CN102153625A - 抗Titin抗体识别的优势抗原表位及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗Titin抗体识别的优势抗原表位。它具有下列所示的氨基酸序列：位于抗原的103-115位点、76-187位点、13211-13227位点，多肽序氨基酸序列分别为：CEQWVDYNLKWNPD、IVTHFPFDEQNC、EIIVTHFPFDEQNCSMK。抗Titin抗体识别的优势抗原表位用于制备重症肌无力药物及诊断试剂盒。本发明通过微阵列和芯片诊断技术筛选有效性好的抗Titin抗体识别的优势抗原表位，进而可以通过化学合成或基因工程表达重组的方法制备相应多肽，并用多肽制备抗体作为探针，开发重症肌无力药物及诊断试剂。上述方法克服了传统抗原抗体制备方法及药物筛选方法的繁琐，不仅大大减少了分别检测的人力和物力，而且同时分析时克服了实验室的检测误差，为重症肌无力相关疾病治疗和血清学诊断开辟了新路。
Description
技术领域
本发明涉及抗Titin抗体识别的优势抗原表位及其应用。
背景技术
重症肌无力个体中，约85％的患者体内存在针对AChR分子的自身抗体，致病性自身抗体的主要结合靶点位于AChR分子亚单位上的主要免疫原性区(main immunogenic region，MIR)。依赖抗体的补体溶解作用是AChR分子破坏的主要原因；同时抗体介导的抗原调变作用也加速了AChR分子的内化和溶酶体的降解作用，使得AChR分子的半衰期由7d降至2d，体内神经突触后膜上功能性AChR分子的数量急剧减少。在单纯眼外肌型患者体内，仅有50％的血清学阳性率，而这些患者自身性抗体的主要结合靶点是胎儿型AChR分子。胎儿型AChR分子与成人型AChR分子最大的区别是AChR五聚体分子中的亚单位替代了t亚单位。胎儿型AChR分子主要分布于眼外肌，因此这类自身抗体导致了患者单纯眼外肌受累，而无其它相关临床症状出现。重症肌无力患者血清中除乙酰胆碱受体抗体(AchRab)外，还可以检测到其他自身抗体。如抗肌动蛋白(actin)抗体、肌球蛋白(myosin)抗体、辅肌动蛋白(α-actinin)抗体、肌联蛋白(titin)抗体、AChR分子相关瞄定蛋白(mpsyn)抗体和肌肉特异性酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase Musk)抗体等。在这些自身抗体中，尤其是Titin在重症肌无力伴胸腺瘤患者和重症肌无力晚期中与疾病进展密切相关[5-7]。
调节性T(Treg)细胞在自身免疫性疾病和肿瘤发生发展中起重要作用。现有研究已证实肿瘤组织局部表现为Treg细胞免疫功能抑制，激活Treg细胞可导致动物移植肿瘤消退；而在自身免疫性疾病中Treg细胞免疫功能过度激活。因而抑制Treg细胞功能可能是自身免疫性疾病治疗的新方法。筛选和鉴定抗原特异性Treg细胞是免疫治疗的前提和基础。重症肌无力中95％的患者外周血可检测到抗Titin抗体，表明Titin在重症肌无力患者中是优势识别抗原，提示重症肌无力患者中存在Titin特异性Treg细胞，可从Titin蛋白分子中筛选和鉴定抗原特异性Treg细胞识别的抗原线性表位。Titin是个巨大的微丝状蛋白质，在横纹肌中单一的Titin跨越半个肌小节。Titin从Z-盘状转变为M-线状在肌肉结构、功能和发育过程中起重要作用。
微阵列和芯片诊断技术具有同时对几十个，乃至数万个基因或蛋白质进行分析，不仅大大减少了分别检测的人力和物力，而且同时分析时克服了实验室的检测误差。本研究采用生物信息学的手段，在微阵列检测的基础上，分别对单个表位抗体的诊断有效性进行评估，通过对其有效性的不断拟合，克服了单个检测得的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供抗Titin抗体识别的优势抗原表位及其应用。
抗Titin抗体识别的优势抗原表位是具有下列所示的氨基酸序列：位于抗原的103-115位点、76-187位点、13211-13227位点，多肽序氨基酸序列分别为：CEQWVDYNLKWNPD、IVTHFPFDEQNC、EIIVTHFPFDEQNCSMK。
抗Titin抗体识别的优势抗原表位的应用用于制备重症肌无力药物及诊断试剂盒。
本发明通过微阵列和芯片诊断技术筛选有效性好的抗Titin抗体识别的优势抗原表位，进而可以通过化学合成或基因工程表达重组的方法制备相应多肽，并用多肽制备抗体作为探针，开发重症肌无力药物及诊断试剂。上述方法克服了传统抗原抗体制备方法及药物筛选方法的繁琐，不仅大大减少了分别检测的人力和物力，而且同时分析时克服了实验室的检测误差，本研究采用生物信息学的手段，在微阵列检测的基础上，分别对单个表位抗体的诊断有效性进行评估，通过对其有效性的不断拟合，克服了单个检测得的不足，并筛选出P5、P6、P9优势抗原表位，为重症肌无力相关疾病治疗和血清学诊断开辟了新路。
根据生物信息学方法设计9条针对Titin蛋白胞外区多肽序列，并与牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶联、点制蛋白质微阵列、检测蛋白质微阵列、对微阵列检测阳性结果分别用酶联免疫吸附(ELISA)法进行验证。
附图说明
图1是重症肌无力患者血清针对P1-P9多肽自身抗体阳性例数；
图2是本发明的P5、P6和P9识别表位交叉性鉴定；
图3是本发明的酶联免疫吸附反应(ELISA)验证试验。
具体实施方式
抗Titin抗体识别的优势抗原表位是具有下列所示的氨基酸序列：位于抗原的103-115位点、76-187位点、13211-13227位点，多肽序氨基酸序列分别为：CEQWVDYNLKWNPD、IVTHFPFDEQNC、EIIVTHFPFDEQNCSMK。
抗Titin抗体识别的优势抗原表位的应用用于制备重症肌无力药物及诊断试剂盒。
实施例1：多肽设计和蛋白质偶联
根据生物信息学方法设计9条针对Titin蛋白胞外区多肽序列见表1。多肽合成采用固相合成法(SPPS)，合成后的多肽再采用琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)双功能交联剂在多肽巯基端与牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶联。
表1.合成多肽序列
实施例2：蛋白质微阵列点制
用BCD法调整各蛋白浓度后，用蛋白点样仪按8×12的方式将各多肽-BSA偶联蛋白点样于硝酸纤维膜(100ng/点)，每个多肽检测重复6次，同时设立β-肌动蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内参照，待干燥后，用5％小牛血清封闭后，备用。
实施例3：蛋白质微阵列检测
将待检稀释血清(1∶100，用5％小牛血清稀释)与微阵列芯片反应室温2h，用含0.5％Tween 20的0.01Mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5次，再加入碱性磷酸酶标记的二抗室温1h，用含0.5％Tween 20的0.01Mol/L，pH7.4的PBS洗涤4次和无Tween 20的0.01Mol/L，pH7.4PBS洗涤1次，最后加入CDP-star发光底物，曝光显色1min。将微阵列检测结果转换成TIFF图片格式后，用Array2.0 version软件分析，凡反应信号与对照比较相差1.5倍以上者，为阳性，否则为阴性。
实施例4：微阵列结果验证：对微阵列检测阳性结果分别用酶联免疫吸附(ELISA)法进行验证。将各多肽-BSA偶联蛋白以1μg/mL浓度包被微孔，过夜，次日取出，用含0.5％Tween 20的0.01Mol/L，pH7.4PBS洗涤3次，用5％小牛血清封闭后，加入100μL用5％小牛血清1∶100稀释的待检稀释血清，37C反应2h，洗涤5次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温1h，洗涤5次，最后加入邻苯二胺底物100μL/孔，室温避光显色5-10min。加入50μL/孔硫酸终止反应，在490nm处测各孔吸光度(A)。凡A值≥对照1.5倍者，判为阳性，否则为阴性。
在84例MG血清中，51例抗多肽自身抗体阳性，阳性率为60.71％。经蛋白质微阵列方法筛选，结果表明，在设计的9条多肽抗原中，针对多肽P5、P6和P9的阳性例数高于其他各多肽(见图1)。经卡方检验，P＜0.05。说明P5、P6和P9是优势识别表位。
为鉴定P5、P6和P9识别表位有无交叉性，我们分析了各样本之间的共同阳性情况。发现P5与P9多肽共同阳性有8例(44.4％)，而P5与P6多肽、P6与P9多肽间共同阳性例数明显低于P5与P9多肽间(见图2)，P＜0.05。P5、P6和P9均阳性的血清仅2例。结果表明，自身抗体识别的P5与P9多肽表位存在交叉性。
将微阵列检测阳性结果分别用ELISA法进行验证，结果100％重复；并且均能被多肽抗原阻断，说明自身抗体与多肽结合呈特异性，蛋白质微阵列方法筛选有效性好，进一步就可以将其用于制备相关药物及诊断试剂。
Claims (2)
1.抗Titin抗体识别的优势抗原表位，其特征在于具有下列所示的氨基酸序列：位于抗原的103-115位点、76-187位点、13211-13227位点，多肽序氨基酸序列分别为：CEQWVDYNLKWNPD、IVTHFPFDEQNC、EIIVTHFPFDEQNCSMK。
2.如权利要求1所述的抗Titin抗体识别的优势抗原表位的应用，其特征在于用于制备重症肌无力药物及诊断试剂盒。
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| CN2010102060282A CN102153625A (zh) | 2010-06-22 | 2010-06-22 | 抗Titin抗体识别的优势抗原表位及其应用 |
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| CN (1) | CN102153625A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109374899A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-02-22 | 上海飞晟生物科技有限公司 | 一种用于检测抗mda5抗体的elisa试剂盒及其检测方法 |
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2010
- 2010-06-22 CN CN2010102060282A patent/CN102153625A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN109374899A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-02-22 | 上海飞晟生物科技有限公司 | 一种用于检测抗mda5抗体的elisa试剂盒及其检测方法 |
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