CN102153498B

CN102153498B - 一种白藜芦醇类似物及其制备方法和应用

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Publication number: CN102153498B
Application number: CN201110060544.3A
Authority: CN
Inventors: 王玉强; 于沛; 刘伟; 刘铭; 程潜; 任俊兰
Original assignee: SOUTH CHINA CENTER FOR INNOVATIVE PHARMACEUTICALS; Jinan University
Current assignee: SOUTH CHINA CENTER FOR INNOVATIVE PHARMACEUTICALS; Jinan University
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2031-03-14
Also published as: CN102153498A

Abstract

本发明公开了白藜芦醇类似物及其制备方法和在治疗与老化或SIRT1酶活性相关的疾病中应用。本发明的白藜芦醇类似物，对DPPH自由基(DPPH?)，超氧阴离子自由基(O₂ ^?-)，氢氧阴离子自由基(OH?)及过氧氮自由基(ONOO?)都具备清除作用，具备优良的抗氧化活性。部分衍生物是SIRT1酶激活剂，有的是优良的SIRT1酶抑制剂。

Description

一种白藜芦醇类似物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种药用化合物及其制备方法和应用，特别涉及一种白藜芦醇类似物及其制备方法和应用。

背景技术

在氧代谢过程中，人体会产生出多种活性氧簇自由基 (ROS)，同时人体也有多种使ROS失去活性的机制。在正常状态下，ROS的产生速率不会超过组织代谢它们的能力，但是在某些情况下，ROS会升高到超出这些保护机制的水平。此时，过多的ROS将进攻蛋白质、脂肪和DNA，造成细胞和组织损坏，致使机体老化，导致多种疾病，如中风、缺血再灌注、心血管疾病、癌症和神经性疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、霍奇金病等。

沉默信息调节因子 (silent information regulator 2，SIR2) 及其同源基因对细胞的生存、衰老、凋亡等生理活动起十分重要的调节作用，可能是所有生物共同的控制寿命的基因之一。在各种物种中发现的SIR2的同源蛋白质统称为Sirtuins家族。哺乳动物的Sirtuins家族有7个成员(SIRT1～SIRT7)，其中SIRT1与SIR2的同源性最高，因此受到广泛关注。SIRT1是一种依赖于NAD的去乙酰化酶，它以许多非组蛋白和组蛋白为底物，与代谢综合征、基因稳定性、肿瘤、神经退行性疾病的发生相关。SIRT1激活剂具备抗氧化活性，可以用于治疗一些代谢综合征，且具备神经保护活性。SIRT1抑制剂可以用于对抗癌症。SIRT1可作为治疗不同疾病的靶点。

白藜芦醇 (Resveratrol) 是一种广泛存在于自然界的具有二苯乙烯结构的植物抗毒素。研究表明白藜芦醇是一种SIRT1激动剂，能清除自由基，具有多种多样生理活性，主要包括：抗癌作用，对心血管系统的保护作用，抗真菌作用，抗氧化、抗自由基作用，抗炎作用，植物雌激素作用，机体损伤的保护作用，对骨代谢和内皮素拮抗剂的影响，保肝、利肝作用等。其中，最令人瞩目和最有潜在应用价值的是其在抗癌、抗氧化、心血管保护方面的作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供白藜芦醇类似物。

本发明的另一个目的在于提供上述白藜芦醇类似物的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供上述白藜芦醇在治疗与老化或SIRT1酶活性相关的疾病中应用。

白藜芦醇类似物，其通式如式Ⅰ所示，

Figure 2011100605443100002DEST_PATH_IMAGE002

式中，Ar为

式（a）、

式（b）或式（c）中的一种，基中，R₁、R₂、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈为 H、烷基、芳基、杂环芳烃或者酰基，R₁、R₂、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈相同或不同；

R₃为H、羟基、烷基、芳基或者为含有酯基、肟、硫代酰胺、硝酮结构的基团；

X，Y相同或不同，为C或N。

优选的，Ar为式（a）所示的基团，R₃不为H。进一步的，R₃为羟基或含有硫代酰胺、丙炔胺、叔丁基胺、硝酮结构的基团。再一步的，R₃为CH₂NHR9、CH=NR9、CH=NOC(CH3)3或者CH2OH，其中R9为NHCSNH₂、CHC≡CH或者C(CH₃)₃；特别的R₁、R₂和R₄为H或甲基， R₁、R₂和R₄相同或不同。最佳的，其结构式如式（Ⅱ）或（Ⅲ）所示，

。

Ar为式（b）或式（c）所示的基团，X、Y均为N，R₁、R₂和R₄为H或甲基，R₁、R₂和R₄相同或不同，R₃、R₈为H。

制备上述优选的白藜芦醇类似物的方法，包括将化合物A与含伯胺基团的相应分子在乙醇中加热回流，通过胺-醛反应得到，其反应方程式如下：

相应的含有伯胺基团的分子包括氨基硫脲、叔丁基氨、炔丙胺。

制备上述优选的白藜芦醇类似物的方法，包括将特硝基丁烷与活性Zn反应得到的白色固体与化合物A反应得到，其反应方程式如下：

。

制备上述优选的白藜芦醇类似物的方法，通过将化合物A的醛基还原得到，其反应方程式如下：

。

本发明的白藜芦醇类似物，对DPPH自由基 (DPPH•)，超氧阴离子自由基 (O₂ ^•-)，氢氧阴离子自由基 (OH•) 及过氧氮自由基 (ONOO•) 都具备清除作用，具备优良的抗氧化活性。部分衍生物是SIRT1酶激活剂，式（Ⅲ）所示的化合物是优良的SIRT1酶抑制剂。因此，本发明的白藜芦醇类似物，可用于治疗与老化或SIRT1酶活性相关的疾病如中风、缺血再灌注、心血管疾病、癌症和神经性疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、霍奇金病等疾病。

附图说明

图1是白藜芦醇(RV)及其主要衍生物对DPPH• 自由基的清除作用效果图；

图2是白藜芦醇及其衍生物2a对超氧阴离子 (O₂ ^•-) 自由基的清除作用效果图；

图3是白藜芦醇及其衍生物2a对氢氧阴离子 (OH•) 自由基的清除作用效果图；

图4是白藜芦醇及其衍生物2a对过氧氮自由基 (ONOO•) 的清除作用效果图；

图5是SIRT1试剂盒的标准曲线；

图6是白藜芦醇及其衍生物对SIRT1酶活性的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

2-(2 ，4- 二羟基-6-(4- 羟基苯乙烯基) 苯亚甲基)- 肼并硫代酰胺(1a) 的制备

反应方程式如下：

256 mg (1 mmol) (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基) 256 mg (1 mmol)苯甲醛溶于无水乙醇溶液中，加入112 mg (1.5 mmol) 氨基硫脲的盐酸盐，加热回流搅拌2 h，蒸除部分乙醇，加入适量的Na₂CO₃中和HCl，过滤，水洗，乙酸乙酯/石油醚 (1：2) 柱层析分离得到淡蓝色固体180 mg，产率54.7%。

ESI-MS: 320.1[M+H]⁺; ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 2.08 (s, 2 H), 6.24 (d, 1 H , J = 1.8 Hz), 6.56 (t, 1 H, J = 6.9 Hz), 6.78 (d, 2 H, J = 8.7 Hz), 6.85 (s, 1 H), 6.90 (s, 1 H), 7.31 (s, 1 H), 7.42 (d, 2 H, J = 24 Hz), 8.67 (s, 1 H), 9.63 (s, 1 H), 11.16 (s, 1 H); 元素分析：C₁₆H₁₅N₃O₃S﹒H₂O 实测值(%): C 55.76%, H 4.95%, N 12.25%. 理论值(%): C 55.49%, H 4.91%, N 12.14%。

实施例2

2-(2- 羟基-6-(4- 羟基苯乙烯基)-4- 甲氧基苯亚甲基)- 肼并硫代酰胺(1b) 的制备

如实施例1所示，不同的是用 (E)-2-羟基-4-甲氧基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛 (270 mg，1 mmol) 代替 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛。得淡蓝色固体283 mg，产率85%。

ESI-MS: 334.2[M+H]⁺; ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 3.78 (s, 3 H), 6.26 (d, 1 H, J = 1.8 Hz), 6.58 (d, 1 H, J = 2.1 Hz), 6.89 (s, 1 H), 6.97 (d, 2 H, J = 6.6 Hz), 7.44 (d, 1 H, J = 12 Hz), 7.54 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 8.06 (s, 1 H), 8.67 (d, 1 H), 9.95 (s, 1 H), 10.04 (s, 1 H), 11.18 (s, 1 H)。

实施例3

2-(2- 羟基-4- 甲氧基-6-(4- 甲氧基苯乙烯基) 苯亚甲基)- 肼并硫代酰胺(1c) 的制备

如实施例1所示，不同的是用 (E)-2-羟基-4-甲氧基-6-(4-甲氧基苯乙烯基)苯甲醛(284mg，1mmol) 代替 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛。淡黄色固体，325 mg，产率91%。

ESI-MS: 358.3[M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 3.79 (s, 6H), 6.42 (s, 1 H), 6.72 (s, 1 H), 6, 96 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.05 (d, 2 H, J = 15 Hz), 7.43 (d, 2 H, J = 8.5), 7.49 (d, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 11.46 (s, 1H); 元素分析：C₁₈H₁₉N₃O₃S 实测值 (%): C 59.88, H 5.59, N 11.62%. 理论值 (%): C 60.49, H 5.36, N 11.76。

实施例4

2-(2 ，4- 二甲氧基-6-(4- 甲氧基苯乙烯基) 苯亚甲基)- 肼并硫代酰胺(1d) 的制备

如实施例1所示，不同的是用 (E)-2， 4-二甲氧基-6-(4-甲氧基苯乙烯基)苯甲醛(298 mg，1 mmol) 代替 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛。淡黄色固体，334 mg，产率90%。

ESI-MS: 372.1[M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 3.79 (s, 3 H), 3.83 (s, 3 H), 4.01 (s, 3 H), 6.57 (s, 1 H), 6.85 (s, 1 H), 6.94 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.05 (d, 2 H, J = 15 Hz), 7.48 (d, 2 H, J = 8.5), 7.49 (d, 1H), 7.69 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 11.46 (s, 1H)。

实施例5

(E)-N-(2 ，4- 二羟基-6-(4- 羟基苯乙烯基) 苯亚甲基)-2- 甲基丙烷- 氧化胺(2a) 的制备

1) 向500 mL的三颈瓶中加入100 mL的95% 的乙醇，加入特硝基丁烷2.7 g (0.026 mol)，活性Zn 1.69 g (0.026 mol)，逐滴加入冰乙酸4.5 mL，确保温度不超过15℃；

2) 滴加完毕，室温搅拌3 h，过滤；

3) 滤液无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸除乙醇得到白色固体2.0 g (0.022 mol)；

4) 向50 mL三颈瓶中加入15 mL甲醇，加入实施例1中得到的 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛256 mg (1 mmol)；

5) 将上述反应生成的白色固体3 mmol溶解于8 mL甲醇中，并向三颈瓶中加入一半白色固体的溶液，氮气保护回流2 h，然后加入另一半溶液，加热回流16 h；

6) 乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离 (石油醚/乙酸乙酯 = 1：2) ，得到淡黄色的固体目标产物，165 mg，产率50.5%。黄色固体。

ESI-MS：328.5 [M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ )：1.54 (s, 9 H), 6.14 (s, 1 H), 6.51 (d, 2 H, J = 14.4 Hz), 6.78 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 6.82 (s, 1 H), 7.36 (d, 2 H, J = 15.9 Hz), 7.47 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 8.09 (d, 1 H, J = 5.1 Hz), 9.65 (s, 1 H), 9.91 (s, 1 H), 12.63 (s, 1 H); 元素分析C₁₉H₂₁NO₄ (实测值) %: C 69.40, H 6.28, N 3.94. (理论值)%: C 68.01 (69.71), H 6.88 (6.47), N 3.68 (4.28)。

实施例6

4-((tert- 丁基胺) 甲基)-5-(4- 羟基苯乙烯基) 苯-1,3- 二醇(2b) 的制备

4-((tert-丁基胺)甲基)-5-(4-羟基苯乙烯基)苯-1，3-二醇的制备同实施例5所示。不同指出在于活性Zn的量为 3.38 g，控制特硝基丁烷与活性Zn的当量比1:2。淡黄色固体。

ESI-MS: 312.6 [M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 1.54 (s, 9 H), 5.99 (d, 1 H J = 2 Hz), 6.37 (d, 1 H, J = 2 Hz), 6.78 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 6.89 (d, 1 H, J = 16), 7.42 (d, 1 H, J = 15.5 Hz), 7.49 (d, 2 H, J = 9 Hz), 8.68 (d, 1 H, J = 5.1 Hz), 9.63 (s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 12.41 (s, 1 H);元素分析C₁₉H₂₁NO₃﹒1.5H₂O (实测值)%: C 67.22, H 7.06, N 3.08. 理论值)%: C 67.45, H 7.08, N 4.12。

实施例7

(E)-N-(2- 羟基-6-(4- 羟基苯乙烯基)-4- 甲基苯亚甲基)-2- 甲基丙烷- 氧化胺(3a) 的制备

如实施例5所示，不同的是用实施例2中的(E)-2-羟基-4-甲氧基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛代替 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛。淡红色固体，产率55.5%。

ESI-MS: 342.6 [M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 1.54 (s, 9H), 6.14 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 6.51 (d, 2H, J = 14.4 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.82 (s, 1H), 7.36 (d, 2H, J = 15.9 Hz), 7.47 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 8.09 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 9.65 (s, 1H), 12.63 (s, 1H)。

实施例8

4-((tert- 丁基胺) 甲基)-5-(4- 羟基苯乙烯基) 苯-3- 甲氧基-1- 醇(3b) 的制备

其制备如实例6所示，不同的是用实施例2中 (E)-2 -羟基-4-甲氧基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛代替代替 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛。淡黄色固体，产率60.0%。

ESI-MS: 326.6 [M+H]⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆ ): 1.54 (s, 9 H), 3.82(s, 3 H), 5.99 (d, 1 H, J =2 Hz), 6, 37 (d, 1 H, J = 2 Hz), 6.78 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 6.89 (d, 1 H, J = 16), 7.42 (d, 1 H, J = 15.5 Hz), 7.49 (d, 2 H, J = 9 Hz), 8.38 (d, 1 H, J = 5.1 Hz), 9.63 (s, 1 H), 12.41 (s, 1 H)。

实施例9

(E)-3- 甲基-5-(4- 甲基苯乙烯基)-4-(( 丙-2- 炔胺) 甲基) 苯酚(4a) 的制备

(E)-2 -羟基-4-甲氧基-6-(4-甲氧基苯乙烯基)苯甲醛284 mg (1 mmol) 溶解于20 mL乙醇/二氯甲烷 (1:1) 溶液中，加入1.5 mmol (600 µL) 丙炔胺，50℃冷凝回流1 h，后加入0.5 mmol NaBH₄室温反应2 h，旋干，20 mL二氯甲烷溶解，分别用饱和氯化钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析分离 (石油醚/乙酸乙酯 = 1:2)，得到白色固体产物154 mg，产率47.7%。白色固体，291 mg，产率90%。

ESI-MS: 324.2[M+H]⁺, ¹H NMR (CDCl₃-d6): 1.25 (m, 1 H, J = 20 Hz), 2.41 (s, 1 H), 3.84 (s, 3 H), 4.22 (d, 2 H, J = 10Hz), 6.36 (d, 1 H, J = 20 Hz), 6.84 (s, 1 H), 6.89 (s, 1 H), 6.91 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.40 (s, 1 H), 7.46 (d, 2 H, J = 10 Hz)。

实施例10

(E)-N-(2 ，4- 二甲氧基-6-(4- 甲氧基苯乙烯基) 苯基) 丙-2- 炔-1- 胺(4b) 的制备

(E)-2 - 4-二甲氧基-6-(4-甲氧基苯乙烯基)苯甲醛298 mg (1 mmol) 溶解于20 mL乙醇/二氯甲烷 (1:1) 溶液中，加入1.5 mmol (600 µL)丙炔胺，50℃冷凝回流1 h，后加入0.5 mmol NaBH₄室温反应2 h，旋干，20 mL二氯甲烷溶解，分别用饱和氯化钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析分离 (石油醚/乙酸乙酯 = 1:3) 得白色固体产物176 mg，产率52.2%。白色固体，307 mg，产率91%。

ESI-MS: 338.1[M+H]⁺, ¹H NMR (CDCl₃-d): 1.25 (m, 1 H, J = 20 Hz), 2.41 (s, 1 H), 3.84 (s, 6 H), 4.22 (d, 2 H, J = 10Hz), 6.36 (d, 1 H, J = 20 Hz), 6.84 (s, 1 H), 6.89 (s, 1 H), 6.91 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.40 (s, 1 H), 7.46 (d, 2 H, J = 10 Hz)。

实施例11

(E)-4-( 羟甲基)-5-(4- 羟基苯乙烯基) 苯基-1 ，3- 二醇(5) 的制备

将 (E)-2，4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛256 mg(1 mmol)溶解于20 mL乙醇中，加入NaBH₄ 19 mg (0.5 mmol)，室温搅拌2 h，旋干，乙醇溶解后乙醇柱层析分离其中的盐，合样，旋干，柱层析分离 (石油醚/乙酸乙酯 = 1:1) 得淡黄色固体145 mg，产率59.4%。白色固体，220 mg，产率85%。

ESI-MS: 258.1[M+H]⁺。

实施例12

(E)-2-(3 ，5- 二甲氧基苯乙烯基)-3 ，5 ，6- 三甲基吡嗪 (6a) 及 (E)-2-(3 ， 5- 二甲氧基苯乙烯基)-4- 叔丁氧羰基氨基喹啉 (7a) 的制备

反应方程式如下：

1) 于20 mL单口圆底烧瓶中加入3，5-二甲氧基苄基溴1.67 g (7.5mmol)、亚磷酸三乙酯8 mL (46 mmol)，搅拌，油浴加热至150℃，反应4h；

2) 将反应物在100℃以下减压蒸馏，除去过量的亚磷酸三乙酯，瓶中剩余的无色油状物即为产物，直接用于下一步反应；

3) 将上步反应所得膦酸酯油状物溶解于10 mL干燥四氢呋喃中，冰盐浴冷却至 -10℃，充入氮气保护；

4) 搅拌下加入氢化钠(质量分数 (60 %) 粉末1.2 g (30 mmol)，保持-10℃搅拌30 min；

5) 30 min后，-10℃搅拌下缓慢滴加7.5 mmol的3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲醛或者4-叔丁氧羰基氨基喹啉-2-醛的四氢呋喃溶液 10 mL；

6) 将反应物升至室温 (14～20℃)，搅拌6～8 h，冷至0℃，缓慢滴加冰水40 mL，以乙酸乙酯 (40 mL×3) 萃取，有机相以饱和亚硫酸氢钠溶液洗，无水硫酸钠干燥；减压蒸干溶剂，经柱色谱纯化 (乙酸乙酯/石油醚=1:5)。

得浅黄色固体6a 0.54 g或白色固体7a 0.82 g，两步总收率6a为25%，7a为27%。

6a: m. p. 134.3℃-136.3℃; ESI-MS: m/z 285.1 [M+1]⁺; ¹H NMR (DMSO-d6, ppm) δ: 7.600 (d, 1 H, J = 15.5 Hz, CH=CH), 7.403 (d, 1 H, J = 15.5 Hz, CH=CH), 6.880 (s, 2 H, Ar-H), 6.466 (s, 1 H, Ar-H), 3.795 (s, 6 H, O-CH₃), 2.575 (s, 3 H, Ar-CH₃), 2.472 (s, 3 H, Ar-CH₃), 2.442 (s, 3 H, Ar-CH₃)。

7a: m. p. 177.4℃-179.4℃; ESI-MS: m/z 407.3 [M+1]⁺; ¹H-NMR (DMSO-d6, ppm) δ: 9.653 (s, 1 H, CONH), 8.308 (d, 1 H, J = 13 Hz, CH=CH), 7.938 (d, 1 H, J = 13 Hz, CH=CH), 8.178 (s, 1 H, Ar-H), 7.641-7.748 (m, 2 H, Ar-H), 7.465-7.532 (m, 2 H, Ar-H), 6.946 (s, 2 H, Ar-H), 6.474 (s, 1 H, Ar-H), 3.810 (s, 6 H, Ar-OCH₃), 1.561 (s, 9 H, C-CH₃)。

实施例13

(E)-2-(3 ，5- 二甲氧基苯乙烯基)-4- 氨基喹啉 (7b) 的制备

0.5 g (1.23mmol) 7a 溶于20 mL乙醇中，滴加1 mL浓盐酸，反应液升温至85℃搅拌10h。反应完毕旋出乙醇，加入40mL饱和碳酸氢钠溶液搅拌，中和盐酸。乙酸乙酯(40mL×3)萃取。有机相水洗一次，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干溶剂，经柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚=1：1)。得浅黄色固体7b 0.31g，产率82%。

7b: m. p. 166.3℃-168.3℃; ESI-MS: m/z 306.9 [M+1]⁺; ¹H-NMR (DMSO-d6, ppm) δ: 8.098 (d, 1 H, J = 8Hz, CH=CH), 7.758 (d, 1 H, J = 8 Hz, CH=CH), 7.516-7.607 (m, 2 H, Ar-H), 7.239-7.366 (m, 2 H, Ar-H), 6.866 (s, 2 H, Ar-H), 6.799 (s, 1 H, Ar-H), 6.764 (d, 2 H, Ar-NH₂), 6.462 (s, 1 H, Ar-H), 3.801 (s, 6 H, O-CH₃)。

实施例14

(E)-2-(3 ，5- 二羟基苯乙烯基)-3 ，5 ，6- 三甲基吡嗪 (6b) 及(E)-2-(3 ，5- 二羟基苯乙烯基)-4- 氨基喹啉7c 的制备

向20 mL 三口烧瓶中加入1.41 mmol 6a或者7b，以 5 mL无水二氯甲烷溶解，冰水浴冷却至 0 ℃以下，充氮气保护。搅拌下缓慢滴加3.52 g (14.07 mmol)三溴化硼的无水二氯甲烷溶液5 mL。室温搅拌6 h。冰水浴冷却至0℃，滴加冷却蒸馏水20 mL ，加入饱和NaHCO₃溶液，至pH 7以上。分离有机层。水层以乙酸乙酯 (25mL×3) 萃取，合并有机相。有机相以饱和氯化钠溶液洗，无水Na₂SO₄ 干燥，减压蒸干溶剂，经柱色谱纯化(6b：乙酸乙酯/石油醚 = 1 : 3；7c：甲醇/氯仿= 1 : 4) 得浅黄色固体6b 0.27 g或者7c 0.30 g，6b收率为75.0%，7c收率为70.0%。

6b: m. p. 253.2℃-255.2℃; ESI-MS: m/z 257.1 [M+1]⁺; ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 9.316 (s, 2 H, Ar-OH), 7.458 (d, 1 H, J = 26.5 Hz, CH=CH), 7.190 (d, 1 H, CH=CH), 6.513 (d, 2 H, Ar-H), 6.209(s, 1 H, Ar-H), 2.534(s, 3 H, Ar-CH₃), 2.461 (s, 3 H, Ar-CH₃), 2.429 (s, 3 H, Ar-CH₃)。

7c: m. p. 274.7℃-276.7℃; ESI-MS: m/z 279.3 [M+1]⁺; ¹H NMR (DMSO-d6, ppm) δ: 8.896 (s, 2 H, Ar-OH), 8.437 (d, 1 H, J = 13.5 Hz, Ar-H), 8.313 (s, 2 H, Ar-NH₂), 8.145 (d, 1 H, J = 14.0 Hz, Ar-H), 7.877-7.926 (m, 1 H, Ar-H), 8.437 (d, 1 H, J = 27.5 Hz, CH=CH), 7.578-7.631 (m, 1 H, Ar-H), 7.726 (d, 1 H, J = 27.5Hz, CH=CH), 7.059 (s, 1 H, Ar-H), 6.591 (s, 2 H, Ar-H), 6.355 (s, 1 H, Ar-H)。

白藜芦醇衍生物对 DPPH 自由基的清除作用

在96孔酶标板中，依次往孔中加入不同浓度的药品50 μL，甲醇100 μL，DPPH(0.4 mmol/L) 50 μL，空白反应孔为50 μL DPPH和150 μL甲醇混合溶液，空白对照孔为200 μL甲醇，白藜芦醇为阳性对照组，各组设4个平行孔。在加入DPPH后，立刻用酶标仪在490 nm波长下测定其吸光度A₀，30 min时再测其吸光度A₃₀，计算30 min时的吸光度A₃₀减去始吸光度A₀的值再取平均值，根据公式计算清除率，以药品浓度对清除率作柱状图，结果如图1所示。

自由基清除率 = [1 - (给药反应组吸光度差值-空白对照组吸光度差值) /(空白反应组吸光度差值-空白对照组吸光度差值)] × 100%

清除率越高，表明此化合物对 DPPH• 自由基的清楚能力越强。

从图1中可以看出，白藜芦醇衍生物1a、2a、2b、3a、3b均对DPPH• 自由基有较好的清除作用，并且其清除作用在1000 µM时与白藜芦醇相当，其中化合物1a在较低浓度时显示出比白藜芦醇更好的自由基清除作用。

白藜芦醇衍生物对超氧阴离子 (O₂ ^•- ) 自由基的清除作用

邻苯三酚自氧化速率的测定：取1.565 mL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液 (pH8.2) 、1.461 mL 蒸馏水在10 mL 的塑胶管中混匀后在37℃水浴中保温20 min，取出后立即加入在37℃馄热过的3 mmol/L 邻苯三酚0.174 mL，迅速摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，计算线性范围内每分钟内吸光度的增加，以10 mmol/L HCl 溶液配制空白管作为对照，记录结果。

加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定：按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.640 mL 的各浓度样品液，蒸馏水相应减少。同样以10 mmol/L HCl 溶液配制空白管作为对照。测定吸光度，每个样品均重复3 次，取其平均值。根据公式计算清除率，以样品浓度和清除率做柱状图，结果如图2所示。

抑制率 = (△A₁/△_t- △A₂/△_t) /(△A₁/△_t) × 100%

式中：△A₁/△_t 为邻苯三酚自氧化时反应速率；△A₂/△_t 为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

结果表明，化合物2a对超氧阴离子自由基的清除作用略优于白藜芦醇，但白藜芦醇衍生物2a在水中的溶解度大于白藜芦醇。

白藜芦醇衍生物对氢氧阴离子 (OH•) 自由基的清除作用

NDA法：在4 mL 的比色皿中依次加入总体积为 3.2 mL 的下列药品，依次加入NDA溶液0.064 mL、H₂O₂溶液 0.016 mL、样品溶液0.064 mL，蒸馏水2.212 mL，最后加入FeSO₄溶液，溶液混合均匀后，立即在用紫外可见分光光度计测其在 440 nm波长处的吸光度 (记录为 A₀)，每隔10 s测一次，100 s时停止，记录为 A₁₀₀，每组样品重复三次。以不加药品组为对照组，计算 100 s时测得的吸光度 A₁₀₀与 0 s时的吸光度 A₀之差，根据公式计算清除率，以药品浓度对清除率作柱状图，其结果如图3所示。

清除率 = 1 - [( A₀ – A₁₀₀)/ A₀] × 100%

清除率越高，表明化合物对氢氧阴离子自由基清除能力越强。

结果表明，白藜芦醇及其衍生物2a在较低浓度下对氢氧阴离子自由基的清除作用均不明显，当化合物浓度达到200 µM时对氢氧阴离子自由基有清除作用才显现，然而由于白藜芦醇溶解度低于化合物2a较低，因此当浓度达到400 µM时，已几乎是白藜芦醇在水溶液中的浓度极限，而化合物2a可以达到800 µM。

白藜芦醇衍生物对过氧氮自由基 (ONOO•) 的清除作用

SIN-1法：将SIN-1 直接用0.1 mol/L的磷酸缓冲液 (PBS，pH 7.4) 溶解，浓度为0.3 mg/mL冰浴保存。称取1.77 mg Luminol 用5% NaOH溶液20 µL先溶解，而后用PBS配成1×10^-3 mol•L^-1。ONOO• 的清除剂按照需要配制。基本发光体系为：SIN-1 100 µL，Luminol 100 µL， PBS 600 µL，各种浓度白藜芦醇及其衍生物200 µL，SIN-1最后加入，并且立即混匀上机，T-2程序测定，连续测量40次，每次时间100 s，得化学发光强度，记录其化学发光强度曲线，取其发光强度为稳定的最高值为最终发光强度，根据公式计算抑制率，结果如图4所示。

抑制率 = 100% × (对照发光值-实验样品发光值)/对照发光值

抑制率越高，表明自由基清除能力越强。

结果表明，白藜芦醇衍生物2a在较低浓度(6.25 µM，12.5 µM) 时，对过氧氮自由基的清除作用较白藜芦醇差，然而当浓度增至25 µM时，其清除能力迅速增加，且优于白藜芦醇。浓度至50 µM时，白藜芦醇及衍生物2a对过氧氮自由基清除率近100%。

白藜芦醇衍生物对SIRT1 酶活性的影响

按照SIRT1试剂盒说明，分别稀释试剂盒中自带溶液，配成不同浓度。试剂盒自带溶液中包括：阻断剂溶液、SIRT1底物溶液、激活剂溶液、标准液及解冻SIRT1、显影液和NAD⁺溶液。测定上述不同浓度溶液的荧光强度绘制标准曲线，所得标准曲线如图5所示。由本图可以看出，本实验条件下测定SIRT1活性具有良好的线性关系，说明操作方法对于完成此试剂盒的误差较小。

将上述溶液配成不同浓度，加入测试样品，配置终浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM的测试样品溶液，所有样品先用DMSO配置成200 mM，然后应用Assay Buffer稀释，样品最高浓度组DMSO不超过0.01%。其中测定化合物对SIRT1的作用除终浓度为所需测试浓度外，还需加入10μL SIRT1底物，混匀以后放入37℃的恒温箱中孵育30 min；加入5μL的显影液，混匀，37℃的恒温箱中孵育10 min；应用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。

所测值按照绘制的标准曲线计算最终化合物对SIRT1酶的作用强弱。

白藜芦醇及其衍生物对SIRT1酶活性的影响如图6所示。本图中白藜芦醇和烟酰胺分别是由试剂盒附带的标准SIRT1激活剂和阻断剂，RV是实验室所购买白藜芦醇。*P < 0.05 vs. 空白组。 ^# P < 0.05 vs. 空白组. ⁺ P < 0.05 vs. 烟酰胺组。

实验结果表明，浓度为10μM和100μM的白藜芦醇可以显著地激活SIRT1（P < 0.05），并且100μM的白藜芦醇与试剂盒提供的白藜芦醇激活SIRT1相比未见统计学差异。经过筛选，10μM白藜芦醇衍生物5较同等浓度的白藜芦醇能够显著激活SIRT1（P < 0.05），但在100μM的时候，化合物5反而可以抑制SIRT1的活性（P < 0.01），其抑制效果比标准对照品烟酰胺更强（P < 0.05）。100μM白藜芦醇衍生物2a和100μM白藜芦醇衍生物3a与空白对照组相比同样可以显著抑制SIRT1的活性（P < 0.05），其抑制作用与烟酰胺相比未见有统计学差异。

Claims

1.白藜芦醇类似物，其结构式如

Figure 2011100605443100001DEST_PATH_IMAGE001

、

、、

、

、、

、、或

所示。

2.权利要求1所述的白藜芦醇类似物在制备与老化或SIRT1酶活性相关疾病药物中的应用。