KR20060008325A

KR20060008325A - 신경 세포 보호제

Info

Publication number: KR20060008325A
Application number: KR1020057022175A
Authority: KR
Inventors: 시게루 아카소후; 마나미 기무라
Original assignee: 에자이 가부시키가이샤
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-14
Publication date: 2006-01-26
Also published as: AU2004246945B2; KR20070113324A; KR20070051342A; JPWO2004110444A1; US20070021397A1; CA2528905A1; EP1632230A1; AU2004246945A1; WO2004110444A1; CN1802155A; CN101348824A

Abstract

본 발명은 염산 도네페질에 대표적인 화합물을 함유하는 중추신경의 신경세포보호제, 또는 중추신경계의 신경세포 질환의 치료제 및/또는 예방제에 관한 것이다.

Description

신경 세포 보호제{NEUROCYTE PROTECTIVE AGENT}

본 발명은, 염산도네페질을 함유하는 신경 세포 보호제에 관한 것이다.

염산도네페질은, 아세틸콜린을 분해하는 효소인 아세틸콜린 에스테라아제를 가역적으로 저해함으로써 뇌내의 아세틸콜린의 양을 증가시켜, 뇌내 콜린 작동성 신경계를 부활시키는 물질이다. 이 물질은, 알츠하이머형 노년성 치매, 알츠하이머병의 치료약으로서 널리 사용되고 있으며 (일본 특허 제2578475호), 염산도네페질에 관해서 여러 연구 기관에서 연구되고 있다. Jin Zhou 들은, 아세틸콜린 에스테라아제 저해제가 래트 PC12 세포 (종양 세포) 의 허혈성의 세포 상해에 대하여 보호적인 효과가 있다는 내용의 논문을 발표하고 있고, 아세틸콜린 에스테라아제 저해제의 일례로서 염산도네페질을 사용하고 있다 (Zhou, J,. Fu, Y., Tang, X. C., 2001. Huperzine A and donepezil protect rat pheochromocytoma cells against oxygen-glucose deprivation. Neurosci. Lett. 306, 53-56)).

그러나, 염산도네페질의 신경 세포 상해에 대한 보호 효과의 상세한 내용은 불분명하다.

상기 문헌에서 사용되고 있는 PC12 세포란 갈색 세포종으로서, 호크롬성 세포종이라고도 하며, 부신 수질 또는 교감 신경절 세포 등 크롬 친화성 세포로부터 발생하는 카테콜아민 산생 종양이다. 이 때문에, PC12 세포는 뇌신경 세포가 아니고, 세포 사이에 시냅스를 형성하고 있지 않으며, 또한 흥분성 물질에 반응하는 기능도 가지고 있지 않음이 알려져 있다 (Sucher, N. J, 1993. Expression of Endogenous NMDAR1 Transcripts without Receptor Protein Suggests Post-transcriptional Control in PC12 Cells. The journal of Biological Chemistry. Vol.268, No.30, 22299-22304). 즉, 상기 문헌에서는 암화된 세포에 관한 검토가 이루어져 있을 뿐, 새롭게 뇌신경 세포로부터 조제된 초대 배양 신경 세포를 사용한 검토는 일체 이루어져 있지 않다. 따라서, 염산도네페질의, 실제 신경 세포에 있어서의 허혈성의 상해에 대한 보호 효과를 증명하는 데이터는 아직 알려져 있지 않았다.

발명의 개시

본 발명은, 신경 세포 (그 중에서도 중추 신경계의 신경 세포) 를 보호하는 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 뜻밖에도 염산도네페질이 신경 세포 (그 중에서도 중추 신경계의 신경 세포) 를 보호하는 작용을 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 다음과 같다.

(1) 이하의 (ⅰ)∼(ⅶ) 로 나타내는 화합물 중 어느 하나를 함유하는, 중추 신경계의 신경 세포 보호제 (일본 공개특허공보 평1-79151호에 기재된 화합물을 포함한다). 이들 화합물의 염은 염산염인 것이 바람직하다.

(ⅰ) 하기 화학식으로 나타내는 1-벤질-4-[(5,6-디메톡시-1-인다논)-2-일]메틸피페리딘 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(일본 특허 제2578475호 청구항 (이하, 「cl.」이라고 한다) 1)

(ⅱ) 다음 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J 는 하기 식

(식 중, S 는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 할로겐 원자 또는 수산기를 의미한다. t 는 0 또는 1∼4 의 정수를 의미한다. 또 (S)_t 는 결합하고 있는 페닐환의 이웃하는 탄소 사이에서 메틸렌디옥시기 또는 에틸렌디옥시기를 형성하고 있어도 된다. 식 (l) 에서의 Y 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미하고, 식 (k) 에서의 V 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 식 (n) 에서의 W¹ 및 W² 는 서로 독립하여, 동일하거나 또는 다르며, 수소 원자, 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, W³ 은 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미한다. 식 (a)∼(e), (g), (j), (l) 및 (q) 에 있어서의 페닐환 A 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 된다.) 으로 나타내는 기로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기를 의미한다. B 는 식 -(CHR²)_n- (식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수, R² 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. K 는 치환기로서, 할로겐화되어 있어도 되는 탄소수 1∼6 의 알킬기, 탄소수 1∼6 의 알콕시기, 니트로기, 할로겐 원자, 카르복실기, 벤질옥시기, 탄소수 1∼6 의 알콕시카르보닐기, 아미노기, 탄소수 1∼6 의 모노알킬아미노기, 탄소수 1∼6 의 디알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬아미노카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬카르보닐옥시기, 수산기, 포르밀기 또는 알콕시 (탄소수 1∼6) 알킬 (탄소수 1∼6) 기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬기를 의미한다.

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.

(ⅲ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(일본 특허 제2733203호 cl.7)

(ⅳ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(일본 특허 제2733203호 cl.8)

(ⅴ) 다음의 일반식 (Ⅰ-1) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J^1-1 은 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 (이하 간단하게 저급 알킬기라고 한다); 시클로헥실기; 치환기로서 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기 (이하 간단하게 저급 알콕시기라고 한다), 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐기, 피리딜기 또는 피라질기; 식

(식 중, G 는 식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식 -O- 로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식 -CH₂-O- 로 나타내는 기, 식 -CH₂-SO₂- 로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기 또는 식

으로 나타내는 기를 의미한다. E 는 탄소 원자 또는 질소 원자를 의미한다.)

으로 나타내는 기; 퀴놀릴기; 퀴녹살릴기; 푸릴기 또는 식 R¹-CH=CH- (식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 저급 알콕시카르보닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. B 는 식 -(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -NR²-(CH₂)_n- (식 중, R² 는 수소 원자, 저급 알킬기, 페닐기 또는 저급 알킬술포닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -CONR³-(CH₂)_n- (식 중, R³ 은 수소 원자, 저급 알킬기, 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 할로겐 또는 수산기를 가져도 되는 페닐기, 벤질기 또는 피리딜기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -NH-CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CH₂-CO-NH-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CO-CH₂-CH(OH)-CH₂- 으로 나타내는 기, 식 -CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -C(OH)-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기 또는 식 -CO-CH=CH-CH₂- 으로 나타내는 기 (이상의 식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수를 의미한다) 를 의미한다. T¹ 은 탄소 원자를 의미한다. K 는 페닐기가 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬 (알킬의 탄소수 1∼2) 기; 신나밀기; 저급 알킬기; 피리딜메틸기; 시클로알킬 (시클로알킬의 탄소수 3∼6) 알킬기; 아다만탄메틸기; 푸르푸릴기: 탄소수 3∼6 의 시클로알킬기 또는 아실기를 의미한다. q 는 1 또는 2 를 의미한다.

(일본 특허 제3078244호 cl.1)

(ⅵ) 다음의 일반식 (Ⅰ-2) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(식 중, J¹ ^-2 는 치환기로서 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기를 가져도 되는 인다노닐기를 의미한다. T² 는 질소 원자를 의미한다. B, K 및 q 는 상기한 의미를 갖는다.)

(일본 특허 제3078244호 cl.2)

(ⅶ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(일본 특허 제3078244호 cl.4)

(2) 이하의 (ⅰ)∼(ⅶ) 로 나타내는 화합물 중 어느 하나를 함유하는, 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방제 및/또는 치료제.

(ⅰ) 하기 화학식으로 나타내는 1-벤질-4-[(5,6-디메톡시-1-인다논)-2-일]메틸피페리딘 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염. 염은 염산염인 것이 바람직하다.

(일본 특허 제2578475호 cl.1)

[식 중, J 는 하기 식

(식 중, S 는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 할로겐 원자 또는 수산기를 의미한다. t 는 0 또는 1∼4 의 정수를 의미한다. 또 (S)_t 는 결합하고 있는 페닐환의 이웃하는 탄소 사이에서 메틸렌디옥시기 또는 에틸렌디옥시기를 형성하고 있어도 된다. 식 (l) 에서의 Y 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미하고, 식 (k) 에서의 V 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 식 (n) 에서의 W¹ 및 W² 는, 서로 독립하여, 동일하거나 또는 다르며, 수소 원자, 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, W³ 은 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미한다. 식 (a)∼(e), (g), (j), (l) 및 (q) 에 있어서의 페닐환 A 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 된다.) 으로 나타내는 기로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기를 의미한다. B 는 식 -(CHR²)_n- (식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수, R² 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. K 는 치환기로서, 할로겐화되어 있어도 되는 탄소수 1∼6 의 알킬기, 탄소수 1∼6 의 알콕시기, 니트로기, 할로겐 원자, 카르복실기, 벤질옥시기, 탄소수 1∼6 의 알콕시카르보닐기, 아미노기, 탄소수 1∼6 의 모노알킬아미노기, 탄소수 1∼6 의 디알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬아미노카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬카르보닐옥시기, 수산기, 포르밀기 또는 알콕시 (탄소수 1∼6) 알킬 (탄소수 1∼6) 기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬기를 의미한다.

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.

(일본 특허 제2733203호 cl.1)

(일본 특허 제2733203호 cl.7)

(일본 특허 제2733203호 cl.8)

(식 중, G 는 식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식 -O- 로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기 또는 식

(일본 특허 제3078244호 cl.1)

[식 중, J¹ ^-2 는 치환기로서 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기를 가져도 되는 인다노닐기를 의미한다. T² 는 질소 원자를 의미한다. B, K 및 q 는 상기한 의미를 갖는다.]

(일본 특허 제3078244호 cl.2)

(일본 특허 제3078244호 cl.4)

상기 (1) 및 (2) 에 있어서, 화합물의 염은 염산염인 것이 바람직하고, 특히 하기 식에 나타내는 염산도네페질인 것이 바람직하다.

또 상기 (2) 에 있어서, 신경 세포 장애로는, 뇌허혈, 흥분성 독성 또는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것을 들 수 있고, 상기 뇌허혈 및 흥분성 독성은, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나에 수반되는 것을 들 수 있다. 또 상기 Aβ 독성은 알츠하이머병 또는 다운 증후군에 수반되는 것이어도 된다.

상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 세포는, 뇌 유래의 성숙한 신경 세포이고, 특히 대뇌 피질, 중격부 (septal area) 및 해마 (hippocampus) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 유래하는 것을 들 수 있다. 또한, 당해 신경 세포는, 초대 배양 세포여도 된다.

(3) 상기 (1) 에 기재된 보호제, 또는 상기 (2) 에 기재된 예방제 및/또는 치료제를 함유하는, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나의 질병의 예후 개선제.

(4) 상기 (1) 에 기재된 보호제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 중추 신경계의 신경 세포 보호 방법.

(5) 상기 (2) 에 기재된 예방제 및/또는 치료제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 방법 및/또는 치료 방법.

상기 (5)에 있어서, 신경 세포 장애로는, 뇌허혈, 흥분성 독성 또는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것을 들 수 있고, 상기 뇌허혈 및 흥분성 독성은, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나에 수반되는 것을 들 수 있다. 또한, 흥분성 독성으로는, 예를 들어 NMDA 또는 카인산에 의한 것을 들 수 있다. 그리고, 상기 Aβ 독성은, 알츠하이머병 또는 다운 증후군에 수반되는 것이어도 된다.

(6) 상기 (3) 에 기재된 예후 개선제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나의 질병의 예후 개선 방법.

(7) 상기 (1) 에 기재된 보호제, (2) 에 기재된 예방제 및/또는 치료제, 그리고 (3) 에 기재된 예후 개선제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 약제를 제조하기 위한, (1) 에 나타낸 화합물의 용도.

(8) 중추 신경계의 콜린 작동성 신경 세포에, Aβ 존재 하에 후보 화합물을 작용시켜, Aβ 응집량을 검출 또는 측정하는 것을 특징으로 하는, Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법.

본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 Aβ 응집량의 검출 또는 측정한 결과를 사용하여, 상기 후보 화합물이 Aβ 응집 억제 작용을 갖는지 여부를, 상기 후보 화합물의 비존재 하에서의 Aβ 응집량과 비교함으로써, 목적으로 하는 화합물인지 여부를 판정할 수 있다.

(9) 상기 (8) 에 기재된 방법에 사용하기 위한, Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트.

(10) 중추 신경계의 콜린 작동성 신경 세포에, Aβ 존재 하에 후보 화합물을 작용시켜, 세포 상해 또는 세포사를 검출하는 것을 특징으로 하는, Aβ 독성에 의해서 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법.

본 발명의 방법에서는, 상기 세포 상해 또는 세포사를 검출한 결과를 사용하여, 상기 후보 화합물이 Aβ 독성에 대한 세포 보호 작용을 갖는지 여부를, 상기 후보 화합물의 비존재 하에서의 세포 상해 또는 세포사의 정도와 비교함으로써, 목적으로 하는 화합물인지의 여부를 판정할 수 있다.

상기 세포 상해 또는 세포사는, 락트산 탈수소 효소 (LDH) 의 농도 측정 또는 MTT 분석에 의해 검출할 수 있다.

(11) 상기 (10) 에 기재된 방법에 사용하기 위한, Aβ 독성에 의해서 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트.

도 1 은, 산소 글루코오스 제거 (OGD) 처리의 12 시간 전, 1 시간 전 및 OGD 처리의 1 시간 후에 도네페질을 세포에 첨가한 경우에 있어서의 래트 초대 배양 세포의 LDH 방출을 나타내는 그래프이다. OGD(-) 는 OGD 무처리, OGD(+) 는 OGD 처리한 것을 나타낸다. Cont 및 Vehi 는 약제 무투여군이다. 데이터는, Dunnett's test 에 의해 해석하였다. 도 1 의 「***」는 P<0.005 인 것을 나타낸다 (「vehicle group」을 대조로 한다).

도 2 는, OGD 처리 유무에 있어서의 래트 초대 배양 세포의 형태학적 관찰을 나타낸 것으로, 각각 A 는 컨트롤, B 는 OGD 처리한 것, C 는 도네페질을 12 시간 전부터 첨가한 후에 OGD 처리한 것의 상태를 나타내는 현미경 사진이다. 스케일 바는 0.1㎜ 를 나타낸다.

도 3 은, OGD 처리 12 시간 전부터 각종 아세틸콜린 에스테라아제 저해제를 첨가한 경우와 도네페질을 첨가한 경우에 있어서의 래트 초대 배양 세포의 LDH 방출을 나타내는 그래프이다. OGD(-) 는 OGD 무처리, OGD(+) 는 OGD 처리한 것을 나타낸다. Cont 및 Vehi 는 약제 무투여군이다. 데이터는 Dunnett's test 에 의해 해석하였다. 도 3 의 「*」는 P<0.05, 「**」는 P<0.01, 「***」는 P<0.005 인 것을 나타낸다 (「vehicle group」을 대조로 한다).

도 4 는, OGD 처리 12 시간 전부터 도네페질과 함께 스코폴라민 (scopolamine: Sco) 또는 메카밀라민 (mecamylamine: Mec) 을 첨가한 경우에 있어서의 래트 초대 배양 세포의 LDH 방출을 나타내는 그래프이다. OGD(-) 는 OGD 무처리, OGD(+) 는 OGD 처리한 것을 나타낸다. Cont 및 Vehi 는 약제 무투여군이다. 데이터는 ANOVA 와 Welch's t-test 에 의해 해석하였다. 도 4 의 「*」는 P<0.05, 「**」는 P<0.01,「***」는 P<0.005 인 것을 나타낸다 (「vehicle group」을 대조로 한다).

도 5 는, NMDA 처리에 의한 래트 초대 배양 신경 세포의 LDH 방출에 대한 도네페질의 효과를 나타내는 그래프이다. 도네페질은 12 시간 전부터 첨가하였다. Cont 및 Vehi 는 약제 무투여군이다. 데이터는 Dunnett's test 에 의해 해석하였다. 도 5 의 「***」는 P<0.005 인 것을 나타낸다 (「vehicle group」을 대조로 한다).

도 6 은, 카인산 처리에 의한 래트 초대 배양 신경 세포의 LDH 방출에 대한 도네페질의 효과를 나타내는 그래프이다. 도네페질은 24 시간 전부터 첨가하였다. Cont 및 Vehi 는 약제 무투여군이다. 데이터는 Dunnett's test 에 의 해 해석하였다. 도 6 의 「***」는 P<0.005 인 것을 나타낸다 (「vehicle group」을 대조로 한다).

도 7 은, 배양 래트 중격부 신경 세포를 항 콜린아세틸 트랜스페라아제 항체로 면역 염색한 도면이다.

도 8 은, Aβ(1-40) 독성에 대한 도네페질의 보호 효과를, LDH 를 지표로 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.

도 9 는, 배양 래트 중격부 신경 세포를 항 MAP2 항체로 면역 염색한 도면이다.

도 10 은, Aβ 의 응집을 CD 의 변화를 지표로 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 11 은, 세포내 아세틸콜린 활성에 대한 siRNA 의 효과를 나타내는 도면이다.

도 12 는, Aβ(1-40) 독성에 대한 siRNA 의 보호 효과를 나타내는 도면이다.

도 13 은, Aβ 의 응집에 대한 siRNA 의 응집 억제 효과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

1. 개요

본 발명은, 이하에 나타내는 화합물 중 어느 하나 (이하, 「화합물 Q」라고 한다) 를 함유하는, 중추 신경계의 신경 세포의 보호제, 당해 신경 세포 장애의 예방제 및/또는 치료제이다. 또한, 본 발명에 의해, 예방제 및/또는 치료제를 적 용량 투여하는 것을 특징으로 하는, 중추 신경계의 신경 세포의 보호 방법 및/또는 당해 신경 세포 장애의 예방 방법 및/혹은 치료 방법이 제공된다. 이하, 본 발명의 보호제, 예방제, 치료제, 예후 개선제에 사용되는 화합물 Q 를 이하에 나타낸다.

2. 화합물 Q

다음의 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 환형 아민 유도체 및 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염 (일본 공개특허공보 평1-79151호, 일본 공개특허공보 평07-252216호, 일본 공개특허공보 평10-067739호를 참조).

[식 중,

J 는 (a) 치환 또는 무치환의 다음에 나타내는 기; ① 페닐기, ② 피리딜기, ③ 피라질기, ④ 퀴놀릴기, ⑤ 시클로헥실기, ⑥ 퀴녹살릴기 또는 ⑦ 푸릴기,

(b) 페닐기가 치환되어 있어도 되는 다음의 군으로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기; ① 인다닐, ② 인다노닐, ③ 인데닐, ④ 인데노닐, ⑤ 인단디오닐, ⑥ 테트랄로닐, ⑦ 벤즈수베로닐, ⑧ 인다놀릴, ⑨ 식

로 나타내는 기,

(c) 환형 아미드 화합물로부터 유도되는 1 가의 기,

(d) 저급 알킬기, 또는

(e) 식 R¹-CH=CH- (식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 저급 알콕시카르보닐기를 의미한다)

으로 나타내는 기를 의미한다.

B 는 식

으로 나타내는 기, 식

(식 중, R³ 은 수소 원자, 저급 알킬기, 아실기, 저급 알킬술포닐기, 치환되어도 되는 페닐기 또는 벤질기를 의미한다) 으로 나타내는 기,

식

(식 중, R⁴ 는 수소 원자, 저급 알킬기 또는 페닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기,

식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기,

식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기,

식

으로 나타내는 기

(이상의 식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수를 의미한다. R² 는 식

으로 나타내는 알킬렌기가 치환기를 갖지 않거나, 또는 1 개 또는 1 개 이상의 메틸기를 가지고 있는 형태로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다.), 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기,

식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기,

식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식 -NH- 으로 나타내는 기, 식 -O- 으로 나타내는 기, 식 -S- 으로 나타내는 기, 디알킬아미노알킬카르보닐기 또는 저급 알콕시카르보닐기를 의미한다.

T 는 질소 원자 또는 탄소 원자를 의미한다.

Q 는 질소 원자, 탄소 원자 또는 식

으로 나타내는 기를 의미한다.

K 는 수소 원자, 치환 또는 무치환의 페닐기, 페닐기가 치환되어도 되는 아릴알킬기, 페닐기가 치환되어도 되는 신나밀기, 저급 알킬기, 피리딜메틸기, 시클로알킬알킬기, 아다만탄메틸기, 푸릴메틸기, 시클로알킬기, 저급 알콕시카르보닐기 또는 아실기를 의미한다.

q 는 1∼3 의 정수를 의미한다.

식 중,

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.]

화합물 (Ⅰ) 에 있어서의 상기 정의에 있어서, J, K, R³, R⁴ 에서 볼 수 있는 저급 알킬기란, 탄소수 1∼6 의 직쇄 또는 분지상 알킬기, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기: sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기 (아밀기), 이소펜틸기, 네오펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 1,2-디메틸프로필기, 헥실기, 이소헥실기, 1-메틸펜틸기, 2-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 3,3-디메틸부틸기, 1-에틸부틸기, 2-에틸부틸기, 1,1,2-트리메틸프로필기, 1,2,2-트리메틸프로필기, 1-에틸-1-메틸프로필기, 1-에틸-2-메틸프로필기 등을 의미한다. 이들 중 바람직한 기로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기 등을 들 수 있고, 가장 바람직한 것은 메틸기이다.

J 에 있어서의 「치환 또는 무치환의 다음에 나타내는 기; ① 페닐기, ② 피리딜기, ③ 피라질기, ④ 퀴놀릴기, ⑤ 시클로헥실기, ⑥ 퀴녹살릴기 또는 ⑦ 푸릴기」라는 정의에 있어서, 치환기로는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기 등의 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기; 메톡시기, 에톡시기 등 상기의 저급 알킬기에 대응하는 저급 알콕시기; 니트로기; 염소, 브롬, 불소 등의 할로겐; 카르복실기; 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 이소프로폭시카르보닐기, n-프로폭시카르보닐기, n-부티록시카르보닐기 등, 상기의 저급 알콕시기에 대응하는 저급 알콕시카르보닐기; 아미노기; 모노 저급 알킬아미노기; 디 저급 알킬아미노기; 카르바모일기; 아세틸아미노기, 프로피오닐아미노기, 부티릴아미노기, 이소부티릴아미노기, 발레릴아미노기, 피발로일아미노기 등, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기; 시클로헥실옥시카르보닐기 등의 시클로알킬옥시카르보닐기; 메틸아미노카르보닐기, 에틸아미노카르보닐기 등의 저급 알킬아미노카르보닐기; 메틸카르보닐옥시기, 에틸카르보닐옥시기, n-프로필카르보닐옥시기 등 상기에 정의한 저급 알킬기에 대응하는 저급 알킬카르보닐옥시기; 트리플루오로메틸기 등으로 대표되는 할로겐화 저급 알킬기; 수산기; 포르밀기; 에톡시메틸기, 메톡시메틸기, 메톡시에틸기 등의 저급 알콕시 저급 알킬기 등을 들 수 있다. 상기한 치환기의 설명에 있어서, 「저급 알킬기」, 「저급 알콕시기」란, 상기 정의로부터 파생되는 기를 모두 포함하는 것으로 한다. 치환기는 동일하거나 또는 다른 1∼3 개로 치환되어 있어도 된다.

또 페닐기의 경우에는, 다음과 같은 경우도 치환된 페닐기에 포함되는 것으로 한다. 즉,

으로 나타내는 기를 나타내는 경우(식 중, G 는 식

으로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기, 식 -O- 로 나타내는 기, 식

으로 나타내는 기 또는 식

으로 나타내는 기를 의미한다. E 는 탄소 원자 또는 질소 원자를 의미한다.

이들 중, 페닐기에 바람직한 치환기로는, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 할로겐화 저급 알킬기, 저급 알콕시카르보닐기, 포르밀기, 수산기, 저급 알콕시 저급 알킬기, 할로겐, 벤조일기, 벤질술포닐기 등을 들 수 있고, 치환기는 동일하거나 또는 다르게 2 개 이상이어도 좋다.

피리딜기에 바람직한 기로는, 저급 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다.

피라질기에 바람직한 기로는, 저급 알콕시카르보닐기, 카르복실기, 아실아미노기, 카르바모일기, 시클로알킬옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.

또한, J 로서의 피리딜기는, 2-피리딜기, 3-피리딜기 또는 4-피리딜기가 바람직하고, 피라질기는 2-피라질기가 바람직하고, 퀴놀릴기는 2-퀴놀릴기 또는 3-퀴놀릴기가 바람직하고, 퀴녹살릴기는 2-퀴녹살릴기 또는 3-퀴녹살릴기가 바람직하고, 푸릴기는 2-푸릴기가 바람직하다.

J 의 정의에 있어서, (b) 그룹에 기재되어 있는 ①∼⑨ 에 관해서, 그 대표 예를 표시하면 다음과 같다.

상기 일련의 식에 있어서, t 는 0 또는 1∼4 의 정수를 의미하고, S 는 동일하거나 또는 다른 상기한 J(a) 의 정의에 있어서의 치환기 중 1 개 또는 수소 원자를 의미하지만, 바람직하게는 수소 원자 (무치환), 저급 알킬기 또는 저급 알콕시 기를 들 수 있다. 또, 페닐환의 이웃하는 탄소 사이에서 메틸렌디옥시기, 에틸렌디옥시기 등의 알킬렌디옥시기로 치환되어 있어도 된다.

이들 중 가장 바람직한 경우는, 무치환 또는 메톡시기가 1∼3 개 치환되어 있는 경우이다.

또, 상기의 인다놀리데닐은 J(b) 의 정의에서의 페닐기가 치환되어 있어도 되는 2 가의 기의 예이다. 즉 J(b) 의 ② 의 인다노닐로부터 유도되는 대표적인 2 가의 기이다.

J 의 정의에 있어서, 환형 아미드 화합물로부터 유도되는 1 가의 기란, 예를 들어 퀴나졸론, 테트라하이드로이소퀴놀린-온, 테트라하이드로벤조디아제핀-온, 헥사하이드로벤츠아조신-온 등을 들 수 있지만, 구조식 중에 환형 아미드가 존재하기만 하면 되고, 이들에 한정되지 않는다.

단환 또는 축합 헤테로환으로부터 유도되는 환형 아미드가 있을 수 있는데, 축합 헤테로환으로는 페닐환과의 축합 헤테로환이 바람직하다. 이 경우, 페닐환은 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 바람직하게는 메틸기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 바람직하게는 메톡시기 또는 할로겐 원자에 의해 치환되어 있어도 된다.

바람직한 예를 들면 다음과 같다.

상기 식 중에서, 식 (i), (l) 에서의 Y 는 수소 원자 또는 저급 알킬기를 의미하고, 식 (k) 에서의 V 는 수소 원자 또는 저급 알콕시기, 식 (m), (n) 에서의 W¹, W² 는 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, W³ 은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 의미한다.

또, 식 (i), (l) 에 있어서, 우측의 환은 7 원환이고, 식 (k) 에 있어서 우측의 환은 8 원환이다.

J 의 상기 정의 중 가장 바람직한 것은, 페닐환이 치환되어도 되는 인다논으로부터 유도되는 1 가의 기, 환형 아미드 화합물로부터 유도되는 1 가의 기이다.

B 의 정의에 있어서, 식

으로 나타내는 기는,

R² 가 수소 원자인 경우에는 식 -(CH₂)_n- 으로 표시되고, 또 알킬렌쇄의 어느 하나의 탄소 원자에 1 개 또는 그 이상의 메틸기가 결합하고 있어도 됨을 의미한다. 이 경우, 바람직하게는 n 은 1∼3 이다.

또한, B 의 일련의 기에 있어서, 기 내에 아미드기를 갖는 경우도 바람직한 기의 하나이다.

더욱 바람직한 기로는, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -NH- 으로 나타내는 기, 식 -O- 으로 나타내는 기 또는 식 -S- 으로 나타내는 기를 들 수 있다.

환

에 관해서는, 5∼7 원환을 취할 수 있다. 구체적으로는

등을 들 수 있지만, 특히 바람직한 환은

(T=C, Q=N) 으로 표시되는 피페리딘의 경우이다.

K 의 정의에서의 「치환 또는 무치환의 페닐기」, 「치환 또는 무치환의 아릴알킬기」에 있어서, 치환기는 상기한 J 의 정의에서 (a) 의 ①∼⑦ 에 있어서 정의된 것과 동일한 것이다.

아릴알킬기란, 페닐환이 상기 치환기로 치환되거나, 무치환의 벤질기, 페네틸기 등을 의미한다.

피리딜메틸기란 구체적으로는, 2-피리딜메틸기, 3-피리딜메틸기, 4-피리딜메틸기 등을 들 수 있다.

K 에 관해서는, 페닐기가 치환되어도 되는 아릴알킬기, 치환 또는 무치환의 페닐기, 페닐기가 치환되어도 되는 신나밀기가 가장 바람직하다.

바람직한 아릴알킬기는, 구체적으로는 예를 들어 벤질기, 페네틸기 등을 말하고, 이들은 페닐기가 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 수산기 등으로 치환되어 있어도 된다.

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.

이중 결합인 경우의 예를 들면, 상기에서 서술한 페닐환이 치환되어도 되는 인다논으로부터 유도되는 2 가의 기인 경우, 즉 인다놀리데닐기인 경우를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 약리학적으로 허용할 수 있는 염이란, 예를 들어 염산염, 황산염, 브롬화수소산염, 인산염 등의 무기산염, 포름산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 타르타르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염 등의 유기산염을 들 수 있다.

또한 치환기의 선택에 따라서는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜린염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염 등의 유기 아민염, 암모늄염 등을 형성하는 경우도 있다.

또, 본 발명에 있어서 상기 화합물은, 치환기의 종류에 따라서는 부제 탄소를 가지고, 광학 이성체가 존재할 수 있으며, 이들이 본 발명의 범위에 속함은 물론이다.

구체적인 예를 한가지 서술하면, J 가 인다논 골격을 갖는 경우, 부제 탄소를 갖기 때문에 기하 이성체, 광학 이성체, 디아스테레오머 등이 존재할 수 있고, 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

이들의 정의를 종합하여 특히 바람직한 화합물군을 들면 다음과 같다.

[식 중, J¹ 은 페닐기가 치환되어 있어도 되는 다음의 군으로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기; ① 인다닐, ② 인다노닐, ③ 인데닐, ④ 인데노닐, ⑤ 인단디오닐, ⑥ 테트랄로닐, ⑦ 벤즈수베로닐, ⑧ 인다놀릴,

⑨ 식

으로 나타내는 기를 의미한다.

B, T, Q, q, K 는 상기와 동일한 의미를 갖는다.]

으로 나타내는 환형 아민 또는 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

상기 J¹ 의 정의 중, 가장 바람직한 기로는, 페닐기가 치환되어 있어도 되는 인다노닐기, 인단디오닐기, 인다놀리데닐기를 들 수 있다. 또한, 이 경우, 페닐기는 치환되어 있지 않거나, 동일하거나 또는 서로 다른 수산기, 할로겐, 저급 알콕시기로 치환되어 있는 경우가 가장 바람직하다. 저급 알콕시기란, 탄소수 1∼6 의 예를 들어 메톡시기, 에톡시기, 이소프로폭시기, n-프로폭시기, n-부톡시기 등을 말하고, 1∼4 치환을 취할 수 있으며, 2 치환인 경우가 바람직하다. 가장 바람직한 경우에는 메톡시기가 2 치환으로 되어 있는 경우이다.

(A) 식에 포함되는 화합물 중에서 더욱 바람직한 화합물군으로는, 다음의 일반식으로 나타내는 화합물 (B) 를 들 수 있다.

⑨ 식

으로 나타내는 기를 의미한다.

B¹ 은 식

(식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수를 의미한다. R² 는 식

으로 나타내는 알킬렌기가 치환기를 가지지 않거나, 또는 1 개 또는 1 개 이상의 메틸기를 가지고 있는 형태로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다.) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다.

T, Q, q, K 는 상기와 동일한 의미를 갖는다.]

(B) 식에 포함되는 화합물 중에서 더욱 바람직한 화합물군으로는, 다음의 일 반식으로 나타내는 화합물 (C) 를 들 수 있다.

(식 중, J¹, B¹, K 는 상기와 동일한 의미를 갖는다.)

즉, 식

으로 나타내는 기가 식

으로 나타내는 기, 즉 피페리딘인 경우이다.

(C) 식에 포함되는 화합물 중에서 더욱 바람직한 화합물군으로는, 다음의 일반식으로 나타내는 화합물 (D) 를 들 수 있다.

(식 중, J² 는 페닐기가 치환되어도 되는 인다노닐, 인단디오닐, 인다놀리데닐기로부터 선택된 기를 의미한다.

K¹ 은 치환 또는 무치환의 페닐기, 치환되어도 되는 아릴알킬기, 치환되어도 되는 신나밀기를 의미한다.

B¹ 은 상기와 동일한 의미를 갖는다.)

3. 신경 세포 보호

본 발명에 있어서, 중추 신경계의 신경 세포란, 뇌 유래의 성숙한 신경 세포 (바람직하게는, 신경 회성에 주입되어 기능적으로 성숙한 인간 또는 인간 이외의 포유 동물에서 유래하는 중추 신경계의 신경 세포) 를 의미하고, 대뇌 피질, 중격부 및 해마로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 유래하는 세포이다.

본 발명에 있어서, 중추 신경계의 신경 세포 보호란, 중추 신경계의 신경 세포에 대한 뇌허혈 등의 허혈성의 작용에 의한 것, NMDA (N-methyl-D-aspartate), 카인산 등 흥분성 물질에 의한 흥분성 독성에 의한 것, 펩티드 또는 단백질의 응집체 독성 (Aβ 독성, 프리온 독성을 포함한다) 에 의한 것, NO (nitric oxide) 나 활성 산소종에 의한 것 외에, 여러 가지의 부하에 대한 보호 작용을 말한다. 또한, 뇌허혈에 의해 유발되는 신경 세포 상해에는, 예를 들어 뇌졸중, 뇌경색, 뇌색전 (최근에는 알츠하이머의 원인으로도 전해지고 있다) 등의, 뇌신경의 변성 질환 등과 같은 상해를 포함한다. 당해 펩티드 또는 단백질의 응집체 독성, 특히 Aβ 독성은, 알츠하이머병 또는 다운 증후군에 수반하여 유발되는 것도 포함된다.

당해 신경 세포 보호는, 예를 들어, 중추 신경계의 신경 세포에 대한 부하 (예를 들어, 스트레스, 영양 장애, 병, 외상, 수술 등에 의한 체력 저하, 쇠약, 노화 등, 항상성 유지에 바람직하지 못한 물리적 또는 화학적인 장애 또는 세포 독성 작용) 에 의한 신경 세포사를 실제로 방지하는 작용 외에, 신경 세포의 기능 저하를 방지하는 작용을 포함하는 넓은 의미로 사용된다.

신경 세포가 보호되었는지 여부를 조사하기 위해서는, 신경 세포를 조제할 필요가 있다. 이 경우, 세포는 특별히 한정되는 것이 아니라, 생체 시료로부터 조제한 초대 배양 세포여도 된다. 생체 시료로부터 초대 배양 세포를 조제하는 방법은, 예를 들어, 대뇌 피질 유래의 초대 배양 신경 세포는 대뇌 피질로부터 얻 을 수 있고, 중격부 세포 유래의 초대 배양 신경 세포는 중격 부위, 즉 중격부 및 전뇌 기저핵을 포함하는 부위로부터 얻을 수 있다.

세포의 채취원이 되는 동물종은, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 등 중 어느 것도 상관없고, 특별히 한정되는 것이 아니다. 세포는, 태아로부터 성체까지의 모든 성장 과정에서 채취할 수도 있지만, 태아 (예를 들어 태생 18 일령) 로부터 조제하는 것이 바람직하다. 채취한 조직을, 트립신 처리 또는 콜라게나아제 등으로 처리함으로써 신경 세포를 얻을 수 있다.

세포 배양은 통상적인 동물 세포의 배양 방법으로 할 수 있고, 당업자이면 적당한 배양 조건을 설정하는 것이 가능하다.

4. 신경 세포 보호제, 보호 방법

전술한 화합물 Q 는, 신경 세포 (그 중에서도 중추 신경계의 신경 세포) 의 장애에 대하여 보호 작용을 갖는다. 또한, 아세틸콜린 에스테라아제 유전자 (AChE 유전자) 의 siRNA 는, AChE 유전자의 발현을 억제하여 AChE 의 기능을 저해하고, Aβ 의 생성을 억제한다. 따라서, 본 발명에 있어서 화합물 Q 또는 후술하는 AChE 유전자의 siRNA 는, 상기 뇌졸중, 뇌경색, 뇌색전 등과 같은 뇌신경의 변성 질환 중추 신경 보호제, 신경 세포 장애의 예방제, 치료제 및/또는 예후 개선제 (이하, 「본 발명의 보호제 등」이라도 한다) 의 유효 성분으로서 유용하여, 알츠하이머병 및 다운 증후군 등의 치료제, 치료 방법, 예후 개선제 및 예후 개선 방법이 제공된다.

본 발명의 보호제 등의 유효 성분 (예를 들어, 염산도네페질) 은, 무수물이 어도 되고, 수화물을 형성하고 있어도 된다. 또, 예를 들어, 상기 도네페질에는 결정 다형이 존재하는 경우도 있지만 여기에 한정되지 않고, 어느 하나의 결정형이 단일할 수도 있고, 결정형 혼합물일 수도 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 화합물 Q (예를 들어 염산도네페질) 는, 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 대표적인 예로서, 일본 공개특허공보 평1-79151호, 일본 특허 제2578475호, 일본 특허 제2733203호, 또는 일본 특허 제3078244호에 개시되어 있는 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 염산도네페질은, 세립제 등의 제제로도 입수할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 siRNA 는 후술하는 방법에 따라서 설계하고, 당업자이면 핵산 합성 장치 등을 사용한 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 보호제 등에는, 화합물 Q 또는 AChE 유전자의 siRNA 를 그대로 사용하는 것도 가능하고, 공지되어 있는 약학적으로 허용할 수 있는 담체 등을 배합하여 제제화하는 것도 가능하다. 이러한 약학적으로 허용할 수 있는 담체로는, 예를 들어, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미교취제, 안정화제, 유화제, 흡수촉진제, 계면활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제 등을 들 수 있다. 제제화의 제형으로는, 경구적 투여 형태에 사용되는 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 시럽제 등을, 또한 비경구적 투여 형태에 사용되는 좌제, 주사제, 연고제, 스킨 패치제 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 보호제 등의 투여 형태는 특별히 한정되지 않고, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 형태로서, 염산도네페질 의 세립제는 상품명 아리셉토 세립 (에이자이주식회사), 정제는 상품명 아리셉토정 (에이자이주식회사) 으로서 입수할 수 있다. 또는, 비경구 투여의 형태로서, 경피 흡수, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 또한, 주사제는, 비수성의 희석제 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜, 올리브유 등의 식물유, 에탄올 등의 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로서 조제하는 것이 가능하다. 주사제의 무균화는, 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시하면 된다. 또한, 주사제는, 사용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결 건조법 등에 의해 무균의 고체 조성물로 하고, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다. 첩포제 (패치제) 로서 경피 흡수에 의해 투여하는 경우에는, 염을 형성하지 않는 이른바 프리체를 선택하는 것이 바람직하다.

경구 투여에 있어서의 화합물 Q 의 투여량은, 염산도네페질을 예로 들면, 바람직하게는 0.1∼100㎎/일 이고, 더욱 바람직하게는 1.0∼50㎎/일 이고, 또, AChE 유전자의 siRNA 의 바람직한 투여량으로는, 0.01∼100㎎/일 이고, 더욱 바람직하게는 0.1∼50㎎/일 이다.

비경구 투여에 있어서, 첩포제의 경우, 바람직한 투여량으로는 5∼50㎎/일 이고, 더욱 바람직하게는 10∼20㎎/일 이다. 또한, 주사제의 경우에는, 생리식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 0.1㎍/㎖ 담체∼10㎎/㎖ 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 해서 제조된 주사제의 투여량은, 처치를 필요로 하는 환자에 대하여 0.01∼5.0㎎/일 이고, 더욱 바람직하게는 0.1∼1.0㎎/일 이고, 1 일 1∼3 회로 나눠 투여할 수 있다.

5. 기능 평가 방법

본 발명의 신경 세포 보호제가 허혈성 상해로부터 신경 세포를 보호하는 효과에 관해서는, OGD (Oxygen Glucose Deprivation: 산소 글루코오스 제거) 시험에 의해 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 신경 세포 보호제가 흥분성 독성으로부터 신경 세포를 보호하는 효과에 관해서는, NMDA 또는 카인산 자극 시험에 의해 평가할 수 있다. 그리고, 본 발명의 신경 세포 보호제가 Aβ 독성으로부터 신경 세포를 보호하는 효과에 관해서는, Aβ 독성 시험 또는 Aβ 응집 시험에 의해 평가할 수 있다. 이하, 각각의 시험 방법에 관해서 설명한다.

(1) OGD 시험

OGD 시험에서는, 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 대하여 산소 글루코오스 제거에 의한 부하를 가함으로써 허혈성의 세포 상해를 유발하는 모델을 사용한다. 그리고, 당해 모델에 있어서, 염산도네페질이 상기 허혈성의 상해에 대하여 신경 세포 보호 작용을 갖는지 여부를 검토한다.

본 실시예에 있어서는, 초대 배양 신경 세포는 래트 태아 (태생 17-19 일령) 의 대뇌 피질로부터 얻을 수 있다. 세포는 통상적인 동물 세포의 배양 환경 하, 예를 들어, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 7 일 이상 배양한 것을 사용할 수 있다. OGD 처리는, 배양한 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포를 글루코오스가 함유되어 있지 않은 완충액 중에 넣고, 계속해서 밀폐된 챔버로 옮겨, 질소 치환하여 저산소 환경으로 함으로써 처리한다. OGD 처리 후의 세포는, 글루코오스가 함유되어 있지 않은 완충액으로부터 세포 배양용 용액으로 치환하고, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 하룻밤 배양한다.

(A) 화합물 Q, 예를 들어 도네페질에 의해 허혈성 상해로부터 신경 세포를 보호하는 효과가 인정되는지 여부를 밝히기 위해서는, 우선 OGD 처리의 전후에 당해 화합물을 첨가한 조건으로 본 실시예를 실시하면 된다. 예를 들어, OGD 처리의 12 시간 전부터 도네페질을 첨가한 12시간 전(Pre-12h), OGD 처리의 1 시간 전부터 도네페질을 첨가한 1시간 전(Pre-1h) 및 OGD 처리의 1 시간 후부터 도네페질을 첨가한 1시간 후(Post-1h)와, OGD 처리하지 않은 Cont 및 OGD 처리 전후에 도네페질을 첨가하지 않은 Vehicle 의 신경 세포 보호 작용을 비교한다. 신경 보호 작용의 지표로는, LDH 방출의 억제율을 사용할 수 있다. LDH(lactate dehydrogenase) 는 세포질에 존재하는 산화 환원 효소로서, 피루브산을 락트산으로 변환하고, 거기에 수반하여 세포내의 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) 양을 감소시킨다. 따라서, 세포가 OGD 에 의해 상해를 입으면 LDH 가 세포내로부터 세포외의 용액 중으로 유출되어, 그 용액에는 세포의 상해도 (세포사) 에 따라서 LDH 가 존재하게 된다. 또한, 용액 중에 존재하는 LDH 의 양은 그 용액에 피루브산, 및 NADH 를 첨가하여, NADH 의 감소율을 흡광도계에 의해 측정함으로써 알 수 있다. 본 시험예에 의해, OGD 처리의 12 시간 전부터 도네페질을 첨가한 경우 (Pre-12h) 에 가장 신경 보호 효과를 나타내는 것이 개시된다.

(B) 또한, 전술한 바와 같이 OGD 처리한 래트 초대 배양 신경 세포를 현미경에 의해 형태를 관찰함으로써, 세포가 받은 상해의 정도, 또는 화합물에 의한 신경 세포의 보호 정도를 관찰할 수도 있다. Vehicle 처치 세포는, 컨트롤 세포와 비교하여 정상적인 형태를 취하지 않는다. 한편, OGD 처리 전에 도네페질을 처치한 경우에는 Vehicle 처치 세포 정도의 세포의 상해는 관찰되지 않으며, OGD 처리 전의 신경 세포에 가까운 형태를 나타낸다. 따라서, 세포 형태의 측면에서도, OGD 처리 전에 도네페질을 첨가함으로써 신경 세포가 보호되어 있음이 개시된다.

(C) 또, 전술한 시험과 동일한 조작에 의해, 래트 초대 배양 신경 세포를 OGD 처리하고, 그 때에 각종 아세틸콜린 에스테라아제 저해제 (갈란타민(galanthamine), 타크린 (tacrine), 리바스티그민 (rivastigmine)) 및 도네페질을 사용하고 각각의 농도를 바꿔 세포에 첨가했을 때의 LDH 방출에 미치는 영향에 관해서 시험할 수도 있다. 이 시험에 있어서, 도네페질의 아세틸콜린 에스테라아제 50% 저해 농도는 리바스티그민과 거의 동등하지만, 리바스티그민이나 다른 아세틸콜린 에스테라아제 저해제는 신경 세포 보호 작용을 나타내지 않았다. 따라서, 도네페질에 의한 OGD 처치 신경에 대한 신경 보호 작용이 아세틸콜린 에스테라아제 저해 작용과는 다른 작용 기전에 근거하는 것임을 시사하고 있다.

(D) 다음으로, 전술한 도네페질의 신경 세포 보호 작용이 아세틸콜린 수용체 를 통한 것인지를 조사하기 위해, 아세틸콜린 수용체 앤타고니스트인 스코폴라민 (무스카린 수용체 앤타고니스트) 및 메카밀라민 (니코틴 수용체 앤타고니스트) 을 세포에 첨가했을 때에 도네페질에 의한 보호 작용이 어떻게 영향을 받는지를 조사한다. 본 시험에 의해, 도네페질의 신경 세포 보호 작용은 스코폴라민 및 메카밀라민의 첨가에 의해 영향을 받지 않고, 따라서 도네페질의 신경 세포 보호 작용은 아세틸콜린 수용체를 통한 것이 아님을 개시하고 있다.

(2) 흥분성 독성 시험

(A) NMDA 독성

흥분성 독성 시험에서는, 초대 배양 신경 세포에 있어서의 NMDA (N-methyl-D-aspartate) 독성에 대한 화합물 (예를 들어 도네페질) 의 세포 보호 작용을 검토한다. 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 대하여 NMDA 자극을 가함으로써 세포 상해를 유발하는 모델을 사용한다. 방법은, 전술한 바와 같이 하여 얻어진 래트 초대 배양 신경 세포에 대하여, NMDA 를 첨가 (예를 들어 100μM 를 9 시간 첨가) 하고, 그 후, 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하면 된다. 도네페질은 NMDA 자극을 첨가하기 전, 예를 들어 12 시간 전부터 세포에 첨가한다. 그리고, NMDA 첨가 후, 예를 들어 9 시간 후에 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하여, 신경 보호 작용의 지표로 할 수 있다.

본 시험에 의해 도네페질은 NMDA 흥분성 독성에 대하여 농도 의존적으로 신경 세포 보호 효과를 나타내는 것이 분명하다.

(B) 카인산 독성

카인산은, 알츠하이머병의 원인 인자의 하나로 되어 있는 β-아밀로이드가 유발하는 신경 세포사를 증강시키는 것으로 전해지고 있다. 본 시험에서는, 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 있어서, 카인산에 의해 유발되는 세포 상해에 대하여 화합물 (예를 들어, 도네페질) 에 의한 세포 보호 작용을 검토한다.

카인산 처치는, 예를 들어, 7 일 이상 배양한 세포의 배지에 카인산을 첨가하고, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 하룻밤 배양하면 된다. 화합물 Q (예를 들어 도네페질) 는, 카인산 자극을 가하기 전, 예를 들어 24 시간 전부터 세포에 첨가한다. 그리고 카인산 첨가 후, 예를 들어 24 시간 후에 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하여 신경 보호 작용의 지표로 할 수 있다. 본 시험에 있어서, 도네페질은, 용량 의존적으로 신경 세포의 LDH 방출을 억제하기 때문에, 도네페질은 카인산 흥분성 독성에 대하여 농도 의존적으로 보호 효과를 나타내는 것이 분명하다.

(3) Aβ 독성 시험 또는 Aβ 응집 시험

(A) 배양 중격부 신경 세포

Aβ 는 알츠하이머병의 원인으로 생각되고 있으며, 또한, 알츠하이머병에서는 기억이나 학습에 관여하는 중추의 콜린 작동성 신경이 탈락된다. 그리고, 콜린 작동성 신경은, 중격부에서 해마 등의 알츠하이머병에서 장애를 입기 쉬운 영역에 투사되어 있다. 이상의 발견과, 염산도네페질의 투여에 의해 알츠하이머병에 의한 해마의 체적 감소가 억제되는 것을 고려하면, 콜린 작동성 신경에 있어 서, 화합물 (예를 들어, 도네페질) 의 Aβ 독성에 대한 보호 효과 및 Aβ 응집 억제 효과를 해석하는 것이 바람직하다.

중격부 신경 세포의 대부분은, 아세틸콜린 합성 효소인 콜린아세틸 트랜스페라아제 (ChAT) 를 갖기 때문에 콜린 작동성 신경이라고 생각된다. 본 발명에서는, 콜린 작동성 신경인 상기 중격부 신경 세포에 있어서, 도네페질에 의한 Aβ 응집 억제 작용에 의한 콜린 작동성 신경 세포의 독성에 대한 세포 보호 효과를 처음으로 나타낸 것이다.

중격부 신경 세포는, 생체로부터 채취하여 배양함으로써 얻을 수 있고, 그 유래는 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 등 중 어느 것도 상관없으며, 특별히 한정되지 않는다. 세포는, 태아로부터 성체까지의 모든 성장 과정에서 채취할 수도 있지만, 태아 (예를 들어 태생 18 일령) 로부터 조제하는 것이 바람직하다. 뇌의 중격 부위, 즉 중격부 및 전뇌 기저핵을 포함하는 부위를 잘라내고, 트립신 처리함으로써 세포를 얻을 수 있다.

중격부 신경 세포는, 상기한 바와 같이 얻어진 세포를 배양 플레이트에 적당한 농도로 파종하여 배양할 수 있다. 배양 플레이트는, 폴리 D-리신으로 코팅한 플레이트가 바람직하고, 농도는, 예를 들어 96 웰 폴리 D-리신 코팅 플레이트에 웰 당 1.2×10⁵ 세포로 파종하는 것이 바람직하다. 배지는, 5% 우태아혈청(fetal calf serum) 을 함유하는 DMEM 을 사용할 수 있고, DMEM 은, 5㎍/㎖ 인슐린(insulin), 30n㏖/ℓ 아셀렌산 나트륨(sodium selenite), 100μ㏖/ℓ 푸트레신 (putrecsine), 20n㏖/ℓ 프로게스테론(progesterone), 15n㏖/ℓ 비오틴(biotin), 100units/㎖ 페니실린(penicillin), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 1m㏖/ℓ 피부르산 나트륨(sodium pyruvate) 등을 함유하는 것이 보다 바람직하다.

배양 중격부 신경 세포가 콜린 작동성 신경인 것은, 상기한 바와 같이 ChAT 의 발현을 지표로 사용하여 확인할 수 있다. ChAT 의 발현 유무는, 배양 중격부 신경 세포를 항 ChAT 항체로 면역 염색하여 확인할 수 있다.

(B) Aβ 응집의 검출

본 발명에 있어서, Aβ 의 응집은 Aβ 의 β-시트 구조 형성에 기인하는 215∼260㎚ 에서의 CD (circular dichroism) 스펙트럼의 변화를 지표로 사용하여 검토할 수 있다. 215∼260㎚ 에서의 CD (circular dichroism) 스펙트럼은, Aβ 가 α-헬릭스 구조 또는 β-시트 구조를 형성하면 감소한다. 특히, β-시트 구조의 형성은, 215㎚ 주변의 CD 스펙트럼을 감소시키는 사실이 알려져 있다.

또한 별도의 양태로서, 배양액 중에서의 Aβ 의 응집을 간편하게 검토하기 위해 Thioflavin T 를 사용하여 Aβ 의 형광을 측정할 수 있다. 세포에 Aβ(1-42) 를 첨가 48 시간 후, 배지를 채취하여 10μ㏖/ℓ 의 Thioflavin T 를 첨가하고, 직후에 여기(excitation) 파장 450㎚, 방출(emission) 파장 490㎚ 에서 형광 측정한다 (Wall J., Schell M., Murphy C., Hrncic R., Stevens F. J., Solomon A. (1999) Thermodynamic instability of human lambda 6 light chains: correlation with fibrillogenicity. Biochemistry. 38(42), 14101-14108.).

(C) Aβ 독성의 검출

Aβ 는 β-시트 구조를 취하면 Aβ 섬유의 덩어리를 형성하기 쉬워지고, 독성을 나타내는 것이 알려져 있다. 본 발명에 있어서 Aβ 독성의 검출은, 중격부 신경 세포에 Aβ 를 첨가한 후, 세포 장애를 측정하는 공지된 방법을 사용하여 검출할 수 있고, 이하에 바람직한 대표예를 기재하지만 이것에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 상기 (1) 과 같이 배지 중의 LDH 양을 지표로 사용하여 검토한다. 또는, 본 발명에 있어서 Aβ 독성은, 중격부 신경 세포에 Aβ 를 첨가한 후에, MTT (dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) 분석에 의해 검토한다. MTT 분석의 방법은, 예를 들어, MTT (시그마사 제조) 를 배지 중에 최종 농도가 1㎎/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 DMSO 로 가용화하여, 그 흡광도 (550㎚) 를 측정하면 된다. 또는, alamar blue 에 의한 세포 장애 측정 방법에 의해 검토한다. alamar blue 에 의한 상기 방법은, 배지의 10 분의 1 양의 alamar blue (와코쥰야쿠사 제조) 를 첨가하여, 5%CO₂ 환경 하에 반응시킨다. 4 시간 후, 여기 파장 530㎚, 형광 파장 590㎚, gain 35 로 측정한다. 배지만을 0%, 컨트롤을 100% 로 하여 환산한다.

세포에 첨가하는 Aβ 는, 전체 길이의 Aβ 를 사용해도 되고, N 말단에서부터 40 잔기만의 Aβ(1-40) 를 사용해도 되며, β 시트 구조를 취하는 서열인 한 어떠한 길이의 Aβ 를 사용해도 된다.

또한, Aβ 독성에 의한 세포사의 정도는 항 MAP2 항체에 의한 면역 염색에 의해서도 검토할 수 있다. 상기한 MAP2 는 신경 세포의 마커이기 때문에, MAP2 를 발현하는 세포의 양으로부터 Aβ 독성에 의한 신경 세포의 탈락 정도를 확인할 수 있다. 또는, 트리판 블루에 의한 세포 장애 측정 방법에 의해 검토한다. 트리판블루 (와코쥰야쿠사 제조) 를 첨가하여, 진한 청색으로 염색되지 않은 세포를 생세포로 하여 그 수를 센다.

(D) 중격부 신경 세포의 Aβ 독성에 대한 신경 보호제 및 Aβ 응집 억제제

아세틸콜린 에스테라아제 (AChE) 유전자의 siRNA 를 중격부 신경 세포에 첨가하면, 세포내의 AChE 활성이 저하된다. siRNA 의 처치에 의해 Aβ 독성에 대한 중격부 신경 세포의 장애가 완화됨이, 상기 (C) 의 LDH 를 측정하는 것에 의해 개시된다.

또한, 당해 siRNA 를 첨가한 중격부 신경 세포에 있어서, siRNA 의 처치에 의해 Aβ 응집 작용이 억제됨이, 상기 (B) 의 CD 스펙트럼을 측정하는 것에 의해 개시된다.

이상의 점에서, 중격부 신경 세포의 Aβ 독성 및 Aβ 응집에는 AChE 가 관여하고 있는 것이 분명하다. 따라서, 아세틸콜린 에스테라아제의 기능 저해 작용을 갖는 화합물로서, 실질적으로 아세틸콜린 에스테라아제와 Aβ 의 상호 작용을 억제하는 작용을 겸비하는 화합물을 함유하는 Aβ 응집 억제제는 본 발명에 포함된다.

「상호 작용」이란, 아세틸콜린 에스테라아제와 Aβ 가 결합하는 것을 의미한다. 「실질적으로 아세틸콜린 에스테라아제와 Aβ 의 상호 작용을 억제한다」라는 것은, 아세틸콜린 에스테라아제 존재 하에 Aβ 의 응집이 촉진되는 것을 억 제하는 것임을 의미한다. 그리고, Aβ 독성이 저해되는 한 「실질적」으로 상호 작용이 억제된다고 할 수 있다.

아세틸콜린의 기능 저하 작용은, 아세틸콜린 에스테라아제의 활성 저해에 의한 것이어도 되고, 아세틸콜린 에스테라아제 유전자의 발현 저해에 의한 것이어도 된다.

AChE 의 활성 저해는, 아세틸콜린과 Aβ 의 상호 작용을 억제하는 한, AChE 의 효소 활성을 저해하는 것이면 어떠한 화합물이어도 좋고 (예를 들어 하기 식의 염산도네페질), 또한, 항 AChE 항체일 수도 있다.

AChE 유전자의 발현 저해는, 아세틸콜린과 Aβ 의 상호 작용을 억제하고, 또한 AChE 유전자의 발현을 저해하는 것이면, RNAi 를 생성하는 어떠한 핵산 (siRNA 나 shRNA) 도 좋다. RNAi 에 의해 AChE 유전자의 발현을 억제하기 위해서는, 예를 들어 AChE 유전자에 대한 siRNA (small interfering RNA) 또는, shRNA (short hairpin RNA) 를 설계 및 합성하고, 이것을 작용시켜 RNAi 를 생기시키면 된다. siRNA 는, 세포내에서 Dicer 에 의해 프로세싱되어 생성되는 단쇄 RNA 이다. 한편, shRNA 는 헤어핀 구조로 절첩된 작은 RNA 분자로서, 센스쇄와 안티센스쇄를 루프로 연결한 스템 루프 구조를 갖는다.

siRNA 의 설계 기준은 다음과 같다.

(a) AChE 를 코드하는 유전자의 개시 코돈의 하류 영역을 선택한다. 개시 코돈보다 하류의 서열이면 특별히 한정되지 않고, 임의의 영역을 모두 후보로 할 수 있다.

(b) 선택한 영역으로부터, aa 에서 시작되는 연속하는 11∼30 염기, 바람직하게는 21∼25 의 서열을 선택한다.

구체적으로는, 이하의 염기 서열을 표적 서열로 하고, 이 표적 서열을 함유하고, 또한 30 염기 이하, 예를 들어 11∼30 염기의 길이 (바람직하게는 21∼25 염기의 길이) 의 서열을 siRNA 로서 사용할 수 있다 ((ⅰ-1) 과 (ⅰ-2), 및 (ⅱ-1) 과 (ⅱ-2)).

(ⅰ-1) 5'-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3' (서열번호 1)

(ⅰ-2) 5'-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3' (서열번호 2)

(ⅱ-1) 5'-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3' (서열번호 3)

(ⅱ-2) 5'-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3' (서열번호 4)

본 발명에 있어서 AChE 유전자의 siRNA 는, (ⅰ-1) 과 (ⅰ-2) 의 조합, 및 (ⅱ-1) 과 (ⅱ-2) 의 조합으로 형성되는 2 쇄 RNA 의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, shRNA 의 설계 기준은 이하와 같다.

(a) RNAi 에 사용하는 AChE 에 대한 shRNA 서열은, 유전자에 특이적인 5' 말단 영역에서 300 염기까지의 사이에 설계한다 (Elbashir, S. M. et. al. Genes Dev.15, 188-200 (2001)).

(b) 각각의 유전자 전사 산물의 5' 말단에 가까운 영역으로부터, aa 또는 a 에서 시작되는 mRNA 서열을 표적 서열로서 선택 및 설계한다. 표적 영역의 길이는 특별히 한정되지 않고, 바람직하게는 30bp 이하, 보다 바람직하게는 21∼25bp 정도이다.

siRNA 및 shRNA 를 배양 중격부 신경 세포에 도입하기 위해서는, 인 비트로(in vitro) 에서 합성한 siRNA 및 shRNA 를 플라스미드 DNA 에 연결하고 이것을 세포에 도입하는 방법, 2 개의 RNA 를 어닐하는 방법 등을 채용할 수 있다.

또한, Aβ 응집 억제 효과를 나타내는 siRNA 또는 shRNA 의 구조 해석으로부터 예상되는 화합물로서, Aβ 응집 억제 효과를 갖는 것도 본 발명에 포함된다.

(E) 콜린 에스테라아제 저해제 또는 콜린에스테라제 유전자의 siRNA 에 의한 Aβ 응집 억제 작용 및 Aβ 독성에 대한 보호 작용의 검출

본 발명은, Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법을 제공한다. 즉, 중추 신경계의 신경 세포에, Aβ 의 존재 하에 피검 화합물 (후보 화합물) 을 첨가했을 때의 215∼260㎚, 특히 215㎚ 에서의 CD 스펙트럼의 감소를 측정함으로써 Aβ 의 응집을 억제하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 피검 화합물이 Aβ 응집 억제 작용을 갖는지의 판단은, 피검 화합물에 의한 Aβ 응집량을 후보 화합물의 비존재 하에서의 Aβ 응집량과 비교함으로써 판단할 수 있다. 본 발명은, 상기 방법에 사용하기 위한 Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트도 제공한다.

본 발명의 키트에는, Aβ 응집 억제를 상기 (B) 의 CD 스펙트럼법으로 측정 하기 위해 필요한 것이 포함된다. Aβ 응집에 필요한 Aβ, CD 스펙트럼 측정시에 사용되는 시약류는, 하기의 실시예 6 및 7 에 있어서 사용한 것이 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명은, Aβ 독성에 의해 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법을 제공한다. 즉, 피검 화합물 및 Aβ 를 배양 중격부 신경 세포에 첨가했을 때의 세포 상해 또는 세포사를 검출함으로써, Aβ 독성에 의해 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물을 스크리닝할 수 있다. 상기의 세포 장애 또는 세포사는, 상기 (C) 에 기재된 LDH 양을 측정함으로써, 또는 MTT 분석 등에 의해 검출할 수 있다. 본 발명은, 상기 방법에 사용하기 위한 Aβ 독성에 의해서 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트도 제공한다.

또한, 본 발명의 키트에는, Aβ 독성에 의한 신경 세포 장애를 상기 (C) 의 세포외 LDH 양을 지표로 측정하기 위해서 필요한 것, 또는 MTT 분석 등을 실시하기 위해 필요한 것이 포함된다. Aβ 독성에 의한 세포 장애의 정도를 LDH 에 의해 측정하기 위해서 필요한 시약류는, 하기의 실시예 1, 2, 3, 5 및 7 에서 사용한 것이 바람직하게 사용되는데, 예를 들어 NADH, 피루브산을 들 수 있다. 또한, Aβ 독성에 의한 세포 장애의 정도를 MTT 에 의해 측정하기 위해서 필요한 시약류는, 예를 들어 MTT 를 들 수 있다.

이들 키트를 구성하는 각 성분은 별도로 준비해도 되고, 또는 지장이 없는 한 공존시켜 두어도 된다. 키트는 용액을 함유할 수도 있고, 또는 그와 같은 용액을 배합하기 위한 성분이 농축된 형태일 수도 있다.

추가로 필요에 따라, 본 키트는 보조제, 전용 용기, 그 밖의 필요한 악세사리, 설명서 등을 포함하고 있어도 된다.

본 발명에 있어서, 도네페질과 같은 아세틸콜린 에스테라아제 저해제 또는 아세틸콜린 에스테라아제 유전자의 siRNA 에 의한 Aβ 응집 억제 작용은, 아세틸콜린 에스테라아제 저해제를 Aβ 의 첨가 전 (예를 들어 24시간) 에 첨가하고, Aβ 의 첨가 후 (예를 들어 48 시간 후) 에 전술한 CD 스펙트럼을 측정함으로써 확인할 수 있다.

또한, 동일하게 처치한 세포에 있어서, 배지 중의 LDH 양을 측정함으로써 도네페질과 같은 아세틸콜린 에스테라아제 저해제 또는 아세틸콜린 에스테라아제 유전자의 siRNA 에 의한 Aβ 독성에 대한 보호 작용을 확인할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: OGD 시험

본 실시예에서는, 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 대하여 산소-글루코오스 제거에 의한 부하를 가함으로써 허혈성의 세포 상해를 유발하는 모델을 사용하였다. 염산도네페질이 상기 허혈성의 상해에 대하여 신경 세포 보호 작용 을 갖는지 여부룰 검토하였다.

본 실시예에 있어서는, 초대 배양 신경 세포는 래트 태아 (태생 17-19 일령) 의 대뇌 피질로부터 얻었다. 배양액은 DMEM (GibcoBRL) 에 10% 우태아혈청(GibcoBRL), 10% 말 혈청(GibcoBRL), 5㎍/㎖ 인슐린 (Sigma), 30nM 아셀렌산 나트륨 (Sigma), 100μM 푸트레신 (Sigma), 20nM 프로게스테론 (Sigma), 15nM 비오틴 (Sigma), 100units/㎖ 페니실린 (GibcoBRL), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Gibco BRL), 8mM 글루코스 및 1mM 피부르산 (Sigma) 를 사용하고 (참조문헌 Scholtz et al., 1988), 세포는 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 배양하였다. 7 일 이상 배양한 후, OGD 처리를 실시하였다. OGD 처리는, 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포를 글루코오스가 함유되어 있지 않은 완충액: 크렙스-링거 중탄산염 완충액(Krebs-Ringer bicarbonate buffer) (5.36mM KCl, 1.26mM CaCl₂, 0.44mM KH₂PO₄, 0.49mM MgCl₂, 0.41mM MgSO₄, 137mM NaCl, 4.17mM NaHCO₃, 0.34mM Na₂HPO₄, 10mM HEPES (pH 7.4)) 중에 넣고, 그리고 나서 밀폐된 챔버로 옮긴 후, 질소 치환하여 저산소 환경으로 함으로써 처리하였다. OGD 처리 후의 세포는, 글루코오스가 함유되어 있지 않은 완충액으로부터 세포 배양용 용액으로 치환하여, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 하룻밤 배양하였다. 우선, OGD 처리의 전후에 도네페질을 첨가함으로써 신경 세포 보호의 효과가 인정되는지, 또, 변화하는지를 검토하였다. OGD 처리의 12 시간 전부터 도네페질을 첨가한 12시간 전, OGD 처리의 1 시간 전부터 도네페질을 첨가한 1시간 전 및 OGD 처리의 1 시간 후부터 도네페질을 첨가한 1시간 후와, OGD 처 리하지 않은 Cont 및 OGD 처리 전후에 도네페질을 첨가하지 않은 Vehicle 의 신경 세포 보호 작용을 비교하였다. 신경 보호 작용의 지표로는, LDH 의 방출 억제율을 사용하였다. LDH (lactate dehydrogenase) 는 세포질에 존재하는 산화 환원 효소로서, 피루브산을 락트산으로 변환하고, 거기에 수반하여 존재하고 있는 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) 양을 감소시킨다. 따라서, 세포가 OGD 에 의해 상해를 입으면 LDH 가 세포내로부터 세포외의 용액 중으로 유출되어, 그 용액에는 세포의 상해도 (세포사) 에 따라서 LDH 가 존재하게 된다. 또, 용액 중에 존재하는 LDH 의 양은 그 용액에 피루브산 및 NADH 를 첨가하여, NADH 의 감소율을 흡광도계에 의해 측정함으로써 알 수 있다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 로부터 알 수 있듯이 12 시간 전이 가장 큰 LDH 방출 억제 작용을 나타내고, 이하 1 시간 전, 1 시간 후로 이어졌다. 이 결과에 의해, OGD 처리의 12 시간 전부터 도네페질을 첨가한 경우에 신경 세포를 효과적으로 보호한다는 것을 알 수 있다. 이 이후의 OGD 시험에 있어서의 도네페질의 첨가 시간은 모두 12시간 전으로 고정하였다.

다음으로, 앞서 시험과 동일한 조작에 의해 래트 초대 배양 세포를 OGD 처리했을 때의 신경 세포를 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 로부터 알 수 있듯이, Vehicle (B) 에서는 컨트롤 (A) 와 비교하여 세포가 정상적인 상태에 머물러 있지 않고, OGD 에 의해 데미지를 입고 있음이 현저하다. 한편, OGD 처리 전에 도네페질을 첨가한 경우에는, (B) 에서 관찰되는 신경 세포의 데미지는 확인되지 않아, OGD 처리 전의 신경 세포 상태에 가까운 상태임이 분명하 다 (C). 따라서, OGD 처리 전에 도네페질을 첨가함으로써 신경 세포가 보호되어 있음이 나타났다.

다음으로, 전술한 시험과 동일한 조작에 의해 래트 초대 배양 신경 세포를 OGD 처리하여, 그 때에 각종 아세틸콜린 에스테라아제 저해제 (갈란타민, 타크린, 리바스티그민) 및 도네페질을 사용하여 각각의 농도를 바꿔 세포에 첨가했을 때의 LDH 방출에 미치는 영향에 관해서 시험하였다. 첨가한 농도는, 도네페질, 타크린 및 리바스티그민은 0.1, 1.0, 10μM, 갈란타민은 1.0, 10, 100μM 로 하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 도 3A 로부터 분명한 바와 같이, 도네페질만이 용량 의존적으로 신경 세포의 LDH 방출을 통계상 유의하게 억제하고 있음을 알 수 있다. 여기서, 각각의 래트 뇌 파쇄 현탁액에 있어서의 아세틸콜린 에스테라아제 저해제의 50% 저해 농도 (IC₅₀) 를 표 1 에 나타낸다.

AChE 저해	IC₅₀(nM)
도네페질	6.7±0.35
갈란타민	1200±33
타크린	77±1.4
리바스티그민	4.3±0.087

Ogura et al. 2000. Comparison of inhibitory activities of Donepezil and other cholinesterase inhibitors on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in vitro. Methods Find Exp Clin Pharmacol.22, 609-613

표 1 로부터 분명한 바와 같이, 도네페질의 아세틸콜린 에스테라아제 50% 저해 농도는 리바스티그민과 거의 동등한 것을 알 수 있다. 그러나, 리바스티그민이나 다른 아세틸콜린 에스테라아제 저해제는 신경 세포 보호 작용을 나타내지 않았다. 이 결과는, 신경 보호 작용이 아세틸콜린 에스테라아제 저해 작용과는 다른 작용 기전에 근거하는 것임을 시사하고 있다.

다음으로, 도네페질의 신경 세포 보호 작용이, 아세틸콜린 수용체 앤타고니스트인 스코폴라민 (무스카린 수용체 앤타고니스트) 및 메카밀라민 (니코틴 수용체 앤타고니스트) 을 세포에 첨가했을 때에 어떻게 영향을 받는지를, 이하의 실험에 의해 조사하였다.

전술한 시험과 마찬가지로, OGD 처리의 12 시간 전부터 도네페질, 스코폴라민, 메카밀라민, 도네페질과 스코폴라민, 또는, 도네페질과 메카밀라민을 신경 세포 배양액 중에 첨가하여, OGD 처리에 의한 LDH 방출에 미치는 영향에 관해서 시험하였다. 첨가한 농도는, 도네페질, 스코폴라민, 메카밀라민 모두 10μM 로 했다.

결과를 도 4 에 나타낸다. 도 4 로부터 분명한 바와 같이, 도네페질의 신경 세포 보호 작용은, Cont (OGD 무처리), Vehi (도네페질 무첨가) 및 도네페질을 첨가한 모든 샘플에 있어서 아세틸콜린 수용체 앤타고니스트인 스코폴라민 (도 4A) 또는 메카밀라민 (도 4B) 의 첨가 유무에 의해서는 영향을 받고 있지 않다는 것을 알 수 있다. 이것은, 도네페질이 아세틸콜린 수용체의 저해 유무에 상관없이 신경 세포를 보호하고 있음을 나타낸다. 따라서, 본 실험에 의해 도네페질은 아세틸콜린 에스테라아제 저해 작용 이외의 작용 기전에 의해 신경 세포 보호적으로 작용하고 있는 것으로 생각된다.

실시예 2: 흥분성 독성 시험

본 실시예에서는, NMDA 독성에 대한 도네페질의 세포 보호 작용을 검토하였다. 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 대하여 NMDA 자극을 가함으로써 세포 상해를 유발하는 모델을 사용하였다. 실시예 1 과 동일하게 하여 얻어진 래트 초대 배양 신경 세포에 대하여 NMDA 100μM 를 첨가하고, 9 시간 후에 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하였다.

본 실시예에 있어서는, 초대 배양 신경 세포는 래트 태아 (태생 17-19 일령) 의 대뇌 피질로부터 얻었다. 배양액은, MEM (invitrogen 사 제조) 에 포도당 (1g/ℓ), penici./strept. (100unit/㎖), 10% FCS 를 첨가한 것을 사용하였다. 배지는 2,3 일마다 교환한다. KA 독성을 볼 때에는, 배지를 Neurobasal Medium (invitrogen 사 제조) 에 B-27 와 글루타민 0.25mM 을 첨가한 것을 사용하였다. 세포는 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 배양하였다. 7 일 이상 배양한 후, 배지에 NMDA 100μM 를 첨가하여, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 하룻밤 배양하였다. 도네페질은 NMDA 자극을 가하기 12 시간 전부터 세포에 첨가하였다. 그리고, NMDA 첨가 9 시간 후에 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하여 신경 보호 작용의 지표로 하였다.

본 실시예의 결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5 로부터, 도네페질이 0.1μM 내지 10μM 의 범위에서 용량 의존적으로 신경 세포의 LDH 방출을 억제하고 있는 것을 알 수 있다. 본 실험에 의해, 도네페질은 NMDA 흥분성 독성에 대하여 농도 의존적으로 신경 세포 보호 효과를 나타냄이 분명해졌다.

실시예 3: 흥분성 독성 시험

카인산은, 알츠하이머병의 원인 인자의 하나로 되어 있는 β-아밀로이드 (Aβ) 가 유발하는 신경 세포사를 증강한다고 전해지고 있다. 본 실시예에서는, 카인산을 래트 초대 배양 대뇌 피질 신경 세포에 대하여 공급함으로써 세포 상해를 유발하는 모델을 사용하였다.

본 실시예에 있어서는, 초대 배양 신경 세포는 래트 태아 (태생 17-19 일령) 의 대뇌 피질로부터 얻었다. 세포는 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 배양하였다. 7 일 이상 배양한 후, 배지에 NMDA 또는 카인산을 첨가하여, 37℃, 5%CO₂ 환경 하에서 하룻밤 배양하였다. 도네페질은, 카인산 자극을 가하기 24 시간 전부터 세포에 첨가하였다. 그리고 카인산 첨가 24 시간 후에 배양액 중에 존재하는 LDH 의 양을 측정하여 신경 보호 작용의 지표로 하였다.

본 실시예의 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 으로부터, 도네페질이 0.1μM 내지 1μM 의 범위에서 용량 의존적으로 신경 세포의 LDH 방출을 억제하고 있는 것을 알 수 있다. 본 실험에 의해 도네페질은 카인산 흥분성 독성에 대하여 농도 의존적으로 보호 효과를 나타내는 것이 분명해졌다.

이하의 실시예 4∼7 에 있어서 사용한 시약 및 통계 해석법은 이하와 같다.

Aβ (Human, 1-40) 는 펩티드연(硏) (Osaka, Japan) 으로부터 구입하였다. 트립신 용액(Trypsin solution), 페니실린, 스트렙토마이신, Dulbecco's-modified Eagle's medium (DMEM), HEPES 는 Life Technologies Inc. (Grand Island, NY) 로부터 구입하였다. 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 푸트레신, DNase I, 메카밀라민, 스코폴라민은 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO) 로부터 구입하였다. 우태아혈청과 열-비활성화 말 혈청(heat-inactivated horse serum) 은 Nichirei Co. (Tokyo, Japan) 로부터 구입하였다. ChAT, 미세소관 연관성 단백질-2(microtubule associated protein-2)(MAP2) 는 Chemicon International Inc. (Temecula, CA) 로부터 구입하였다. Alexa Fluor 546 은 Molecular Probes (Eugene, OR) 로부터 구입하였다. Vecstain Elite ABC 키트, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine) (DAB) 키트는 Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) 로부터 구입하였다. Lipofectamine 2000 은 Invitrogen Co. (Carlsbad, CA) 로부터 구입하였다. siRNA 는 닛폰바이오서비스 (Saitama, Japan) 에 합성을 의뢰하였다.

통계 해석의 데이터는 평균치±표준 오차로 표시하였다. 비교 검정은 Welch's t-test 를 사용하였다. p<0.05 를 유의차 있음으로 하였다. 통계 해석 소프트는 SAS 8.1 (SAS Institute Japan Ltd., Tokyo, Japan) 을 사용하였다.

실시예 4: 중격부 신경 세포의 배양 및 콜린 작동성 신경인 것의 확인

중격부 신경 세포는 위스터 래트 (닛폰찰스리버) 의 태아 (태생 18 일령) 로부터 조제하였다. 태아 뇌로부터 중격 부위 (중격부 및 전뇌 기저핵을 포함한다) 를 잘라내고, 0.25% 트립신과 0.2㎎/㎖ DNase I 을 함유하는 Ca² ⁺/Mg² ⁺-함유하지 않은 행크 염평형용액 (Hanks' balanced salt solution) 중에서, 37℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다. 얻어진 세포에, 10% 우태아 혈청, 10% 말 혈청을 첨가한 DMEM (5㎍/㎖ 인슐린 30n㏖/ℓ 아셀렌산 나트륨, 100μ㏖/ℓ 푸트레신, 20n㏖/ℓ 프로게스테론, 15n㏖/ℓ 비오틴, 100units/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1m㏖/ℓ 피부르산 나트륨등을 함유) 를 첨가하여 트립신을 실활시키고, 세포를 2회 세정하였다. 96-웰의 폴리-D-리신 코팅된 배양 플레이트(poly-D-lysine-coated culture plates)에, 1.2×10⁵ 세포/웰의 농도로 세포를 파종했다. 파종한 세포를 CO₂ 인큐베이터 (5%CO₂, 37℃) 에서 배양하였다. 1 일 후, 5% 우태아 혈청을 함유하는 상기 DMEM 에서 배지의 3 분의 2 를 교환하였다. 3 일 후에, 다시 5% 우태아 혈청을 함유하는 상기 DMEM 에서 배지의 3 분의 2 를 교환하였다. 6 일 후에, 혈청을 함유하지 않은 상기 DMEM (단, Gln 은 함유되어 있지 않다) 로 배지를 전량 교환하였다.

이상의 방법으로 배양한 중격부 신경 세포를, 항 콜린아세틸 트랜스페라아제 (ChAT) 항체로 면역 염색하였다. 우선, 배양한 중격부 신경 세포를 중성 포르말린 용액으로 60 분간 고정하였다. 5% 염소 혈청으로 30 분간 인큐베이션한 후, 1% 염소 혈청 존재 하에서 500 배 희석한 ChAT 항체로 1 일간 인큐베이션하였다. 계속해서, 세포를 500 배 희석한 염소 항-토끼(goat anti-rabbit) IgG 및 HRP 라벨된 아비딘-비오틴 복합체(HRP labeled avidin-biotin complex)로 1 시간 인큐베이션한 후, 페록시다제(Peroxidase)의 기질로서 DAB 를 사용하여 세포를 염색하였다.

배양 래트 중격부 신경 세포를 항 ChAT 항체로 면역 염색한 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 의 스케일바는 0.1㎜ 를 나타낸다. 면역 염색에 의해, 배양 래트 중격부 신경 세포의 대부분은 아세틸콜린 합성 효소인 콜린아세틸 트랜스페라아제 (ChAT) 를 갖는 것이 나타났다. 이것은, 배양 래트 중격부 신경 세포가 콜린 작동성 신경인 것을 의미하고 있다. 즉, 당해 세포가 콜린 작동성 신경인 것을 확인할 수 있었다.

지금까지, 알츠하이머 환자의 뇌에 있어서의 콜린아세틸 트랜스페라아제의 감소는, 인지 장애의 중증도와 상관이 있음이 보고되어 있다 (Perry E. K., Tomlinson B.E., Blessed G., Bergman K., Gibson P.H. and Perry R.H. (1978) Correlation of cholinergic abnormalities with senile senile plaques and mental test scores in senile dementia. Br. Med. J.2, 1457-1459.). 따라서, 중격부 신경 세포 상해의 억제 정도는 알츠하이머병 환자에서의 인지 기능 저하 억제로 이어진다고 할 수 있다.

실시예 5: Aβ(1-40) 독성에 대한 도네페질의 보호 효과 및 세포사 실험

세포 장애의 지표로서, LDH (lactate dehydrogenase) 를 측정하였다. 세포에는, 실시예 4 의 배양 방법에 따라서 7 일간 배양한 중격부 신경 세포를 사용하였다. 중격부 신경 세포의 배양 배지에 15μ㏖/ℓ 의 Aβ(1-40) 를 첨가하여, CO₂ 인큐베이터 (5% CO₂, 37℃) 에서 배양하였다. 도네페질 (0.01, 0.1, 1, 10μ㏖/ℓ), 메카밀라민 (10μ㏖/ℓ), 스코폴라민 (10μ㏖/ℓ) 은 Aβ(1-40) 첨가의 24 시간 전에 첨가하였다. Aβ(1-40) 의 첨가 48 시간 후에, 배지 중의 락트산 탈수소 효소(LDH) 활성을 측정하였다. 동시에, 세포를 0.5% TritonX-100 을 함유하는 인산 완충액(phosphate buffer) (pH 7.4) 로 가용화하여, 세포 중의 LDH 도 측정하였다. 전체 LDH (세포내 및 배지 중) 중, 배지 중으로 누출된 LDH 의 양을 계산하여 % 로 나타내었다 (Koh J.Y. and Choi D.W. (1987) Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay. J. Neurosci. Meth.20, 83-90.). 데이터는 ANOVA 및 Welch's t-test 의 해석 수법으로 해석하였다.

결과를 도 8 에 나타낸다. 도 8 중, 백색 칼럼은 Aβ 를 첨가하지 않은 세포를 나타내고, 회색 칼럼은 Aβ 를 첨가한 세포를 나타낸다. 각각의 값을 평균치±S.E.M.(n=23-25) 로 구하여 그래프화하였다. 도 8 의 「*」는 P<0.05, 「**」은 P<0.01, 및 「***」은 P<0.001 인 것을 나타낸다 (「컨트롤 세포(control cells)」을 대조로 한다).

배양한 중격부 신경 세포는 Aβ(1-40) 에 의해 장애를 입기 쉬웠다 (도 8 「컨트롤 세포」). Aβ(1-40) 을 48 시간 첨가했을 때의 독성에 대하여, 도네페질은 0.1μ㏖/ℓ 에서부터 유의하게 보호 효과를 나타내었다 (도 8). 도네페질에 의한 Aβ(1-40) 독성의 억제 효과는, 아세틸콜린 수용체 길항제인 메카밀라민 및 스코폴라민에 의해 저해되지 않았다 (도 8).

다음으로, 상기한 바와 같이 Aβ(1-40) 으로 처치한 배양 마우스 중격부 신경 세포를 항 MAP2 항체로 면역 염색하였다. MAP2 는 신경 세포의 마커로서 사용되고 있다 (Herzog W. and Weber K. (1978) Fractionation of brain microtubule-associated proteins. Isolation of two diffrent proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro. Eur J Biochem. 92(1), 1-8). MAP2 염색은, 상기 실시예 4 의 면역 염색의 방법에 준하여 실시하고, 중격부 신경 세포에 15μ㏖/ℓ 의 Aβ(1-40) 을 48 시간 첨가 후, 세포를 고정하여 면역 염색하였다. 도네페질은 Aβ(1-40) 첨가의 24 시간 전부터 첨가하였다. 세포를 고정한 후, 300 배로 희석한 항 MAP2 항체로 1 일간 인큐베이션하고, Alexa Fluor 546 을 형광 기질로서 사용하여 검출하였다.

결과를 도 9 에 나타낸다. 스케일바는 0.1㎜ 를 나타낸다. A 는 Aβ(1-40) 을 첨가하지 않은 컨트롤 세포를 나타낸다. B 는 Aβ(1-40) 을 첨가한 세포를 나타낸다. C, D, E 는 각각 Aβ(1-40) 과 도네페질 (0.1, 1, 10μ㏖/ℓ) 을 첨가한 세포를 나타낸다. 좌측의 사진은 호프만 모듈레이션(Hoffman modulation)에 의한 명(明)시야의 사진이다. 우측의 사진은 형광 사진이다. Aβ(1-40) 을 48 시간 첨가하면, MAP2 로 염색되는 신경 세포가 감소했다 (도 9B). 도네페질은, Aβ(1-40) 에 의한 MAP2 염색 세포의 장애를 억제하는 것이 인정되었다 (도 9).

실시예 6: Aβ(1-40) 의 응집에 대한 도네페질의 효과

배양액 중에서의 Aβ(1-40) 의 구조 상태를 검토하기 위해 CD 스펙트럼을 측정하였다. Aβ 는 β-시트 구조를 취하면 Aβ 섬유의 덩어리를 형성하기 쉬워지고, 독성을 나타내는 것이 알려져 있다 (Howlett D.R., Jennings K.H., Lee D.C., Clark M.S., Brown F., Wetzel R., Wood S.J., Camilleri P. and Roberts G.W. (1995) Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloid peptide. Neurodegeneration .4, 23-32.). 또한, Aβ(1-40) 이 α-헬릭스 구조 또는 β-시트 구조를 취하면, 205㎚ 내지 225㎚ 에서의 CD (circular dichroism) 스펙트럼이 감소하는 것이 알려져 있다 (Sreerama N., Venyaminov S.Y. and Woody R.W. (2000) Estimation of peptide secondary structure from circular dichroism spectra: inclusion of denatured peptides with native peptides in the analysis. Anal. Biochem. 287, 243-251, Bokvist M., Lindstrom F., Watts A. and Grobner G. (2004) Two types of Alzheimer's beta-amyloid (1-40) peptide membrane interactions: aggregation preventing transmembrane anchoring versus accelerated surface fibril formation. J. Mol. Biol. 335, 1039-49.). 특히, β-시트 구조의 형성은 215㎚ 주변의 CD 스펙트럼을 감소시키는 것이 알려져 있다. 그래서, Aβ 의 응집의 지표로서 CD 를 측정하였다.

배양한 중격부 신경 세포에 15μ㏖/ℓ 의 Aβ(1-40) 을 첨가하고, 첨가 48 시간 후에 배지를 채취하여 215㎚∼260㎚ 의 CD 스펙트럼을 측정하였다. CD 스펙트럼 측정에는 JASCO (닛폰분꼬, J-720WI) 를 사용하였다.

결과를 도 10 에 나타낸다. A 는 도네페질을 첨가하지 않은 세포를 나타낸다. B 는 도네페질 (10μM) 을 첨가한 세포를 나타낸다. 실선은 Aβ 를 첨가하지 않은 세포, 파선은 Aβ 를 첨가한 세포를 나타낸다. 또한, A2 및 B2 는, 각각 A 및 B 그래프의 파선의 값으로부터 실선의 값을 뺀 것을 나타내었다. 10μ㏖/ℓ 의 도네페질 첨가에 의해, 215㎚ 내지 225㎚ 에서 CD 스펙트럼의 감소가 억제되었다. 따라서, 본 실시예에 의해, Aβ 가 α-헬릭스 구조 또는 β-시트 구조를 형성하는 것을 도네페질이 억제하는 것이 개시되었다.

실시예 7: siRNA 의 세포내 아세틸콜린 활성에 대한 효과 및 Aβ(1-40) 독성에 대한 보호 효과

(1) siRNA 처리

아세틸콜린 에스테라아제의 2 쇄 siRNA 로서 하기한 2 조의 올리고뉴클레오티드 ((ⅰ) 및 (ⅱ)) 를 사용하였다.

(ⅰ) ; 5'-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3' (서열번호 1),

5'-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3' (서열번호 2) 및

(ⅱ) ; 5'-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3' (서열번호 3),

5'-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3' (서열번호 4).

중격부 신경 세포의 배양 6 일째와 7 일째에, 1μ㏖/ℓ 의 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 의 siRNA 와 lipofectamine 2000 (0.4㎕/㎖) 을 배지 중에 첨가하였다. 배양 9 일째에 세포를 가용화하여, 세포내의 아세틸콜린 에스테라아제 활성 (AChE 활성) 을 측정하였다.

(2) 아세틸콜린 에스테라아제 활성의 측정

아세틸콜린 에스테라아제 활성은, Ellman 들의 방법에 따라서 측정하였다 (Ellman G.L., Courtney K.D., Anders V.J., Feafher-Stone R.M. (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95). 세포를 0.5% Triton X-100 을 함유하는 인산 완충액 (pH 8.0) 으로 가용화하였다. 얻어진 세포 가용화 용액을 원심 분리하고, 상청을 인산 완충액 (pH 8.0) 으로 3 배 희석하였다. 희석한 상등액에, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))(0.33m㏖/ℓ)와 요오드화아세틸티오콜린(acetylthiocholine iodide) (AthCh) (0.5m㏖/ℓ) 를 첨가하여, 교반한 후, 412㎚ 에서의 흡광도의 증가를 측정하였다 (Molecular Devices, SpectraMax 190EXT). 데이터는 ANOVA 와 Welch's t-test 에 의해 해석하였다.

결과를 도 11 에 나타낸다. 각각의 값을 평균치±S.E.M. (n=11) 의 형식으로 그래프화하였다 (n=11). 도 11 중, siRNA 무첨가 세포에 대하여, 「**」는 P<0.01 을, 「***」는 P<0.001 인 것을 나타낸다.

2 종류의 siRNA (ⅰ) 및 (ⅱ) 를 검토한 결과, 모두 AChE 활성의 억제 효과가 인정되었다 (도 11).

(3) Aβ(1-40) 독성에 대한 siRNA 의 보호 효과

세포 장애의 지표로서 LDH (lactate dehydrogenase) 를 측정하였다. 중격부 신경 세포에 15μ㏖/ℓ 의 Aβ(1-40) 을 배양 7 일째에 첨가하여, 48 시간 인큐베이트하였다. 1μ㏖/ℓ 의 siRNA 는 Aβ(1-40) 첨가 24 시간 전과 직전에 첨가하였다. 백색 칼럼은 Aβ(1-40) 을 첨가하지 않은 세포를 나타낸다. 회색 칼럼은 Aβ(1-40) 을 첨가한 세포를 나타낸다. 데이터는 ANOVA 와 Welch's t-test 에 의해 해석하였다.

결과를 도 12 에 나타낸다. 각각의 값을 평균치±S.E.M. 의 형식으로 그래프화하였다 (n=7). 도 12 중, siRNA 무첨가 세포에 대하여, 「***」는 P<0.001 인 것을 나타낸다.

상기 2 종류의 siRNA ((ⅰ) 및 (ⅱ)) 의 효과를 검토한 결과, 모두 Aβ 독성을 억제하였다 (도 12).

LDH 의 측정과 병행하여, Aβ 의 응집을 215㎚∼260㎚ 에 있어서의 CD 스펙트럼의 변화에 의해 해석하였다.

결과를 도 13 에 나타낸다. A 는 RNAi 를 첨가한 세포를 나타낸다. 실선은 Aβ 를 첨가하지 않은 세포, 파선은 Aβ 를 첨가한 세포를 나타낸다. B 는, A 의 파선의 값으로부터 실선의 값을 뺀 값을 나타낸다. siRNA 의 첨가에 의해 CD 스펙트럼의 215㎚ 내지 225㎚ 의 감소가 억제되었다 (도 13).

본원발명에 관련된 신경 세포 보호제는, 허혈성의 세포 상해 및 흥분성 독성에 의한 상해에 대하여 신경 세포 보호적으로 기능한다. 따라서, 본원발명에 관련된 신경 세포 보호제에 의해서 뇌경색이나 뇌혈전 등에 의해 유발되는 허혈성 신경 세포사 및 흥분성 독성에 의해 유발되는 신경 세포사를 방지, 억제할 수 있다.

서열표 프리 텍스트

서열번호 1: siRNA

서열번호 2: siRNA

서열번호 3: siRNA

서열번호 4: siRNA

<110> Eisai Co., Ltd. <120> Neurocyte-protective agent <130> G05-0066KR <150> JP 2003-167744 <151> 2003-06-12 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 1 aaugucagug acucuguuut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 2 aaacagaguc acugacauut t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 3 gcugccucaa gaaaguauct t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 4 gauacuuucu ugaggcagct t 21

Claims

이하의 (ⅰ)∼(ⅶ) 로 나타내는 화합물 중 어느 하나를 함유하는, 중추 신경계의 신경 세포 보호제.

(ⅰ) 하기 화학식으로 나타내는 1-벤질-4-[(5,6-디메톡시-1-인다논)-2-일]메틸피페리딘 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅱ) 다음 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J 는 하기 식

(식 중, S 는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 할로겐 원자 또는 수산기를 의미한다. t 는 0 또는 1∼4 의 정수를 의미한다. 또 (S)_t 는 결합하고 있는 페닐환의 이웃하는 탄소 사이에서 메틸렌디옥시기 또는 에틸렌디옥시기를 형성하고 있어도 된다. 식 (l) 에서의 Y 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미하고, 식 (k) 에서의 V 는 수소 원자 또는 탄소 수 1∼6 의 저급 알콕시기, 식 (n) 에서의 W¹ 및 W² 는, 서로 독립하여, 동일하거나 또는 다르며, 수소 원자, 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, W³ 은 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미한다. 식 (a)∼(e), (g), (j), (l) 및 (q) 에 있어서의 페닐환 A 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 된다.) 으로 나타내는 기로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기를 의미한다. B 는 식 -(CHR²)_n- (식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수, R² 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. K 는 치환기로서, 할로겐화되어 있어도 되는 탄소수 1∼6 의 알킬기, 탄소수 1∼6 의 알콕시기, 니트로기, 할로겐 원자, 카르복실기, 벤질옥시기, 탄소수 1∼6 의 알콕시카르보닐기, 아미노기, 탄소수 1∼6 의 모노알킬아미노기, 탄소수 1∼6 의 디알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬아미노카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬카르보닐옥시기, 수산기, 포르밀기 또는 알콕시 (탄소수 1∼6) 알킬 (탄소수 1∼6) 기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬기를 의미한다.

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.

(ⅲ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅳ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅴ) 다음의 일반식 (Ⅰ-1) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J^1-1 은 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 (이하 간단하게 저급 알킬기라고 한다); 시클로헥실기; 치환기로서 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기 (이하 간단하게 저급 알콕시기라고 한다), 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐기, 피리딜기 또는 피라질기; 식

(식 중, G 는 식
으로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기, 식 -O- 로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기, 식 -CH₂-O- 로 나타내는 기, 식 -CH₂-SO₂- 로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기 또는 식
으로 나타내는 기를 의미한다. E 는 탄소 원자 또는 질소 원자를 의미한다.)

으로 나타내는 기; 퀴놀릴기; 퀴녹살릴기; 푸릴기 또는 식 R¹-CH=CH- (식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 저급 알콕시카르보닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. B 는 식 -(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -NR²-(CH₂)_n- (식 중, R² 는 수소 원자, 저급 알킬기, 페닐기 또는 저급 알킬술포닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -CONR³- (CH₂)_n- (식 중, R³ 은 수소 원자, 저급 알킬기, 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 할로겐 또는 수산기를 가져도 되는 페닐기, 벤질기 또는 피리딜기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -NH-CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CH₂-CO-NH-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CO-CH₂-CH(OH)-CH₂- 으로 나타내는 기, 식 -CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -C(OH)-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기 또는 식 -CO-CH=CH-CH₂- 으로 나타내는 기 (이상의 식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수를 의미한다) 를 의미한다. T¹ 은 탄소 원자를 의미한다. K 는 페닐기가 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬 (알킬의 탄소수 1∼2) 기; 신나밀기; 저급 알킬기; 피리딜메틸기; 시클로알킬 (시클로알킬의 탄소수 3∼6) 알킬기; 아다만탄메틸기; 푸르푸릴기: 탄소수 3∼6 의 시클로알킬기 또는 아실기를 의미한다. q 는 1 또는 2 를 의미한다.

(ⅵ) 다음의 일반식 (Ⅰ-2) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J¹ ^-2 는 치환기로서 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기를 가져도 되는 인다노닐기를 의미한다. T² 는 질소 원자를 의미한다. B, K 및 q 는 상기한 의미를 갖는다.]

(ⅶ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.
제 1 항에 있어서, 염이 염산염인 보호제.
이하의 (ⅰ)∼(ⅶ) 로 나타내는 화합물 중 어느 하나를 함유하는, 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방제 및/또는 치료제.

(ⅰ) 하기 화학식으로 나타내는 1-벤질-4-[(5,6-디메톡시-1-인다논)-2-일]메틸피페리딘 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅱ) 다음 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J 는 하기 식

(식 중, S 는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, 할로겐 원자 또는 수산기를 의미한다. t 는 0 또는 1∼4 의 정수를 의미한다. 또 (S)_t 는 결합하고 있는 페닐환의 이웃하는 탄소 사이에서 메틸렌디옥시기 또는 에틸렌디옥시기를 형성하고 있어도 된다. 식 (l) 에서의 Y 는 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미하고, 식 (k) 에서의 V 는 수소 원자 또는 탄소 수 1∼6 의 저급 알콕시기, 식 (n) 에서의 W¹ 및 W² 는, 서로 독립하여, 동일하거나 또는 다르며, 수소 원자, 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기, W³ 은 수소 원자 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기를 의미한다. 식 (a)∼(e), (g), (j), (l) 및 (q) 에 있어서의 페닐환 A 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 알콕시기에 의해 치환되어 있어도 된다.) 으로 나타내는 기로부터 선택된 1 가 또는 2 가의 기를 의미한다. B 는 식 -(CHR²)_n- (식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수, R² 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =(CH-CH=CH)_b- (식 중, b 는 1∼3 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 =CH-(CH₂)_c- (식 중, c 는 0 또는 1∼9 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기, 또는 식 =(CH-CH)_d= (식 중, d 는 0 또는 1∼5 의 정수를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. K 는 치환기로서, 할로겐화되어 있어도 되는 탄소수 1∼6 의 알킬기, 탄소수 1∼6 의 알콕시기, 니트로기, 할로겐 원자, 카르복실기, 벤질옥시기, 탄소수 1∼6 의 알콕시카르보닐기, 아미노기, 탄소수 1∼6 의 모노알킬아미노기, 탄소수 1∼6 의 디알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬아미노카르보닐기, 탄소수 1∼6 의 알킬카르보닐옥시기, 수산기, 포르밀기 또는 알콕시 (탄소수 1∼6) 알킬 (탄소수 1∼6) 기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬기를 의미한다.

는 단결합 또는 이중 결합을 의미한다.

(ⅲ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅳ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

(ⅴ) 다음의 일반식 (Ⅰ-1) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J^1-1 은 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 (이하 간단하게 저급 알킬기라 고 한다); 시클로헥실기; 치환기로서 저급 알킬기, 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기 (이하 간단하게 저급 알콕시기라고 한다), 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐기, 피리딜기 또는 피라질기; 식

(식 중, G 는 식
으로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기, 식 -O- 로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기, 식 -CH₂-O- 로 나타내는 기, 식 -CH₂-SO₂- 로 나타내는 기, 식
으로 나타내는 기 또는 식
으로 나타내는 기를 의미한다. E 는 탄소 원자 또는 질소 원자를 의미한다.)

으로 나타내는 기; 퀴놀릴기; 퀴녹살릴기; 푸릴기 또는 식 R¹-CH=CH- (식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 저급 알콕시카르보닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기를 의미한다. B 는 식 -(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -NR²-(CH₂)_n- (식 중, R² 는 수소 원자, 저급 알킬기, 페닐기 또는 저급 알킬술포닐기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -CONR³-(CH₂)_n- (식 중, R³ 은 수소 원자, 저급 알킬기, 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 할로겐 또는 수산기를 가져도 되는 페닐기, 벤질기 또는 피리딜기를 의미한다) 으로 나타내는 기, 식 -NH-CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CH₂-CO-NH-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -CO-CH₂-CH(OH)-CH₂- 으로 나타내는 기, 식 -CO-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기, 식 -C(OH)-(CH₂)_n- 으로 나타내는 기 또는 식 -CO-CH=CH-CH₂- 으로 나타내는 기 (이상의 식 중, n 은 0 또는 1∼10 의 정수를 의미한다) 를 의미한다. T¹ 은 탄소 원자를 의미한다. K 는 페닐기가 치환기로서 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 할로겐, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노기, 모노 저급 알킬아미노기, 디 저급 알킬아미노기, 카르바모일기, 탄소수 1∼6 의 지방족 포화 모노 카르복실산으로부터 유도되는 아실아미노기, 시클로헥실옥시카르보닐기, 저급 알킬아미노카르보닐기, 저급 알킬카르보닐옥시기, 할로겐화 저급 알킬기, 수산기, 포르밀기 또는 저급 알콕시 저급 알킬기를 가지고 있어도 되는 페닐알킬 (알킬의 탄소수 1∼2) 기; 신나밀기; 저급 알킬기; 피리딜메틸기; 시클로알킬 (시클로알킬의 탄소수 3∼6) 알킬기; 아다만탄메틸기; 푸르푸릴기: 탄소수 3∼6 의 시클로알킬기 또는 아실기를 의미한다. q 는 1 또는 2 를 의미한다.

(ⅵ) 다음의 일반식 (Ⅰ-2) 로 나타내는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, J¹ ^-2 는 치환기로서 탄소수 1∼6 의 저급 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 저급 알콕시기를 가져도 되는 인다노닐기를 의미한다. T² 는 질소 원자를 의미한다. B, K 및 q 는 상기한 의미를 갖는다.]

(ⅶ) 하기 식으로 나타내는 화합물군으로부터 선택되는 환형 아민 유도체 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염.
제 3 항에 있어서, 염이 염산염인 예방제 및/또는 치료제.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 뇌허혈, 흥분성 독성 또는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것인 예방제 및/또는 치료제.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나에 수반되는 뇌허혈, 흥분성 독성에 의해서 유발되는 것인 예방제 및/또는 치료제.
제 6 항에 있어서, 흥분성 독성이 NMDA 또는 카인산에 의한 것인 예방제 및/또는 치료제.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 알츠하이머병 또는 다운 증후군에 수반되는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것인 예방제 및/또는 치료제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뇌 유래의 성숙한 신경 세포인 제.
제 9 항에 있어서, 신경 세포가, 대뇌 피질, 중격부 및 해마로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 유래하는 것인 제.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 신경 세포가, 초대 배양 세포인 제.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 보호제 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 기재된 예방제 및/또는 치료제를 함유하는, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나의 질병의 예후 개선제.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 보호제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 중추 신경계의 신경 세포 보호 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 기재된 예방제 및/또는 치료제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 방법 및/또는 치료 방법.
제 14 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 뇌허혈, 흥분성 독성 또는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것인 방법.
제 15 항에 있어서, 흥분성 독성이 NMDA 또는 카인산에 의한 것인 방법.
제 14 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나에 수반되는 뇌허혈 또는 흥분성 독성에 의해서 유발되는 것인 방법.
제 14 항에 있어서, 신경 세포 장애가, 알츠하이머병 또는 다운 증후군에 수반되는 Aβ 독성에 의해서 유발되는 것인 방법.
제 12 항에 기재된 예후 개선제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중, 뇌경색 또는 뇌색전 중 어느 하나의 질병의 예후 개선 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 보호제, 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 예방제 및/또는 치료제, 그리고 제 12 항에 기재된 예후 개선제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제를 제조하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 나타낸 화합물의 용도.
중추 신경계의 콜린 작동성 신경 세포에, Aβ 존재 하에 후보 화합물을 작용시켜, Aβ 응집량을 검출 또는 측정하는 것을 특징으로 하는, Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법.
제 21 항에 있어서, Aβ 응집량의 검출 또는 측정 결과를 사용하여, 후보 화합물이 Aβ 응집 억제 작용을 갖는지 여부를, 후보 화합물의 비존재 하에서의 Aβ 응집량과 비교함으로써 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항 또는 제 22 항에 기재된 방법에 사용하기 위한, Aβ 응집 억제 작용을 갖는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트.
중추 신경계의 콜린 작동성 신경 세포에, Aβ 존재 하에 후보 화합물을 작용 시켜, 세포 상해 또는 세포사를 검출하는 것을 특징으로 하는, Aβ 독성에 의해서 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 방법.
제 24 항에 있어서, 세포 상해 또는 세포사의 검출 결과를 사용하여, 후보 화합물이 Aβ 독성에 대한 세포 보호 작용을 갖는지 여부를, 후보 화합물의 비존재 하에서의 세포 상해 또는 세포사의 정도와 비교함으로써 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 세포 상해 또는 세포사의 검출이, 락트산 탈수소 효소의 농도 측정에 의한 것 또는 MTT 분석에 의한 것인 방법.
제 24 항 또는 제 25 항에 기재된 방법에 사용하기 위한, Aβ 독성에 의해서 유발되는 중추 신경계의 신경 세포 장애의 예방 및/또는 치료에 유효한 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 스크리닝 키트.