CN102154122A - 一种瘤菌根真菌及其在促进环草石斛生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瘤菌根真菌EpulorhizarepensCG035菌株及其在促进环草石斛生长中的应用，CG035菌株的保藏编号为CCTCC NO.M2010370，可用于与环草石斛共生培养以促进环草石斛的生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种瘤菌根真菌及其在促进环草石斛生长中的应用。
背景技术
兰科植物与其菌根真菌存在着密切关系，在自然状态下兰科植物种子萌发成原球茎（根状茎）到第一片真叶长出阶段都需要菌根真菌，甚至有些有叶幼苗的生长发育完全依赖或部分依赖菌根真菌，菌根真菌可为兰科植物提供N源、C源和矿物质。研究表明同种真菌可与多种兰科植物共生，研究报道兰科菌根真菌分泌B族维生素和赤霉素，对植物生长有影响。
环草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)为兰科石斛属多年生草本植物，为贵州地道药材，是我国传统名贵中药。环草石斛生长缓慢，自然繁殖系数低，但需求量却日益增多，虽然环草石斛组培已经成功，但组培苗移栽成活率低且生长缓慢，这阻碍着环草石斛的产业化发展。目前未见用外源兰科植物菌根真菌对环草石斛生长方面的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有环草石斛生长缓慢，繁殖系数低、成活率低的缺陷，提供一种瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株及其在促进环草石斛生长中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明利用兰科植物与其内生真菌专一性低的特点，用春兰（Cymbidium georingii Rchb.f.）菌根真菌与环草石斛接种共生，筛选出促进环草石斛组培苗生长的菌株，以期提高环草石斛组培苗移栽成活率和提高产量，为生产促进环草石斛生长的微生物肥料打下基础。
本发明瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株。将贵州春兰（Cymbidium georingii Rchb.f.）的根洗净，参照单菌丝团分离法（专利号：ZL200610051196.2），接种在PDA培养基上，纯化，保存于4℃备用，培养后与环草石斛共生，经系列生长指标评价试验筛选获得。该CG035菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生科院保藏中心；邮编：430072），其保藏编号是CCTCC NO.M 2010370，保藏日期为2010年12月28日，分类命名为瘤菌根真菌，拉丁文学名为Epulorhiza repens。
上述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株的生物学形态特征描述为：在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚度均匀，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0.088mm/h，菌丝直径2.27～5.37μm，细胞长13.05～98.65μm，念珠状细胞球形,常形成长链，大小6.17～18.25×7.47～16.35μm，菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
前述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1。
前述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370在促进环草石斛生长中的应用。
本发明还提供了一种瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370与环草石斛共生培养的方法：将在PDA培养基上活化的瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株用孔径为5.0mm的打孔器打取菌片，接种在共生培养基上，培养15天，在无菌条件下将3～4叶组培苗接入共生培养基中，自然条件下的温度和光照培养。
上述方法中所述的共生培养基是由蛭石、锯木屑和苔鲜组成，其体积比为1:1:1。
前述共生培养基在121℃灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次。
上述技术方案中的瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370的微生物学特征如下：
1、形态特征：在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚度均匀，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0.088mm/h，菌丝直径2.27～5.37μm，细胞长13.05～98.65μm，念珠状细胞球形,常形成长链，大小6.17～18.25×7.47～16.35μm，菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
2、生理生化特征：纤维素酶活阳性，多酚氧化酶活阴性。
3、菌丝体所含物质：菌丝体含有B族维生素和赤霉素。
具有上述特征的菌株，参照（Currah R.S. et al.，1997)等资料，综合生理生化特征，ITS序列结果，鉴定为瘤菌根真菌（Epulorhiza repens），命名为CG035。
与现有技术相比，本发明是一种新的瘤菌根真菌，鉴定为CG035菌株，保藏编号为CCTCC NO.M2010370，发明人对其促进环草石斛生长的作用进行了验证：
1、瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株的分离
将贵州春兰的根洗净，参照单菌丝团分离法（专利号：ZL200610051196.2），接种在PDA培养基上，纯化，得瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株，保存于4℃备用。
2、将在PDA培养基上活化的CG035菌株用孔径为5.0mm的打孔器打取菌片，接种在共生培养基质(蛭石：锯木屑：苔鲜的体积比为1：1：1，在121℃灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次)上，培养15天，在无菌条件下将3～4叶的组培苗接入共生培养基中，每瓶接种3颗苗，簇拥，重复5瓶，每瓶苗根数、茎长、茎粗细大致一致。自然条件下的温度和光照，培养80天。
3、环草石斛组培苗的生长和重量测定
接种前，在无菌情况下洗去祖培苗上的琼脂，再用滤纸吸干表面水分，用电子天平准确称量环草石斛组培苗的重量，并记录根的数量和长度，茎高和茎宽。培养80天后，将苗从组培瓶（罐头瓶）中取出，小心洗去培养基及附着于根上的菌丝，用滤纸吸干表面水分，称重，与接种真菌前的苗重、苗高、根数、根长、茎粗相减即得苗重、苗高、根数、根长、茎粗增加；利用SPSS软件进行单因素方差分析。结果如表1所示。
表1 共培养80天瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株对环草石斛生长效应
以上数据是5个重复的均数及标准误，进行单因素方差分析，显著性水平 P＜0.05, *为显著性差异。
从表1看出，瘤菌根真菌（Epulorhiza repens）CG035菌株与环草石斛组培苗的共生形成菌根结构，对环草石斛组培苗茎高、茎宽及鲜重、原根保留数、根数增加数、新根增加数、新侧苗增加数都有所增加，其中原根保留数与对照的差异性达到显著性。所筛选得到的CG035菌株对环草石斛具有促生作用，可以提高环草石斛的移栽成活率。
附图说明
本发明的瘤菌根真菌（Epulorhiza repens）CG035菌株，已于2010年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC NO：M 2010370。
图1是瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370的平板照片；
图2是瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370的念珠状细胞照片；
图3是瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370的细胞核照片；
图4是瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370的桶孔隔膜照片；
图5是瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370对环草石斛促生作用图。
具体实施方式
实施例1：本发明瘤菌根真菌的获得
将贵州春兰的根洗净，参照单菌丝团分离法（专利号：ZL200610051196.2），接种在PDA培养基上，纯化，得瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株，保存于4℃备用。
实施例2：实施例1所得CG035菌株与环草石斛组培苗的共生培养
将在PDA培养基上活化的CG035菌株用孔径为5.0mm打孔器打取菌片，接种在共生培养基上(蛭石：锯木屑：苔鲜的体积比为1：1：1，在121℃灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次)，培养15天，在无菌条件下将3～4叶组培苗接入共生培养基中，自然条件下的温度和光照培养。
实施例3：本发明瘤菌根真菌的鉴定
形态特征鉴定：参照鉴定方法（Currah R.S. et al.，1997；Moore R. T.,1987），检测其生长速度，菌丝、念珠状细胞大小，核数，菌丝隔桶孔隔膜有无，有无穿孔，形状等。结果表明：该菌标准BDPDA培养基生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚薄均匀，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0.088 mm/h，菌丝直径2.27～5.37μm，细胞长13.05～98.65μm，念珠状细胞球形,常形成长链，大小6.17～18.25×7.47～16.35μm，菌丝有隔，细胞核为双核。菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
生理生化特征鉴定：参照（Zelmer CD,1994）对瘤菌根真菌（Epulorhiza repens）的纤维素酶活及多酚氧化酶活进行检测，结果为纤维素酶活阳性，多酚氧化酶活阴性。
ITS基因的PCR扩增和序列测定：采用PDA平板培养，待菌落长至平板直径一半时收集菌丝。采用改良的CTAB法（Ming MA，2003）提取DNA，正向通用引物选用ITS1（F）5：TCC GTA GGT GAA CCG GCG G，反向通用引物选用ITS4（R）5：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC，25μl反应体系进行PCR扩增ITS序列，PCR反应程序：循环前94℃变性3min，30次循环（94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min），72℃再延伸5min。把PCR产物直接送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。ITS序列长度是616bp，在Genebank中的登陆号为HQ833210，与Tulasnella calospor相近性为99%。从进化树可以看出，CG035与Tulasnella calospor的亲缘关系近，结合形态学鉴定结果，本发明所述菌株为Tulasnella calospor的无性型Epulorhiza repens。
实施例4：瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株产B族维生素和赤霉素检测试验
混标的配制及标准峰的确定：取VB1、VB3（烟酸）、菸酰胺、VB2、赤霉素等标样配制成混标，混标中各标样的浓度分别为VB1 0.088mg/ml，VB3 0.046mg/ml，菸酰胺0.046mg/ml，VB20.04 mg/ml，赤霉素0.042mg/ml，取20ul混标进样，利用岛津高效液相色谱仪HPLC-20AT检测，获得标准峰。
瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株菌丝B族维生素和赤霉素的测定方法：收集用PDA液体培养基培养的菌丝，去除接种的菌片，利用蒸馏水反复冲洗4-5次，取菌丝1克放入试管，用2ml 0.05mol/L盐酸浸泡，超声波处理30min左右，过滤，取20ul滤液进样，岛津高效液相色谱仪HPLC-20AT检测结果。
菌根真菌菌丝中B族维生素和赤霉素含量的计算公式：
样品中所测目标含量= 混标中目标含量×（样品峰面积/混标中峰面积）
通过检测，本发明提供的瘤菌根真菌（Epulorhiza repens）CG035菌株产生VB1 50μg/g，烟酸VB3 3.6μg/g，菸酰胺0.7μg/g，VB2 0.66 μg/g，赤霉素2.2 μg/g。
序 列 表
<110> 贵州省果树科学研究所
<120>一种瘤菌根真菌及其在促进环草石斛生长中的应用
<160> 1
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 616
<212> DNA
<213> 瘤菌根真菌（Epulorhiza repens）
<220>
<221> misc_feature
<222> (80,100,112)
<223> （1）…(616)
<400> 1
acctgcggaa ggatcatagt aatcgtcttt gacgttcgct tattccgttg tcctcgggac 60
gttaaattgc tctggtcgag gataaatgac ccctctgacc gaggtaaaac ccgtcgctct 120
gtgttacctc tgaggcacac gttaaagatc gttccgcgtt gtgagtctaa caccagttgt 180
ataaactttt tacaaccggt agcgatggat cccttggcac gtcattcgat gaagaccgtt 240
gcaaattgcg ataaagtgat gtgatgcgca agtccaccac ttatacgtga atcatcgagt 300
tgttgaacgc attgcaccgc gccctaatcc ggctgcggta tgcccctttg agcgtcattg 360
tattccttcg ggagtccttt ttacaaagga cccgagttcg gagtcctcgg tcctctggat 420
cgtgttctct tagatgcgtc gcaccgatcg cctgatgggt ctctaatgcc taagcgtgga 480
gttccttcag agtctgagac gtgcttgacc gggtgttgag ctcgcgtcac caagtctgcc 540
tcacaagcag tactacaacg catgacctca ttggggtagg acaacccgct agacttaagc 600
atatcaataa ggcgga 616
Claims (7)
1.瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株，其保藏编号为CCTCC NO.M2010370。
2.按照权利要求1所述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370，其特征在于：生物学形态特征描述为：在标准BDPDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌丝乳白色，蜡质，菌落边缘整齐，厚度均匀，菌落边缘侵入培养基生长，后期产生稀疏白色蛛网状气生菌丝，菌丝生长速度0.088mm/h，菌丝直径2.27～5.37μm，细胞长13.05～98.65μm，念珠状细胞球形,常形成长链，大小6.17～18.25×7.47～16.35μm，菌丝有隔，细胞核为双核，菌丝隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形。
3.按照权利要求1所述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1。
4.瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370在促进环草石斛生长中的应用。
5.瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于：将在PDA培养基上活化的瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株用孔径为5.0mm的打孔器打取菌片，接种在共生培养基上，培养15天，在无菌条件下将3～4叶组培苗接入共生培养基中，自然条件下的温度和光照培养。
6.按照权利要求5所述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于：所述共生培养基是由蛭石、锯木屑和苔鲜组成，其体积比为1:1:1。
7.按照权利要求6所述瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO.M2010370与环草石斛共生培养的方法，其特征在于：所述的共生培养基在121℃灭菌1小时，1天后同样方法再灭菌一次。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
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Granted publication date: 20130130 Termination date: 20140121 |