CN102153612A - 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法 - Google Patents

罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102153612A
CN102153612A CN 201010617287 CN201010617287A CN102153612A CN 102153612 A CN102153612 A CN 102153612A CN 201010617287 CN201010617287 CN 201010617287 CN 201010617287 A CN201010617287 A CN 201010617287A CN 102153612 A CN102153612 A CN 102153612A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mogroside
reaction
hapten
bsa
artificial antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201010617287
Other languages
English (en)
Inventor
段小群
杨新平
李勇文
李丽
卢曦
陈旭
李芳耀
林家逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guilin Medical University
Original Assignee
Guilin Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guilin Medical University filed Critical Guilin Medical University
Priority to CN 201010617287 priority Critical patent/CN102153612A/zh
Publication of CN102153612A publication Critical patent/CN102153612A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原及其制备方法，所制备的罗汉果苷V人工半抗原的结构式为：罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的结构式为：罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的结构式为：
Figure 251517DEST_PATH_IMAGE006
其制备方法是：以罗汉果甜苷V为原料，以吡啶为溶剂，利用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯(罗汉果甜苷V-HS)，得到人工半抗原；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之分别与牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)结合，制得罗汉果甜苷V人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA复合物和罗汉果甜苷V-HS-HAS复合物，用红外光谱和紫外光谱鉴定罗汉果甜苷V人工抗原，这为后续的罗汉果甜苷V抗血清的制备和抗血清效价的检测提供了可靠的实验基础。

Description

罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体是罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原及其制备方法。
背景技术
免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分析的药物。免疫分析不仅为临床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用，而且在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有所进展。免疫分析具有检测灵敏度高、特异性强、前处理简单、反应速度快、检测费用低廉，适于现场监控和大批量样品分析的特点。
罗汉果甜甙V为葫芦素烷三萜类化合物是罗汉果的主要有效成分,在罗汉果干果中的总含量为3.755%-3.858%。罗汉果甜苷V在医药领域与食品工业方面运用非常广泛，其社会需求呈逐年上升趋势。罗汉果甜苷V为小分子天然化合物，相对分子质量较小，仅具有反应原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法检测，需要与大分子蛋白等偶联形成复合物后才能成为完全抗原。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种罗汉果甜苷V的半抗原和人工抗原；
本发明的另一个目的是要提供上述罗汉果甜苷V的半抗原和人工抗原的制备方法，所制备出的产品可用于诱导生成抗罗汉果甜苷V特异性抗体的免疫方法研究，可用于罗汉果甜苷V特异性抗体效价的检测，其制备方法合成步骤简单，条件温和，产率较高。
本发明的目的通过如下技术方案来实现：
一种罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原的制备方法，以罗汉果甜苷V为原料，利用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯(罗汉果甜苷V-HS)，得到罗汉果甜苷V人工半抗原，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之分别与牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)结合，制得罗汉果甜苷V人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA复合物和罗汉果甜苷V-HS-HAS复合物，用红外光谱和紫外光谱鉴定罗汉果甜苷V人工抗原，测定其结合比；其反应方程式为：
（1）罗汉果甜甙V-HS人工半抗原
Figure 923611DEST_PATH_IMAGE001
（2）罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原
罗汉果甜苷V-HS           牛血清蛋白      罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原
（3）罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原
Figure 745122DEST_PATH_IMAGE003
罗汉果甜苷V-HS            人血清蛋白       罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原
本发明所述一种罗汉果甜苷V-HS半抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏的吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应；
2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3）取反应液用氯仿和甲醇制备薄层，得油状纯罗汉果甜苷V-HS半抗原，置于4℃冰箱保存，所述氯仿与甲醇的体积比为V氯仿∶V甲醇=1∶1。
本发明所述一种罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应；
2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；
4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存，
步骤4）所述BSA-碳酸缓冲液是将10mgBSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液。
本发明所述一种罗汉果甜苷V-HS-HAS人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应；
2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；
4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。
步骤4）所述HAS-碳酸缓冲液是将10mgHSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液。
本发明的优点是：本合成方法简便，本实验用罗汉果甜苷V和丁二酸酐为原料，以吡啶做溶剂，加4-二甲基氨基吡啶为催化剂，室温反应，合成出中间体罗汉果甜苷V-HS，中间体不需要分离，加入缩合剂N,N-二环己基碳二酰亚胺后，于室温下加入BSA（或HSA）碳酸缓冲液，较高产率地合成罗汉果甜苷V的人工抗原。
附图说明
图1为BSA、罗汉果甜苷V-HS和罗汉果甜苷V-HS-BSA抗原紫外扫描光谱图；
图2为HSA、罗汉果甜苷V-HS和罗汉果甜苷V-HS-HSA抗原紫外扫描光谱图；
图3为罗汉果甜苷V的红外光谱图；
图4为罗汉果甜苷V-HS红外光谱图；
图5为BSA红外光谱图；
图6为HSA红外光谱图；
图7为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原红外光谱图；
图8为罗汉果甜苷V-HS-HAS人工抗原红外光谱图。
具体实施方式
实施例1
罗汉果甜苷V-HS半抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）称取罗汉果甜苷V30.5mg（0.024mmol）、丁二酸酐23.6mg（0.236mmol）投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶3ml，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应3天；
2）TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液，取1/3反应液用于制备薄层（V氯仿∶V甲醇=1∶1），得少量油状纯罗汉果甜苷V-HS半抗原，置于4℃冰箱保存。
如图4所示，得到的罗汉果甜苷V-HS用红外光谱(IR)鉴定，分别取罗汉果甜苷V和罗汉果甜苷V-HS测它们的红外光谱，比较罗汉果甜苷V和罗汉果甜苷V-HS的红外光谱可以看出，罗汉果甜苷V-HS的红外光谱中出现了1733.89cm-1和1722.92cm-1信号，为C=O伸缩振动峰，说明反应产物具有酯羰基和游离-COOH结构，即罗汉果甜苷V-HS已合成。
实施例2
罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）称取罗汉果甜苷V30.5mg（0.024mmol）、丁二酸酐23.6mg（0.236mmol）投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶3ml，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应3天；
2）TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的1/3反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；
4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液（10mgBSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得15.20mg 偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。
如图7所示，产物用红外光谱（IR）和紫外光谱（UV）鉴定。分别测得BSA、罗汉果甜苷V-HS、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物（罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原）的紫外光谱，罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的紫外光谱最大吸收峰与BSA和罗汉果甜苷V-HS相比均发生了变化，初步说明人工抗原合成获得成功。以KBr压片，测出罗汉果甜苷V-HS、BSA、罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原的红外光谱。从红外光谱中可以看出，罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原及BSA的红外光谱在3600～3200cm-1区域具有相似的吸收，这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰，说明合成的偶联产物具有BSA的特征官能团。BSA在800～1000cm-1处没有吸收峰存在，而偶联产物的红外光谱在1067.4cm-1、1163.3cm-1处有较中强吸收峰存在，具有罗汉果甜苷V-HS的部分吸收峰特征，说明偶联产物有罗汉果甜苷V结构部分；进一步比较偶联产物与罗汉果甜苷V-HS的红外光谱，偶联产物结构中仍有1740.7cm-1峰（酯C=O伸缩振动峰），而-COOH羰基峰消失，推测-COOH与BSA中的氨基反应，据此进一步说明罗汉果甜苷V-HS与BSA偶联成功。
结合比的计算：
准确称取罗汉果甜苷V-HS（A）、BSA（B）、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物（C），用同一碳酸盐缓冲液配成确切的浓度。然后分别测定3种溶液在A物质和B物质最大吸收峰波长处（紫外扫描得）吸收值，即AAam、AAbm、ABam、ABbm、ACam、ACbm。计算出A物质和B物质吸收峰波长处的摩尔吸光系数，即KAam、KAbm；以及B物质在A和B吸收峰波长处的摩尔吸光系数，即KBam、KBbm。按以下公式计算A物质和B物质的摩尔分子比：
结合比=（ACam×KBbm－ACbm×KBam）/( ACbm×KAam－ACam×KAbm)
结合比=25.9~61.7
可以求出罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的结合比在25.9~61.7之间，本试验中人工合成的半抗原-蛋白复合物罗汉果甜苷V人工抗原的结合数值较大，说明半抗原与载体的偶联情况良好，这为后续的罗汉果甜苷V抗血清的制备提供了可靠的实验基础。
实施例3
罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1）称取罗汉果甜苷V30.5mg（0.024mmol）、丁二酸酐23.6mg（0.236mmol）投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶3ml，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应3天；
2）TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的1/3反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；
4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液（10mgHSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
4）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得14.5mg 罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。
如图8所示，产物用红外光谱（IR）和紫外光谱（UV）鉴定，分别测得HSA、罗汉果甜苷V-HS、罗汉果甜苷V-HS与HSA的偶联物（罗汉果甜苷V-HSA人工抗原）的紫外光谱，罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的紫外光谱最大吸收峰与HSA和罗汉果甜苷V-HS相比均发生了变化，初步说明人工抗原合成获得成功。以KBr压片，测出罗汉果甜苷V-HS、HSA、罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的红外光谱。从红外光谱中可以看出，罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原及HSA的红外光谱在3600～3200cm-1区域具有相似的吸收，这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰，说明合成的偶联产物具有HSA的特征官能团。HSA在800～1200cm-1处没有吸收峰存在，而偶联产物的红外光谱在1067.5cm-1、1161.9cm-1处有较中强吸收峰存在，具有罗汉果甜苷V-HS的部分吸收峰特征，说明偶联产物有罗汉果甜苷V-HS结构部分；进一步比较偶联产物与罗汉果甜苷V-HS的红外光谱，偶联产物结构中仍有1738.8cm-1峰（酯C=O伸缩振动峰），而-COOH羰基峰消失，推测-COOH与BSA中的氨基反应，进一步说明人工抗原制备成功。
结合比的计算按实施例2进行：
结合比=（ACam×KBbm－ACbm×KBam）/( ACbm×KAam－ACam×KAbm)
结合比=38.1~90.3
可以求出罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的结合比在38.1~90.3之间，本试验中人工合成的半抗原-蛋白复合物罗汉果甜苷V人工抗原的结合数值较大，说明半抗原与载体的偶联情况良好，这为后续的罗汉果甜苷V抗血清效价的检测提供了可靠的实验基础。

Claims (8)

1.一种罗汉果甜苷V半抗原，其特征是：以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯制得，其结构式为：
Figure 2010106172874100001DEST_PATH_IMAGE001
                                         。
2.一种罗汉果甜苷V半抗原的制备方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
（1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏的吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室温下反应；
（2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
（3）取反应液用氯仿和甲醇制备薄层，得油状纯罗汉果甜苷V-HS半抗原，置于4℃冰箱保存，所述氯仿与甲醇的体积比为V氯仿∶V甲醇=1∶1。
3.一种罗汉果甜苷 V-HS-BSA人工抗原，其特征是：以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯制得，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之与牛血清蛋白-BSA结合制得，其结构式为：
Figure 2010106172874100001DEST_PATH_IMAGE002
                                             。
4.一种罗汉果甜苷 V-HS-BSA人工抗原的制备方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；
2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；
4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：步骤4）所述BSA-碳酸缓冲液是将10mgBSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液。
6.一种罗汉果甜苷 V-HS-HSA人工抗原，其特征是：以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯制得，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之与人血清蛋白-HAS结合制得，其结构式为：
Figure 2010106172874100001DEST_PATH_IMAGE003
                                             。
7.一种罗汉果甜苷 V-HS-HSA人工抗原的制备方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；
2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；
4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；
5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是：步骤4）所述HAS-碳酸缓冲液是将10mgHSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液。
CN 201010617287 2010-12-31 2010-12-31 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法 Pending CN102153612A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010617287 CN102153612A (zh) 2010-12-31 2010-12-31 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010617287 CN102153612A (zh) 2010-12-31 2010-12-31 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102153612A true CN102153612A (zh) 2011-08-17

Family

ID=44435319

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010617287 Pending CN102153612A (zh) 2010-12-31 2010-12-31 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102153612A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102253222B (zh) 检测雌激素的方法及其专用试纸
CN106831534B (zh) 酚酞半抗原、人工抗原及其制备方法
CN106290889A (zh) 黄曲霉毒素b1的检测方法
Zeng et al. Synthesis of haptens and gold-based immunochromatographic paper sensor for vitamin B6 in energy drinks and dietary supplements
CN106905318A (zh) 氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法
CN105712970B (zh) 一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用
CN104327183B (zh) 一种多效唑人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用
CN109324182A (zh) 一种检测二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN101671345A (zh) 一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法
CN103588661A (zh) 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备
CN103018440B (zh) 一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡
Pan et al. An ic-ELISA and immunochromatographic strip assay for the detection of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid in bean sprouts and cabbage
CN104710488B (zh) 一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法
CN102875512B (zh) 一种抗凝血鼠药大隆半抗原及完全抗原的制备方法
CN111978271B (zh) 噻螨酮半抗原及其制备方法、噻螨酮抗原、抗体及其应用
CN105085665A (zh) 维生素b2的偶联物及其制备方法与应用
CN102153612A (zh) 罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法
CN107383225A (zh) 一种抗肿瘤的药物果聚糖羧酸酯及其合成方法
CN104513314A (zh) 地西泮单克隆抗体筛选及其用途
CN102942519B (zh) 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN108918859B (zh) 基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法
CN101333257A (zh) 甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体及其应用
CN105085298A (zh) 邻苯二甲酸二丁酯半抗原及其制备方法和用途
CN103073633A (zh) 一种抗5-羟甲基糠醛的抗体
CN102146116B (zh) 罗汉果甜苷v特异性抗血清的制备及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110817