CN102159190A - 化疗剂的口服制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化疗剂的新口服制剂、它们的制备方法及它们的治疗用途。更具体地，所述发明涉及纳米颗粒，其包含至少一种作为活性成分的化疗剂、至少一种聚合物以及至少一种能够与所述喜树碱衍生物复合的环状低聚糖，所述纳米颗粒用于治疗性口服给药。

Description

化疗剂的口服制剂

发明领域

本发明涉及化疗剂的新口服制剂、它们的制备方法及它们的治疗用途。

发明背景

癌症的特征在于伴随恶性行为的不可控细胞生长：侵袭和转移。癌症是大多数工业国家中死亡的主要原因。可以使用不同的癌症治疗方法：化疗、放疗、手术、免疫疗法和激素疗法。

化疗可以定义为使用细胞毒性药物(也称为“化疗剂”)来治疗癌症。概括地，大多数化疗剂通过破坏有丝分裂(细胞分裂)或DNA合成来发挥作用，从而有效地靶向快速分裂的细胞。由于这些药物对细胞造成损害，所以它们被命名为“细胞毒性的”。

化疗剂最经常为肠胃外，特别是静脉内(i.v.)递送。卡培他滨、替加氟和诺维本是仅有的少数口服给药的化疗剂的实例。静脉内化疗可以根据药物和要治疗的癌症类型，随不同量的时间进行。例如，可以将用于化疗的每个进程的药物以如下方式给予患者：

·在几分钟内注射入静脉，

·在从30分钟至几小时的任何时间内通过滴注器(静脉内输注)，

·在2天或更多天内通过滴注器或泵，

通过患者不得不携带数周或数月的泵；在数周或数月内给予化疗称为“连续输注”。其又称为“持续静脉输入”(PVI)或“移动输注”(这意味着患者必须带着泵行动)。

如果化疗治疗只持续几小时，那么患者通常不得不在医院度过一天以从医生或经过专门培训的护士那里接受适当的治疗。如果治疗花费的时间超过几小时，则患者经常需要进入医院的病房。

因此，化疗剂的肠胃外给药与包括诸如疼痛或针注射恐惧的患者不适在内的某些不利情况和缺陷相关。由于患者不能自己给予化疗剂，所以他需要到医生办公室进行药物给药，很明显患者不方便。

因此，化疗剂的口服给药表现出一些优势，如患者的偏好、方便、减少的住院期以及卫生保健工作人员减少的细胞毒性暴露风险。

WO 99/43359公开了包含至少(i)一种聚合物、(ii)一种环状低聚糖以及(iii)一种活性成分的纳米颗粒。据描述这些纳米颗粒允许药物的缓释(控释)(Maincent P and al.“Preparation and in vivo studies of a new drug delivery system.Nanoparticles of alkylcyanoacrylate”，Appl.Biochem.Biotechnol.1984；10：263-5)，并且具有生物粘附性质，特别是在胃肠道中(Ponchel G and al.“Specific and non-specific bioadhesive particulate systems for oral delivery to the gastrointestinal tract”，Adv Drug Deliv Rev.1998Dec 1；34(2-3)：191-219)。所述纳米颗粒在下文称为“缓释纳米颗粒”(“SRN”)。

本发明人惊讶地发现含有化疗剂的SRN适合于口服给药(下文称为“本发明的口服制剂”)。

除了口服给药的一些通常优势(例如，患者的偏好、方便、减少的住院期以及卫生保健工作人员减少的细胞毒性暴露风险)之外，可以确认更多的具体优势。事实上，本发明的口服制剂允许克服静脉内或口服给予化疗剂的限制。

化疗由于其对非肿瘤细胞的细胞毒性可以使患者身体疲惫。取决于化疗剂，目前的静脉内或口服的化疗治疗存在一些副作用。常见的副作用包括疼痛、恶心和/或呕吐、腹泻或便秘、贫血、营养不良、脱发、记忆丧失、免疫系统衰退、由此(可能致命)的感染和脓毒症、脱水、眩晕、血肿、口干症/口腔干燥、心理社会压力、体重减轻或增加、水潴留、出血、肾损害、继发性肿瘤、心脏毒性、肝毒性、肾毒性、神经毒性、阳萎、耳毒性……。

本发明人惊讶地发现本发明的口服制剂可以减少化疗剂的副作用并因此可以改善它们的耐受性。

此外，与静脉内途径相比，口服化疗治疗的开发受其不合适的生物利用度所限。生物利用度是治疗活性药物到达体循环及在作用部位可用的速率和程度的度量。本发明人还证实本发明的口服制剂改善了化疗剂的生物利用度。

表现本发明的口服制剂的优势的一些非限制性实例在下面给出。

喜树碱(CPT)是从喜树(Camptotheca acuminata)(喜树属(Camptotheca)，喜树(Happy tree))分离的水溶性细胞毒性喹啉生物碱家族，喜树是原生于中国和西藏的树。喜树碱抑制DNA酶拓扑异构酶I。拓扑异构酶I是一种与扭转拉伸的超螺旋双链DNA非共价结合的核内酶，其在DNA分子中产生瞬间的单链断裂(命名为“可裂解复合物”)。这允许在复制、转录、重组以及其他DNA功能的过程中完整的互补DNA链通过。称为可裂解复合物的该酶-桥接DNA断裂随后通过拓扑异构酶I酶重接(reseal)。所述酶的解离恢复完整的新松弛DNA双螺旋。

CPT使拓扑异构酶I分子与游离的DNA 3′-磷酸酯之间的可裂解复合物稳定。所得的酶-连接DNA断裂诱发细胞毒性。在过去，CPT经常称为拓扑异构酶I抑制剂。然而，它不是经典的酶抑制剂，因为它不是直接改变拓扑异构酶I的功能，而是将该正常的内源蛋白转变为细胞毒素。因此，CPT经常优选地称为拓扑异构酶I毒物(Bomgaars and al.(2001)Oncologist6(6)：506-16)。

CPT在初步临床试验中表现出抗癌活性，且两种CPT类似物已被批准并用于癌症化疗：(i)伊立替康(CPT-11)，由UpJohn(现在为Pfizer)以开普拓或Camptosar出售；以及(ii)托泊替康，由Smith Kline&Beecham(现在为GSK)以Hymcamptamin、Hycamptin或Thycantin出售(Ulukan and al.(2002)Drugs 62(2)：2039-2057)。其他CPT类似物包括hexatecan、silatecan、勒托替康(lutortecan)、karenitecin(BNP1350)、吉马替康(ST1481)、贝洛替康(CKD602)或它们的药学可接受的盐。然而，CPT类似物呈现出诸如低溶解度和不良反应的重大缺陷。

伊立替康(“IRN”或“CPT-11”或“盐酸伊立替康”)是喜树碱的半合成类似物且是在转移性结肠直肠癌中具有主要适应症的公知抗癌化疗剂。它还被研究用于治疗肺癌、胃癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、头颈癌、脑癌和卵巢癌。

伊立替康是前药，其在肝、肠道和一些肿瘤中由羧酸酯酶转变为其活性代谢物SN-38(7-乙基10-羟基喜树碱)。SN-38比伊立替康更有效100倍至1,000倍。SN-38随后由尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)通过葡糖醛酸化灭活，以形成SN-38葡糖苷酸(SN-38G或7-乙基-10-[3，4，5-三羟基-吡喃-2-羧酸]喜树碱)(Kawato et al.，1991 Cancer Chemother Pharmacol 28(3)：192-8；Takasuna et al.，Cancer Res(1996)56(16)：3752-7；Slatter et al.，1997 MetabDispos 25(10)：1157-64))。

伊立替康的缺陷是严重的不良反应和明显的严重腹泻以及极度的免疫系统抑制。伊立替康相关的腹泻可能是临床上显著的，有时导致严重的脱水，需要住院治疗或进入重症监护病房。伊立替康相关的免疫系统抑制导致血液中白细胞，特别是嗜中性粒细胞计数急剧下降。当产生嗜中性粒细胞的骨髓加速生产来补偿时，患者可能经历一段时期的嗜中性粒细胞减少，即：临床上血液中缺少嗜中性粒细胞。

伊立替康的效力已知为剂量依赖性的，并且还证实为是方案依赖性的，并且长期低剂量给药比短期高剂量给药方案更有效且毒性更小(Houghton，P.J.et al.“Efficacy of Topoisomerase I Inhibitors Topotecan and Irinotecan administered at Low Dose Levels in Protracted Schedules to Mice Bearing Xenografts of Human Tumors”Cancer Chemother.Pharmacol.(1995)，36，393-403；Thompson，J.et al.“Efficacy of Systemic Administration of Irinotecan Against Neuroblastoma Xenografts”Clin.Cancer Res.(1997)，3，423-432；Furman WL and al.，“Direct translation of a protracted irinotecan schedule froma xenograft model to a phase I trial in children”Journal of clinical oncology(1999)，17，1815-1824)。

延长暴露的一种有效方式是利用口服途径。除了口服给药的一些通常优势(例如，患者的偏好、方便、减少的住院期以及卫生保健工作人员减少的细胞毒性暴露风险)之外，可以举出更多的具体优势。事实上，与i.v.给药相比，口服给药后总SN-38比总伊立替康的代谢率更高(Gupta E and al.。Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of the topoisomerase inhibitor irinotecan in cancer patients.J Clin Oncol 1997；15：1502-10)。

因此，亟需开发会提高生物利用度并改善副作用的喜树碱衍生物口服制剂。直到最近，游离喜树碱衍生物的口服给药及口服IRN制剂的开发受缺乏耐受性，特别是严重腹泻所限。此外，据报导伊立替康的口服生物利用度与其i.v.生物利用度相比仅为约20％。因此，在口服递送作为治疗选择成为可用之前，需要克服伊立替康的吸收和系统前(presystemic)代谢的严重问题。

因此期望提供允许耐受且生物可利用的口服给药的伊立替康新制剂。

本发明人惊讶地发现含有喜树碱衍生物的SRN(“喜树碱-SRN”)适合于喜树碱衍生物的口服给药。它们已令人惊讶地表明口服给予喜树碱-SRN比静脉内和口服给予游离喜树碱耐受性更好且没有损失抗肿瘤效力。此外，与静脉内或口服给予游离喜树碱溶液相比，口服给予喜树碱-SRN增加了其生物利用度。因此SRN与喜树碱衍生物结合，例如但不只是与伊立替康结合(伊立替康-SRN)是极为有利的。

事实上，喜树碱-SRN以不明显的方式允许活性成分的口服给药和缓释，这有助于改善其生物利用度并减少其副作用。SRN在肠粘膜上的生物粘附增加了停留时间并因此增强了活性成分的缓释。

此外，改善伊立替康在胃肠道中的停留时间允许更多的伊立替康转变为其活性代谢物SN38。特别地，据发现IRN-SRN能够有效地保护活性剂免于诸如胃肠环境中的pH-依赖性降解。因此，伊立替康的内酯形式受到保护免于转变为其非活性形式(羧酸酯)，这通常会在口服给药时发生，因为IRN和SN38在肠pH(pH 5.5至7)下是不稳定的。

纳米颗粒可能是不充分浓缩的且会迫使患者吞咽太多体积的SRN。因此本发明的口服制剂有利地浓缩为适合于口服给予患者的体积。

本发明人已确定称为冷冻干燥的冻干方法来克服此缺陷。特别地，他们还确定了适合于所述冷冻干燥方法的化疗剂-SRN的制剂。冷冻干燥方法和所述制剂是本发明的进一步的目的。它们特别适于工业化。

多柔比星(也称为羟基柔红霉素)是用于癌症化疗的水溶性药物。其是蒽环类抗生素，与天然产物柔红霉素密切相关。多柔比星通常用于治疗某些白血病、霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、多发性骨髓瘤和其他癌症。

已知多柔比星通过嵌入并抑制大分子生物合成来与DNA相互作用。这抑制了解开DNA以用于转录的酶拓扑异构酶II的进展。多柔比星使拓扑异构酶II复合物在其断裂DNA链以用于复制之后稳定，这防止DNA双螺旋重接并由此停止复制过程。

多柔比星的急性副作用可以包括恶心、呕吐和心律失常。其还可能引起嗜中性粒细胞减少(白细胞减少)以及全秃发(脱发)。当多柔比星的累积剂量达到550mg/m²时，发展包括充血性心力衰竭、扩张型心肌病和死亡在内的心脏副作用的风险大大增加。多柔比星的心脏毒性的特征在于线粒体的氧化磷酸化的剂量依赖性减少。通过多柔比星与铁的相互作用所产生的反应性氧化合物随后可损伤肌细胞(心肌细胞)，引起肌原纤维损失和细胞质空泡形成。另外，一些患者可能发展特征在于手的手掌或脚的脚底上的皮疹，肿胀、疼痛和红斑的掌足红肿疼痛(erythrodysesthesia)或“手-足综合征”。多柔比星还可能引起乙型肝炎病毒的再激活。

多柔比星仅静脉内给予患者。因此，亟需多柔比星的口服制剂。多柔比星口服制剂受多柔比星对胃肠道的毒性(坏死)作用所限。此外，多柔比星的口服效力受胃肠道中的系统前灭活所限，这导致不合适的生物利用度。事实上，多柔比星的口服生物利用度与其i.v.生物利用度相比仅为约5％。本发明人令人惊讶地证实本发明的多柔比星口服制剂有良好的耐受性且通过本发明的口服制剂应当改善多柔比星的生物利用度。

紫杉醇和多西他赛是用于癌症化疗的疏水有丝分裂抑制剂。它们共同属于紫杉烷类。紫杉醇仍然通过从天然来源分离来生产，而紫杉醇的半合成类似物多西他赛则是由10-脱乙酰浆果赤霉素合成的。紫杉醇与多西他赛的区别在于10位的乙酰化的羟基官能团和在丙酸苯酯侧链上是苯甲酰基部分而不是叔丁基。因此，紫杉醇和多西他赛具有非常接近的化学式和物理化学性质。紫杉烷类的作用机理基于这样的能力，即它们与微管蛋白的β亚基结合，干扰微管的解聚，从而破坏分裂的细胞。这样的作用特性在肿瘤学中广泛使用以治疗不同的实体瘤，特别是卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱、头颈癌。

常见的副作用包括恶心和呕吐、食欲不振、味觉改变、头发稀疏或脆发、持续2-3天的手臂或腿的关节疼痛、指甲颜色改变、手或脚趾的麻刺感。还可能出现更严重的副作用，例如异常损伤或出血、注射部位的疼痛/发红/肿胀、超过2天的正常大便习惯改变、发烧、发冷、咳嗽、咽喉痛、吞咽困难、眩晕、呼吸急促、极度疲倦、皮疹、面部潮红和胸痛。许多这些副作用与所用的赋形剂乳浮EL有关，其是聚氧乙基化蓖麻油。对诸如环孢素、替尼泊苷的药物和含有聚氧乙基化蓖麻油的药物的过敏反应可以表明增加的紫杉醇副作用的风险。

紫杉醇和多西他赛具有较差的口服生物利用度。稀缺的水溶性也使得不可能使用紫杉烷类的口服溶液。事实上，水分散性是必须克服以制备用于诸如紫杉醇或多西他赛的疏水药物的口服剂型的核心问题。因此，静脉内(i.v.)输注是唯一的给药方式。现在三种静脉内药物组合物是可商购的：

-

(有效成分：紫杉醇)基于一种聚乙氧基化蓖麻油以87∶1的重量比重量(w/w)比溶解紫杉醇的能力。其是第一种商业化的紫杉烷制剂，开创了在肿瘤学中使用紫杉烷的时代。然而，后来发现

是在

输注期间的超敏反应的原因，并且为了降低这些反应的发生和严重性，使用组胺阻断剂和糖皮质激素的前驱用药及连续输注方案成为常规作法。

-

是由40mg/mL-1多西他赛和1040mg/mL-1聚山梨酯80(吐温80)配制而成的，聚山梨酯80是低摩尔质量的表面活性剂，由连接到烃段的非离子极性基团构成，其主要组分是具有类似于聚乙二醇的结构的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。这使其高度溶解于水。从I期临床试验中观察到静脉内给予这种制剂伴随有从轻度瘙痒(pruritis)至过敏性休克的不同程度的严重超敏反应，以及反映为体重增加、外周水肿(peripheral oedema)和偶尔的胸腔积液和心包积液的大量液体潴留。超敏反应的发生率为5％至60％，这归因于所用的赋形剂聚山梨酯80，且更具体地是归因于存在于聚山梨酯80中的氧化产物和油酸，其已知引起组胺的释放，组胺的释放是产生这些超敏反应的原因。这是经常必需进行使用皮质类固醇和抗组胺剂的前驱用药以避免副作用的原因。此外，在给予制剂前需要在乙醇中稀释制剂，很明显这对于要治疗的患者是主要的不利因素。

-

是第三代递送系统，由人血清白蛋白以w/w比为9∶1稳定的紫杉醇纳米颗粒组成，且纳米颗粒的平均直径为130nm。不含非离子表面活性剂简化了治疗，因为无需前驱用药而且缩短了输注时间。另一方面，

制剂比的效力低，因为

纳米颗粒与尺寸超过100nm的其他颗粒一样，是网状内皮系统的底物。该药物递送媒介物的另一缺陷是使用从供体血分离的人血清白蛋白，这总是带有较小但确定的传染病毒性疾病的风险。

因此，亟需对生物可用度更高、毒性更小且耐受性更好的溶解的紫杉醇或多西他赛制剂。

本发明人令人惊讶地证实当配制为紫杉烷类-SRN时，明显改善了口服给予的紫杉烷类的生物利用度。

本发明的口服制剂还允许紫杉烷类更好地增溶。事实上，包含在SRN中的环糊精能够与活性成分复合。如国际专利申请WO/9943359中所述，SRN允许即使是疏水、两亲和/或不溶的活性成分透入由一种或多种聚合物与一种或多种环糊精的缔合而得到的聚合物结构的内部，与现有技术相比此结构内的包封产率显著增加。产率看起来与以下情况之间的平衡有关：第一，由使用能够与活性成分复合的化合物(环糊精)所导致的增溶以及第二，活性成分对新聚合物结构的亲和力，这在治疗水平和工业水平方面带来实质性进展。因此，SRN允许装载纳米颗粒，所述纳米颗粒不仅含有亲水的活性成分，而且还含有疏水、两亲和/或不溶的活性成分。

更特别地，通过特定的环糊精的增效混合物获得了惊人的增溶效力。事实上，羟丙基-β-环糊精(HP-βCD)与甲基化-β-环糊精(Me-β-CD)的混合物；HP-βCD与γ-CD的混合物；或Me-β-CD与γ-CD的混合物允许显著改善诸如紫杉烷类的活性成分的溶解性。

羟丙基-β-环糊精(HP-βCD)与甲基化-β-环糊精(Me-β-CD)的混合物；或HP-βCD与γ-CD的混合物；或Me-β-CD与γ-CD的混合物中的紫杉烷的制剂也是本发明的部分。

发明概述

本发明涉及纳米颗粒，其包含至少一种作为活性成分的化疗剂、至少一种聚合物和至少一种能够与所述化疗剂复合的环状低聚糖以用于所述化疗剂衍生物的治疗性口服给药。

包含所述化疗剂的所述纳米颗粒在本文称为“化疗剂-SRN”。

本发明还涉及用于治疗和/或预防癌症的所述化疗剂-SRN，所述治疗和/或预防包括口服给予所述化疗剂-SRN。

优选地，所述聚合物选自聚(氰基丙烯酸烷基酯)，其中所述烷基是直链或支链的，包含一至十二个碳原子。

优选地，所述聚合物是聚(氰基丙烯酸异己酯)。该聚合物可以由

(Bioalliance Pharma)的聚合来获得。

优选地，所述环状低聚糖是环糊精，例如中性或带电的环糊精，其是天然的(α、β、γ、δ、ε环糊精)、支化或聚合的或化学修饰的。优选通过用烷基、芳基、芳基烷基、糖苷基团取代一个或多个羟基或通过与醇或脂肪酸的醚化、酯化进行环糊精的化学修饰。更优选的环糊精可选自但不只是羟丙基-β-环糊精或HP-βCD(从Roquette获得)、随机甲基化-β-环糊精或Rameb-CD(从Cyclolab获得)、甲基化-β-环糊精或Me-β-CD、磺丁基醚-β-环糊精或Captisol(从Cydex获得)、γ-CD。

本发明的纳米颗粒还可以包含其他药学可接受的赋形剂，如通常用于此领域的那些赋形剂，例如诸如葡聚糖或泊洛沙姆或其他非离子表面活性剂(如聚山梨酯、脱水山梨糖醇酯或其他物质)的表面活化剂、稳定剂或表面活性剂。优选泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188(也称为普流罗尼克F68)。

纳米颗粒的尺寸通常取决于在能够与活性成分复合的环状低聚糖中的浓度、聚合介质的pH以及搅拌速度。纳米颗粒的尺寸低于1微米，优选为20nm至1000nm，且更优选50nm至700nm。

因此通过进行标准预测试来调整纳米颗粒的尺寸是可以的，这取决于特定的期望效果。

本发明的纳米颗粒优选包含，以重量百分比表示：

-0.1至30％的所述化疗剂；

-10至85％的所述聚合物；

-0.1至70％的所述能够与所述化疗剂复合的环状低聚糖。

此外，本发明的纳米颗粒还可以包含：

-0至60％的赋形剂，例如泊洛沙姆；和/或

-0至2％的酸，例如柠檬酸。

本发明的优选纳米颗粒包括含有以下物质的那些纳米颗粒：

-至少一种化疗剂，其选自伊立替康、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、玫瑰树碱或它们的药学可接受的盐；

-聚(氰基丙烯酸异己酯)；

-泊洛沙姆188；以及

-羟丙基-β-环糊精和/或rameb甲基化-β-环糊精和/或甲基化-β-环糊精和/或γ-环糊精。

根据本发明，化疗剂可以指(i)拓扑异构酶抑制剂、(ii)蒽环类药物(anthracycline)、(iii)纺锤体毒性(poison)植物生物碱、(iv)烷化剂、(v)抗代谢物以及(vi)其他化疗剂：

(i)拓扑异构酶抑制剂，

拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构的重要酶。I型或II型拓扑异构酶的抑制通过扰乱正常的DNA超螺旋来干扰DNA的转录和复制。

某些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱衍生物。喜树碱衍生物是指诸如伊立替康、托泊替康、hexatecan、silatecan、勒托替康、karenitecin(BNP1350)、吉马替康(ST1481)、贝洛替康(CKD602)……的喜树碱类似物或它们的药学可接受的盐。伊立替康、其活性代谢物SN38和托泊替康是优选的。伊立替康是更优选的。

II型拓扑异构酶抑制剂的实例包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷...。这些II型拓扑异构酶抑制剂是表鬼臼毒素的半合成衍生物，表鬼臼毒素是在美洲盾叶鬼臼(American Mayapple)(盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum))的根部中天然存在的生物碱。

(ii)蒽环类药物：

蒽环类药物(或蒽环类抗生素)源自链霉菌。这些化合物用于治疗许多癌症，包括白血病、淋巴瘤以及乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。

蒽环类药物有三种作用机理：

-通过插入DNA/RNA链的碱基对之间来抑制DNA和RNA合成，由此阻止迅速生长的癌细胞的复制。

-抑制拓扑异构酶II，阻止超螺旋DNA的松弛并由此阻断DNA转录和复制。

-产生破坏DNA和细胞膜的铁介导的氧自由基。

蒽环类药物的一些非限制性实例是：多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星或它们的药学可接受的盐。

(iii)纺锤体毒性植物生物碱

这些植物生物碱源自植物，并通过阻止细胞分裂所必需的微管功能来阻断细胞分裂。

实例是长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春西汀...)和紫杉烷类。紫杉烷类包括紫杉醇和多西他赛或它们的药学可接受的盐。紫杉醇最初源自太平洋紫杉。多西他赛是紫杉醇的半合成类似物。

与紫杉烷类相比，长春花生物碱破坏有丝分裂纺锤体。因此紫杉烷类和长春花生物碱命名为纺锤体毒剂或有丝分裂毒剂，但它们以不同的方式起作用。

(iv)烷化剂：

烷化剂由于它们在细胞中所存在的条件下向许多负电性基团添加烷基的能力而得名。它们通过与生物学上重要的分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键来破坏细胞功能。值得注意的是，它们的细胞毒性被认为是由抑制DNA合成所引起的。

铂化合物如奥沙利铂、顺铂、卡铂……是烷化剂。其他烷化剂是氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺。

(v)抗代谢物：

抗代谢物是抑制代谢物的利用的化学品，代谢物是正常代谢的一部分。这些物质经常在结构上与它们所干扰的代谢物类似。抗代谢物的存在抑制了细胞生长和细胞分裂。

嘌呤或嘧啶类似物阻止核苷酸并入DNA中，使DNA合成及由此导致的细胞分裂停止。它们还影响RNA合成。嘌呤类似物的实例包括硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨...。嘧啶类似物的实例包括抑制胸苷酸合成酶的5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)和胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)……。

抗叶酸剂是破坏叶酸功能的药物。许多抗叶酸剂用于癌症化疗，一些被用作抗生素或抗原生动物剂。一个公知的实例是甲氨喋呤。它是叶酸类似物，且由于与叶酸的结构类似性，它结合并抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，并因此阻止四氢叶酸的形成。四氢叶酸是嘌呤和嘧啶合成所必需的，且这导致DNA、RNA和蛋白(因为四氢叶酸还参与氨基酸丝氨酸和甲硫氨酸的合成)产生的抑制。其他抗叶酸剂包括甲氧苄啶、雷替曲塞、乙胺嘧啶和培美曲塞……。

(vi)其他化疗剂

上面的实例是非限制性的且可以描述其他化疗剂。

其中，可以列举玫瑰树碱和哈尔明碱。

玫瑰树碱是从夹竹桃科的常绿树中分离的天然植物生物碱产物。玫瑰树碱据发现具有细胞毒性和抗癌活性(Dalton et al.，Aust.J.Chem.，1967.20，2715)。对于许多实验肿瘤，在9位上羟基化的玫瑰树碱衍生物(9-羟基玫瑰树碱(9-hydroxyellipticinium))据发现抗肿瘤活性高于玫瑰树碱(Le Pecq et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，USA，1974，71，5078-5082)。已进行研究以确定适于人治疗的玫瑰树碱衍生物并获得依利醋铵(Celiptium)或N2-甲基-9-羟基玫瑰树碱(NMHE)的制备，其已用于治疗某些人癌症，特别是用于治疗乳腺癌的骨转移。其他的9-羟基玫瑰树碱衍生物，例如2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱乙酸酯、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基-玫瑰树碱乙酸酯和2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱已经描述于例如美国专利4,310,667号中。

哈尔明碱是从骆驼蓬(Peganum harmala)种子中分离的天然植物生物碱产物。骆驼蓬(蒺藜科(Zygophyllaceae))是一种广泛分布于中亚、北非、中东及澳洲的半干旱草场中的植物。骆驼蓬的药理学活性化合物特别是在种子和根部中发现的几种生物碱。这些包括(3-咔啉，例如哈尔明碱、哈马灵、哈尔酚、哈马洛尔和哈尔满，以及喹唑啉衍生物：鸭嘴花碱和鸭嘴花碱酮(vasicinone)。

骆驼蓬生物碱据发现拥有显著的抗肿瘤潜力(Lamchouri and al.，Therapie，1999，54(6)：753-8)。肿瘤细胞系的增殖明显减少了。

据报导哈尔明碱表现出抗许多人肿瘤细胞系的强细胞毒性(Ishida andal.，Bioorg Mad Chem Lett，1999，9(23)：3319-24)。

哈尔酚二聚体的抗癌活性也已经描述于例如国际专利WO2009047298中。

癌症在本文是指任何恶性增殖细胞病症，例如肿瘤或白血病，包括癌、肉瘤、淋巴瘤、干细胞瘤、胚细胞瘤，并且包括任何种类的结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、脑癌、乳腺癌和卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病。

如本文所使用的，术语“患者”是指动物，例如对于饲养、公司或保存目的有价值的动物，或优选人或人儿童，其患有本文所述的一种或多种疾病和疾病状况或具有罹患本文所述的一种或多种疾病和疾病状况的可能性。

如本文所使用的，“治疗有效量”是指在预防、减轻、消除、治疗或控制本文所述疾病和疾病状况的症状中有效的本发明化合物的量。术语“控制”意指其中可能存在减缓、中断、阻止或终止本文所述疾病和疾病状况的进展的所有过程，但并不必表示完全消除所有疾病和疾病状况的症状，且意图包括预防性治疗。

如本文所使用的，术语“药学可接受的”是指在合理的医学判断的范围内，适合与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理受益/风险比相当的其他成问题的并发症的那些化合物、材料、赋形剂、组合物或剂型。

如本文所使用的，“药学可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱式盐而被修饰。药学可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸所形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括源自诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的无机酸的那些盐；以及由诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸(glucoronic acid)、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等的有机酸制备的盐。其他加成盐包括诸如氨丁三醇、葡甲胺、吡咯乙醇等的铵盐，诸如钠、钾、钙、锌或镁的金属盐。

本发明的药学可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物来合成。通常，这样的盐可以通过在水中或在有机溶剂中、或在水与有机溶剂的混合物中使游离酸或游离碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。通常，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，17^th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，1418页中找到，其所公开的内容通过引用并入本文。

如本文所使用的，“药学可接受的赋形剂”包括任何载体、稀释剂、佐剂或媒介物，例如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。将这样介质和试剂用于药学活性物质是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的使用是预期的。还可以将补充活性成分并入组合物中作为合适的治疗组合物。

本发明还涉及相应的治疗方法，包括将本发明的纳米颗粒与药学可接受的赋形剂一起口服给予有需要患者。

需要治疗本文所述的疾病和疾病状况的那些受试者的鉴别完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。本领域有经验的兽医或医生可以通过使用临床测试、身体检查、病史/家族史或生物学试验和诊断测试来容易地鉴别需要这样的治疗的那些受试者。

通过作为本领域技术人员的主治诊断医师，通过使用常规技术以及通过在类似情况下获得的观察结果可以容易地确定治疗有效量。在确定治疗有效量时，主治诊断医师所要考虑的许多因素包括但不限于受试者的物种；其大小、年龄和一般健康情况；所患的具体疾病；患病程度或疾病的严重性；个体受试者的应答；给予的特定化合物；给药方式；给予制剂的生物利用度特性；所选择的剂量方案；伴随用药的使用；以及其他相关情况。

获得期望的生物学效果所需要的化疗剂的量会根据许多因素而变化，包括所用的化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物的效力、疾病类型、患者所属物种、患者的患病状态、给药途径、所选择途径的化合物生物利用度、规定要给予的所需剂量、递送和方案的所有因素。

在本发明的情况下，如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指逆转、缓解、抑制该术语所应用的病症或疾病状况或者这样的病症或疾病状况的一种或多种症状的进展，或者预防该术语所应用的病症或疾病状况或者这样的病症或疾病状况的一种或多种症状。

一般来说，可以以含有0.05至10％w/v化合物的水溶液或悬浮液的形式提供本发明化合物。通常的剂量范围为每天1μg/kg体重至0.1g/kg体重；优选的剂量范围为每天0.01mg/kg体重至10mg/kg体重或在人儿童中的等效剂量。要给予的药物的优选剂量可能依赖于可变因素，如疾病或病症的类型和进展程度、特定患者的总体健康状态、所选择化合物的相对生物学效力、化合物的制剂、化合物经由所选择递送途径的药物动力学性质、给药方案(给定的时间段内的重复次数)和伴随治疗。

如在下文中所描述的，本发明的化合物还能够以单位剂量形式给药，其中术语“单位剂量”意指能够给予患者，且能够容易地处理和包装的单次剂量，其保持为包含任何活性化合物本身的物理和化学稳定的单位剂量或药学可接受的组合物。就这点而论，通常的每日总剂量范围为0.01至100mg/kg体重。根据一般指导原则，用于人的单位剂量的范围为每天1mg至3000mg。优选地，单位剂量的范围为每天一至六次地给予1至1000mg，且甚至更优选一天一次地给予10mg至1000mg。本文所提供的化合物可以通过与一种或多种药学可接受的赋形剂混合来配制为药物组合物。可以制备这样的单位剂量组合物以用于通过口服给药，特别是以片剂、胶囊、口服混悬剂、用于再悬浮的粉剂或糖浆的形式。

所述组合物可以方便地以单位剂量形式来给药且可以通过任何制药领域中公知的方法来制备，例如，在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20^th ed.；Gennaro，A.R.，Ed.；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2000中所描述的。

对于口服给药，片剂、丸剂、粉剂、胶囊、混悬剂、糖浆等可以含有任何以下媒介物或类似性质的化合物中的一种或多种：粘合剂，例如微晶纤维素或黄芪树胶；稀释剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选地与增塑剂共混的明胶共混物来制备；以及淀粉胶囊的形式。另外，单位剂量形式可以含有改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖包衣、虫胶或肠内药剂。其他口服剂型糖浆或酏剂可以含有甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。

根据另一目的，本发明还涉及本发明纳米颗粒的制剂，所述制剂包含：

-水溶液或水悬浮液中的所述纳米颗粒，浓度为0.5至10mg/ml、优选0.5至2mg/ml、更优选1至1.5mg/ml当量的诸如IRN的所述化疗剂；以及

-所述溶液或悬浮液，其包含0.5至5％、有利的1％的诸如葡萄糖、甘露醇、乳糖的低温防护剂，更有利的1％的葡萄糖。

本发明还涉及冻干的纳米颗粒，其包含本发明的所述化疗剂。

所述冻干的纳米颗粒特别适合于口服给药以用于治疗和/或预防癌症。

本发明还涉及将本发明的纳米颗粒冻干的方法。所述方法包括以下步骤：

·步骤1：将上述本发明的制剂冷冻：通常，合适的冷冻温度为-80℃至-30℃，优选约-55℃。冷冻可以在10分钟至10天的时间段内进行，通常在约5小时内进行。

·步骤2：将所述冷冻的制剂初级干燥。初级干燥温度可以为+5℃至+50℃，例如约+20℃，并且在减压下进行，减压为50至200μBar，有利地约120μBar。初级干燥可以进行几分钟至几天，有利地约1天。

·步骤3：将所述初级干燥的冷冻制剂次级干燥。次级干燥可以通过降低干燥压力和/或升高干燥温度的一个或多个阶段来实现。优选的次级干燥条件包括约+20℃的温度和P＝80μBar的条件下一个阶段，以及随后的T＝+35℃且P＝80μBar的条件下的第二阶段。次级干燥的各阶段可进行几分钟至几天，有利地约5小时：

所得的产物允许用水搅拌时立即复原为均匀的液体制剂。

还根据另一目的，本发明还涉及一种药剂，其包含药学可接受的媒介物中的至少一种本发明的纳米颗粒，所述药剂用于口服给药。

还根据另一目的，本发明还涉及一种药剂，其包含药学可接受的媒介物中的至少一种本发明的纳米颗粒以用于治疗和/或预防癌症，所述治疗和/或预防包括口服给予所述药剂。

根据本发明的另一目的，治疗还可以包括给予一种或多种其他抗癌剂，例如但不限于5-氟尿嘧啶或其他抗代谢物氟嘧啶如卡培他滨或替加氟尿嘧啶(Tegafur-Uracile)(“UFT”)。

根据另一目的，本发明还涉及制备本发明纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

-制备聚合介质，其包含至少一种酸、诸如环糊精的所述环状低聚糖以及任选的诸如泊洛沙姆188的所述表面活性剂或表面活化剂；

-将所述化疗剂与所述聚合介质混合；

-与所述聚合物的单体混合；

-使聚合发生。

附图说明

图1说明了处理的小鼠的肿瘤发展，其中相对肿瘤体积(RTVm)表示与开始使用本发明的制剂处理时所记录的体积相关的肿瘤发展。

图2说明了给予本发明的制剂后，在两个处死时间评价的处理小鼠的同位肿瘤体积发展。

图3说明了给予本发明的制剂后，处理的小鼠的重量发展，其中相对体重(RBWm)表示与每组实验开始时所记录的重量相关的体重发展。

图4说明了处理的小鼠的肿瘤发展，其中相对肿瘤体积(RTVm)表示与开始使用本发明的制剂处理时所记录的体积相关的肿瘤发展。

实施例

以下实施例是作为本发明的非限制性说明给出的。

实施例1：原材料和主要方案

原材料：

·有效成分

○伊立替康(由Interchemical/Haorui提供)，

○玫瑰树碱衍生物(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基-玫瑰树碱)(由Novasep提供)，

○多柔比星，

○紫杉醇。

·赋形剂

制备聚合介质(pH为2至3.5)的方法

-制备0.1M柠檬酸

-在搅拌下添加泊洛沙姆188(浓度为0.5至15％)，直至完全溶解

-添加环糊精(浓度为0.1至70％)

-调节至所需pH

-在0.2μm滤器上过滤

制备伊立替康、多柔比星、紫杉醇或玫瑰树碱衍生物(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱)-SRN(5m l批量)的方法

-在10ml烧瓶中，加入5ml的

○聚合介质中的0.5至2mg/ml的伊立替康、紫杉醇和玫瑰树碱衍生物

○0.5至10mg/ml的多柔比星

-磁力搅拌

-在搅拌下缓慢加入50至200μl的

-在磁力搅拌和室温下，使聚合进行高达24h的时间段

-在2μm滤器上过滤

实施例2：包封研究和优化：增加IRN的量的影响

方案：制备pH 3.5的聚合介质中的0.5、0.75、1、2&5mg/ml的IRN溶液，并置于10ml烧瓶中(每烧瓶5ml溶液)。在磁力搅拌下，通过滴加50μl的

起始聚合。24h后，收集悬浮液，并在2μm滤器上过滤之前和之后，在20℃下以50.000rpm离心分离30min之前和之后通过HPLC进行分析。

结果：以固定量的单体增加伊立替康的量导致包封产率值的降低(数据未显示)。含50μl的的0.5至1.5mg/ml IRN溶液获得最佳结果，包封产率＞95％。

实施例3：IRN-SRN的体外和体内初步试验结果

3.1.IRN-SRN对HT29细胞的体外细胞毒性结果

测试了伊立替康-SRN的效果。使单独的SRN、伊立替康-SRN(伊立替康/聚合物重量比等于1/20)以及单独的伊立替康与生长的HT29细胞接触4天并测定IC₅₀。进行了三次不同的试验并估算了IC₅₀(抑制浓度50％)。

所测定的不同效力列举如下：

表1：三种测试对象的体外抗肿瘤活性(IC50值)

在体外，伊立替康-SRN表现出与单独的伊立替康类似的在人结肠癌细胞系HT-29中的抗癌活性，这表明将伊立替康包封在纳米颗粒中并未减少其活性。然而应记住：SN38是IRN的活性代谢物，且为了有活性其必须通过羧酸酯酶代谢。因此这可能是细胞的体外测试的局限性。

应注意，空白纳米颗粒(单独的SRN)表现出体外细胞毒性活性。事实上，已经描述了空白纳米颗粒的降解导致已知为体外细胞毒性的聚氰基丙烯酸(polycyanoacrylate acid)。

这个对人结肠癌细胞系HT-29的体外研究证实了包封在纳米颗粒中的伊立替康保持其效力且不被聚合过程所改变的事实。

3.2.IRN-SRN对异种移植的小鼠的体内研究

3.2.1.单次最大耐受剂量(MTD)研究：

IRN-SRN的口服给药

首先进行了单次剂量MTD评价研究。用口服方式测试了三种递增剂量50mg/kg；100mg/kg和200mg/kg。每种剂量以3个动物为一组进行测试并监测动物2周，每两天观察临床毒性迹象并测量动物重量。

口服50mg/kg和100mg/kg时，没有表现出毒性迹象且没有观察到体重减轻。200mg/kg时，4天后，2只动物是其初始体重的94％，而1只动物是其初始体重的91.5％，但没有明显的临床毒性迹象。参照组为口服

(溶液中的IRN)且没有表现出重量减轻或临床毒性迹象。

在该实验模型中，IRN-SRN口服剂量的最大耐受剂量是200mg/kg。

3.2.2.口服给予IRN-SRN的MTTD(最大总耐受剂量)研究

MTTD的研究方案是在三周内每周给药一次。每种剂量以3个动物为一组进行测试并在最后一次处理结束之后监测动物2周，每两天观察临床毒性迹象并测量动物重量。

计划的MTTD研究具有以下方案：

表2：MTTD研究的方案和临床表现

对于口服给药，由于最大的所需剂量的体积，无法确定MTTD。因此，在该实验模型中，最大可行剂量确定为200mg/kg。

3.3.异种移植的小鼠的口服MTTD研究

为了尽可能接近地模拟结肠肿瘤的体内模型，进行了对异种移植的小鼠的耐受性和效力研究。由于异种移植的小鼠是非常敏感的，所以对皮下移植HT-29人结肠直肠肿瘤细胞的小鼠进行MTTD和效力研究。

方案如下：

表3：MTTD研究的方案和临床表现

每天口服给予IRN-SRN持续5天没有表现出毒性的临床迹象(表3)。另一方面，IRN引起明显的重量减轻。

对于给药方案为每周三次口服给药持续3周的先前实验，由于最大的所需剂量的体积，无法确定MTTD。因此，在该实验模型中，最大可行剂量确定为200mg/kg。

在该实验期间还考虑了对肿瘤发展的检查。用IRN-SRN(50、100和200mg/kg)处理导致肿瘤体积明显减小(见图1)。

在此步骤中，IRN-SRN表现出令人感兴趣的性质。事实上，它们不仅具有剂量依赖性的效力及与

相当的抗肿瘤效果，而且还具有更好的耐受性。

3.4.IRN-SRN抗同位生长的HT29肿瘤异种移植物的效力研究

目的是测试口服给予IRN-SRN对同位生长的HT-29结肠直肠瘤的效力。所使用的剂量和方案选自耐受性研究的结果。

同位移植：如上所述将约30mm³的肿瘤片段靠近盲肠壁缝合。移植后2周将15只小鼠的组随机进行处理。

如果动物体重减轻(连续72小时内＞10％)，则将处理调节至较低剂量。在每组中，在开始处理后的第19天和第45天处死7-8只小鼠。将肿瘤样品在10％甲醛中固定并进行组织学检查。

用IRN-SRN(200mg/kg)处理导致肿瘤体积明显减小(见图2)。

实施例4：人结肠直肠腺癌HT29异种移植物模型中的IRN-SRN和伊立替康的体内抗肿瘤效果

4.1.材料和方法

动物的识别和剂量组的组成

将所有动物在每次实验之前称重并细分为不同的剂量组。

每个笼子通过纸标签来识别，纸标签指示：实验代码、笼子编号、小鼠编号、肿瘤代码、测试项目名称、给药剂量和途径。

肿瘤诱导

以裸小鼠中皮下生长的肿瘤异种移植物建立HT29结肠直肠肿瘤细胞系。

肿瘤异种移植物通过连续移植到免疫缺陷小鼠中来维持。使小鼠接受来自先前传代(previous passage)的肿瘤片段的皮下移植物。用于该测定的片段来自5只供体小鼠，其带有先前肿瘤传代并在肿瘤达到直径为12至15mm时处死。来自相同实验的全部小鼠在同一天进行移植。计划每组包含至少10只小鼠。

通过颈脱位法处死荷瘤供体小鼠。在无菌条件下切除肿瘤。将肿瘤保藏在含有培养基的培养皿中并小心地剖开肿瘤以除去通常包围肿瘤的纤维囊。弃去坏死的肿瘤。在移植过程中将肿瘤组织保存在培养基中。一个肿瘤引出8个移植物，每个片段测量为约40mm³。

在无菌条件下进行皮下移植。用氯胺酮/赛拉嗪麻醉以及用聚维酮碘溶液给皮肤消毒后，在肩胛间区的水平上切开皮肤，并将肿瘤片段置于皮下组织中。用夹子闭合皮肤。

包含标准和随机取样

本研究只包括7至9周龄且称重为至少20g的健康小鼠。在移植步骤中，将肿瘤片段随机分配至裸小鼠，并且通过数字来单独识别且指定为一个肿瘤片段。随机选择装有3至5只小鼠的箱子进行处理。

化疗方案

·药物给药

遵循指定的方案通过口服或静脉内途径给予IRN-SRN和IRN。使小鼠接受不同体积的IRN-SRN以获得所需的剂量(约125至750μL)。将伊立替康稀释以通过口服途径给予500μL。

·媒介物

对照动物接受用于制备IRN-SRN溶液的媒介物(聚合介质)。

实验方案

·耐受性研究(步骤1)

目的是根据所规定的剂量和给药途径，测试iv或口服给予荷HT29肿瘤裸小鼠的伊立替康和IRN-SRN的耐受性。

当皮下HT29异种移植物是可检测的且达到150mm3的平均肿瘤体积时，对小鼠的组随机进行处理。排除没有肿瘤的小鼠。

如果动物体重减轻(连续72小时内＞15％)，则将处理调节至较低剂量。

使对照组中的小鼠接受750μl体积的媒介物。

·IRN-SRN抗皮下生长的HT29肿瘤异种移植物的效力研究(步骤2)

目的是测试口服给予IRN-SRN对皮下生长的HT-29结肠直肠瘤的效力。所用的剂量和方案选自耐受性研究的结果。

随机将小鼠分为各处理组，每组10只，使得当肿瘤体积为60-150mm³时，各组之间相同的平均肿瘤体积相同。在分组后的次日(第1天)开始处理。如果动物体重减轻(连续72小时内＞15％)，则将处理调节至较低剂量。

·IRN-SRN的生物分布研究(步骤3)

在单次iv注射5min、10min、15min、30min、60min、2h、4h、8h、16h、30h和48h后，或单次po给药15min、30min、60min、2h、4h、8h、16h、30h和48h后，通过对赛拉嗪-氯胺酮麻醉的小鼠心脏穿刺采集血液。

单次iv注射或po给药60min、4h、8h、16h、30h和48h后，将肿瘤剖开并快速冷冻。

每个时间点使用三只小鼠。对于对照组只进行一次采样。

制备血浆样品以用于CPT11及其活性代谢物SN38测定。

肿瘤生长

为了评价药物对人异种移植物的抗肿瘤活性，通过用卡尺两周一次地测量肿瘤直径来评价肿瘤体积。使用公式TV(mm³)＝[长度(mm)x宽度(mm)2]/2，其中长度和宽度分别为每个肿瘤的最长直径和最短直径。

相对肿瘤体积(RTV)：以时间t的体积除以第1天的初始体积的比值再乘以100来计算。在报告中生成并显现了处理组和对照组中作为时间函数的平均RTV的曲线。

毒性参数

不同处理的毒性确定如下：体重减轻百分比(％BWL max)＝100-(平均BWx/平均BW1 x 100)，其中BWx是在处理期间的最大体重减轻的那天的平均BW，而BW1是处理第1天的平均BW。

致死毒性是处理组中的任何死亡。

临床观察

·死亡率

每天检查动物的死亡率。

·临床迹象

每天观察小鼠的身体外观、行为和临床变化。

进行临床观察是为了检测与体被系统、消化系统、肌肉骨骼系统、呼吸系统、生殖泌尿器系统和中枢神经系统的参与相关的异常。

记录每只动物的所有疾病迹象以及对处理的任何行为改变或反应。在整个研究期间在实验记录本中记录单个动物的所有临床机箱。

·体重

为了调节药物给药体积并计算由于不同处理的体重减轻百分比，在整个处理期间对所有动物称重。

4.2.结果

·耐受性研究(步骤1)

表4：作为时间函数的相对体重(RBW)

口服给药后，在IRN-SRN组(50、100、200和300mg/kg)中没有观察到体重减轻，然而在单独口服IRN组中观察到超过15％的体重减轻(见图3)。这表明口服给药后，IRN-SRN比单独的IRN有更好的耐受性。这证实IRN-SRN能够减少口服给予伊立替康的副作用。

·IRN-SRN抗皮下生长的HT29肿瘤异种移植物的效力研究(步骤2)

表5：作为时间函数的相对肿瘤体积(RTV)

用IRN-SRN(50、100、200和300mg/kg)处理还导致肿瘤体积的明显减小(见图4)。此外给予不同剂量显示出IRN-SRN的剂量相关效果。事实上，处理效力随IRN-SRN的给药剂量而增加。口服IRN-SRN 200和300mg/kg与单独口服IRN 100mg/kg一样有效且具有更好的耐受性。

·IRN-SRN的生物分布研究(步骤3)

表6：IRN和IRN-SRN的药物动力学参数。

·AUC＝对应于给定时间段内的血浆浓度积分的曲线下面积。

·清除率＝表示器官或组织从有机体体液除去给定物质的能力的系数。常用的术语为“肾清除率”，即：身体的尿流量与其在血浆中的浓度的比率。清除率显示出药物是如何除去的。

·T1/2＝药物的血浆半衰期(T¹/₂)是血浆浓度减少一半，例如从100至50mg/L所需的时间。知道半衰期使得可以设计药物给药频率(每日给药次数)以获得期望的血浆浓度。在大多数情况下，半衰期与给予的药物的剂量无关。在某些特殊情况下，半衰期随剂量而变化：根据发生饱和的机理(消除、分解代谢、粘附到血浆蛋白等)，其可以增加或减少。

·Cmax＝最大血浆浓度。术语半最大效应浓度(EC50)是指在某些特定暴露时间后，导致在基线与最大值之间的一半的应答的药物、抗体或毒物的浓度。其通常用作药物效力和毒性的量度。

·Tmax＝达到Cmax的时间(Cmax与时间之间的相互关系)

·F％＝生物利用度，其表示到达中央区室的给予的药物的百分比。其通常通过将静脉内与经由通常为口服的其他途径给予相同药物后获得的AUC进行比较来测量。静脉内给药后，所获得的AUC对应于定义为100％生物利用度；口腔给药后，AUC在理想情况下对应于相同的生物利用度，但通常对应于较低的生物利用度或偶尔为零的生物利用度。

以300mg/kg口服给予IRN-SRN以及以20mg/kg iv给予游离IRN溶液后的伊立替康的药物动力学结果如下：AUC分别为9698ng.h/ml比1284ng.h/ml，清除率分别为30.9l/h比15.6l/h，T1/2分别为4.68h比1.22h。用300mg/kg的IRN-SRN获得的伊立替康的相对生物利用度为50％。

表7：SN-38的药物动力学参数。

对于SN-38(伊立替康的活性代谢物)，以300mg/kg口服给予IRN-SRN以及以20mg/kg iv给予游离IRN溶液后，AUC分别为21056ng.h/ml比6403ng.h/ml，T1/2分别为3.7h比1.52h。用300mg/kg的IRN-SRN获得的SN-38的相对生物利用度为22％。

药物动力学研究证明了与游离静脉内或口服IRN溶液相比，该IRN-SRN口服制剂具有改善的生物利用度，此外还具有明显延长的半衰期。实施例5：IRN-SRN制剂的冷冻干燥和复原测试

5.1.介绍

进行该研究以确定对于冷冻干燥方法的IRN-SRN最佳制剂。

冻干后进行复原测试以确定每种制剂的复原条件。

为确定最佳制剂，对每种冷冻干燥产物进行粒度控制。

对以下制剂进行了测试：

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1mg/ml当量的IRN)，无低温防护剂

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1mg/ml当量的IRN)，1％葡萄糖

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1mg/ml当量的IRN)，1％甘露醇

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1mg/ml当量的IRN)，5％葡萄糖，0.5％乳糖

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1.5mg/ml当量的IRN)，无低温防护剂

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1.5mg/ml当量的IRN)，1％葡萄糖

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1.5mg/ml当量的IRN)，1％甘露醇

-1小瓶：水中的IRN-SRN(1.5mg/ml当量的IRN)，5％葡萄糖，0.5％乳糖

5.2.冷冻干燥过程和结果

冷冻条件为：搁板温度＝-55℃，持续时间4h30

初级干燥条件：搁板温度＝+20℃，P＝120μBar，持续观察时间19h

次级干燥条件：

i.搁板温度＝+20℃，P＝80μBar，持续时间＝5h30

ii.搁板温度＝+35℃，P＝80μBar，持续时间＝4h00

冷冻干燥过程的总持续时间为约33小时。

冷冻干燥过程后，小瓶的视觉外观是变化的：

-无低温防护剂的制剂：外观是一致的

-含1％葡萄糖的制剂：外观是一致的

-含1％甘露醇的制剂：外观是一致的，但产物粘在小瓶上

-含5％葡萄糖和0.5％乳糖的制剂：由于在冷冻步骤中葡萄糖的玻璃化，外观是不一致的。观察到团块(cake)的收缩。

5.3.复原方案和结果

-从冰箱中取出小瓶并在室温下放置至少30分钟

-首先用针刺穿瓶塞以在添加水的过程中允许空气进入

-在每个小瓶中的团块上添加适量的水

■5ml的复原测试：添加1ml，且在团块完全溶解后再向小瓶中添加4ml

■250μl的复原测试：直接向团块上添加250μl水

-在团块上添加水后剧烈并手动地摇动(check)小瓶。在小瓶中存在聚集物(aggregate)的情况下使用“涡旋振荡”。

5ml的复原测试的总结

最难复原的制剂是不含任何低温防护剂的制剂。对于其他制剂复原是令人满意的。

250μl的复原测试的总结

最难复原的制剂是不含任何低温防护剂的制剂。甚至在使用涡旋振荡来混合样品后有许多聚集物残留。

含有1％甘露醇的制剂，产物粘在小瓶上。其他制剂复原是令人满意的。

总之，优选的冻干制剂含有1％葡萄糖。产物在5ml水中或250μl水中可以容易地复原，且对于两种制剂(1mg/ml和1.5mg/ml)颗粒特性(profile)是一致的。

实施例6：IRN-SRN中包埋的环糊精的测量

6.1.原材料和主要方案

6.1.1.原材料

在碱性溶液中，酚酞是粉红色的(酚酞的阴离子形式)。该阴离子形式具有554nm处的特征吸收峰。当将酚酞加入含有HP-bCD的溶液时，一些PP阴离子与HP-b-CD形成包合复合物并变为无色的。这导致554nm处的吸收峰强度的减小。

使用包含0至0.15％浓度的HP-bCD的不同聚合介质进行校准。

所述方法用含有0.1％HP-bCD的聚合介质中的1mg/mL伊立替康溶液进行了验证。

纳米颗粒中的环糊精的量通过间接剂量(indirect dosage)来确定：将纳米颗粒悬浮液在20℃下，30分钟内，以50000rpm离心。分析上清并通过差值来确定包埋在纳米颗粒中的HP-bCD浓度。

6.1.2.主要方案

制备含有用于校准的已知浓度HP-bCD的聚合介质的方法(pH为2至3.5)

·制备0.1M柠檬酸

·在搅拌下向之前的溶液添加泊洛沙姆188(浓度为0.5至1％)，直至完全溶解

·添加环糊精(浓度为0至0.15％)

·调节至所需pH

制备用于分析的样品的方法

制备以下溶液：

·8％的样品(聚合介质和上清中的伊立替康)，

·10％的0.01％酚酞在乙醇中的溶液，

·10％的0.04mol.L-1碳酸钠在水中的溶液

·72％的水

将所得的混合物搅拌至平衡(至少48h)。

分析

从200nm至800nm扫描吸光度以确定包合复合物的形成以及特征吸收波长。因为复合形式是无色的，所以在特征吸收波长(554nm)处测量吸光度以确定溶液中PP的量。

6.2.结果

根据％HP-bCD校准吸光度。

·冷冻干燥前：

-第一次实验

-第二次实验

·冷冻干燥后

样品	测量的％HP-bCD	SD	包埋在纳米颗粒中的％HP-bCD
				上清NP 1mg/ml	0,015％	0,003％	85％

实施例7：通过口服途径给予多柔比星-SRN

7.1.材料和方法

·动物

8周大的C57BL/6J雌性小鼠由Harlan(Gannat，France)提供。口服给药前使小鼠保持驯化7天。

研究包括21只C57BL/6J雌性小鼠。

·药物给药

如下进行处理：

·毒理学迹象监测

口服给药后，在随后的数小时内监测毒理学迹象(死亡率、效果的类型、效果时间长短)。然后，在随后的3天内每天监测小鼠行为和毒理学迹象，随后定期监测直至研究结束(小鼠被处死)

·体重监测

临处理前记录动物的体重，随后在口服给药后的3天内每天记录动物的体重，随后定期记录动物的体重直至研究结束。

7.2.结果

作为时间函数的相对体重(RBW)表明多柔比星(doxorubicine)-SRN具有很好的耐受性(见图5)。

此外，当用多柔比星纳米制剂(transdrug)处理时，观察到小鼠的尿是橙色的。由于橙色是多柔比星-SRN的颜色，这表明多柔比星通过了肠屏障。由于单独的多柔比星口服给药时的生物利用度很差(约5％)，这表明当配制为多柔比星-SRN时，预期改善了多柔比星的生物利用度。

实施例8：通过口服途径给予紫杉醇-SRN

紫杉醇-SRN是用于口服给药的紫杉醇的新制剂。

8.1.材料和方法

用放射性标记的紫杉醇处理的大鼠的组如下：

组	处理	途径	紫杉醇剂量(mg/kg)
				1	紫杉醇-SRN	口服	5
2	环糊精-SRN	口服	10
				3	紫杉醇-SRN溶液(乳浮EL/乙醇)	口服	10

口服给药10min、30min、1H、2H、3H、4H、6H和8H后取出动物血液样品。随后通过液体闪烁照相术检测放射性标记的紫杉醇。

8.2.结果

这些研究的主要结果是紫杉醇剂量为5mg/kg的紫杉醇-SRN显示出与两倍高的剂量的紫杉醇样(Taxol-like)的溶液(即紫杉醇-SRN溶液(乳浮EL/乙醇))相同的AUC值。令人感兴趣的是该紫杉醇的新制剂的效力正好是用于口服目的的紫杉醇(Taxol)的效力的两倍，而且并不需要诸如环孢素A的任何抗-Pgp剂来例如增加生物利用度。

实施例9：多西他赛增溶

9.1.使用环糊精增加多西他赛的表观溶解度

尽管使用环糊精是目前应用最广泛的增加水溶性差的活性物质的水溶解度的方法之一，但是文献中所描述的使用不同环糊精时的多西他赛溶解度的数据经常是不完全的。因此，本发明人研究了使用诸如：HP-β-CD、Me-β-CD、SBE-β-CD、α-CD和γ-CD的不同环糊精时多西他赛溶解度的图表。

9.2.环糊精混合物

如通过分子模拟研究所显示的，似乎一个多西他赛分子可能同时与至少两个环糊精相互作用。此外，β-环糊精或γ-环糊精的空腔可证实更适合于这样或那样的可能相互作用的组。因此，不同环糊精的缔合构成了令人感兴趣的策略。然而，在现有技术还没有报导在此领域的研究工作。

基于本发明人的假设，一方面选择不同比例的各种环糊精以获得40％m/m的总环糊精浓度，而另一方面根据它们的最大溶解度选择不同比例的各种环糊精。事实上，Me-β-CD在10.2％w/w时有最佳溶解度，而γ-CD在10.2％至16％w/w有最佳溶解度。

下表中所示的结果显示了这些混合物在增溶方面的效力。事实上，与磷酸盐缓冲液中的多西他赛溶解度相比，比例为(30.6/10.2)％w/w的(HP-β-CD/Me-β-CD)混合物将多西他赛溶解度增加722倍。(30.6/10.2)％w/w的(HP-β-CD/γ-CD)混合物允许多西他赛溶解度从(1.9±0.1)μg/mL增加至(1425±47)μg/mL。类似地，(10.2/10.2)％w/w的(Me-β-CD/γ-CD)混合物使活性物质的溶解度从(1.9±0.1)μg/mL增加至(1388±149)μg/mL。对于三种环糊精的混合物，与单独的多西他赛相比溶解度明显改善，但与两种环糊精的混合物相比时溶解度较低。

表：环糊精混合物对多西他赛溶解度的影响

F：与对照相比，多西他赛溶解度增加的倍数

单独使用这些环糊精改善了多西他赛的表观溶解度。当混合时，它们通过协同现象改善多西他赛的表观溶解度，因为环糊精的同时作用产生的效果显著大于两种环糊精中的每一种的分离效果的总和。

9.3.结论

口服吸收多西他赛的障碍之一在于该物质在消化液中溶解度很差。在本研究中，本发明人应用基于环糊精的策略来改善多西他赛溶解度。

结合不同类型的环糊精，特别是γ和β-环糊精的新方法允许该溶解度增加高达750倍。

在实践层面上，已完成的工作使得可以明显改善多西他赛的表观溶解度，这可以代表其有效的口服给药的关键因素之一。

Claims (21)

1.纳米颗粒，其包含至少一种作为活性成分的化疗剂、至少一种聚合物和至少一种能够与所述化疗剂复合的环状低聚糖，所述纳米颗粒用于治疗性口服给药。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其用于治疗和/或预防癌症。

3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述聚合物选自聚(氰基丙烯酸烷基酯)，其中所述烷基是直链或支链的，包含1至12十二个碳原子。

4.根据权利要求1、2或3所述的纳米颗粒，其中所述聚合物是聚(氰基丙烯酸异己酯)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述能够与所述活性成分复合的环状低聚糖为环糊精。

6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述环糊精为羟丙基-β-环糊精和/或随机甲基化-β-环糊精和/或甲基化-β-环糊精和/或γ-环糊精。

7.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包含至少一种选自表面活性剂或表面活化剂的药学可接受的稳定剂。

8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述表面活性剂或表面活化剂为泊洛沙姆。

9.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述化疗剂为拓扑异构酶抑制剂、蒽环类药物、纺锤体毒性植物生物碱、烷化剂、抗代谢物或其他化疗剂或者它们的药学可接受的盐。

10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述拓扑异构酶抑制剂为喜树碱衍生物，并优选伊立替康、SN-38或托泊替康或者它们的药学可接受的盐。

11.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述蒽环类药物为多柔比星或其药学可接受的盐。

12.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述纺锤体毒性植物生物碱为紫杉醇、多西他赛或它们的药学可接受的盐。

13.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其包含：

-至少一种化疗剂，其选自伊立替康、多柔比星、紫杉醇或多西他赛或者它们的药学可接受的盐，

-聚(氰基丙烯酸异己酯)；

-泊洛沙姆188；以及

-羟丙基-β-环糊精和/或rameb甲基化-β-环糊精和/或甲基化-β-环糊精和/或γ-环糊精。

14.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述治疗包括给予一种或多种其他抗癌剂。

15.药剂，其包含药学可接受的媒介物中的至少一种根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，所述药剂用于口服给药。

16.药剂，其包含药学可接受的媒介物中的至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的纳米颗粒以用于治疗和/或预防癌症，所述治疗和/或预防包括口服给予所述药剂。

17.根据权利要求1至14中任一项所述的包含至少一种化疗剂的纳米颗粒的制剂，所述制剂包含：

-水溶液或水悬浮液中的所述纳米颗粒，浓度为0.5至10mg/ml当量的所述化疗剂，

-0.5至5％的低温防护剂。

18.根据权利要求17所述的制剂，其包含：

-水中的IRN-SRN，浓度为1至1.5mg/ml当量的IRN；

-1％葡萄糖。

19.冻干的根据权利要求1至14中任一项所述的包含所述化疗剂的纳米颗粒。

20.根据权利要求19所述的冻干的纳米颗粒，其用于口服给药，用于治疗和/或预防癌症。

21.将根据权利要求1至14中任一项所述的纳米颗粒冻干的方法，所述方法包括以下步骤：

-步骤1：将根据权利要求17或18所述的制剂冷冻；

-步骤2：将所述冷冻的制剂初级干燥；

-步骤3：将所述初级干燥的冷冻制剂次级干燥。

Images