CN102154179B

CN102154179B - 一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌及生物制剂与应用

Info

Publication number: CN102154179B
Application number: CN 201110030415
Authority: CN
Inventors: 林壁润; 蒲小明; 沈会芳; 李培谦; 潘群英
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2031-01-28
Also published as: CN102154179A

Abstract

本发明公开了一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌及生物制剂与应用。该名称为芽孢杆菌PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010365。将芽孢杆菌PPRI78进行深层液体发酵，获得大量的菌体，将菌体与固体粉剂混合，即可得到防治蔬菜卵菌病的生物制剂。该生物制剂成本低，对蔬菜卵菌病害防治效果达到70～75％，无毒，安全，环保。

Description

一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌及生物制剂与应用

技术领域

本发明属于属生物农药技术领域，特别涉及一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌及生物制剂与应用。

背景技术

蔬菜是我国重要的出口创汇农产品，栽培面积仅占总耕地面积的13％左右，但年均总产值达8000多亿元，年均出口创汇达60亿美元。蔬菜病害已成为制约蔬菜产业的重大问题，其中卵菌病害给蔬菜生产造成严重的损失，蔬菜卵菌病害主要包括辣椒疫病、黄瓜疫病、黄瓜霜霉病、大白菜霜霉病等，全国范围内四种蔬菜卵菌病害年损失近几百亿元。我国蔬菜卵菌病害对常规化学药剂普遍产生抗性，导致防效下降，施药量增加，残留量加重。因此，开发生物杀线虫剂具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种防治蔬菜卵菌病的生物制剂，该生物制剂含有上述防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌。

本发明的再一目的在于提供所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法和应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌(Bacillus sp.)，名称为芽孢杆菌PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2010365；

所述细菌PPRI 78形态及生理生化特性：单个细胞(0.6～0.8)×(2.2～3.0)μm，无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，芽孢(0.7～0.9)×(1.0～1.4)μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。可利用蛋白质、木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

所述细菌PPRI 78的16S rDNA序列在GeneBank与Bacillus sp.DYJL30比对，同源率100％，系统发育树与Bacillus sp.DYJL30聚为一枝，但其形态有一定的差异；

所述芽孢杆菌PPRI 78根据其形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，故命名为Bacillus sp.PPRI 78；

一种防治蔬菜卵菌病的生物制剂，含有上述芽孢杆菌PPRI 78；

所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂还含有固体粉剂；

所述的固体粉剂的粒径优选小于1毫米；

所述的固体粉剂优选滑石、高岭土、膨润土、硅藻土、陶土或麸皮中的至少一种；

所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：将芽孢杆菌Bacillus sp.PPRI 78菌体与固体粉剂混和得到。

所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)菌种活化：在灭菌的NA培养基中接入芽孢杆菌PPRI 78进行摇瓶培养；摇瓶培养条件如下：28～30℃，转速为170～200转/min、培养时间为8～16小时；得到活化的菌种；

NA培养基的组成为每升含有：牛肉膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH为7.2～7.4；

(2)菌体的大量繁殖：发酵培养，培养基为LA培养基，发酵的条件如下：装液量为发酵罐体积的70％，培养基灭菌后接种步骤(1)得到的活化的菌种，接种量为发酵培养基体积的5～10％，泡敌量为体积百分比0.05～0.1％，初始pH为7.0～7.2，发酵温度28～30℃、发酵培养12～36小时，期间分别取样镜检菌体数，菌体老化前停止发酵；

LA培养基的组成为每升含有：玉米淀粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米浆25g、MnSO₄0.0308mg、K₂HPO₄3g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.5g、FeSO₄ 0.1g、CaCO₃1g，水定容至1000mL，pH7.0；

(3)防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备：将步骤(2)得到的发酵液离心，得到菌体；将菌体与固体粉剂进行混和，然后干燥至水分相对湿度小于质量百分比10％、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制剂。

步骤(1)中所述的摇瓶培养的条件更优选为摇瓶装液量为摇瓶体积的1/5，28～30℃，转速为170～200转/min、培养时间为8～16小时；

步骤(2)中所述离心的条件优选为转速为15000～20000rpm，温度为25～30℃；

步骤(3)中所述的菌体与所述的固体粉剂优选按质量百分比5％进行混合；

步骤(3)中所述的固体粉剂的粒径优选小于1毫米

步骤(3)中所述的固体粉剂优选滑石、高岭土、膨润土、硅藻土、陶土或麸皮中的至少一种；

步骤(3)中所述的干燥是流化床干燥；流化床干燥的优选温度为50～70℃；

所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的使用方法可以是拌种或淋施，也可以是喷雾；

所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的使用时期可以是蔬菜种子期，苗期和成株期。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的制备方法有效地促进了芽孢杆菌PPRI 78的增殖。本发明通过对芽孢杆菌PPRI 78进行深层液体发酵，获得大量的菌体；收集菌体与相应的固体粉剂制备成粉剂。本发明具有原料成本低，生产工艺先进等特点，所制成的防治蔬菜卵菌病的生物制剂对蔬菜卵菌病害防治效果达到70～75％，无毒，安全，环保。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)细菌的分离

采用平皿稀释法分离采自广东广州市天河区五山的菜地土壤的细菌，将土壤样品用无菌水稀释成10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10梯度浓度，NA固体培养基(牛肉膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，琼脂18g，水定容至1000mL，pH为7.2～7.4)灭菌后倒入9cm平皿中(每皿约15mL)，用移液管每浓度移取0.1ml放入每皿中，用涂布棒均匀涂布，每浓度重复10皿，30-32℃下培养24-30h后，选取每皿生长10-30个细菌菌落的平皿进行挑取，无菌操作抑制NA试管斜面，30-32℃培养24-30h后保存备用。

(2)防治蔬菜卵菌病的细菌的筛选

将步骤(1)分离得到的细菌进行筛选，采用对峙培养法。将灭菌好的V8固体培养基(V8固体培养基组分为美国进口V₈蔬菜汁100mL，CaCO₃0.2g，琼脂18g，水定容至1000mL)倒入9cm的平皿中(每皿约15mL)，冷却后，将生长的好的辣椒疫霉菌(辣椒抗疫病鉴定方法初探，天津农业科学，2010，16(5)：100-103)和黄瓜疫霉病菌FR-58(新型杀菌剂氟吗啉对黄瓜疫霉病菌细胞壁主要组分合成及分布的影响.高等学校化学学报，2007，28(4)：658-662)的琼脂块(6mm)放在平皿，26-28℃培养24h后，将分离得到的细菌用移植环挑取后点在距病菌琼脂块3cm处，26-28℃培养培养72h后，观察辣椒疫霉菌和黄瓜疫霉病菌的生长情况。如细菌对病菌有抑制作用，则有明显的抑菌带；如细菌对病菌无抑制作用，则无抑菌带。

筛选得到一株对辣椒疫霉菌和黄瓜疫霉病菌具有明显的抑制作用的细菌，其对辣椒疫霉菌和黄瓜疫霉病菌的抑菌带宽度分别为1.6cm和1.5cm生防菌，命名为细菌PPRI 78。

实施例2

细菌PPRI 78的分类鉴定

(1)形态及生理生化特征

采用NA培养基平皿，将细菌PPRI 78通过稀释平皿法和划线法进行纯化，与32～35℃条件下用NA培养基(牛肉膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH为7.2～7.4)培养18h～24h，并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征观察；参照张纪忠(1990)的方法进行需氧试验、碳源利用试验、吲哚试验。

单个细胞(0.6～0.8)×(2.2～3.0)μm，无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，芽孢(0.7～0.9)×(1.0～1.4)μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌，可利用蛋白质、木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

(2)16S rDNA序列分析

采用细菌通用16S rRNA扩增引物序列27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rRNA基因片段，扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序后，将所测的16SrDNA序列(如下所示)与GenBank数据库中所有已测定的原核生物16S rDNA序列进行比较。该菌株的16S rDNA序列在GeneBank与Bacillus sp.DYJL30比对，同源率100％，系统发育树与Bacillus sp.DYJL30聚为一枝，但其形态有一定的差异。

1 tggctcctaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc

61 ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga

121 ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga

181 ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc

241 caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg

301 cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg

361 cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact

421 ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag acctggtaag

481 gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa

541 ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct

601 gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta

661 ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc

721 agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt

781 ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt

841 gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa

901 ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg

961 ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa

1021 caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt

1081 tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag

1141 tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgttgccttg gtgagccgtt

1201 acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt

1261 ttatgtctga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt

1321 atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg

1381 gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg ca

根据生理生化特征以及16S rDNA序列分析，可知该菌株属于芽孢杆菌，将其命名为芽孢杆菌Bacillus sp.PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M2010365。

实施例3芽孢杆菌PPRI 78生物制剂制备

(1)菌种的活化：配制NA培养基(每升的组成为：牛肉膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH为7.2～7.4)后，每个规格为500mL的三角瓶中装NA培养基100mL，121灭菌15min。冷却后接入芽孢杆菌PPRI 78(平板上的培养菌1环)，放入摇床内发酵培养，温度28℃，转速为200转/min、培养时间为16小时，得到活化的菌液；

(2)种子液的准备：应用100L的发酵罐进行发酵，发酵液为LA培养基(每升的组成为：玉米淀粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米浆25g、MnSO₄ 0.0308mg、K₂HPO₄ 3g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.5g、FeSO₄ 0.1g、CaCO₃ 1g，水定容至1000mL，pH7.0)，装液量为70L，将步骤(1)得到的活化的菌液5L接种至100L发酵罐，泡敌量(体积百分比)为0.05％，初始pH为7.2，发酵温度30℃、发酵培养24小时；

(2)菌体的大量繁殖：应用1000L生物发酵罐发酵进行发酵，发酵液为LA培养基，装液量为700L，接种步骤(2)得到的活化的菌种70L，泡敌量(体积百分比)为0.05％，初始pH为7.2，发酵温度30℃、发酵培养36小时，期间分别取样镜检菌体数，菌体尚未老化；

(3)生物制剂制备：将发酵液于室温、20000rpm进行离心，获得的菌体与粒径小于1毫米的固体粉剂(由滑石、高岭土和膨润土按质量比1∶1∶1混合而得)进行混和，菌体含量占质量百分比5％，然后流化床干燥，流化床干燥的条件是温度不高于70℃，干燥至水分相对湿度小于质量百分比10％、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制剂。

实施例4

获得的菌体防治蔬菜卵菌病的生物制剂的效果实验测定

(1)试验生物制剂：实施例3获得的生物制剂，菌体含量为3×10¹¹cfu/g。

(2)辣椒疫霉病菌游动孢子悬浮液：将辣椒疫霉病菌接种至V8培养液(V8蔬菜汁10％，CaCO₃ 0.02％，水定容至1000mL)中，26～28℃培养5～7天，过滤菌丝得到孢子悬浮液，用血球计数板计数并稀释至浓度800cfu/mL。

(3)温室实验：在温室培养辣椒苗，待辣椒苗长至3片叶左右时，用实施例2获得的芽孢杆菌PPRI 78生物制剂1∶800待测液喷施叶片，以甲霜灵可湿性粉剂为阳性对照(CK1)、清水喷雾为阴性对照(CK2)。喷施4-6小时后用辣椒疫病菌，游动孢子悬浮液(浓度为800cfu/mL)进行接种，28-30℃培养3-4天后调查叶发病率，计算防治效果，结果如表1所示。

表1PPRI 78防治辣椒疫病效果

(4)田间小区试验

将实施例3获得的生物制剂进行田间试验，防治对象为丝瓜霜霉病。PPRI78生物制剂设三个稀释倍数，分别为1∶200、1∶400和1∶800，对照药剂为25％甲霜灵可湿性粉剂1∶500倍液。试验采用随机区组排列，重复3次，设定每小区面积为25m2，每小区定株5株，每处理重复三次，按照每亩50kg用水量进行喷雾施药。施药前和施药后10天调查总叶数，病叶数并分级，计算病情指数和防治效果。

表2防治丝瓜霜霉病效果

结果表明(如表2所示)，该制剂防治丝瓜霜霉病的效果相当理想，与25％甲霜灵可湿性粉剂1∶500倍液防效相当，说明细菌PPRI78是一个生物防治效果较好的菌株，可进一步深入研究。

上述实验结果说明本发明制备的防治蔬菜卵菌病的生物制剂能有效防治蔬菜卵菌病的生长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种防治蔬菜卵菌病的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于名称为芽孢杆菌PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2010365；

所述的蔬菜卵菌病为辣椒疫霉菌、黄瓜疫霉病菌或丝瓜霜霉病。

2.一种防治蔬菜卵菌病的生物制剂，其特征在于含有如权利要求1所述的芽孢杆菌PPRI 78。

3.如权利要求2所述的防治蔬菜卵菌病的生物制剂，其特征在于：所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂还含有固体粉剂。

4.如权利要求3所述的防治蔬菜卵菌病的生物制剂，其特征在于：所述的固体粉剂的粒径小于1毫米。

5.如权利要求3所述的防治蔬菜卵菌病的生物制剂，其特征在于：所述的固体粉剂为滑石、高岭土、膨润土、硅藻土、陶土或麸皮中的至少一种。

6.权利要求2～5任一项所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将芽孢杆菌PPRI 78菌体与固体粉剂混和得到。

7.如权利要求6所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）菌种活化：在灭菌的NA培养基中接入芽孢杆菌PPRI 78进行摇瓶培养；摇瓶培养条件如下：28～30℃，转速为 170～200转/min、培养时间为8～16小时；得到活化的菌种；

（2）菌体的大量繁殖：发酵培养，培养基为LA培养基，发酵的条件如下：装液量为发酵罐体积的70%，培养基灭菌后接种步骤（1）得到的活化的菌种，接种量为发酵培养基体积的5～10%，泡敌量为体积百分比0.05～0.1%，初始pH为7.0～7.2，发酵温度28～30℃、发酵培养12～36小时，期间分别取样镜检菌体数，菌体老化前停止发酵；

LA培养基的组成为每升含有：玉米淀粉 3g、大豆蛋白粉15g、玉米浆25g、MnSO₄0.0308mg、K₂HPO₄ 3g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.5g、FeSO₄ 0.1g、CaCO₃ 1g，水定容至1000mL，pH7.0；

（3）防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备：将步骤（2）得到的发酵液离心，得到菌体；将菌体与固体粉剂进行混和，然后干燥至水分相对湿度小于质量百分比10%、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制剂。

8.如权利要求7所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的摇瓶培养的条件为摇瓶装液量为摇瓶体积的1/5；

步骤（3）中所述离心的条件为转速为15000～20000rpm，温度为25～30℃；

步骤（3）中所述的菌体与所述的固体粉剂优选按质量百分比5％进行混合；

步骤（3）中所述的干燥为流化床干燥，温度为50～70℃。

9.权利要求2～5任一项所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的应用，其特征在于：所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的使用方法为拌种、淋施或喷雾。

10.权利要求2～5任一项所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的应用，其特征在于：所述防治蔬菜卵菌病的生物制剂的使用时期为蔬菜种子期、苗期和/或成株期。