CN102154248B - 一种纤维素酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶的制备方法，一，斜面孢子制备：选择绿色木霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子；二，液体种子制备：将斜面孢子接种于种子培养基中，达到108个孢子/ml然后进一步培养使孢子萌发，孢子萌发后即可作为种子；三，将种子与发酵料质量比1∶10的比例，均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，从进入培养室开始，每隔一段时间需要向浅盘内进行浇水；四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性。

Description

一种纤维素酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶的制备方法。

背景技术

农作物秸秆是自然界中最为丰富的可再生资源之一，在我国目前大部分未被充分利用，而是被烧掉，每年由于秸秆焚烧不仅造成环境污染，还造成大量的资源浪费。农作物秸秆的主要成份是纤维素、半纤维素和木质素，另外还有一些蜡质物质。因此，要有效的利用秸秆首先要解决纤维素的降解问题，如果能够将纤维素降解为可利用的糖类物质，不仅可用作养殖饲料，提高农民收入；对解决我国所面临的环境污染、粮食短缺等问题也有重大现实意义。目前纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水解作用。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，可将纤维素水解成葡萄糖。纤维素酶来源非常广泛，如昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，来源于真菌的纤维素酶酶系较全，活性强。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属。特别是绿色木霉(Trichodermaviride)及其近缘菌株最佳，国内外普遍认为绿色木霉的纤维素酶产率最高，酶系最全。我国对纤维素酶的研究有几十年的历史，采用微生物发酵法生产纤维素酶的报道和专利有很多，但是普遍存在酶系不全，和酶活力不高的问题。目前主要的发酵方法有固态发酵和液态发酵。液态发酵生产稳定，占地面积小，方法容易掌握近年来越来越被重视；但纤维素酶为诱导酶，需要天然的纤维素类物质如稻草等为诱导物，所以液态发酵酶往往存在酶系不全的缺点，且培养要求条件高，应用成本高。固态发酵虽然利用天然秸秆资源，成本低，酶系齐全，设备简单，容易推广，但是占地面积大，发酵条件难控制。

发明内容

本发明提供了一种纤维素酶的制备方法，它不但可以提高酶的存活率，完善酶系，而且大大降低了成本。

本发明采用了以下技术方案：一种纤维素酶的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，斜面孢子制备：选择绿色术霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中，静置培养，每日观察，一段时间后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子；步骤二，液体种子制备：将斜面孢子接种于种子培养基中，达到108个孢子/ml然后进一步培养使孢子萌发，孢子萌发后即可作为种子；步骤三，将种子与发酵料质量比1∶10的比例，均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，从进入培养室开始，每隔一段时间需要向浅盘内进行浇水，根据浅盘中物料湿度大小可以减少或增加浇水量；步骤四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性，当纤维素酶活性大于110U/g干曲时即可结束发酵，发酵结束湿曲，无异味，蛋白含量高，可直接用于牛羊饲喂，酶活力高，牛羊消化率高，效果好。

本发明的步骤一中所述的斜面培养基容量为1L的制备方法：称取去皮新鲜土豆200克，切成小块，加水至1L，煮沸30分钟，用纱布过滤后加20克葡萄糖、15克琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1L，分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，倾斜静置，待凝固后备用。本发明的步骤一中所述的绿色木霉接种于斜面培养基中在35℃的条件下静置培养5天，每日观察，在5天后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子。

本发明的步骤二中的所述的种子培养基容量为1L的制备方法：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾6g氯化钙1g，七水硫酸镁1g，碳酸钙0.5g，PH值为5.6，分装，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟。本发明的步骤二中斜面孢子接种于种子培养基中时在温度为30℃，转速为50r/min萌发培养6h，萌发后的孢子数含量为108个/ml。

本发明的步骤三中所述的发酵培养基质量为1kg的制备方法：称取硫酸铵20g，尿素5g，磷酸二氢钾5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁2.5g，氯化钴0.5g，七水硫酸镁1g溶于2L水，pH自然。再称取：稻草800g，麸皮200g，将2L盐溶液倒入稻草粉和麸皮混合物中，充分拌匀，装盘，装盘厚度为8-10cm，121℃灭菌60min或常压蒸锅灭菌16h。本发明的步骤三中倒在发酵培养基上进行培养的种子为步骤二中种子总量的10％，放入发酵培养室后的温度控制在28～30℃，在浅盘中物料的温度高于室温2℃左右，湿度控制在80％，培养周期为7-9天，培养期间可以通过空调和加湿装置来调节室内的温度和湿度，当出现发酵培养室内上下温度不均衡时，可采用改变浅盘的摆放位置来调节物料温度、湿度和供氧情况，从进入培养室开始，每隔12h时间需要向浅盘内进行浇水，所浇的水为无菌水。

本发明的步骤四中结束发酵后将物料在50℃热空气下烘干，即制得纤维素粗酶，纤维素粗酶直接应用于饲料添加剂。本发明的步骤四中结束发酵后将物料在浸提灌中以5倍水在30℃下，缓慢搅拌2h，过滤得到上清夜可作为粗酶液，将粗酶液浓缩，喷雾干燥可得粉状工业酶。

本发明具有以下有益效果：本发明以粉碎稻草和麦麸为主要原料，配成发酵培养料，以绿色木霉为菌种，采用固态浅盘发酵培养，所产生的纤维素酶活力高，酶系齐全，滤纸酶活可达110U/g干曲以上，生产稳定。本发明在发酵结束后处于湿曲状态，这样无异味，蛋白含量高，可直接用于牛羊饲喂，酶活力高，牛羊消化率高，效果好。本发明将稻草、麸皮等农业废弃物作为原料发酵生产纤维素酶，发酵产物可直接应用于饲料行业，发酵工艺简单易行，成本低，具有良好的应用前景。本发明采用萌发的孢子液接种既有利孢子与发酵料充分混合，又有利于缩短孢子萌发时间，提高发酵设备利用率

具体实施方式

本发明公开了一种纤维素酶的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，斜面孢子制备：首先制备斜面培养基，1L的斜面培养基的制备方法：称取去皮新鲜土豆200克，切成小块，加水至1L，煮沸30分钟，用纱布过滤后加20克葡萄糖、15克琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1L，分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，倾斜静置，待凝固后备用，选择绿色木霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中，静置培养5天，每日观察，在5天后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子；步骤二，液体种子制备：首先制备种子培养基，1L种子培养基的制备方法：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾6g氯化钙1g，七水硫酸镁1g，碳酸钙0.5g，PH值5.6。分装，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，再将斜面孢子接种于种子培养基中，然后进一步培养使孢子萌发，面孢子接种于种子培养基中时在温度为30℃，转速为50r/min萌发培养6h，萌发后的孢子数含量为108个/ml，孢子萌发后即可作为种子；步骤三，首先制备发酵培养基，1kg干料的发酵培养基制备方法：称取硫酸铵20g，尿素5g，磷酸二氢钾5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁2.5g，氯化钴0.5g，七水硫酸镁1g溶于2L水，pH自然。再称取：稻草800g，麸皮200g，稻草选择新收割稻草，自然风干，无霉变堆积待用。使用前2两天，稻草粉碎，过40目，自然风干，备用，将2L盐溶液倒入稻草粉和麸皮混合物中，充分拌匀，装盘，装盘厚度8～10cm。121℃灭菌60min或常压蒸锅灭菌16h，将步骤二中种子按照步骤三中发酵料总量10％的种子均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，放入发酵培养室后的温度控制在28～30℃，在浅盘中物料的温度高于室温2℃左右，湿度控制在80％，培养周期为7-9天，从进入培养室开始，每隔12h需要向浅盘内进行浇水，所浇的水为无菌水，根据浅盘中物料湿度大小可以减少或增加浇水量，培养期间可以通过空调和加湿装置来调节室内的温度和湿度，当出现发酵培养室内上下温度不均衡时，可采用改变浅盘的摆放位置来调节物料温度、湿度和供氧情况；步骤四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性，本发明中酶活的测定采用滤纸测定：滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原搪的量来表达纤维素酶系总的搪化能力的方法得到广泛应用，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活(FPA)，比色管底部放入1×6cm(50±1mg)的滤纸条，加0.5mL的稀释酶液，1mLpH4.8的醋酸缓冲液混匀后，50℃水浴60min，DNS法反应后根据540nm处的光密度值测定还原糖含量，进而算的酶活。在上述反应条件下(50℃pH4.8)，酶液每分钟水解底物产生1μmol葡萄糖的能力定义为1个酶活单位(U)。还原糖的测定：采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。本发明中的滤纸酶活采用国际标准酶液每分钟水解底物产生1μmol葡萄糖的能力定义为1个酶活单位(U/g)，此方法与其他一些发明中的每分钟水解底物产生1μg葡萄糖的能力定义为1个酶活单位(U/L)的表示方法不同，本发明的1U/g＝1μmol/g＝160μg/g≈160μg/ml＝160000μg/L＝1000μmol/L，第七天测定固体酶活达到103.5U/g干曲，第八天测定固体酶活达到112.6U/g干曲，第九天测定固体酶活达到117.3U/g干曲，当纤维素酶活性大于110U/g干曲时即可结束发酵，结束发酵后将物料在50℃热空气下烘干，即制得纤维素粗酶，纤维素粗酶直接应用于饲料添加剂，发酵结束湿曲，无异味，蛋白含量高，可直接用于牛羊饲喂，酶活力高，牛羊消化率高，效果好，结束发酵后将物料在浸提灌中以5倍水在30℃下，缓慢搅拌2h，过滤得到上清夜可作为粗酶液，将粗酶液浓缩，喷雾干燥可得粉状工业酶。

本发明制备时的地形要求方正、开旷，不要窄长边角多。地势要求干燥，向阳背风，近水源。周围环境要求无有害气体、废水和垃圾污染源，如化工厂、农药厂、硫酸厂、印染厂等，并要远离厕所、粪堆坑、禽舍、仓库等场所，有效防止染菌。场地四周最好有绿化带，起净化空气和调节小气候的作用。发酵场所应选择交通方便的地方，以利原料和产品的运输。场内应有一定空地，以供堆料和晒料之用，发酵培养室要求：建造的固体发酵室应具有良好的通风条件，通风采用无菌空气通风，不能有死角，但又要防止通风时，冷风或热风直袭到发酵床上；发酵室顶部装排气口。发酵室内墙面及地面光滑整洁易于消毒清洗，发酵室内设有保温保湿设备，室外设置指示器。室内设置多层金属架，用于访置发酵盘，发酵盘采用长70～100cm宽50cm高15cm的不锈钢盘或搪瓷盘无毒且易于消毒清洗，金属架宽40～80cm，间距1.2m，两端距墙面1.2m方便操作，内置接种室与培养室由无菌通道直接相通。

Claims (1)

1.一种纤维素酶的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，斜面孢子制备：选择绿色木霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中，静置培养，每日观察，一段时间后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子，所述的斜面培养基容量的制备方法：称取去皮新鲜土豆200克，切成小块，加水至1L，煮沸30分钟，用纱布过滤后加20克葡萄糖、15克琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1L，分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，倾斜静置，待凝固后备用，所述的绿色木霉接种于斜面培养基中在35℃的条件下静置培养5天，每日观察，在5天后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子；

步骤二，液体种子制备：将斜面孢子接种于种子培养基中，达到108个孢子/ml然后进一步培养使孢子萌发，孢子萌发后即可作为种子，种子培养基的制备方法：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾6g氯化钙1g，七水硫酸镁1g，碳酸钙0.5g，PH值为5.6，加水补足1L，分装，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，斜面孢子接种于种子培养基中时在温度为30℃，转速为50r/min萌发培养6h，萌发后的孢子数含量为108个/ml；

步骤三，将种子按照与发酵培养基质量比1∶10的比例，均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，从进入培养室开始，每隔一段时间需要向浅盘内进行浇水，根据浅盘中物料湿度大小可以减少或增加浇水量，所述的发酵培养基的制备方法：称取硫酸铵20g，尿素5g，磷酸二氢钾5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁2.5g，氯化钴0.5g，七水硫酸镁1g溶于2L水，pH自然，再称取：稻草800g，麸皮200g，将2L盐溶液倒入稻草粉和麸皮混合物中，充分拌匀，装盘，装盘厚度为8-10cm，121℃灭菌60min或常压蒸锅灭菌16h，倒在发酵培养基上进行培养的种子为步骤二中种子总量的10％，放入发酵培养室后的温度控制在28～30℃，在浅盘中物料的温度高于室温2℃，湿度控制在80％，培养周期为7-9天，培养期间可以通过空调和加湿装置来调节室内的温度和湿度，当出现发酵培养室内上下温度不均衡时，可采用改变浅盘的摆放位置来调节物料温度、湿度和供氧情况，从进入培养室开始，每隔12h时间需要向浅盘内进行浇水，所浇的水为无菌水；

步骤四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性，当纤维素酶的活性大于110U/g干曲时即可结束发酵，发酵湿曲结束，结束发酵后将物料在50℃热空气下烘干，即制得纤维素粗酶，纤维素粗酶直接应用于饲料添加剂，结束发酵后将物料在浸提罐中以5倍水在30℃下，缓慢搅拌2h，过滤得到上清夜可作为粗酶液，将粗酶液浓缩，喷雾干燥可得粉状工业酶。