및 3-NP + HSB-13가 투여된 마우스의 운동 활성 측정. 투여 용량 및 조건은 방법에 상세히 기술되어 있다. 활성은 15분 이상의 기간 동안 측정되었다. A) 전체 이동 에피소드 (total movement episodes); B) 전체 이동 거리; C) 평균 속도; D) 수직면 입구. 막대는 평균 ± SD를 표시한다.

실시예 1. 반응-1:

(Z)-2,6-디브로모-4-((3-옥소-3,4-디하이드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-2-일리덴)메틸)페닐 아세테이트: (0.5 g, 3.35 mmol)의 2H-1,4-벤즈옥사진-3(4H)-온, 1.4 g의 4-g하이드록시-3,5-디브로모 벤즈알데하이드, 1.68 mL (17.729 mmol)의 아세트 무수화물 및 0.7 mL (5 mmol)의 트리에틸 아민의 저어진 혼합물은 7시간 동안 환류되었고, 상온에서 하룻밤 동안 방치되었으며 깨진 얼음 내에 넣어두었다. 침전된 고체는 여과에 의해 수집되었고 아세토니트릴으로 세척되었다. 이 조산물은 DMF : 에탄올로부터 재결정화에 의해 정제되었다.

실시예 2. 반응-2: (Z)-2-(3,5-디브로모벤질리덴)-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온

(Z)-2-(3,5-디브로모벤질리덴)-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온. 화학적 합성은 실시예 1, 반응-1에서와 동일하다.

소뇌 입자 뉴런의 배양 및 처리: 입자 뉴런 배양은 이전에 기술된 바와 같이 6-7일령의 위스타 래트 (Wistar rats)의 연관된 소뇌로부터 획득되었다 (D'Mello et al ., 1993). 세포는 우태아 혈청 (FCS), 25 mM KCl, 2 mM 글루타민 (인비트로겐), 및 100 μg/ml 젠타마이신 (gentamycin)이 보충된 기본 이글 배지 (Basal Eagle's Medium, BME)로 폴리-L-라이신 코팅된 24-웰 디쉬에 1 x 10⁶ 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 도말 이후에 사이토신 아라비노퓨라노사이드 (cytosine arabinofuranoside) (10μM)가 이 배양 배지에 첨가되어 비뉴런성 세포의 복제를 방지하였다. 우리 실험실과 다른 연구자에 의한 이전의 면역세포화학적 분석은 이들 세포배양이 95% 이상의 입자 뉴런을 포함하는 높은 정제도를 가지는 것을 보여주었다 (Thangnipon et al., 2003; Kingsbury et al., 2005).

뉴런의 배양은 처리 이전에 7-8일 동안 유지되었다. 처리를 위해, 세포는 한 번 헹구진 다음 낮은 K+ 배지 (무혈청 BME 배지; LK 라고 약칭함)에서 또는 대조군 세포배양의 경우에서는 높은 K+ 배지 (20 mM KCl 이 보충된 무혈청 BME 배지; HK 라고 약칭함)에서 유지되었다. 처리를 위해, (디메틸설포옥사이드에 녹인) 화학적 화합물이 HK 로부터 교환되는 시점에 1, 5, 또는 25 μM 농도로 LK 배지에 직접적으로 첨가되었다. 생존도는 4'6'-디아미디노-2-페닐인돌 하이드로클로라이드 (DAPI)에 의해 24시간에 평가되었다 (하기 참조). 각 화합물은 (각각의 농도에서) 이중으로 테스트 되었고 이 실험은 적어도 3번 반복되었다.

HK, LK, 또는 다양한 화합물이 보충된 LK 배지로 처리된 뉴런의 세포배양의 생존 상태는 위상차 현미경에 의해 평가되었고 이전에 기술된 바와 같이 DAPI 로 세포 핵을 염색하여 정량되었다 (Yalcin et al., 2003; Morrison et al ., 2006; Majzadeh et al., 2007). 간략하게는, 세포가 4% 파라포름알데하이드에서 4℃로 20분 동안 고정되었다. 인산 완충용액에서 세척된 이후에 디아미디노-2-페닐인돌 하이드로클로라이드 (DAPI; 인산 완충용액에서 1μg/ml)가 상온에서 15분 동안 첨가되었고 자외선 (260 nm) 하에서 관찰되었다. 응축되거나 분획화된 핵을 가진 세포는 죽은 것으로 계산되었다. 생존도는 대조군 세포배양의 퍼센트로서 표현되었고, 이는 HK 배지로 교환되었다. 통계학적 분석법이 LK 처리를 받은 대조군 세포배양의 평균 뉴런 생존과 비교하여 비쌍의, 두 개 테일드 스튜던트 T 테스트 (unpaired, two-tailed Student's T test)를 사용하여 수행되었다.

마우스 HT-22 신경모세포종 (neuroblastoma) 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고 10% FBS, 100 유닛/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 보충된 4.5 g/L 포도당 (소듐 피루베이트 없음)을 가지는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 배양되었다. 세포배양은 HCA 처리를 위해 ~ 30% 충만도로 도말되었다. HCA 는 pH 7.5 로 맞추어진 150 mM 스톡 용액으로 만들어졌고 최종 농도 1.5 mM 에서 사용되었다.

피질 뉴런의 일차 세포배양은 배아 18일령의 래트로부터 배양되었다. 이 세포배양은 이후 1 - 2일 동안 5 μM의 오래된 Aβ 펩타이드 (Aβ_25-35; 시그마-알드리지로부터 구입함)로 처리되었다. 뉴런의 생존도는 24시간 이후에 분석되었다.

뉴런의 세포배양의 TUNEL 분석법은 세포배양의 처리 이후 24시간에 프로메가 (Promega, Madison, WI)로부터 나온 DEADEND^TM 형광측정 TUNEL 시스템 (DEADEND^TM Fluorometric TUNEL System)을 사용하여 제조자의 지침서에 따라 수행되었다. 활t성이 있는 캐스파제 3 (caspase 3)의 면역세포화학적 분석법을 위해, 뉴런의 배양 세포가 고정되었고 0.2% 트리톤으로 5분 동안 처리되었다. PBS에서 5% BSA 및 5% 염소 혈청을 포함하는 PBS로 블록킹한 이후, 커버슬립을 활성이 있는 캐스파제-2 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 인산 완충용액 (PBS)로 세 번 세척한 이후, 세포는 이차 항체와 25℃에서 45분 동안 배양되었고, 그 다음 세포는 PBS로 세척되었다. 핵을 영상화하기 위하여, 세포는 DAPI로 25℃에서 15분 동안 염색되었다.

세포배양 배지는 제거되었고 세포는 얼음에 차갑게 한 인산 완충용액으로 두 번 세척되었으며 용출 완충용액 [1% Triton, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM 베타-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 1 μg/mL 류펩틴 (leupeptin) 및 1 프로테아제 저해제 혼합물]에서 용출시켰다.

단백질 농도가 측정되었고 브래드포드 단백질 분석 반응용액 (바이오-래드, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정상화시켰다. 정상화에 이어서, 40μg의 단백질이 웨스턴 블럿팅에 투입되었다. 면역반응성 (immunoreactivity)은 증진된 화학발광법 (enhanced chemiluminescence) (에머샴 바이오사이언스, Piscataway, NJ, USA)에 의해 조사되었다.

3-니트로프로피온산 투여 및 행동적 평가는 HSB-13가 있거나 없이 10회 복강내 주입으로 3-NP가 투여된 (5일 동안 하루 두 번 50 mg/kg) 8-주령 C57BL/6 수컷 마우스 (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) 상에서 수행되었다. HSB-13 의 주입은 3-NP 투여 30분 전에 수행되었다. 대조군 동물은 식염수 주입을 받았다. 5일의 주입이 끝난 날에, 운동 활성 (locomotor activity)이 TRU-SCAN® 활성 감시 시스템 (TRU-SCAN® activity monitoring system; Coulborn Instruments, PA)을 사용하여 평가되었다 (Chin et al ., 2004; Chen et al ., 2008b). 하기 행동적 매개변수가 선택되었다: (1) 전체 이동 시간, (2) 전체 이동 거리: 바닥면에서의 모든 벡터화된 X-Y 위치 변화의 합계, (3) 이동 당 평균 거리, (4) 평균 속도: 모든 X-T 위치 변화 (coordinate changes)의 평균 속도는 이동을 정의하였다. 행동적 평가를 이어서, 마우스는 깊게 마취되었고, 뇌는 적출되었다. 이 뇌는 0.1 M 인산 완충용액에서 녹인 4% 파라포름알데하이드에서 고정되었고 0.1 M 인산 완충용액에 녹인 20% 슈크로스에서 냉동보호되었다. 관상 섹션이 40 마이크론에서 냉동미세절단기 (cryostat) 상에서 절단되었고 크레실 바이오렛 (cresyl violet) (시그마-알드리치)을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 염색되었다 (Chin et al., 2004; Chen et al., 2008b).

인간 APP₆₉₅의 발현은 UAS-APP₆₉₅ 작제 (construct)를 보유하는 형질전환 파리 (transgenic flies)를 UAS/GAL4 시스템 (Brand and Perrimon, 1993)을 사용하는 액틴-GAL4 프로모터를 포함하는 파리와 함께 교배하여 보편적으로 유발되었다 (Fossgreen et al ., 1998). 파리는 서로 다른 농도의 HSB-13 (0, 2.5, 5, 및 50 mM)를 포함하는 10% 효모 페이스트 상에 25℃ 암소에서 사육되었다. 생존하는 APP₆₉₅-발현하는 자손 (progeny)의 퍼센트는 이를 동일한 교배에서 획득된 프로모터 작제를 보유하지 않는 대조군 자손과 비교하여 결정되었고 따라서 이전에 기술된 바와 일치하는 조건 하에서 사육되었다 (Greeve et al ., 2004).

배양된 소뇌 입자 뉴런이 HK 배지로부터 LK 배지로 교환될 때, 약 50%의 세포가 24시간 이내에 세포 사멸을 겪었다 (D'Mello et al ., 1993). 본 발명자들은 이러한 널리 사용되고 인정된 모델을 사용하여 LK-유도성 뉴런의 사망에 대항하여 보호작용을 하는 그들의 능력에 대해 20가지의 서로 다른 1,4-벤즈옥사진 유도체 전체를 테스트하였다. 각 화합물은 3가지 서로 다른 용량 - 1μM, 5μM 및 25 μM에서 테스트 되었고 생존도는 DAPI-염색에 의해 정량되었다. 가장 높은 용량은 화합물의 가능한 독성 효과를 테스트하기 위해 포함되었다. 주요 결과는 세포사멸의 또 다른 믿을만한 분석법인 TUNEL 염색을 사용하여 검증되었다 (도 1). 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명은 유의한 신경보호적 효과를 가지는 몇 가지 화합물들을 확인하고 있다. 가장 보호적 작용을 하는 화합물의 두 가지는 모두 Ar = 3',5'-디브로모-4'-하이드록시페닐을 가지는 HSB-13 및 HSB-22이다 (도 1). 이들 화합물은 1 μM에서 건강한 보호작용을 제시하고 이 보호작용은 이 연구에서 사용되는 더 높은 두 가지의 용량에서도 유지된다. HSB-4, HSB-9, ASK-8, 및 ASK-9를 포함하는 몇 가지 화합물은 1 μM 용량에서 최대 또는 최대에 가까운 효능을 보여주었다. 더 높은 수준의 보호작용이 1 μM 보다 더 낮은 용량에서 관찰되는지 여부를 조사하기 위하여, 이들 화합물의 분석이 0.5, 0.25, 및 0.1 μM의 용량으로 확장되었다. 모든 경우에, 이들 용량에서는 1 μM 에서 관찰되는 것보다 보호작용이 더 낮아졌다. 따라서, 1,4-벤즈옥사진 화합물은 배양된 뉴런을 세포 사멸로부터 보호하였다.

화합물의 구조 및 그들이 부여하는 신경보호의 정도에 기초하여, 하기 결론이 도출될 수 있다: (a) 6-자리에서의 치환된 그룹의 부재와 관련가능성이 있는 ADK-2a와 비교할 때, HSB-13 및 HSB-22를 사용하여 어느 정도 더 높은 수준의 보호작용이 관찰되었고, (b) 4'-OH 그룹 대신에 4'-OAc 그룹을 가지는 ASK2 에 의한 보호작용의 감소 (도 2) 또한 3',5'-디브로모 (ASK-1) 및 3',4',5'-트리메톡시 (HSB-6) 유도체에 의한 신경보호 작용의 결여 때문에 HSB-3, 및 HSB-22에서의 4'-OH 중요성을 확인하며, (c) 5μM 에서 보호 작용을 하는 HSB-7 (피리딘-2-일)을 제외하고는, 헤테로사이클릭 유도체, 예로 HSB-11 (티오펜-2-일), HSB-12 (티오펜-3-일), HSB-4 (티오펜-3-일)는 불활성이었고, 또한 (d) 4'-OH의 4'-OCOCH₃ 에스테르로의 전환은 혼합된 결과를 제시하였다. 예를 들어, 화합물 HSB-2 (6-Cl), HSB-5 (6-F) 및 HSB-3 (6-메틸)은 25 μM에서 높은 보호작용을 하였고 HSB-1 (6-니트로)는 5 μM에서는 효과적이었지만 다른 두 가지 테스트 농도에서는 그렇지 않았다. 대조적으로, 4'-OH 화합물인 HSB-13 (6-NH2), HSB-22 (6-Cl) 및 ASK-2a (6-H)는 이들 세 가지 농도 모두에서 효과적이었다.

3-치환된 인돌론을 사용한 이전의 연구는 2-자리에서 C=S를 사용한 C=O의 치환이 신경보호적 활성을 없애지 못하는 것을 보여주었다 (Balderamos et al., 2008). 그러나, 본 발명에 포함되는 벤즈옥사진의 경우에는 ASK-9 (피롤-2-일 및 N-Me) 및 ASK-11 (2',5'-디메톡시페닐)가 유의한 수준의 보호작용을 나타내었다. 그러나, ASK-8 (티오펜-2-일)은 불활성이었다.

표 1: 21가지의 화합물이 3가지 농도에서 (1, 5, 및 25 μM) 각각 테스트 되었고 LK 배지에 첨가되었다. 생존은 HK 배지를 받았던 대조군 세포배양에서의 % 생존도로 표시된다. 데이타는 각각 이중으로 수행되었던 적어도 3번의 연구로부터 나온 평균값을 나타낸다.

Raf-MEK-ERK 및 PI-3 키나제-Akt 신호전달은 많은 신경영양 폴리펩타이드, 약제학적 제제, 및 신경보호적 화합물의 보호적 효과를 매개하는 포유동물 세포에서의 잘-확립된 강력한 항-세포사멸 경로이다 (D'Mello and Chin, 2005; Hetman et al., 2006). 이들 경로의 어느 것이 1,4-벤즈옥사진의 신경보호적 효과를 내는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 이들 경로의 약제학적 저해가 그들의 신경보호적인 효능에 어떤 영향을 주는지를 연구하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 두 가지의 구조적으로 구별되고 매우 선택적인 MEK 저해제인 PD98059 및 U0125가 둘 다 HSB-13에 의한 신경보호 작용을 감소시키지 못하였다. 유사하게, 테스트된 화합물 (PI-3 키나제 저해제, 워트마닌, Akt 저해제 X, 또는 시판되는 Akt의 저해제)은 어느 것도 HSB-13의 능력을 감소시켜 LK-유도성 세포 사멸에 대항하여 뉴런을 보호하지 못하였다 (도 3). 이들 연구에서 사용되는 용량에서, 이들 저해제는 HK-처리로부터 발생되는 ERK 또는 Akt 자극을 완벽히 저해한다. HSB-13에 관해 관찰되는 바와 같이, MEK-ERK 및 PI-3K-Akt 경로의 약제학적 저해는 ASK-2a 또는 HSB-22의 신경보호 작용에 전혀 효과를 나타내지 못한다.

웨스턴 블럿 분석법이 1,4-벤즈옥사진에 의한 신경보호 작용이 MEK-ERK 또는 PI3 키나제-Akt 신호전달의 활성화에 관여하지 않는 것을 검증하기 위해 수행되었다. MEK, ERK 및 Akt의 활성화는 그들의 인산화를 필요로 하고, 이는 포스포-특이 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명자들과 다른 연구자들에 의해 이전에 보고된 바와 같이 (Chin et al ., 2004; Johnson et al ., 2005; Majdzadeh et al ., 2008), MEK 및 ERK 인산화는 이어지는 소뇌 입자 뉴런의 LK 치료를 감소시킨다. 이러한 감소는 HSB-13, HSB-22, 또는 ASK-2a에 의해 예방되지 않는다 (도 4). Akt의 세린 473 자리에서의 인산화도 역시 LK 처리 이후 6시간에서 약간 감소된다 (Chin et al., 2004; Johnson et al., 2005; Majdzadeh et al ., 2008). 이것은 또한 ASK-2a 또는 HSB-22를 사용한 처리에 의해 영향받지 않는다 (도 4). HSB-13 및 두 가지 다른 신경보호적 화합물 간의 인산화 양상의 두드러진 차이점은 HSB-13이 HSB-22 및 ASK-2a와는 다른 방식으로 신호전달 분자에 영향을 주는 것을 제시한다.

HSB-13에 의한 신경보호 작용을 위해 Raf-MEK-ERK 또는 PI3 키나제-Akt 경로가 필요하지 않기 때문에, 뉴런의 생존을 촉진하는 것으로 알려진 다른 신호전달 분자의 관여가 조사되었다. GSK3β는 많은 뉴런성 및 비-뉴런성 시스템에서 세포 사멸시 활성화되는 전세포사멸 분자 (proapototic molecule)이다. 생존을 촉진시키는 조건 하에서, GSK3β는 다른 키나제에 의해서뿐만 아니라 Akt에 의해 유발될 수 있는 변형인 저해 부위의 인산화에 의해 불활성화가 지속된다. 도 4에서 나타난 바와 같이, GSK3β의 탈인산화는 HSB-13에 의해서 억제되지 않는다. 대조적으로, HSB-22 및 ASK-2a는 GSK3β의 탈인산화를 억제한다.

소뇌 입자 뉴런의 HK를 사용한 처리는 칼슘-캐모듈린 키나제 (CaMK)를 활성화시키고, KN-62와 같은 약제학적 저해제를 사용한 CaMK의 저해는 HK-매개성 생존을 억제시킨다 (See et al ., 2001; Linseman et al ., 2003; Morrison et al ., 2006). 그러나 HSB-13에 의해 신경보호 작용은 KN-62 처리에 의해 감소되지 않는다 (도 3). 본 발명자들은 여러 명의 연구자들이 사이클릭 AMP 유사체 및 단백질 키나제 A의 약제학적 활성인자가 다른 생존-촉진 자극 (survaival-promoting stimuli)의 부재 시 다른 뉴런 타입뿐만 아니라 소뇌 입자 뉴런의 생존도 촉진시킨다고 보고하였던 것을 알고 있었다 (Rydel and Greene, 1988; D'Mello et al ., 1993; Hanson et al., 1998). PKA-매개성 뉴런의 생존은 강력하고 선택적인 PKA 저해제인 H89 처리에 의해 차단된다 (Li et al ., 2000; Bhave and Hoffman, 2004). 도 3에서 나타난 바와 같이, H89을 사용한 처리는 HSB-11 매개성 신경보호 작용에 전혀 효과를 나타내지 못한다. 본 발명자들은 이전에 트리코스타틴 A (trichostatin A)와 같은 히스톤 탈아세틸라제 (histone deacetylase) 저해제가 소뇌 입자 뉴런의 생존을 유지시키기 위해 HK의 능력을 방해한다고 보고한 바 있었다 (Salminen et al ., 1998; Boutillier et al., 2002; Morrison et al ., 2006). 그러나, TSA 처리도 역시 HSB-13의 신경보호적 효능을 억제하지 못하였다 (도 3).

c-jun 발현은 다양한 조직 배양 및 뉴런성 세포 사멸의 생체내 패러다임에서 유도된다 (Schenkel et al., 2004). 이러한 전사인자의 활성화는 뉴런 사망의 다른 모델뿐만 아니라 LK-유도성 소뇌 입자 뉴런에서의 뉴런 사망을 위해 필요한 것으로 밝혀졌다 (Estus et al ., 1994; Ham et al ., 1995; Watson et al ., 1998). 도 5에 나타난 바와 같이, LK에 의한 c-jun 발현의 유도는 HSB-13, HSB-22, 및 ASK-2a에 의해 억제된다. HSB-13을 사용한 처리는 HK-처리된 세포배양에서 관찰되는 것보다 훨씬 덜 c-jun 발현을 억제시킨다. 세포 사멸 시 발현이 뉴런에서 자극되는 또 다른 전사인자는 CREB 패밀리 단백질의 구성원인 ATF-3이고, 이는 서로 다른 모델에서 뉴런 사망을 촉진하는 것으로 밝혀져 왔었다 (Hai et al ., 1999; Vlug et al., 2005; Chen et al ., 2008a). siRNA를 사용하는 ATF-3 발현의 억제 (suppression)는 본 발명자들에 의해 이전에 기술되었던 바와 같이 소뇌 입자 뉴런의 LK-매개성 사망을 저해한다 (Chen et al., 2008a). 도 5에서 나타난 바와 같이, LK-매개성 ATF-3 증가는 세 가지 신경보호적 벤즈옥사진 모두에 의해 억제된다. c-jun 을 사용하여 관찰된 바와 같이, HSB-13을 사용한 억제가 가장 건강하였다. 그 결과, 이들 조성물은 c-jun 및 ATF-3의 활성을 억제할 수 있고, 이는 다시 암과 c-jun과 같은 발암단백질 (oncoproteins)을 치료하는 데 역할을 수행한다.

호모시스테인산 (HCA)를 사용한 마우스 신경모세포종 HT-22 세포주의 치료법은 글루타치온 고갈 및 산화적 스트레스를 통하여 세포 사멸을 유발한다 (Murphy et al. 1990; Ratan et al. 1994a, 1994b). 본 발명자들은 HSB-13, HSB-22, 및 ASK-2a가 이러한 산화적 스트레스-유도성 뉴런 사망의 패러다임에서 보호작용을 하는지 여부를 연구하였다. 도 6A 및 6B에서 나타난 바와 같이, HSB-13은 HCA-유도성 세포 사망을 예방하였다. 가장 높은 보호작용이 25 μM 농도에서 관찰되었지만, HSB-13는 5 μM에서도 역시 건강한 보호작용을 보여주었다. 놀랍게도, ASK-2a 및 HSB-22는 서로 구조적 유사성이 있긴 하지만, 조사되었던 세 가지 용량 모두에서 보호작용을 하는 데는 실패하였다 (데이타 미도시). 세 가지의 벤즈옥사진 모두는 LK-매개성 뉴런의 사망에 대항하여 보호작용을 하지만, HSB-13만이 HCA-유도성 세포 사멸에 대항하는 보호작용을 하는 연구는 이들 두 가지 패러다임에서 세포 사멸의 기초가 되는 분자적 기작이 서로 다른 것을 제시한다. 더구나, 이 결과는 6-자리에서의 아미노 그룹 (도 2 참조)이 HCA 독성에 대항하는 보호작용을 위해 필요한 것을 제시한다. 우리는 또한 HSB-14이 일차 세포배양 또는 Aβ 독성에 대항하는 피질 뉴런을 보호하는 것을 밝혀왔다. 따라서, ASK-2a 및 HSB-22는 아니라고 할지라도, HSB-13은 산화적 스트레스-유도성 뉴런의 사망에 대항하여 보호작용을 한다.

소뇌 입자 뉴런 세포배양 및 HT-22 세포는 HSB-13이 조직 배양 패라다임에서 강력하고도 다양한 신경보호적 효능을 가지는 것을 보여주었다. 설치류 및 비인간 영장류에서 니트로프로피온산 (3-NP) 투여는 선택적인 선조체 퇴화 (striatal degeneration), 자발적인 무도성 (choreiform) 및 근육긴장 이상 운동 (dystonic movements)을 포함하는 HD의 임상적 및 병리생리학적 표지의 대부분을 재현해낸다. 이러한 신경독소의 투여는 따라서 HD의 유용한 모델이 된다 (Brouillet et al ., 1999). 본 발명자들은 이러한 생체내 패러다임에서 HSB-13의 효능을 조사하였다. 도 7A에서 나타난 바와 같이, 3-NP가 투여된 마우스는 광범위한 선조체 손상을 보여준다. 이러한 퇴화는 HSB-13가 2 mg/kg 체중의 농도로 투여될 때 실질적으로 감소된다 (도 7A). 3-NP-유도성 선조체 신경퇴화에 대항하는 HSB-13에 의한 보호작용은 운동 성적의 유의한 개선과 상호관련되어 있었다 (도 7B). 상세하게는, 모두 3-NP 투여에 의해 손상되었던 전체 이동 시간; 전체 이동 거리; 이동 당 평균 거리 및 이동의 평균 속도는 HSB-13을 받은 동물에서 탁월하게 더 높았고, 이는 HSB-13가 헌팅턴씨병 (HD)의 생체내 모델에서 신경보호 작용을 하는 것을 입증한다.

또한 본 발명자들은 APP₆₉₅를 보편적으로 발현하는 파리 모델을 사용하여 APP-유도성 독성에 미치는 HSB-13의 유익한 효과를 연구하였다 (Greeve et al., 2004). 도 8에서 나타난 바와 같이, 처리되지 않은 파리는 APP₆₉₅를 발현하지 않는 동일한 조건 하에서 사육된 대조군 파리와 비교하여 약 5%의 생존율만을 보여준다. 증가된 농도의 HSB-13를 포함하는 사료에서 이들 파리를 사육한 것은 APP-발현 파리의 생존율에서 동일하게 처리된 대조군 파리와 비교하여 50 μM에서 65%로부터 50 μM에서 44%까지에 이르는 유의한 증가를 가져왔다. 이들 생존율은 처리되지 않은 파리와 비교하여 대략 10배 더 높은 것이고 (모든 P 값 < 0.05) 따라서 HSB-13도 역시 초파리 (Drosophila) 생체내 모델에서 APP- 유도성 독성에 대항하여 보호작용 하는 것을 보여준다.

따라서, 본 발명은 소뇌 입자 뉴런의 LK-유도성 세포 사멸에 대항하여 보호작용을 하는 몇 가지의 새로운 화합물을 기술하고 있다. 본 발명의 초점은 이들 세 가지 화합물, HSB-13, HSB-22 및 ASK-2a에 관한 것이었다. 구조적으로 유사할지라도, 이들 화합물 중 단 하나인 HSB-13만이 해마 신경모세포종 (hippocampal neuroblastoma) HT22 세포의 HCA-유도성 독성에 대항하여 보호작용을 한다. HSB-22 및 ASK-2a는 일차 입자 뉴런에서 인상적인 신경보호 작용을 제공하고, 그들이 산소 스트레스가 결정적인 요소가 아닌 다른 패러다임의 뉴런 사망에서 효능이 있을 수 있는 것을 제시한다. LK 및 HCA-유도성 세포 사망에 덧붙여, HSB-13은 Aβ-유도성 독성 및 HCA-독성에 대항하여 일차 피질 뉴런을 보호한다. HSB-13의 증가된 반응성 (versatility)은 단일 치환 그룹 - 6 자리에 존재하는 아미노 그룹에 의한 것일 수 있다.

또한 본 명세서에서 제공되는 데이타는 HSB-13도 두 가지 별도의 신경퇴화 생체내 모델에서 보호작용하는 것을 보여주고 있다. 따라서, HSB-13은 선조체 퇴화를 감소시켰고 헌팅턴씨병의 화학적으로 유도된 마우스 모델에서 행동적 성적을 개선시키며, 파리에서 APP-독성에 대항하여 보호작용을 한다. 신경퇴화의 생체내 패러다임에서뿐만 아니라 조직 배양에서 그의 효율성은 HSB-13 또는 그의 유도체가 인간 신경퇴화 상태의 치료법에서 치료 약물로서 가치를 가질 수 있는 점을 제시한다.

본 발명자들의 연구는 PI-3 키나제 - Akt 및 Raf-MEK-ERK 신호전달 경로, 또는 CaMK, PKA, 및 HDACs와 같은 HK-매개성 뉴런의 생존에 관여하는 다른 분자들이 이들 화합물의 능력에 관여하지 않고 별도의 작용 기작을 제시하면서 보호작용하는 것을 제시하고 있다. 그러나 이 연구는 이들 화합물이 ATF-3 및 c-jun의 활성화를 이들이 매개되는 상위 기작은 유지되더라도 억제하는 것을 보여준다. HCA-유도성 독성에 대항하여 보호작용하는 능력으로 관찰되는 바, 몇 가지 신호전달 분자에 미치는 HSB-13의 효과는 HSB-22 또는 ASk-2a 처리에 의해 나타나는 것과는 정량적으로 서로 다르다. 예를 들어, ATF-3 및 c-jun의 억제는 HSB-22 및 ASK-2a로 관찰되는 것과 비교하여 HSB-13을 사용하는 것이 훨씬 더 건강하다. 또한 HSB-13은 Akt의 세린 473 자리에서 인산화를 억제하는 유일한 화합물이다. 또한 GSK3 활성화의 정도는 그의 인산화에 의해 판단되는 바와 같이, HSB-22 및 ASK-2a보다는 HSB-13을 사용하여 더 높아진다. 이들 몇 가지 차이점은 HSB-22 및 ASK-2a가 아닌 HSB-13이 HCA-유도성 독성에 대항하여 보호작용을 하는 이유를 설명하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 화합물의 작용기작을 보다 잘 이해하기 위하여, 이에 제한되는 것은 아니지만, 20가지의 서로 다른 키나제에 주는 HSB-13 및 ASK-2a의 효과를 시험 관내 (in vitro)에서 조사하였다. 이 연구의 결과는 표 2 및 3 에 나열되어 있다. 500 nM 농도에서, ASK-2a는 GSK3α, GSK3β, p38α, p38β, JNK3, MLK3, 및 B-Raf의 키나제 활성을 실질적으로 억제하였다. 상기에서 언급된 키나제를 억제하는 것에 추가하여, HSB-13도 역시 500 nM로 사용될 때 ROCK1 뿐만 아니라 CDK1, CDK2, CDK5를 억제하였다. 이들 화합물 둘 다는 p38β에 대항하는 가장 강력한 저해를 나타내었다. 상기에서 기술된 바와 같이, ASK-2a는 소뇌 입자 뉴런을 LK-유도성 사망에 대항하여 보호하지만, HT-22 세포의 HCA-유도성 독성에 대항하여는 효과적이지 못하다. 대조적으로, HSB-13은 이 둘 패러다임에서 모두 보호작용을 한다. 이것은 HCA-처리된 HT-22 세포배양에서 HSB-13의 효과가 CDKs에 미치는 그의 저해 효과로 인한 것임을 나타낸다. 이전의 연구는 CDK 저해제가 많은 서로 다른 세포 사멸 자극에 대항하여 뉴런을 보호할 수 있는 점을 확립해주었다.

100 nM에서, HSB-13은 GSK3α, GSK3β, p38β 및 B-Raf를 억제하는 데 상당히 더욱 선택적이다. 강력한 신경보호적 효과를 가지는 3-치환된 인돌론인 GW5074도 역시 B-Raf를 억제한다. GW5074가 GSK3β를 약하게 억제할지라도, B-Raf가 구조적으로 구별되는 신경보호 작용하는 화합물에 의해 억제된다는 발견은 이러한 키나제의 저해가 신경보호 작용의 기초가 되는 분자적 기작에서 중요한 사건으로서 의미를 갖게 한다.

표 2: ASK-2a의 500 nM에서 시험관내 측정된 20가지의 서로 다른 키나제에 주는 효과. 키나제 활성은 대조군 분석법 (ASK-2a 없음)에서의 결과 퍼센트로 표시된다. 그 값은 이중으로 수행된 분석법의 평균이다. 키나제 활성의 실질적인 저해 (> 20%)는 굵은 글자로 표시된다.

표 2: ASK-2a의 100 nM 및 500 nM에서 시험관내 측정된 20가지의 서로 다른 키나제에 주는 효과.

% 활성

각 키나제의 활성이 시험관내 100 nM 또는 500 nM의 ASK-2a 존재 시 측정되었다. 키나제 활성은 대조군 분석법 (ASK-2a 없음)에서의 결과 퍼센트로 표시된다. 그 값은 이중으로 수행된 분석법의 평균이다. 키나제 활성의 실질적인 저해 (> 20%)는 굵은 글자로 표시된다.

HSB-13을 사용하여 GSK3α, GSK3β, p38β 및 B-Raf가 효율적으로 (100 nM 농도에서) 저해되는 것이 밝혀졌다. CDK1, CDK2, ROCK1, JNK2, MLK3, 및 c-Raf도 역시 저해되었다 (이들 모두 500 nM에서 저해되었다.). ASK-2a를 사용하여 GSK3α, GSK3β, p38α, p38β, JNK3, 및 B-Raf가 효율적으로 (100 nM 에서) 저해되는 반면, MLK3는 덜 효율적으로 저해되는 것이 밝혀졌다. 따라서, 1,4-벤즈옥사진의 표적이 되는 키나제는 GSK3α, GSK3β, p38α, p38β, B-Raf, CDK1, CDK2, JNK2, JNK3, 및 MLK3를 포함한다.

표 3: HSB-13의 500 nM에서 시험관내 측정된 20가지의 서로 다른 키나제에 주는 효과. 키나제 활성은 대조군 분석법 (HSB-13 없음)에서의 결과 퍼센트로 표시된다. 그 값은 이중으로 수행된 분석법의 평균이다. 키나제 활성의 실질적인 저해 (> 20%)는 굵은 글자로 표시된다.

표 3. HSB-13의 100 nM 및 500 nM에서 시험관내 측정된 20가지의 서로 다른 키나제에 주는 효과.

% 활성

1,4-벤즈옥사진 화합물은 배양된 뉴런을 세포 사멸로부터 보호하는 것이 밝혀졌다. 배양된 소뇌 입자 뉴런이 LK 배지로 교환될 때, 세포의 약 50%가 24시간 이내에 세포 사멸을 겪는다. 이 연구에서, 도 1에 나타난 20가지 서로 다른 구조의 1,4-벤즈옥사진 유도체 모두가 소뇌 입자 뉴런의 LK-유도성 사망에 대항하여 보호 작용하는 그들의 능력에 대해 테스트 되었다. 각 화합물은 3가지 서로 다른 용량 - 1 μM, 5 μM 및 25 μM에서 테스트 되었다. 뉴런의 생존도는 세포 사멸적 세포 사망의 보편적이고 믿을만한 분석법인 DAPI-염색에 의해 정량되었다. 뉴런의 사망에 주는 효과의 결과는 표 4에 정리되었다. 몇 가지 경우에서, DAPI-염색으로부터 획득된 결과는 두 가지의 서로 다른 세포 사멸 분석법 - TUNEL 염색 및 활성 캐스파제-3 면역세포화학 (active caspase-3 immunocytochemistry)에 의해 검증되었다.

표 4

표 4는 3가지 농도 (1, 5 및 25 μM)에서 각각 테스트되고 LK 배지에 첨가되는 20가지 화합물을 제공한다. 생존은 HK 배지를 받았던 대조군 세포배양에서 % 생존도로 표시된다. 데이타는 각각이 이중으로 수행되었던 적어도 3번의 연구로부터 나온 평균값을 나타낸다. 첨가물이 없는 LK 배지에서, 평균 생존은 48.16 ± 8.44%이었다. 화합물은 표 4 에 나열된 바와 같이 치환과 함께 하기 기본 구조를 가졌다.

상세한 구조-활성 관련성은 분석되지 않았지만, 우리의 20가지 화합물 분석은 하기 결론을 제시한다: (1) 모 화합물 (중심 구조에 대해 표-4 참조) 중 가장 효과적인 신경보호 작용하는 화합물은 ASK-2 (Ar = 3,5-디브로모-4-하이드록시퓨에닐)이다. 표 4에 나타난 바와 같이, ASK-2는 25 μM (102.5%) 및 5 μM (92.1%)에서는 높게 보호작용을 하지만 1μL (80.3%)에서는 적당한 보호작용만을 한다. 4-OH의 중요성은 3,5-디브로모 (ASK-1) 및 3,4,5-트리메톡시 (HSB-6) 유도체에 의해 신경보호 작용이 결여되는 것으로 확인한다. 5 μM에서 적당한 활성이 있는 (88%) HSB-7 (피리딜-3-일)을 제외하고는, 모 헤테로사이클릭 유도체, 예로 ASK-9 (티오펜-2-일), HSB-4 (티오펜-3-일)는 활성이 없었다. (2) ASK-2의 6-자리에서 아미노 그룹 [HSB-13] 또는 염소 원자 [HSB-22]로의 치환은 소정의 농도에서 개선된 활성을 가져온다. 예를 들어, HSB-22는 모든 농도에서, 예로 각각 1 μM, 5 μM 및 25 μM에서 92%, 97% 및 90.6%로 높은 보호작용을 나타낸다. 화합물 HSB-13은 5 μM농도에서 ASK-2 (92.2)보다 유의하게 더욱 효과적이었고 (100.8%) 25 μM 농도에서의 거의 ASK-2 (102.5) 정도로 효과적이었다 (99.5). (3) 주요한 화합물의 신경보호 능력에 영향을 주는 정도는 7-자리에서의 치환이 6-치환과 비해 훨씬 덜하다. 한 가지 농도에서만이 높은 활성을 가진다. 예를 들어 HSB-2 (7-Cl), HSB-5 (7-F) 및 HSB- (7-메틸)은 25 μM 용액에서 높게 보호적 작용을 하고 (~ 97%), HSB-1 (7-니트로)는 5 μM에서 효과적이었다. 네 가지 모두는 다른 두 가지 테스트 용액에서 효과적이지 못하였다. (4) C=S 에 의한 C=O의 치환은 혼합된 결과를 제시한다. 이 연구에서 ASK-9 (피롤-2-일 및 N-Me)는 1 μM에서 적당한 활성 (84.5%)이 있었고, ASK-11 (2,5-디메톡시페닐)은 5 μM에서 높은 활성 (90.7%)이 있었다. 그러나, ASK-8 (티오페닐-2-일)은 활성이 없었다.

배양된 소뇌 입자 뉴런에서의 분석은 HSB-13을 강력한 신경보호적 효능을 가지는 것이라고 확인해주었다. 따라서 우리는 그의 보호적 효과가 다른 뉴런 타입 및 세포 사멸 자극에도 확장되는지 여부를 조사하기 위하여 HSB-13을 선택하였다. 해마-유래 신경모세포종 세포주 HT-22를 호모시스테인산 (HCA)으로 처리하는 것은 세포 사멸을 유도하는 글루타치온 결핍으로 인한 산화적 스트레스를 초래한다 (Murphy et al ., 1990; Ratan et al ., 1994a 및 1994b). 도 9에서 나타난 바와 같이 2 mM HCA로의 처리는 25 μM 농도에서 HSB-13 에 의해 예방되었던 세포 사망을 거의 완벽히 유발하였다. HSB-13은 이 패러다임에서 5 μM로 사용되었을 때 보호작용을 하지 않았다.

HSB-13은 헌팅턴씨병 (HD)의 생체내 모델에서 신경보호 작용을 한다. 설치류 및 비인간 영장류에서 니트로프로피온산 (3-NP) 투여는 선택적인 선조체 퇴화, 자발적인 무도성 및 근육긴장이상 운동을 포함하는 HD의 임상적 및 병리생리학적 표지의 대부분을 재현해낸다. 이러한 신경독소의 투여는 따라서 HD의 유용한 모델이 되었다 (Brouillet et al ., 1999에서 리뷰됨). 본 발명자들은 이 생체내 패러다임에서 HSB-13의 효능을 조사하였다. HSB-13의 효능이 측정되었다. 도 10A에서 나타난 바와 같이, 3-NP가 투여된 마우스는 광범위한 선조체 손상을 나타낸다. 이러한 퇴화는 HSB-13가 2 mg/kg 체중의 농도로 투여될 때 실질적으로 감소된다 (도 10). 3-NP-유도성 선조체 신경퇴화에 대항하는 HSB-13에 의한 보호작용은 운동 성적의 건강한 개선과 상호연관이 있었다. 상세하게는, 모두 3-NP 투여에 의해 손상되었던 전체 이동 에피소드; 전체 이동 거리; 및 이동의 평균 속도는 HSB-13을 받은 동물에서 탁월하게 더 높았다(도 10B).

3-니트로프로피온산 투여 및 행동적 평가. 8-주령 C57BL/6 수컷 마우스 (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA)에 3-NP를 HSB-13 존재 (2.5 mg/kg) 또는 부재 시 복강내 주입으로 10회 투여하였다 (5일 동안 하루 두 번 50 mg/kg). HSB-13 주입은 3-NP 투여 ~ 30분 전에 수행되었다. 대조군 동물은 식염수 주입을 받았다. 5일 간의 주입이 끝난 날에, 운동 활성이 이전에 기술된 바와 같이 TRU-SCAN® 활성 감시 시스템 (TRU-SCAN® activity monitoring system; Coulborn Instruments, PA)을 사용하여 평가되었다 (Chin et al., 2004). 하기 행동적 매개변수가 선택되었다: (1) 전체 이동 에피소드: 바닥면에서의 각 이동은 적어도 1개 시료 간격에 대해 휴지기가 없는 일련의 위치 변화이다. (2) 전체 이동 거리: 바닥면에서의 모든 벡터화된 X-Y 위치 변화의 합계, 및 (3) 평균 속도: 모든 X-T 위치 변화의 평균 속도는 이동을 정의하였다. 행동적 평가를 이어서, 마우스는 깊게 마취되었고, 뇌는 적출되었다. 이 뇌는 0.1 M 인산 완충용액에서 녹인 4% 파라포름알데하이드에서 고정되었고 0.1 M 인산 완충용액에 녹인 20% 슈크로스에서 냉동보관되었다. 관상 섹션이 50 마이크론으로 냉동미세절단기 상에서 절단되었고 크레실 바이오렛 (시그마)을 사용하여 염색되었다.

본 발명은 신경보호적 제제로서의 1,4 벤즈옥사진을 첫 번째로 기술한 것이고 이 부류의 화합물이 인간 신경퇴화성 질병을 위한 새로운 치료적 제제임을 의미하는 흥미로운 가능성을 제시한다.

화학적 화합물의 세포성 c-Raf 및/또는 B-Raf에 주는 효과 평가. 세포 용출액으로부터 면역침전에 이어서 c-Raf 또는 B-Raf 활성이 평가된다. 간략하게는, 약 250 μg의 단백질을 1.0μg의 일차 항체 (c-Raf 또는 B-Raf에 대한 항체) 및 12 μl의 단백질 A/G 플러스-아가로스 비드 (Protein A/G PLUS-Agarose beads)와 하룻밤 동안 반응시킨다. 면역침전물은 6,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 수집되고 용해 완충용액으로 두 번, 350 mM NaCl이 보충된 용해 완충용액으로 두 번, 또한 키나제 완충용액 (25 mM HEPES pH 7.4, 및 10 mM MgCl₂)으로 두 번 세척된다. 정제된 재조합 GST-MEK1 K97M 단백질은 85 μM ATP가 보충된 키나제 완충용액에 30℃에서 35분 동안 기질로서 첨가된다. 시험관내 키나제 분석법을 위해, 화합물이 키나제 완충용액에 첨가되고 ATP 첨가에 의한 키나제 반응을 시작하기 전에 5분 동안 30℃에서 반응시킨다. 키나제 반응은 6x SDS 시료 완충용액을 첨가하여 정지시키고 5분 동안 끓여준다. 단백질은 SDS-PAGE 로 분리시킨 다음 웨스턴 블럿을 실시한다. 키나제의 활성 수준을 웨스턴 블럿팅에 이어서 포스포-MEK 항체를 사용하여 검출한다.

곤충세포로부터 정제된 화학적 화합물 c-Raf 및 B-Raf의 효과. 시험관내 기나제 분석법은 정제된 키나제 (Sf9 곤충세포에서 배큘로바이러스에 의해 발현됨) 및 합성 기질을 사용하여 업스테이트 바이오테크놀로지사 (Upstate Biotechnology)의 키나제 프로파일 서비스 (Kinase Profiling Service)를 사용하는 표준 조건 하에서 수행되었다. 간략하게, 각 분석법을 위해 5 - 10 mU의 정제된 키나제를 화학적 화합물 (0.1 - 1 μM 농도)과 8 mM MOPS, pH 7.2, 0.2 mM EDTA, 10 mM Mg 아세테이트 및 [γ-³³P-ATP]를 포함하는 완충용액으로 상온에서 40분 동안 반응시킨다. 이 때 MBP가 기질로서 사용된다. 키나제 활성은 P30 필터 상에 일정량 (aliquot)을 스포팅 (spotting)하고 50 mM 인산 (phosphoric acid)으로 세척한 다음 신틸레이션 측정법 (scintillation counting)을 실시하여 ³³P 도입을 측정함으로써 정량된다.

몇 가지 경우에서, c-Raf 및 B-Raf에 주는 효과는 하기에 기술된 바와 같이 시그날켐 (SignalChem)에 의해 분석된다. 단백질 키나제 분석법 (이중 또는 삼중으로)이 상온에서 20-40분 동안 최종 부피 25 μl로 수행되었다. 이 분석법은 ³³P-ATP을 첨가하여 개시되었고 반응 혼합물을 단백질 키나제 표적에 따라 상온에서 20-40분 동안 반응시켰다. 반응 이후에, 10 μl의 반응 혼합물을 멀티스크린 포스포셀룰로우즈 (Multiscreen phosphocellulose) P81 플레이트 상에 스포팅하여 반응을 종결시켰다. 멀티스크린 포스포셀룰로우즈 P81 플레이트는 대략 15분 동안 각각 1% 인산 (phosphoric acid) 용액에서 3번 세척되었다.

P81 플레이트 상에서의 방사능 활성은 신틸레이션 용액을 넣어 트리럭스 신틸레이션 측정기 (Trilux scintillation counter)로 측정되었다. 공 대조군에는 적절한 기질을 첨가하는 것을 제외하고는 (동일한 부피의 분석 희석 완충용액으로 대체됨) 모든 분석법의 구성요소가 포함되고, 각각의 단백질 키나제 표적에 대해 설정되었다. 각 단백질 키나제 표적에 대한 교정된 활성은 공 대조군 값을 빼고나서 결정되었다.

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Claims

화학식 (I)의 화합물:

여기에서
A 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
B 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
R₁-R₇ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R⁸ 은 C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 또한
R₉-R₁₃ 은 H, C₁-C₆ 알킬; C₁-C₆ 알케닐, 할로, 치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환된 C₁-C₆알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
제 1항에 있어서,
A 는 O 로부터 선택되고;
B 는 N 으로부터 선택되고;
R₂-R₆ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R₇ 은 옥소 그룹이고;
R₈ 은 C₁ 알케닐 그룹이고;
R₉ 및 R₁₃ 은 할로겐이고;
R₁₀-R₁₂ 은 수소이고; 또한
R₁₁ 은 아세톡시 그룹;인 것을 특징으로 하는 화합물.
(Z)-2,6-디브로모-4-((3-옥소-3,4-디하이드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-2-일리덴)메틸)페닐 아세테이트, 및 (Z)-2-(3,5-디브로모벤질리덴)-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온을 포함하는 화합물.
신경학적 상태에 대항한 보호를 필요로 하는 개체를 확인하고; 하기를 포함하는 조성물을 상기 개체에게 제공하는: 단계로 이루어진 상기 개체에서 신경학적 상태에 대항하여 보호하는 방법.

여기에서
A 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
B 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
R₁-R₇ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R⁸ 은 C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 또한
R₉-R₁₃ 은 H, C₁-C₆ 알킬; C₁-C₆ 알케닐, 할로, 치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환된 C₁-C₆알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
제 4항에 있어서,
A 는 O 로부터 선택되고;
B 는 N 으로부터 선택되고;
R₂-R₆ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R₇ 은 옥소 그룹이고;
R₈ 은 C₁ 알케닐 그룹이고;
R₉ 및 R₁₃ 은 할로겐이고;
R₁₀-R₁₂ 은 수소이고; 또한
R₁₁ 은 아세톡시 그룹;인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 신경학적 상태는 이에 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머병 (Alzheimer's desease), 파킨슨씨병 (Parkinson's disease), 헌팅턴씨병 (Huntington's disease), 뇌졸중 (stroke) 및 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 개체는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소 (cow), 황소 (bull), 래트, 마우스 및 파리로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 신경학적 상태에 대항한 보호는 하나 이상 뉴런의 사망, 하나 이상 뉴런의 소실, 하나 이상 뉴런에서 독성의 예방, 개선된 운동 성적 (locomotor performance), 또는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein) 및 기타 분체 (moiety)의 독성 효과에 대항한 보호를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(Z)-2,6-디브로모-4-((3-옥소-3,4-디하이드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-2-일리덴)메틸)페닐 아세테이트, (Z)-2-(3,5-디브로모벤질리덴)-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온의 치료적 유효량을 개체에게 제공하는: 단계를 포함하는 신경학적 상태에 대항하여 개체를 보호하는 방법.
신경학적 상태에 대항한 보호를 필요로 하는 개체를 확인하고; 하기 화학식을 가지는 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에게 제공하는: 단계로 이루어진 신경학적 상태에 대항하여 상기 개체를 보호하는 방법.

여기에서
A 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
B 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
R₁-R₇ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R⁸ 은 C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 또한
R₉-R₁₃ 은 H, C₁-C₆ 알킬; C₁-C₆ 알케닐, 할로, 치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환된 C₁-C₆알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
제 10항에 있어서,
상기 신경학적 상태는 이에 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅턴씨병, 뇌졸중 및 허혈성 뇌졸중을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 개체는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 황소, 래트, 마우스 및 파리로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 신경학적 상태에 대항한 보호는 하나 이상 뉴런의 사망, 하나 이상 뉴런의 소실, 하나 이상 뉴런에서 독성의 예방, 개선된 운동 성적, 또는 아밀로이드 전구체 단백질 및 기타 분체의 독성 효과에 대항한 보호를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
증가된 키나제 활성에 대항한 보호를 필요로 하는 개체를 확인하고; 상기 개체에서 키나제 활성을 감소시키는 데 효과적인 하기 화학식을 포함하는 조성물의 양을 상기 개체에게 제공하는: 단계로 이루어진 상기 개체에서 키나제를 저해하는 방법.

여기에서
A 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
B 는 C, N, S, O 로부터 선택되고;
R₁-R₇ 는 H, C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, C₁-C₆에테르 그룹, C₁-C₆ 에스테르 그룹, C₁-C₆ 알킬 알카노에이트 그룹, C₁-C₆ 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R⁸ 은 C₁-C₆ 알킬 그룹, C₁-C₆ 알케닐 그룹, 할로 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알킬 그룹, 치환된 C₁-C₆ 알케닐 그룹, 카르보닐 그룹, 카보네이트 에스테르 그룹, 에테르 그룹, 에스테르 그룹, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 또한
R₉-R₁₃ 은 H, C₁-C₆ 알킬; C₁-C₆ 알케닐, 할로, 치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환된 C₁-C₆ 알케닐, 카르보닐, 카보네이트 에스테르, 아세톡시 그룹, 아세틸 그룹, 에테르, 에스테르, 알킬 알카노에이트 그룹, 알콕시 그룹, 케토 그룹, 및 옥소 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
제 14항에 있어서,
상기에 더하여 상기 개체에서 키나제 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
키나제 활성에서의 증가에 대항한 보호를 필요로 하는 상기 개체가 신경학적 상태를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서,
상기 신경학적 상태는 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅턴씨병, 뇌졸중, 또는 허혈성 뇌졸중을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
키나제 활성에서의 감소는 하나 이상 뉴런의 사망, 하나 이상 뉴런의 소실, 하나 이상 뉴런에서 독성의 예방, 개선된 운동 성적, 또는 아밀로이드 전구체 단백질 및 기타 분체의 독성 효과에 대항한 보호를 포함하는 신경학적 상태에 대항하여 보호하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 개체는 암을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 저해된 키나제는 GSK3α, GSK3β, p38β, 및 B-Raf의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 저해된 키나제는 CDK1, CDK2, ROCK1, JNK2, MLK3, 및 c-Raf의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 저해제는 100 및 500 nM 사이의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기에 더하여 상기 개체에게 상기 화합물을 제공하기 이전에 GSK3α, GSK3β, p38α, p38β, B-Raf, CDK1, CDK2, JNK2, JNK3, 및 MLK3의 적어도 하나의 활성을 측정한 다음 처리 이후에 상기 활성을 측정하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 상태는 바이러스 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.