KR100758214B1 - 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료에 있어서의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 소정의 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머, 치매 또는 파킨슨 병일 수 있다.
아릴우레이도아세테이트, 퇴행성 뇌질환

Description

아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물{ARYL UREIDO ACETATE-BASED COMPOUND, AND COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASE CONTAINING THE SAME}
도 1은 PC12 세포에서 베타-아밀로이드에 의한 신경세포독성 (A25-35-induced cytotoxicity)에 대한 화합물 KHG21834의 보호 효과를 나타낸 것이다.
(A) 내지 (C) 현미경 분석,
(D) MTT 리덕션 에세이에 의한 세포 생존률 분석:
(a) 베타-아밀로이드를 처리하지 아니한 대조군,
(b) 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 경우,
(c) 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 후, KHG21834 50 mM 을 처리한 경우.
도 2는 PC12 세포에서의 베타-아밀로이드에 의한 TUNEL-라벨링 (Transferase-mediated dUTP nick end labeling)에 대한 화합물 KHG21834의 보호 효과를 보여주는 것이다.
(A) 내지 (C)는 TUNEL-라벨링 측정 결과로서 (A)는 대조군, (B)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 경우, (C)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간 동안 처리한 후 화합물 KHG21834 50 mM 을 처리한 경우이고,
(D)는 400 X 확대하여 측정한 TUNEL 양성 뉴런의 정량 분석 결과이고,
(E)는 DNA 단편화를 보여주는 것으로, (a)는 대조군, (b)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 경우, (c)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 후 화합물 KHG21834 50 mM 을 처리한 경우, (M)은 1Kb Plus DNA Ladder (Gibco/BRL)의 결과이다.
도 3은 랫트 피질 뉴런-아교세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 신경세포 퇴행에 대한 KHG21834의 보호 효과를 면역생화학분석에 의하여 보여주는 것이다. (A) 내지 (C)는 TUNEL-라벨링 측정 결과로서 (A)는 대조군, (B)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 경우, (C)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 후, KHG21834 50mM을 처리한 경우이고,
(D) 내지 (F)는 MAP-2 염색 측정결과로서, (D)는 대조군, (E)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 경우, (F)는 베타-아밀로이드 50mM 을 7일동안 처리한 후 화합물 KHG21834를 처리한 경우이며,
(G)는 LDH 방출 분석을 이용하여 측정된 (A)내지 (C)에서의 세포독성을 대조군에 대한 퍼센트로 나타낸 것이다.
도 4는 랫트 중간뇌 뉴런-아교세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 신경퇴행에 대한 화합물 KHG21834의 보호 효과를 나타낸 것이다.
(A) 내지 (F)는 면역생화학분석 측정 결과로서, (A) 및 (D)는 대조군, (B) 및 (E)는 베타-아밀로이드 50mM을 48시간동안 처리한 경우, (C) 및 (F)는 베타-아 밀로이드 50mM을 48시간동안 처리한 후, 화합물 KHG21834 50mM을 처리한 경우이고,
(G)는 LDH 방출 분석 방법을 이용하여 (A) 내지 (C)의 세포독성을 대조군에 대한 퍼센트로 나타낸 것이며,
(H)는 (A) 내지 (C)에서의 TH 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 5는 피질 뉴런-신경세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 GABA 흡수의 감소에 대한 KHG21834의 효과를 나타낸 것이다.
(A)는 화합물 KHG21834를 표시된 정도의 양으로 첨가한 상태에서 12일동안 베타-아밀로이드의 농도를 달리하여 처리한 경우 베타-아밀로이드 농도에 따른 GABA 흡수율을 나타낸 것이고,
(B)는 화합물 KHG21834를 표시된 정도의 양으로 첨가한 상태에서 베타-아밀로이드의 농도에 따른 GABA 흡수율을 시간별로 측정하여 나타낸 것이다.
(●: 0mM KHG21834, □: 25mM KHG21834, ■: 50mM KHG21834)
도 6는 중간뇌 뉴런-신경세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 도파민 흡수의 감소에 대한 KHG21834의 효과를 나타낸 것이다.
(A)는 화합물 KHG21834를 표시된 정도의 양으로 첨가한 상태에서 12일동안 베타-아밀로이드의 농도를 달리하여 처리한 경우 베타-아밀로이드 농도에 따른 GABA 흡수율을 나타낸 것이고,
(B)는 화합물 KHG21834를 표시된 정도의 양으로 첨가한 상태에서 베타-아밀로이드의 농도에 따른 GABA 흡수율을 시간별로 측정하여 나타낸 것이다.
(●: 0mM KHG21834, □: 25mM KHG21834, ■: 50mM KHG21834)
도 7은 랫트 중간뇌-아교 세포에서 ERK1 및 ERK2의 인산화 활성에 대한 화합물 KHG21834의 효과를 나타낸 것으로, KHG21834 0mM, 25mM 또는 50mM 를 처리한 후, 베타-아밀로이드 50mM 를 24시간동안 처리하였다.
(A)는 인산화-ERK1, 인산화-ERK2, ERK1 및 ERK2에 대한 면역블랏 분석이고,
(B)는 대조군에 대한 ERK의 인산화 정도를 퍼센트로 나타낸 것이다.
[기술분야]
본 발명은 신규한 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 퇴행성 뇌형관질환은 알츠하이머, 치매 또는 파킨슨 병일 수 있다.
[종래기술]
최근 우리나라의 여러 질병 중에서 뇌질환은 국가적인 문제로 등장하고 있다. 뇌질환은 지난 10년간의 사망원인으로 가장 큰 상승폭을 나타내고 있으나, 다른 질환에 비하여 진단 및 치료가 어려워 그로 인한 피해는 증가될 것으로 추산되고 있다.
특히 치매는 기억력 장애 및 판단력 상실 등의 전반적인 정신기능 장애를 초래하여 인간의 삶을 황폐하게 하는 질환이다. 치매의 원인은 다양한 편으로, 약 50% 는 알츠하이머형 치매이고, 20-30%는 혈관성 치매, 알코올성 치매 또는 파킨슨 병 치매 등이며, 약 15-20%는 알츠하이머형과 혈관성 치매 모두에 의한 것이다.
이중 알츠하이머병(Alzheimer's disease, 이하 'AD') 치매는 노인성 치매라고도 하며, 40대에서부터 많이 발병하게 되어 발병원인이 정확하게 밝혀지지 않았지만 노화와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.
치매는 신경세포 손상이나 아세틸콜린 농도저하에 의하여 발생되는 것으로 보고되고 있다. 신경세포 손상은 자유 라디칼, 글루타메이트, 칼슘 과다, 질소, 아밀로이드 베타 단백질 및 사이토카인 등의 다수 요인에 의하여 유발되며, 그 중에서 알츠하이머 병을 가진 환자의 신경세포의 경우 과량의 베타-아밀로이드(β-Amyloid)를 포함하는 신경염 플라그를 보인다.
이러한 베타-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, 이하 'APP'라고 함)으로부터 형성되며, 정상적인 사람의 경우는 상기 아밀로이드 전구체 단백질로부터 P3 아밀로이드를 형성하게 된다.
그러나 알츠하이머병 환자의 경우는 APP가 변형되어 베타-아밀로이드 단백질로 구성된 아밀로이드 플라크(신경세포 외부에 형성)와 신경세포의 구조를 유지하고 신경전달을 돕는 작용을 하는 타우(tau) 단백질이 과잉산화되어 형성되는 신경원섬유엉킴(신경세포 내부에 형성) 등 두가지의 특징적인 병변을 보인다.
상기와 같이 과량의 베타-아밀로이드 형성은 신경퇴행적인 단계의 시작점으로 대표되어질 수 있다. 뇌에서의 베타-아밀로이드 결집의 형성은 현재 신경염 플라크의 형성을 부르는 신경세포에서의 다양한 독성의 효과로 보여진다.
세포내, 외적인 실험 모두에서 신경세포의 세포자멸의 유발을 포함하는 베타 -아밀로이드의 신경독성 효과가 증명되었다. 예를 들어, 배양된 중추 신경계 뉴런 및 신경세포 PC 12가 베타-아밀로이드에 노출되면 신경세포 자멸사 를 일으킨다(Loo et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 7951-7955; Ivins et al., J Bio Chem, 1999, 2107- 2112). 베타-아밀로이드는 미세아교세포의 존재하에서 중간뇌 또는 피질 뉴런에 대하여 신경세포 독성을 현저히 증가시킨다. 미세아교세포의 활성화 및 과산화물 자유 래디칼의 형성이 신경세포 독성을 증가시키는 것으로 알려졌다(Gao et al., J Neurochem., 2002, 1285-1297; Qin et al., Neurochem., 2002, 973-983). 뇌에서의 염증은 파킨스병 및 알츠하이머 병 등을 포함하는 여러가지 신경퇴행성 질병에서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 인식되어있다. 염증-매개 신경세포 퇴행은, 뉴런이 신경퇴행을 일으키는데 영향을 미치는 에이코사노이드, 사이토카인, 반응성 산소 중간물, 질소산화물 등을 포함하는 전염증 및 신경독성 인자들을 생산하는, 뇌에 존재하는 면역세포인 미세아교세포의 활성화를 수반한다 (Qin et al., Neurochem., 2002, 973-983). 선행 연구에서는 미세아교세포의 베타-아밀로이드 의존성 활성화와 알츠하이머 환자의 뇌에서 일어나 뉴런 사멸의 여러가지 특징적인 마커 간의 연관관계를 증명하였다 (Combs et al., J Neurosci., 2001, 1179-1188).
흥미롭게도, 베타-아밀로이드는 미세아교세포의 존재하에서의 중간뇌 및 피질 뉴런 모두에서 대하여 현저하게 증가된 신경세포 독성을 가졌다(Gao et al., J Neurochem., 2002, 1285-1297; Qin et al., Neurochem., 2002, 973-983). 그러므로 아밀로이드 펩타이드는 알츠하이머병 이외에도 PD(Parkinson's Disease)와 같은 다른 신경세포 퇴행적인 질병의 발병기전에 수반될 수 있다(Puglielli and Kovacs, Rev Med Chil., 2001, 569-575; Small et al., Nature Rev., 2001, 595-598). Parkinsonism 증상은 알츠하이머 환자에게도 일반적이며, 알츠하이머 환자에서 인지력(cognitive) 감소는 파킨스니즘 진행과 연관있는 것으로 밝혀졌다(Wilson et al., Psychol Aging, 2000, 18-28). 도파민 뉴런은 산화 자극에 취약한 것으로 알려졌기 때문에(Greenamyre et al., Biochem Soc Symp 1999, 85-97), 미세아교세포의 활성 억제가 잠재적인 치료물질의 개발에 대한 효과적인 전략일 수 있다.
따라서, 신경세포퇴행성 질환의 치료와 예방에 있어서, 베타-아밀로이드와 미세아교세포 활성 억제 효과를 갖는 물질의 탐색 및 개발이 매우 유용할 것으로 기대되며, 이에 대한 연구가 요구된다.
상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 베타-아밀로이드 형성으로 인한 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용하고 부작용이 적은 화합물과 이를 함유하는 효과적인 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머, 치매 또는 파킨슨 병일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명은 신규한 아릴우레이도아세테이트계 화합물에 관한 것이다. 상기 아릴우레이도아세테이트계 화합물은 하기의 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 것일 수 있다:
(화학식 1)
Figure 112006041706671-pat00001
상기 식 중,
X는 S 또는 NH이고,
R1은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 니트로기로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
R2는 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 탄소수 1 내지 5의 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이다.
(화학식 2)
Figure 112006041706671-pat00002
상기 식 중, R3은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 할로겐 원자로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
(화학식 3)
Figure 112006041706671-pat00003
아릴우레이도아세테이트계 화합물, 특히 벤조티아졸계 화합물은 약제 개발에 있어서 굉장히 흥미로운 물질로, 뇌혈관 및 신경퇴행성 질병의 일부분에 있어서 치료에 유용하다는 것이 알려진 물질이다.
본 발명자는 베타-아밀로이드에 의하여 유도된 신경세포의 사멸에 대항하는 효과적인 신경세포 보호제의 발달에 관심을 가지고 연구하던 중, 다양한 아릴우레이도아세테이트계 화합물을 합성하고, 이를 배양된 PC12 세포 및 중간뇌(mesencephalic) 및 피질(cortical) 뉴런-아교세포에 적용하여 실험을 수행한 결 과, 상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트계 화합물이 우수한 베타-아밀로이드 합성 억제 능력, 미세아교세포 활성 억제 능력, 및 이로 인한 우수한 신경세포 보호 능력을 갖고 있음을 발견하였다.
상기 아릴우레이도아세테이트계 화합물이 신경세포 보호제의 능력을 갖는지 여부는 TUNEL(In situ transferase-mediated dUTP nick end labeling) 라벨링 측정법, TH 항체를 이용하여 신경세포퇴행 여부를 면역생화학적으로 분석하는 방법에 의할 수 있으며, 간질병, 경련, 발작 등의 원인이 되는 GABA(γ-aminobutyrate)의 감소율 및/또는 신경전달물질인 도파민의 감소율 측정, ERK (Extracellular signal-regulated kinase) 인산화 정도 측정, MAP-2(microtubule-associated proteins) 염색법, 및/또는 LDH (lactate dehydrogenase) 방출 분석에 의할 수 있다.
GABA는 흥분을 억제시키는 시냅스에서 대표적으로 발견되는 아미노산류의 신경 전달 물질로 몸 전체 중에서 중추신경계에 고농도(30mM)로 분포한다. 베타-아밀로이드로 인하여 감소하였던 GABA의 양이 회복되는 것은 신경 전달 물질의 기능을 정상적으로 담당할 수 있는 농도에 도달함을 의미한다. 즉, 뇌가 정상적인 기능을 위하여 회복됨을 의미하는 것이다. 도파민 뉴런에서 주로 나타나는 도파민 흡수의 감소가 약화되는 것도 상기 GABA의 경우와 마찬가지로 해석할 수 있다. 따라서, GABA 및/또는 도파민 함량을 측정함으로써, 신경세포 보호 작용을 평가할 수 있다.
또한, ERK 인산화는 세포가 고사되기 위한 신호전달 체계의 한 부분으로 외 부의 자극 또는 내부의 세포 사멸시 활성화(인산화)될 수 있다. 따라서, 상기 ERK 인산화는 신경세포의 사멸을 나타내는 지표로 이용할 수 있다. 또한, MAP-2 염색법은 피질 신경세포 또는 신경돌기의 형태변화에 있어서 세포가 손상되는 정도를 나타내는 지표로 사용될 수 있다. 또한, 자극으로 인하여 세포막이 손상되는 경우 세포외부로 LDH가 유리되는 특징을 이용하여, LDH 분석에 의하여 세포손상 및 신경세포의 사멸을 측정할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 측정 방법에 의하여, 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트 화합물이 퇴행성 뇌질환의 직접적인 원인이 되는 신경세포의 사멸 또는 변성의 예방 또는 치료 효능을 확인함으로써, 이들 아릴우레이도아세테이트계 화합물이 퇴행성 뇌질환에 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 구조를 갖는 화합물, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 퇴행성 뇌질환은 베타아밀로이드 형성으로 인한 것으로, 예컨대, 알츠하이머, 치매 또는 파킨슨 병일 수 있다.
상기 화학식 중 화학식 1의 에톡시기 대신에 메톡시기로 치환된 화합물은 공지의 화합물로서, JP 57149280 (1982)에 제초제, 살균제, 항콜레스롤제 및 항부정맥제로 사용가능다고 보고되었으나, 본 발명과 같은 신경세포 보호 효과에 대해서 는 전혀 기재하는 바가 없다. 따라서 본 발명의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 상기 문헌에 기재된 내용과 화합물은 구조 및 작용에 있어서 전혀 다른 것이다. 또한, 상기 화학식 2의 우레아 기능기의 산소원자 대신 황원자로 치환된 화합물인 [[(4-페닐-2-티아졸릴)아미노]티옥소메틸]카르밤산, 에틸 에스테르는 화학전문잡지 'J. Heterocycl. Chem. (1979), 16(1), 61-64, Chem. Phar. Bull. (1973), 21(1), 74-86' 및 'Chem. Pharm. Bull. (1972), 20(12), 2626-2633'에 수록되어 있으나, 이 또한 본 발명의 화학식 2의 구조를 갖는 화합물과 구조와 작용에 있어서 상이한 것이다.
상기 아릴우레이도아세테이트계 화합물은 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 이 경우 상기 조성물 내 아릴우레이도아세테이트계 화합물은 0.1 내지 99 중량%일 수 있으나, 바람직한 함량은 조성물의 사용방법 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.
상기 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 사용가능한 담체 또는 부형제는 제형에 따라 적절한 물질을 사용할 수 있는데, 제제화하는 경우 통상의 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리톨, 리퀴드 파라핀, 탈크, 이성화당, 소디움 메타비설파이트, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 스테아린산 마그네슘, 유당, 생리식염수, 향료 및 색소가 있다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물은 약제, 식품 첨가제 또는 식품으로 사용할 수 있으며, 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하다. 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSTESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등일 수 있다.
퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은 복용자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 1㎎/㎏(체중) 내지 500 ㎎/㎏(체중)으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
1-1: 실험 재료의 준비
베타25-35-아밀로이드 (A25-34), 폴리-D-라이신, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT), 행크스' 밸런스염 용액(Hank's balanced salt solution, HBSS), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 항-베타-액 틴 모노클론 항체는 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 라미닌, RPMI 1640, 최소 필수 영양 배지 (minimum essential medium, MEM), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 말 혈청 (horse serum)은 인비트로젠사(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였으며, 항-p-ERK 모노클론 항체 및 항-ERK 폴리클론 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 항-티로신 하이드록시라제(TH) 폴리클론 항체는 칼바이오켐사(Calbiochem, San Diego, CA, USA)로부터 구입하였으며, 항-MAP2(microtubule associated protein-2) 모노클론 항체는 아브캠사(Abcam, Cambridge, UK) 로부터 구입하였다. [3H] DA(Dopamine)(30Ci/mmol) 및 [3H]GABA(Gamma-Aminobutric Acid)(90Ci/mmol)는 퍼킨엘머 라이프 사이언스사(PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)로부터 구입하였으며, 알렉사 플루어 488 (Alexa Fluor 488) 및 알렉사 플루어 546는 Molecular Probes사(Eugene, OR, USA)로부터 구입하였다.
1-2: 아릴우레이도아세테이트 유도체의 합성
본 실시예에서는, 상기 화학식 1, 2 또는 3의 구조를 갖는 화합물을 대표하여, 하기 표 1의 화합물을 합성하고, 이에 대하여 신경세포 보호능력을 측정하였다.
Figure 112006041706671-pat00004
화합물 KHG21834 (Ethyl 2-[3-(benzo[ d ]thiazol-2-yl)ureido]acetate, R1=H)의 합성
에틸 알코올 20㎖에 하기 반응식 1과 같이 0.01 mol의 2-아미노아릴우레이도아세테이트(하기 화학식 4) 1.5g과 0.01 mol 에틸 이소시아네이토아세테이트(하기 화학식 5) 1.14㎖을 용해시킨 용액을 2시간 동안 환류시켰다
(반응식 1)
Figure 112006041706671-pat00005
얻어진 반응 혼합물을 실온에서 냉각시킨 후, 여과하여 침전물을 수집하여 흰색 고체의 우레아를 얻었으며 (14.7g, 수율: 52%), 얻어진 흰색 고체를 KHG21834 (상기 표 1의 화합물 번호 1)로 명명하였다.
상기 KHG21834의 화학적 특성은 다음과 같다;
mp 282℃,
1H NMR (DMSO-d 6 , 300MHz) 11.1 (br s. 1H, NH) 7.08-7.89 (m, 4H ArH), 6.95(br s. 1H, NH), 4.11 (q, J = 7.10 Hz, 2H, ethyl-CH2), 3.96(d, J = 5.8 Hz, CH2),1.21(t, J = 7.10 Hz, 3H, ethyl-CH3),
상기와 같은 방법으로 상기 표 1의 화합물 번호 2 내지 10의 구조를 갖는 화합물을 합성하였다. 상기 합성에 있어서, 한국특허출원 공개공보 제2002-0010028호 (발명의 명칭: 2. 2-페닐이미노티아졸린 유도체, 그의 염 및 제조방법; 2002년 2월 2일 공개, 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 방법을 참조하였다. 얻어진 화합물의 화학적 특성은 다음과 같다
KHG24027 (화합물 번호 2)
Ethyl 2-[3-(6-methylbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=6-CH3)
수율 : 38.0 %
융점 : 288.5 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.95 (s, 1H, NH), 7.67 (s, 1H, NH), 7.52-7.07 (m, 3H, Ar-H), 4.13 (q, 2H, J = 7.11 Hz, ethyl-CH2), 3.95 (d, 2H, CH2), 2.37 (s, 3H, CH3), 1.21 (t, 3H, J = 7.11 Hz, ethyl-CH3).
KHG24028 (화합물 번호 3)
Ethyl 2-[3-(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=6-NO2)
수율 : 21.8 %
융점 : 239.0 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.69-7.40 (m, 3H, Ar-H), 8.26 (s, 2H, 2 X NH, 4.12 (m, 2H, ethyl-CH2), 3.99 (d, 2H, CH2), 1.22 (t, 3H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH3).
KHG24029 (화합물 번호 4)
Ethyl 2-(3-benzo[d]imidazol-2-ylureido)acetate (R1=H)
상기 화합물은 이미 공지된 화합물이나, 그의 베타아밀로이드 활성 억제 효과 및 이로 인한 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료효과는 본 발명에서 최초로 규명되어 본 발명의 유효 성분 범위에 포함시켰다.
수율 : 41.0 %
융점 : 270.6 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.98 (s, 1H, NH), 7.69 (s, 1H, NH), 7.37-7.00 (m, 4H, Ar-H), 4.13 (q, 2H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH2), 3.98 (d, 2H, CH2), 1.56 (t, 3H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH3).
KHG24030 (화합물 번호 5)
Ethyl 2-[3-(4-(4-chlorophenyl)thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=4-Cl)
수율 : 11.0 %
융점 : 250.4 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.98 (s, 1H, NH), 7.89-7.45 (m, 4H, Ar-H), 7.83 (m, 1H, NH), 7.54 (s, 1H, vinyl-H), 4.13-4.09 (q, 2H, J = 7.11 Hz, CH2), 3.94 (d, 2H, CH2), 1.23-1.86 (t, 3H, J = 7.11 Hz, CH3).
KHG24031 (화합물 번호 6)
수율 : 8.0 %
융점 : 245.5 ℃
Ethyl 2-[3-(4-methoxybenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=4-OCH3)
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.09 (s, 1H, NH), 7.45-6.93 (m, 3H, Ar-H), 7.03 (s, 1H, NH), 4.13 (q, 2H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH2), 3.95 (d, 2H, CH2), 3.89 (s, 3H, OCH3), 1.57 (t, 3H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH3).
KHG24032 (화합물 번호 7)
Ethyl 2-[3-(4-methylbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=4-CH3)
수율 : 14.0 %
융점 : 261.5 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.27 (s, 1H, NH), 8.68 (s, 1H, NH), 7.70-7.08 (m, 3H, Ar-H), 4.14 (q, 2H, J = 7.09 Hz, ethyl-CH2), 3.96 (d, 2H, CH2), 2.52 (s, 3H, CH3), 1.21 (t, 3H, J = 7.11 Hz, ethyl-CH3).
KHG24033 (화합물 번호 8)
Ethyl 2-[3-(4-p-tolylthiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=4-CH3)
수율 : 8.0 %
융점 : 176.9 ℃
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.71 (s, 2H, (NH)2), 7.67-7.27 (m, 4H, Ar-H), 7.14 (s, 1H, 5-CH), 4.11 (q, 2H, ethyl-CH2), 3.94 (d, 2H, CH2), 2.33 (s, 3H, CH3), 1.21 (t, 3H, ethyl-CH3).
KHG24034 (화합물 번호 9)
수율 : 21.0 %
융점 : 171.3 ℃
Ethyl 2-[3-(4-(4-bromophenyl)thiazol-2-yl)ureido]acetate (R1=4-Br)
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.76-7.55 (m, 4H, Ar-H), 7.34 (s, 2H, (NH)2), 7.11 (s, 1H, 5-CH), 4.11 (q, 2H, J = 7.10 Hz, ethyl-CH2), 3.71 (d, 2H, CH2), 1.19 (t, 3H, J = 7.14 Hz, ethyl-CH3).
KHG21835 (화합물 번호 10)
Ethyl 2-[3-(benzo[d][1,3]dioxole-5-yl)ureido]acetate
수율 : 49.3 %
1H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.67 (s, 1H NH), 7.15 (s, 1H, NH), 6.78-6.33 (m, H, Ar-H), 5.92 (s, 2H, dioxo-CH2), 4.11 (q, 2H, J = 7.13 Hz, ethyl-CH2), 3.83 (d, 2H, CH2), 1.19 (t, 3H, J = 7.11 Hz, ethyl-CH3).
1-3: 베타-아밀로이드의 처리
베타-아밀로이드는 무균의 탈염수 및 보존용액 (1mM)으로 희석하였으며, 영하 70℃에서 부분표본으로 보관하였다. 처리를 위하여 베타-아밀로이드 보존용액을 처리배지에 있어서 원하는 농도로 맞추어 희석하였다. 시약은 DMSO(dimethyl sulfoxide) 하에서 보존용액(10mM)으로 새롭게 준비되었고, 처리 배지에서 원하는 농도로 희석하였다.
1-4: 세포 배양
PC12 세포는 10% 열-불활성화된 말혈청(heat-inactivated horse serum), 5% 소태아혈청, 50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 5% CO2 및 95% 공기를 포함하는 대기조건하, 37℃에서 배양되었다. 상기 배지를 3일에 한번씩 교체하였으며, 세포를 각각의 실험 규모에 따라 적절한 밀도로 평판배양하였다.
1-5: 세포 생존률 측정
PC12 세포를 96-웰 플레이트에 5 X 104 의 밀도로 평판배양하였으며, 세포 생존률을 통상적인 MTT 분석법 및 락테이트 디하이드로게나제(LDH) 분석법에 의하여 측정하였다. 상기 MTT 분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아 대사 능력에 따라 달라지며, 세포내 산화환원 상태를 반영한다. 배양후, 세포를 MTT 용액(최종농도 1㎎/㎖)으로 4시간동안 처리하였다. 원래의 세포에 형성된 진청색 포르마잔 결정을 용해 버퍼에 용해시키고, 마이크로플래이트 리더로 595nm에서의 흡광도를 측정하였다.
상기 배양배지에서 방출된 LDH 활성을 측정하였으며, 이를 세포 사멸 지수로서 평가하였다. 상기 배양배지를 소디움 락테이트, NADH 및 소디움 피루베이트를 함유하는 시약(test)에 첨가한 후, NADH에 의한 340nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 미처리 대조군의 균등액에서의 LDH 활성을 100%로 하여 결과값을 계산하였다.
1-6: 랫트 중간뇌 뉴런-아교세포의 배양
중간뇌 뉴런-아교세포의 일차 배양물을 배아 일수가 14일된 Sprague-Dawley 랫트 배아뇌세포로부터 얻은 세포를 이용하여 다음과 같은 통상적인 프로토콜(Liu et al., 2000a)에 의하여 얻었다. 자세하게는, 중간뇌조직을 경기계적분쇄에 의하여 얻었으며, 세포를 파스퇴르 파이펫을 이용한 파이펫팅으로 기계적으로 해리하였다. 상기 세포를 폴리(D-라이신) 20㎍/㎖ 및 1㎍/㎖ 라미닌으로 전처리된 6-웰 배양 플레이트에 7 X 105의 농도로 접종하였으며, 3㎖/웰 유지 배지에서 5% CO2 및 95% 공기의 가습 대기조건, 37℃ 온도조건하에서 유지하였다. 상기 배지는 20% 열-불활성화된 소태아혈청, 0.1% 글루코오스, 2mM L-글루타민, 1mM 소디움 피루베이트, 100mM 불필수 아미노산, 50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신를 포함하는 최소 필수 배지로 구성된 것을 사용하였다. 5일째 배양된 배양액을 처리용으로 사용하였다. 처리시, 중간뇌 뉴런-아교세포 배양액은 48% 별아교세포, 11% 미세아교세포, 40% 뉴런, 및 1% 도파민신경세포로 구성되었다.
1-7: 랫트 피질 뉴런-아교세포의 배양
랫트 피질 뉴런-아교세포는 배아 일수가 16/17일된 Sprague-Dawley 랫트 배아 뇌세포로부터 얻었고, 모든 세포는 Hippocampal neurons 및 다른 CNS 뉴런의 성장에 있어서 오랜기간동안 세포를 유지시키고 낮은 농도의 세포배양에 있어서 세포의 활성을 유지시키는 B27세포, 0.5mM L-글루타민, 및 항균/항진균제가 첨가된 무혈청 Neurobasal(Nb) 배지(Gibco, Gaithersburg, MD)에 현탁하여 현탁액으로 만들어 사용하였다.
흥분 독성 (excitotoxicity)에 대한 무혈청 배지의 효과를 실험하기 위하여, 세포를 25μM 글루타메이트를 포함하는 Nb 배지에서 4-웰 챔버 슬라이드에 평판배양한 후, 4일 후에 Nb 배지로 옮겼다. 세포가 배양되는 Nb 배지는 일주일에 두 번씩 글루타메이트를 함유하지 않는 신선한 Nb/B27 배지로 절반씩 교체하여 주었다. 세포를 폴리 D-라이신 20㎍/㎖ 및 라미닌 1㎍/㎖으로 코팅된 멀티-웰 플레이트 또는 챔버 슬라이드에 5 X 105/㎠로 평판배양하였고, 5% CO2 및 95% 공기의 가습 대기 조건, 및 37℃ 온도 조건 하에 놓아 두었다. 그 후 12일째 된 배양액을 실험에 사용하였다. 상기 피질 뉴런-아교세포 배양액을 미세관 연관 단백질-2(microtubule associated protein-2)에 대한 항체를 이용하는 면역염색법으로 관찰하였다.
피질 뉴런-아교세포 배양액은 60%의 뉴런 및 5% 미세아교를 포함하였으며, 나머지 세포는 별아교세포인 것으로 추정되었된다.
1-8: 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 관찰
일차 중간뇌 뉴런-아교세포를 D-라이신 20㎍/㎖ 및 1㎍/㎖ 라미닌으로 코팅된 Lab-Tek 챔버 커버 글라스(Nunc, IL, USA)에 3 X 106 의 농도로 평판배양하였으며, 도파민 뉴런을 TH에 대한 항체로 염색하였다. 베타-아밀로이드 및 약물에 노출한 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 뉴런을 실온에서 10분동안 PBS(pH 7.5)에서 4% 파라포름알데히드와 함께 배양하여 이를 고정시켰다. 커버 슬립을 PBS로 3번에 걸쳐서 3분 동안 세척한 후, 실온의 블로킹 버퍼에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, 상기 커버-슬립을 블로킹 버퍼로 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 상기 커버-슬립을 PBS로 3분간 3번 세척하고, 블로킹 버퍼로 희석된 이차 항체(알렉사 플루어(Alexa Fluor) 488과 접합된 산양 항-래빗 항체 또는 알렉사 플루어(Alexa Fluor) 546과 접합된 항-마우스 항체)와 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 상기 커버-슬립을 현미경 슬라이드 상에 고정시키고, 관찰할때까지 4℃의 암실에서 보관하였다. Zeiss 510 Meta 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 510 META)을 이용하여 형광 현미경 영상을 관찰하였다.
1-9: 웨스턴 블랏 분석
베타-아밀로이드로 처리된 세포(6-웰의 5 X 104 셀/3㎖)를 수집하여 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 원심분리후, 상기 세포를 4℃에서 0.1 ㎖의 RIPA 버퍼(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소디움 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 50mM 글리세로포스페이트, 20mM NaF, 20mM EGTA, 1mM DTT, 1mM Na3VO4, 및 프로티아제 억제제를 포함)하에서 15분동안 세게 진탕하여 용해시켰다.
얼음에서 10분동안 배양한 후, 용해질을 5분동안 14,000rpm으로 원심분리하였다. 세포 용해질로부터 얻은 단백질 20㎍을 가열하여 끓이고, 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 환원조건하에서 전기영동하였다. 1시간동안 블로킹 버퍼(20mM Tris, 5% 비지방 건조 우유를 포함하는 0.1% 트윈 20을 함유하는 pH 7.4-버퍼 식염수)에서 배양하여 비특이적 결합을 억제하였다. 일차 항체(항-ERK1, 항-ERK2, 항-인산-ERK1, 및 항-인산-ERK2)를 90분동안 멤브레인에 노출시켰다. 세척 후, 블랏을 1:10,000로 희석한 고추냉이 (horseradish) 과산화효소-접합 항-마우스 IgG 와 함께 1시간동안 배양하고, 화학발광 물질 (Chemiluminescent Substrate, Pierce)를 사용하여 제조자 사용설명서에 따라 1분동안 검출하고, X-레이 필름으로 가시화시켰다.
1-10: DNA 절편화 (fragmentation)
말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP 니크 엔드 라벨링(TUNEL) 방법으로 DNA 단편화를 측정하였다. 또한, 세포자멸사 측정 시스템(Promega, Madison, WI)을 이용하여 DNA 단편화를 측정하였다.
1-11: GABA 및 도파민 흡수 분석
[3H] DA 또는 [3H]GABA 흡수 분석법을 Liu dt al., 2000; Gao et al., 2002에 기재된 바에 따라서 수행하였다. 간략하게 말해서, 따뜻한 Kres-Ringer 버퍼(KRB, 16 mM 소디움 포스페이트, 119mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 1.3mM EDTA, 및 5.6mM 글루코오스, pH 7.4)로 두번 세척한 후, DA 또는 GABA 흡수를 위하여 배양물을 KRB에서 1μM [3H] DA 또는 5μM [3H] GABA와 함께 각각 20분동안 배양하였다. 그 후, 배양물을 얼음 냉각된 KRB 로 세번 세척한 후, 1N NaOH 에서 세포를 수집하였다. Packard Bioscience사의 액체 섬광 계수계(TRI-CARB 3100 TR)로 방사능을 측정하였다. 10 μM의 마진돌 또는 10 μM 1-(2-[([디페닐메틸렌]이미노)옥시]에틸)1,2,5,6-테트라하이드로-3-피리딘카르복실산(NO-711) 존재하에서 관찰된 비특이적 DA 또는 GABA 흡수는 감산하였다.
1-12: 통계학적 분석
세포 생존률의 변화를 ANOVA(analysis of variance)에 의하여 분석한 후, Student's t-test를 수행하였다. p-값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의미한 것으로 하였다.
실시예 2: PC12 세포에서의 베타-아밀로이드로 유도된 세포독성에 대한 KHG21834의 효과
실시예 1에서 얻은 PC12 세포를 50μM의 베타-아밀로이드로 48시간동안 전처리하고, 그 후 베타-아밀로이드로 처리된 세포에 50μM 의 KHG21834를 48시간동안 더욱 처리하였다. 상기에서 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 현미경 분석에서는 PC12 세포 6 웰 플레이트에 2 X106 cells/well를 사용하였으며, MTT 분석에 있어서는 96웰 플레이트에 PC12 세포 5 X 104 를 사용하였다.
도 1에 있어서, (A) 내지 (C)는 상기 세포들을 현미경 분석하여 얻은 형태 변화를 보여주는 것이고, (D)는 실시예 1의 의한 MTT 분석 리덕션 에세이에 의한 세포 생존률을 측정하여 나타낸 것이다. 이 때, (A)는 베타-아밀로이드 및 KHG21834을 처리하지 아니한 대조군, (B)는 베타-아밀로이드 50mM을 48시간동안 처리한 경우, (C)는 베타-아밀로이드 50mM 을 48시간동안 처리한 후, KHG21834 50mM 을 처리한 경우의 위상차 현미경 사진이며, (D)는 (A) 내지 (C)의 경우에 대한 MTT 리덕션 에세이에 의한 세포 생존률 분석 결과이다.
도 1에 나타나듯이, 정상적인 PC12 세포(대조군, 도 1A)과 비교하여, 베타-아밀로이드로 처리된 세포는 둥근 모양을 보이며 바닥에서 이탈하여 응집된 상태로 존재하였으나(도 1B), KHG21834를 후처리 한 경우 (도 1C)는 (B)와 같은 손상 세포의 형태학적인 특징이 완화되는 것을 볼 수 있었다.
또한, 도1D에서 나타나듯이, 베타-아밀로이드를 처리한 경우 세포생존율은 대조군에 비하여 52% 감소되었으며, 여기에 KHG21834를 처리한 경우에는 세포생존율이 82%까지 증가되었다.
PC12세포에서 베타-아밀로이드에 의한 신경세포퇴행에 있어서, 베타-아밀로이드를 첨가하기 전 미리 KHG21834를 첨가한 배양액에서의 신경퇴행에 대한 보호효과의 결과도 상기의 KHG21834를 후처리한 경우와 유사한 것으로 나타났다.
실시예 3: PC12 세포에서 베타-아밀로이드로 유도된 TUNEL-라벨링에 있어서의 KHG21834의 보호효과
48시간동안 실시예 1에서 얻은 PC12 세포 3 X 106 cells/well 에 50μM의 베타-아밀로이드를 전처리하고, 그 후 베타-아밀로이드로 처리된 세포에 50μM 의 KHG21834를 48시간동안 더욱 처리하였다. 상기 세포들에 대하여 실시예 1의 방법으로 TUNEL-라벨링(transferase-mediated dUTP nick end labelin)에 대한 KHG21834의 효과를 측정하여 도 2에 나타냈다.
(A) 내지 (C)는 TUNEL-라벨링 측정 결과로서 (A)는 대조군, (B)는 베타-아밀로이드 50mM 을 48시간동안 처리한 경우, (C)는 베타-아밀로이드 50mM 을 48시간동안 처리한 후 KHG21834 50mM 을 처리한 경우이고,
(D)는 400 X 확대하여 측정한 TUNEL 양성 뉴런의 정량 분석 결과이고,
(E)는 DNA 단편화를 보여주는 것으로, (a)는 대조군, (b)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 경우, (c)는 베타-아밀로이드 50 mM을 48 시간동안 처리한 후 KHG21834 50 mM 을 처리한 경우, (M)은 1Kb Plus DNA Ladder (Gibco/BRL)의 결과이다.
도 2에서 나타나듯이, 대조군(도 2A)에서는 TUNEL-라벨링이 측정되지 않은 반면, 베타-아밀로이드를 처리한(도 2B)에서는 TUNEL 염색이 관찰됨에 따라 베타-아밀로이드로 인하여 신경세포의 사멸이 나타남을 알 수 있었다.
흥미롭게도, KHG21834를 처리한 경우 베타-아밀로이드에 의한 TUNEL 염색이 2.5배 감소함을 알 수 있었다(도 2C 및 도 2D).
베타-아밀로이드에 의한 신경세포 사멸에 대하 KHG21834의 효과는 DNA 래더 형성에서도 유사하게 관찰되었다. 도 2E에 나타나듯이, 베타-아밀로이드로 인한 DNA 래더 형성 및 베타-아밀로이드에 의한 세포사멸은 KHG21834의 첨가로 현저하게 방지되었다. 이러한 결과는 PC12 세포에 있어서 베타-아밀로이드에 의한 세포사멸이 KHG21834로 약화된다는 사실을 뒷받침한다.
실시예 4: 랫트 피질 뉴런-아교세포 배양의 베타-아밀로이드로 유도된 퇴행에 있어서의 KHG21834 효과
실시예 1에서 배양된 랫트 중간뇌 뉴런-아교세포를 50μM의 베타-아밀로이드와 함께 48시간동안 전처리하고, 상기 전처리된 세포를 48시간동안 KHG21834 50μM 를 이용하여 처리하였다. 면역생화학분석은 항-TH 항체로 처리한 중간뇌 뉴런-아교세포 배양을 이용하여 시행되었으며, 세번의 실험을 통하여 측정하여 도 3에 나타냈다.
도 3에 있어서 (A) 내지 (C)는 TUNEL-라벨링 측정 결과로서 (A)는 대조군, (B)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 경우, (C)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 후, KHG21834 50mM을 처리한 경우이고,
(D) 내지 (F)는 MAP-2 염색 측정결과로서, (D)는 대조군, (E)는 베타-아밀로이드 50mM을 7일동안 처리한 경우, (F)는 베타-아밀로이드 50mM 을 7일동안 처리한 후 KHG21834를 처리한 경우이며,
(G)는 LDH 방출 분석을 이용하여 측정된 (A)내지 (C)에서의 세포독성을 대조군에 대한 퍼센트로 나타낸 것이다.
도 3A 및 도 3B에 나타나듯이, 대조군에서는 TUNEL 염색결과가 관찰되지 아니하는 것과 달리 7일동안 베타-아밀로이드를 처리한 경우는 TUNEL 염색된 부분이 넓게 나타났다.
상기 베타-아밀로이드가 처리된 세포에 7일동안 KHG21834를 더욱 처리한 경우 베타-아밀로이드에 의한 TUNEL 염색을 KHG21834가 크게 감소시킴을 볼 수 있었다(도 3C).
또한, 베타-아밀로이드에 의한 신경세포 사멸에 있어서의 KHG21834의 효과는 MAP-2 염색에서 관찰되었다. MAP-2 단백질의 발현은 베타-아밀로이드 처리에 의하여 감소된다. 그러나 베타-아밀로이드에 의한 신경세포퇴행은 KHG21834의 첨가에 의하여 현저하게 방지된다는 사실을 도 3D 내지 도 3F에 의하여 알 수 있었다.
또한, 도 3G에 나타나듯이 베타-아밀로이드에 의한 신경세포 사멸에 있어서 KHG21834가 첨가됨에 따라 보호효과가 있다는 사실은 LDH 방출 분석법에 의하여 확인되었다.
실시예 5: 중간뇌 뉴런-아교세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 신경퇴행에 대한 KHG21834의 보호 효과
실시예 1에서 얻은 세포는 48시간동안 베타-아밀로이드 50mM로 전처리되었으며, 베타-아밀로이드 처리된 세포는 48시간동안 KHG21834 50mM로 처리되었다. 베타-아밀로이드에 의한 신경세포독성의 면역생화학분석은 항-TH 항체를 이용하여 행하여 도 4에 나타냈다.
(A) 내지 (F)는 면역생화학분석 측정 결과로서, (A) 및 (D)는 대조군, (B) 및 (E)는 베타-아밀로이드 50mM을 48시간동안 처리한 경우, (C) 및 (F)는 베타-아밀로이드 50mM을 48시간동안 처리한 후, KHG21834 50mM을 처리한 경우이고,
(G)는 LDH 방출 분석 방법을 이용하여 (A) 내지 (C)의 세포독성을 대조군에 대한 퍼센트로 나타낸 것이며,
(H)는 (A) 내지 (C)에서의 TH 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 4A에 나타나듯이, 대조군은 긴 돌기를 갖는 양극 또는 단극의 형태를 나타지만, 베타-아밀로이드를 처리하는 경우 TH-면역반응을 일으키는 세포가 현저히 줄어들고 반응을 하는 세포들도 정교한 가지돌기 네트워크가 대부분 소멸되었다(도 4B).
그러나 도 4C에 나타나듯이, KHG21834를 더욱 처리한 경우는 도 4B에 비하여 훨씬 건강하고 보존된 가지돌기 네트워크를 가짐을 알 수 있었다.
KHG21834를 전처리한 배양액에 베타-아밀로이드를 처리하는 경우의 배양액에서 TH-면역반응 신경세포는 베타-아밀로이드를 처리한 배양액에서의 경우보다 훨씬 TH-면역반응을 일으키는 가지돌기의 수가 적음을 알 수 있었다(도 4D 내지 도 4F).
비록 베타-아밀로이드 처리된 배양액에서 TH-면역반응 뉴런의 평균적인 가지돌기의 길이가 대조군의 경우의 6%에 그치지 않았지만, 베타-아밀로이드 처리 후 KHG21834로 처리된 배양액의 가지돌기는 대조군에 비하여 79%의 길이를 갖는다는 사실을 알 수 있었다. LDH 방출 분석법을 이용하여 측정되는 세포 생존율에서도 유사한 결과가 나타났다(도 4G).
마지막으로, 랫트 중간뇌 뉴런-아교세포 배양의 웨스턴 블랏 분석에 의하여 베타-아밀로이드가 TH 단백질의 발현을 60% 감소시키고, KHG21834가 베타-아밀로이드에 의한 TH 단백질 발현의 감소를 현저하게 약화시킨다는 사실을 알 수 있었다(도 4H).
베타-아밀로이드로 유도된 신경퇴행의 정도를 피질 및 중간뇌 뉴런-미세아교 배양에서의 GABA 및 도파민의 흡수를 측정하므로써 조사하였다. 피질 뉴런에서 베타-아밀로이드로 유도된 퇴행의 투여량 및 시간의 의존에 대한 특징을 측정하기 위하여, 랫트 초기 피질 뉴런-미세아교 배양액 1㎖/well에 12일동안 베타-아밀로이드를 15, 30, 45, 60, 75 μM으로 처리한 후, 실시예 1의 방법으로 GABA 흡수정도를 측정하여 도 5A에 나타냈다. 또한, 50 μM의 베타-아밀로이드를 3,6,9,12,15일 동안 처리한 랫트 초기 피질 뉴런-미세아교 배양액 1㎖/well 에서의 GABA 흡수정도를 측정하여 도 5B에 나타냈다.
도 5A에 나타난 바와 같이, KHG21834 존재와 관계없이 피질 뉴런에서 베타-아밀로이드에 의하여 유도된 퇴행은 농도 의존적이었으며, 특히 75μM의 베타-아밀로이드 처리시 GABA 흡수율이 55% 감소됨이 나타났다. 그러나 KHG21834의 존재하에서 베타-아밀로이드를 처리한 경우, 베타-아밀로이드로 유도된 신경퇴행의 증거인 GABA 흡수율의 감소가 적게 관찰되었다.
또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, 베타-아밀로이드에 의한 GABA 흡수율의 현저한 감소는 9일째로부터 관찰되었고, 50%까지의 감소가 15일째에 관찰되었다. 그러나 KHG21834가 처리된 시료의 경우에는 GABA 흡수율의 감소가 줄어드는 것이 관찰됨에 따라, 본 발명의 KHG21834 화합물이 베타-아밀로이드에 의한 신경퇴행을 감소시킴을 알 수 있었다.
실시예 6: 피질 뉴런-아교세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 GABA 흡수의 감소에 대한 KHG21834의 효과
베타-아밀로이드로 유도된 신경퇴행의 정도를 피질 및 중간뇌 뉴런-미세아교 배양에서의 GABA 및 도파민의 흡수를 측정하여 조사하였다. 피질 뉴런에서 베타-아밀로이드에 의한 퇴행의 투여량 및 시간의 변화에 대한 특징을 측정하기 위하여, 랫트 초기 피질 뉴런-미세아교 배양액에 12일동안 베타-아밀로이드를 15, 30, 45, 60, 75 μM으로 처리하거나 4 내지 15일동안 50μM 베타-아밀로이드로 처리하여, 실시예 1의 방법으로 GABA 흡수정도를 측정하여 도 5에 나타냈다.
(A)는 표시된 정도의 KHG21834 양을 첨가한 상태에서 12일동안 베타-아밀로이드의 농도를 달리하여 처리한 경우 베타-아밀로이드 농도에 따른 GABA 흡수율을 나타낸 것이고,
(B)는 표시된 정도의 KHG21934 양을 첨가한 상태에서 베타-아밀로이드의 농도에 따른 GABA 흡수율을 시간별로 측정하여 나타낸 것이다.
(●:0mM KHG21834, □:25mM KHG21834, ■:50mM KHG21834)
도 5A에 나타나듯이, 베타-아밀로이드에 의한 피질 뉴런의 퇴행은 농도-의존적임을 알 수 있었다. 최고 농도(75 μM)에서, 베타-아밀로이드는 GABA 흡수를 55% 감소시켰다.
또한, 베타-아밀로이드에 의한 피질 신경세포퇴행은 시간 의존적이다. 50μM 베타-아밀로이드를 처리한 배양액에서 9일째부터 GABA 흡수의 현저한 감소가 관찰되었고, 15일째에는 50%의 감소가 관찰되었다(도 5B.)
피질 뉴런-아교세포 배양액을 KHG21834의 존재하에서 베타-아밀로이드를 처리한 경우, 베타-아밀로이드에 의한 GABA 흡수의 감소는 투여량 및 시간 의존적으로 약화되었다. 50μM KHG21834와 함께 처리된 배양액의 경우 대조군에 비하여 80%의 GABA 흡수율을 나타냈다.
이와 같이, KHG21834 화합물을 처리하는 경우 베타-아밀로이드에 의한 GABA 흡수의 감소가 약화된다는 사실을 알 수 있었는바, 본 발명의 조성물이 뇌신경 세포의 사멸 등의 퇴행을 방지함으로써 신경세포의 손상을 방지함을 알 수 있었다.
실시예 7: 피질 뉴런-아교세포 배양액에서 베타-아밀로이드에 의한 도파민 흡수의 감소에 대한 KHG21834의 효과
피질 뉴런-아교세포 대신 중간뇌 뉴런-아교세포를 사용한 것을 제외하고 실시예 6과 동일한 방법으로 도파민 흡수율을 측정하여 도 6에 나타냈다.
도 6A에 나타난 바와 같이, 50μM의 베타아밀로이드를 9 일동안 처리한 경우 배양액에서의 도파민 뉴런의 현저한 손상이 나타났다.
도 6B에 나타난 바와 같이, 베타-아밀로이드에 의한 도파민 신경세포의 퇴행도 시간 의존적으로 나타났다. 50μM 베타-아미로이드로 처리된 배양액에서 처리 후, 6일째에 DA 흡수의 현저한 감소가 관찰되었고, 15일째에 60%의 감소가 나타났다. 또한, 중간뇌 뉴런-아교세포 배양을 KHG21834 존재하에서 베타-아밀로이드로 처리하는 경우, 베타-아밀로이드에 의한 DA 흡수의 감소가 투여랑 및 시간 의존적으로 약화됨이 관찰되었다. 50 μM KHG21834와 함께 처리된 배양액의 DA 흡수는 대조군의 경우에 비하여 72%로 나타났다.
도파민 뉴런의 면역생화학적인 분석에 의하여 KHG21834의 신경보호적인 효과가 뒷받침되었다. 그러므로 면역분석화학적인 연구 및 GABA 및 DA 흡수 분석의 결과와 함께 베타-아밀로이드의 처리가 피질 및 도파민 뉴런에서의 퇴행을 유발하고, KHG21834가 베타-아밀로이드에 의한 신경세포 독성을 약화시킬 수 있음을 밝혔다.
실시예 8: ERK1/2의 활성에 있어서의 KHG21834의 효과
본 발명의 KHG21834의 베타-아밀로이드에 의한 ERK의 인산화에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 베타-아밀로이드로 자극된 피질 및 중간뇌 뉴런-아교세포 배양액에 있어서 ERK1/2의 가능한 병발을 측정하였다.
ERK의 활성은 트레오닌 및 티로신의 인산화에 의하므로 면역블롯 분석은 특이적인 항-포스포-ERK1/2 항체에 의하여 측정되었다. ERK1/2의 인산화되지 아니한 형태는 대조군으로 측정되었고, 농도계측에 의하여 상대적인 발현정도를 측정하여 도 7에 나타내었다.
도 7A에 나타나듯이, 중간뇌 뉴런-아교세포 배양에 있어서 KHG21834존재 하에서 베타-아밀로이드를 처리한 경우, 베타-아밀로이드에 의한 포스포-ERK1/2의 증가가 현저하게 약화됨을 알 수 있었다.
또한, 농도계측적인 분석에서 25 μM KHG21834와 함께 처리된 배양액에서의 포스포-ERK1 및 포스포-ERK2의 발현 정도는 베타-아밀로이드만 처리된 경우에 비하여 30% 및 50%인 것으로 밝혀졌다.
도 7B에 나타나듯이, 50μM 농도에서는 베타-아밀로이드만 처리한 그룹에 비하여 KHG21834를 더욱 처리한 경우 ERK1 및 EKR2 의 인산화정도가 12% 및 25%로 감소된 것을 알 수 있었다.
실시예 9: 다른 아릴우레이도아세테이트계 화합물의 베타-아밀로이드 독성 감소 효과
상기 실시예 1-2에서 합성된 화합물들 (화합물 번호 2 내지 10)에 대하여 상기 실시예 4 및 5와 동일한 시험을 수행하고, LDH 분석에 의하여 이들 화합물의 베타-아밀로이드 독성 감소 효과를 시험하였다. 이와 같이 얻어진 상기 화합물들의 베타-아밀로이드 독성 감소 효과를 상기 실시예 4 및 5에서 얻어진 화합물 KHG21834 (화합물 번호 1)의 베타-아밀로이드 독성 감소 효과 (도 3G 및 도 4G 참조)를 100%로 하여 비교한 상대적 % 수치로 계산하여, 아래의 표 2에 나타내었다.
Figure 112006041706671-pat00006
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 10 개의 화합물 모두에서 베타-아밀로이드 독성 감소효과가 나타났으며, 이 중에서 화합물 KHG21834와 KHG24034에서 가장 우수한 독성 감소 효과가 나타났고, 다른 화합물에서도 유의미한 수치의 독성 감소 효과가 나타남을 확인하였다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환 방지용 조성물은 베타-아밀로이드에 의하여 발생하는 뇌신경세포의 퇴행 및 손상을 방지하는 아릴우레이도아세테이트 화합물을 포함하여 세포독성이 적은 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는다.

Claims (8)

  1. 하기의 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트계 화합물:
    (화학식 1)
    Figure 112006041706671-pat00007
    (화학식 2)
    Figure 112006041706671-pat00008
    (화학식 3)
    Figure 112006041706671-pat00009
    X는 S이고,
    R1은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 니트로기로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
    R2는 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 탄소수 1 내지 5의 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이고,
    R3은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 할로겐 원자로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
  2. 제1항에 있어서,
    에틸 2-[3-(벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(6-메틸벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(6-니트로벤졸[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-메톡시벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-메틸벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-p-톨릴티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-(4-브로모페닐)티아졸-2-일)우레이도]아세테이트, 및
    에틸 2-[3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)우레이도]아세테이트]
    로 이루어진 군 중에서 선택된 것인,
    아릴우레이도아세테이트계 화합물.
  3. 유효성분으로서 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는
    알츠하이머, 치매 및 파킨슨병으로 이루어진 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물:
    (화학식 1)
    Figure 112007052910693-pat00010
    (화학식 2)
    Figure 112007052910693-pat00011
    (화학식 3)
    Figure 112007052910693-pat00012
    X는 S 또는 NH이고,
    R1은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 니트로기로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
    R2는 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 탄소수 1 내지 5의 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이고,
    R3은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 할로겐 원자로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
  4. 제3항에 있어서,
    에틸 2-[3-(벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(6-메틸벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(6-니트로벤졸[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-(3-벤조[d]이미다졸-2-일우레이도)아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-메톡시벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-메틸벤조[d]티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-p-톨릴티아졸-2-일)우레이도]아세테이트,
    에틸 2-[3-(4-(4-브로모페닐)티아졸-2-일)우레이도]아세테이트, 및
    에틸 2-[3-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)우레이도]아세테이트]
    로 이루어진 군 중에서 선택된 것인,
    퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량이 전체 조성물에 대하여 0.1 내지 99 중량%인 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 조성물이 경고제, 과립제, 로션제, 산제, 시럽제, 액제, 에어로솔제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 침제, 정제, 주사제, 캅셀제 및 환제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 삭제
  8. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 갖는 아릴우레이도아세테이트계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는
    퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품:
    (화학식 1)
    Figure 112007052910693-pat00020
    (화학식 2)
    Figure 112007052910693-pat00021
    (화학식 3)
    Figure 112007052910693-pat00022
    X는 S 또는 NH이고,
    R1은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 니트로기로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
    R2는 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 탄소수 1 내지 5의 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이고,
    R3은 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬기 및 할로겐 원자로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
KR1020060053585A 2006-06-14 2006-06-14 아릴우레이도아세테이트계 화합물, 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 KR100758214B1 (ko)

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