CN102151302B

CN102151302B - 一种外用大黄脂质体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102151302B
Application number: CN2010190870348A
Authority: CN
Inventors: 宋毅; 唐尧
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-02-11
Also published as: CN102151302A

Abstract

本发明提供了一种大黄脂质体，它是由大黄无水乙醇提取物、卵磷脂、胆固醇为原料制备而成，其重量配比为：大黄无水乙醇提取物，以大黄药材计：6000-25000份、卵磷脂30-70份、胆固醇30-70份。本发明还提供了该大黄脂质体的制备方法和用途。本发明还提供了含有该大黄脂质体的药物组合物。本发明脂质体粒径分布小，均匀，质量稳定，包封率高，能够提高透皮吸收效率，并能通过对其进行不同的后期修饰达到不同的靶向性，同时也能制成直接涂敷的各种制剂。

Description

一种外用大黄脂质体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种外用大黄脂质体，属药物领域。

背景技术

脂质体是由脂质分散在水中形成的定向排列的双分子层囊泡，脂质双分子膜以同心圆的形式包封而形成微球状体。由于脂质体具有两性分子的性质，表面很容易就能被修饰，并且良好的生物相容性使得其有惊人的溶解力。脂质体具有双重特性-亲水性和疏水性，可以较好的包裹亲水性物质和亲脂性物质。1971年英国Gregoriadis和Rymen等人开始将脂质体用于药物载体，此后人们开始广泛运用脂质体包裹药物。药物被脂质体包封后，具有靶向性、缓释性、组织亲和性、降低药物毒性和提高药物稳定性等特点。因脂质体是类似生物膜结构的囊泡，对正常细胞和组织无损害和抑制作用，有细胞亲和性与组织相容性，并可长时间吸附于靶细胞周围，使药物能充分向靶细胞靶组织透过，脂质体也可通过融合进入细胞内，经溶酶体消化释放药物，脂质体在药物传递系统(drug delivery system，DDS)中的重要性不言而喻。近年来为了改善脂质体的靶向性和体内外稳定性，人们还研究了许多新型的脂质体：温度敏感脂质体、酸度敏感脂质体、长循环脂质体、光敏感脂质体、免疫脂质体、多糖脂质体、磁性脂质体、前体脂质体。与凝胶制剂相比，脂质体组的渗透速率常数Pm较凝胶组大，说明脂质体制剂较凝胶制剂的透皮速率高。其可能的机制是脂质体能增加角质层湿化和水合作用，使角质细胞间结构改变，脂质双层中疏水性尾部排列紊乱，药物通过扩散等作用进入细胞间质；同时脂质体的磷脂与表皮脂质屏障中的脂质层融合，使角质层脂质组成和结构改变，形成一种扁平的颗粒状结构，使其屏障作用发生逆转，包封有药物的脂质体可顺利通过这些脂质颗粒的间隙，而促进药物透皮吸收；另外脂质体可经皮脂腺、汗腺、毛囊甚至直接穿透皮肤角质层进入皮肤深层、皮下组织，达到透皮作用。开发脂质体用作局部给药的载体，可使药物具有较大的皮肤透过量，有效地使药物渗透入局部深层组织，避免因透入药量不足引起的疗效欠佳；同时还可以减少药物在全身其它部位，尤其是在血液、胃肠、肝组织的分布，使得药效加强的同时减少药物副反应。

但是，并非任何药物均适合制备成脂质体，脂质体中药物的性质决定了制备的脂质体的质量，如脂质体中药物的渗漏和稳定性。如邓英杰等在试验研究证明，一般具有较高油水分配系数P_oct值的药物都能成功地包封在脂质体中，并具有较高的包封率，是适合于脂质体剂型的理想药物。而对于那些不具备适当的油水分配系数的药物，可以在保留药物活性的前提下，改变药物的化学结构，使药物成为具有适当油水分配系数和药物活性的衍生物，将这种衍生物包封在脂质体中比原药物效果好。此外，脂质体的结构类型决定了脂质体的质量，脂质体粒径越小越稳定，同时需要考虑包封率，通常在保护脂质体高包封率的前提下，制备较高稳定性的脂质体。因此，目前制备成脂质体的药物通常是用量较少，药效明确的化合物。而中药提取物由于其中的成分复杂，制备成脂质体通常比较复杂，且很难满足脂质体的质量要求，目前报道的中药提取物的脂质体也较少。

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheumtanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。性味归经：苦，寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经。功能主治：泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经。用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌打损伤，外治水火烫伤；上消化道出血。酒大黄善清上焦血分热毒。用于目赤咽肿，齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓，泻火解毒。用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血。用于血热有瘀出血者。大黄性寒味苦，除内服具有泻毒热、破积滞、行瘀血功效外，还有很强的抗菌作用。试验证实，大黄对多数革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌均有抗菌作用；对金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉、枯草、炭疽杆菌以及伤寒、副伤寒、痢疾杆菌和致病真菌均有抑制作用，故常外用疗疾。外用可治疗口腔炎、口唇溃疡及毛囊炎；治臁疮(下肢溃疡)；治水火烫伤；治痈肿疼痛：生大黄适量研细末，以白酒调和敷痈肿处，干燥后换药；治冻疮皮肤溃烂；治肠腹胀气。从大黄乙醇提取物中分离到10个化合物，鉴定了其中的6个化合物，分别为大黄酚(chrysophanol)，大黄素甲醚(physcion)，大黄素(emodin)，芦荟大黄素(aloe-emodin)，大黄酸(rhein)，大黄酚。游离型蒽醌具有抗菌活性、抗炎抗病毒作用和抗肿瘤作用，大黄蒽醌类成分多数呈黄色，易溶于乙醇，是产生抗菌等药效的主要成分。

目前将大黄制备的脂质体通常是选择大黄中的单一化合物，如将其中的有效成分大黄素制备的脂质体。顾宜等报道了采用薄膜-超声分散法制备脂质体(大黄素纳米脂质体的制备和质量评价，第四军医大学学报，2003；24(5))，具体方法是取处方量的大黄素、胆固醇、磷脂于250mL圆底烧瓶中，加氯仿20ml溶解，于旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，加入60g.L^-1葡萄糖液10ml得脂质体粗混悬液，冷水浴超声2次，每次1.0min，0.8um微孔滤膜过滤，得到脂质体胶体溶液。雷瑶，等，大黄素脂质体对Hep-2细胞毒的检测，《武汉大学学报：理学版》，2006年52卷2期，证明说明大黄素脂质体对Hep-2细胞的生长存在抑制作用.莫穗林，等，大黄素磁性纳米脂质体的研制，《中药材》，2005年28卷9期，为了提高大黄素在体内的生物利用度，研制大黄素磁性纳米脂质体。方法：用薄膜-超声法制备大黄素磁性纳米脂质体。结果：大黄素磁性纳米脂质体粒径100～300mm.包封率33.75％。虽然大黄素是单一的化学成分，但是按常规制备方法制备得到的脂质体的包封率也不高，要制备成合格的脂质体难度较大。也有文献报道采用大黄甲醇提取物制备的脂质体，如，申请号：01107203.2，发明名称：一种治疗螨虫感染性皮肤疾病的外用脂质体制剂，该发明为以草本植物大黄提取物和甲硝唑为主要活性成份，用于治疗皮肤螨虫感染引发的螨性皮肤疾病的外用脂质体制剂。本外用制剂对治疗螨性皮炎，螨性痤疮和“酒渣鼻”等常见皮肤疾病疗效确切，且具有良好的皮肤赖受性和接受度，无刺激性和毒副作用。其中，所述的大黄提取物是大黄甲醇提取物，它的制备方法是取大黄的根或茎粉碎后，以甲醇做有机溶剂，于索式脂肪提取器中50℃-70℃循环提取2小时，有机提取液减压下低温蒸发，残余溶剂65℃温度烘箱干燥，得提取物。其脂质体的制备方法是：将大黄提取物、克磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇及甲硝唑溶解于甲醇溶液、混合物溶液于0.08mPa负压，40℃下，减压旋转5小时蒸发有机溶液，容器中加入缓冲溶液，立即于往复式震荡器上震荡2小时，得到白色微有黏度的液态制剂。该方法是制备脂质体的常规方法，由于大黄甲醇提取物是由许多已知和未知成分组成的复合物，仅采用常规方式，能不能制备成合格的脂质体，是很难知晓的，且该专利说明书中并没有进行对制备的产物指标的检测，如包封率等，不能证明按该方法就能制备得到合格的大黄脂质体。目前，将大黄中的多种有效成分同时包入同一脂质体是尚未解决的技术难题。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种大黄脂质体，它是由大黄无水乙醇提取物制备而成的脂质体。本发明的另一技术方案是提供了该大黄脂质体的制备方法和用途。

本发明提供了一种大黄脂质体，它是由大黄无水乙醇提取物、卵磷脂、胆固醇为原料制备而成，其重量配比为：

大黄无水乙醇提取物，以大黄药材计：6000-25000份、卵磷脂30-70份、胆固醇30-70份。

进一步优选地，它是由下述重量配比的原料制备而成：

大黄无水乙醇提取物，以大黄药材计：15000份、卵磷脂50份、胆固醇50份。

其中，所述的大黄无水乙醇提取物中含有大黄素0.1-0.3mg/ml。

所述的脂质体中含有大黄素0.22-0.53mg/g、大黄酸0.24-0.67mg/g、大黄酚0.39-0.89mg/g、大黄素甲醚0.15-0.37mg/g。

本发明还提供了一种制备所述的大黄脂质体的方法，它包括如下步骤：

a、制备大黄无水乙醇提取物：称取大黄粉末，加入无水乙醇，水浴回流提取，得大黄醇提液；

b、取卵磷脂和胆固醇，加入氯仿，混匀，得膜材氯仿溶液；

c、搅拌大黄醇提液，将膜材氯仿溶液注入大黄醇提液中，得含药氯仿-乙醇膜材溶液；

d、除尽氯仿，得含药乙醇膜材；

e、将含药乙醇膜材以3～4滴/秒的速度滴入40-80mg/ml葡萄糖溶液中，得药脂混合溶液；

f、除去乙醇，得大黄脂质体溶液；微孔滤膜过滤，冷藏，即得脂质体。

其中，d步骤所述的除尽氯仿的方法为水浴旋蒸法，操作步骤为：先在水浴温度37℃，转速20r/min，真空度0.07MPa的条件下旋蒸至旋转蒸发仪冷凝管上无液滴滴下，再升温至42℃，继续旋蒸。

其中，f步骤所述的除去乙醇的方法为水浴旋蒸法，操作步骤为：先在水浴温度47℃，转速20r/min，真空度0.07Mpa条件下旋蒸至旋转蒸发仪的冷凝管上无液滴滴下，再升温至52℃-65℃。

本发明还提供了所述的大黄脂质体在制备止痛、消炎的外用药物中的用途。

本发明还提供了一种用于止痛、消炎的外用药物组合物，它是由所述的大黄脂质体，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的外用制剂。

其中，所述的外用制剂是散剂、膏剂、喷雾剂。

以往对中药脂质体的制备几乎都是对某味药其中的一种有效成分进行脂质体的制备，而这本身就有悖中药的作用机制——中药的药效是复方中各种成分的功效和作用机制相互作用的结果——不能片面地从中草药的单一品种或成分的单一药理作用来判定复方的作用，中药复方的重要性是必须加以强调的。本发明药物中原料脂质体不是对单味药中的单一成分进行脂质体制备，而是同时将单味药中多种有效成分同时包入同一脂质体，这样就能尽量避免由于成分不完整而导致的中药药效的降低或改变。本发明选择含量较大且较稳定的大黄素作为大黄脂质体的评价标准，但并不是对大黄中的单一成分大黄素进行脂质体制备，而是对大黄醇提液中多种有效成分进行脂质体制备。

本发明大黄脂质体的平均粒径为86.12nm，在60g.L^-1的葡萄糖分散介质中能稳定存在，以大黄素为指标的包封率平均可达83.52％。脂质体粒径分布小且均匀，稳定，包封率高，提高了透皮吸收效率，并能通过对其进行不同的后期修饰达到不同的靶向性，同时也为制成直接涂敷的各种制剂打下基础。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.大黄脂质体粒度分布图

图2大黄素标准曲线图

具体实施方式

实施例1本发明药物脂质体的制备

1.1实验材料

胆固醇(Solarbio)；卵磷脂(Solarbio)；Sephadex^TMG-50medium(Solarbio)；大黄粉末(四川省中药饮片有限责任公司，批号20081110)；大黄素对照品(编号110756-200110)；磷酸二氢钾(批号20071212)、磷酸氢二钾(批号20080920)、十二烷基苯磺酸钠(批号20081109)、葡萄糖粉末、碳酸氢钠均为成都市科龙化工试剂厂所制；枸橼酸(广东省台山市新宁制药厂，批号20011201)；无水乙醇、甲醇、氯仿、磷酸(批号20071203)等均为成都市科龙化工试剂厂所制分析纯试剂；甲醇(色谱纯，Tedia Company USA，1000ml装)，水为纯净水。

1.2实验仪器

岛津高效液相色谱仪(LC-10Atvp进样泵；SPD-M10Avp二级管整列紫外检测器；SIL-10Advp自动进样器；CTD-10Asvp柱温箱；SCL-10Avp系统控制器；CLASSvp工作站)；C₁₈色谱柱(250×460mm 5mioron；phenomenex)；粒度分布仪；TG16-WS台式高速离心机(湘仪离心机厂)；85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；R-201型旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；水浴锅(上海申顺生物科技有限公司)；KQ-300DE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科技工贸有限公司)；微孔滤膜(0.45μm有机膜，直径50mm，上海市新亚净化器件厂)。

1.3方法

1.3.1有效成分的提取

称取处方比例的大黄粉末15g，置烧瓶中。加入10倍量无水乙醇，80℃水浴，微沸，回流提取3h。药液真空抽滤。

1.3.2大黄纳米脂质体的制备

按重量比1∶1的比例精密称取卵磷脂和胆固醇各50.0mg，加入15ml氯仿，缓慢搅拌，混匀，使胆固醇和卵磷脂充分溶解，得膜材氯仿溶液。取1.3.1中大黄醇提液的续滤液40ml于烧杯中；温和磁力搅拌下，用注射器取膜材氯仿溶液，针头置于醇提液液面下，缓慢注入，即得含药的氯仿-乙醇膜材溶液。溶液转移至250ml烧瓶中，置旋转蒸发仪旋蒸(水浴温度37℃，转速20r/min，真空度0.07MPa)，旋蒸至旋转蒸发仪冷凝管上无液滴滴下，再升温至42℃，继续旋蒸除尽氯仿，得含药乙醇膜材40ml。称取6.0g的葡萄糖，用少量纯化水搅拌使完全溶解，转移至100ml容量瓶，纯化水定容，摇匀，得60mg/ml葡萄糖溶液；取35ml葡萄糖溶液置烧杯中，磁力搅拌下，用注射器将含药乙醇膜材溶液以3～4滴/秒的速度缓慢滴入葡萄糖溶液中，待分散均匀，即得药脂混合溶液。转移至250ml烧瓶，旋蒸(水浴温度47℃，转速20r/min，真空度0.07MPa)至旋转蒸发仪的冷凝管上无液滴滴下后，将水浴锅温度升至52摄氏度，直到乙醇除尽，得到大黄脂质体溶液。将大黄脂质体溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于小玻璃瓶中，4-8℃冷藏，待用。

为避免葡萄糖水化烧瓶壁上膜不完全的现象，不能直接将药物膜材乙醇溶液旋蒸成膜后再水化，由于乙醇与水互溶，故将其滴加至葡萄糖溶液中，再旋蒸除去乙醇，能达到了膜材水化形成脂质体的效果，并且避免了洗膜不彻底的问题。

实施例2本发明脂质体的制备

取大黄6g，卵磷脂和胆固醇各30.0mg，葡萄糖1.8g，按实施例1的方法制备成大黄脂质体。

实施例3本发明脂质体的制备

取大黄25g，卵磷脂和胆固醇各70.0mg，葡萄糖2.4g，按实施例1的方法制备成大黄脂质体。

实施例4本发明脂质体制备中胆固醇、卵磷脂的配比筛选试验

按实施例1的方法，比较不同胆固醇∶卵磷脂比例下的大黄脂质体包封率

取相同量的大黄醇提液，按本方法制备大黄脂质体及测定包封率，结果如下(n＝3)：

胆固醇∶卵磷脂	1∶1	1∶1.5	1∶3
				大黄脂质体平均包封率(％)	79.85	62.71	26.71

该试验结果提示，其中以胆固醇∶卵磷脂按1∶1配比时，包封率最高。

实施例5本发明脂质体原料大黄的提取溶剂及脂质体工艺中有机溶剂的选择试验

1、本发明原料大黄的提取溶媒选择试验

取大黄50％乙醇提取液，同实施例1的方法，加10ml氯仿超声溶解。按有机注入法，用注射器取膜材氯仿溶液，针头置于醇提液液面下，缓慢注入，即得含药的氯仿-乙醇膜材溶液。溶液转移至250ml烧瓶中，置旋转蒸发仪旋蒸成膜，壁上出现颗粒物且无法溶解而失败。该实验说明，采用大黄50％乙醇提取液，不能制备成合格的脂质体。

2、本发明脂质体制备工艺中有机溶剂的选择试验

方法一：将大黄醇提液置于烧瓶中，减压旋蒸除去乙醇后，用膜材的氯仿溶液溶解烧瓶壁上有效成分，然后依照背景技术所述的(如专利申请号01107203.2)薄膜分散法步骤制备大黄脂质体。

结果：用氯仿溶解烧瓶壁上有效成分时，只能溶解一部分，采用超声助溶解，只能将壁上成分分散到了氯仿膜材溶液中，但是颗粒较大，不利于后续的膜材包封；当用葡萄糖溶液水化膜材时，膜材不能被葡萄糖溶液从烧瓶壁上洗下来。

方法二：采用甲醇作为大黄提取液和脂质体制备的有机溶剂：

将大黄细粉直接用甲醇提取，按本发明方法操作如下：称取15g大黄细粉，加入70ml甲醇，于70℃水浴中回流3小时，过滤，得大黄甲醇提取液，待用。精密称取卵磷脂51.39mg和胆固醇49.65mg，加入15ml甲醇，在70℃水浴中搅拌至溶解。得膜材溶液。将15ml膜材液与30ml大黄提取液混合均匀，旋转蒸发仪上旋转，使含药磷脂的甲醇液在壁上成膜，减压除甲醇。另取葡萄糖溶液(6g/L)适量，加至烧瓶中，转动下水化，溶液中有部分颗粒难溶物。取出脂质体溶液移至烧杯中，置磁力搅拌器上，室温下，分别搅拌孵化60分钟。

结果：溶液为黄色悬浊液，仅1/4能通过0.45μm微孔滤膜。

方法三：采用无水乙醇作为大黄提取液和脂质体制备的有机溶剂：

将大黄用无水乙醇提取，并将乙醇替换氯仿溶解卵磷脂胆固醇，具体操作如下：称取15g大黄细粉，加入70ml乙醇，于83℃水浴中回流3小时，过滤，得大黄乙醇提取液，待用。精密称取卵磷脂50.59mg和胆固醇51.26mg，加入15ml乙醇，在70℃水浴中搅拌至溶解。得膜材溶液。将膜材溶液于旋转蒸发仪上旋转，使含磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压除乙醇。加入30ml大黄乙醇提取液，将含磷脂和胆固醇的膜材溶解，得含药膜材。取35ml葡萄糖溶液置烧杯中，磁力搅拌下，用注射器将含药乙醇膜材溶液缓慢滴入葡萄糖溶液中，待分散均匀后，转移至圆底烧瓶，旋蒸，将乙醇除尽，得到大黄脂质体溶液为黄色混悬液。

结果：将大黄脂质体溶液用0.8μm微孔滤膜过滤，不能滤过。

上述试验证明，将成分复杂的大黄提取物制备成合格的脂质体，是技术上的一大难题。发明人在实验过程中认识到乙醇与氯仿是可互溶的有机溶剂，膜材极易溶于氯仿，意外地发现，若先将膜材溶于氯仿，再滴加入乙醇中，再旋蒸除去氯仿，即得膜材的乙醇溶液，通过该方法所得膜材的乙醇溶液澄透，无析出，无不溶物。由此可知，只有采用大黄无水乙醇提取后，再以乙醇与氯仿的混合溶剂作为脂质体的制备溶剂，才能制备出粒径分布小且均匀，稳定，包封率高的脂质体。

实施例6本发明脂质体粒径及包封率的测定

1.粒径测定：

取实施例1制备的大黄脂质体，置激光粒度分布仪中测定平均粒径，记录结果。

2.大黄脂质体包封率的测定：

2.1、色谱条件

色谱柱：phenomenex C₁₈柱，250×460mm 5mioron；流动相：0.1％磷酸-甲醇＝15∶85；检测波长：254nm；流速：1ml/min；柱温：25℃。

2.2、标准曲线的绘制

精密称取4.0mg的大黄素对照，用少量甲醇将其溶解后，转移至50ml容量瓶中，再用甲醇润洗转移三次，用甲醇定容至刻度线，摇匀，得到0.08mg/ml的对照品储备液。分别精密移取该储备液10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0ml于10ml量瓶中，再精密移取该储备液2.0、1.0、0.5ml于50ml容量瓶中，得到浓度为80.0、64.0、48.0、32.0、16.0、8.0、3.2、1.6、0.8μg/ml的一系列溶液。分别取20μL进样，记录峰面积。以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(C，μg/ml)为横坐标进行回归分析。

2.3、投药量测定

将实施例1制备的大黄提取液经0.22μm有机膜过滤后，进样10μl。记录峰面积，峰面积值乘以二，代入标准线性方程中，求出浓度，再依据稀释倍数和体积计算出用于制备过程的提取液中大黄素含量。公式如下：

投药量＝X×取样体积；X为峰面积代入标准方程后得到的浓度值。

2.4、大黄脂质体溶液中大黄素总量的测定

破乳后进HPLC无干扰；精密移取0.5ml 1.3中制备的脂质体溶液于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，超声5min，得破乳后澄透的脂质体溶液，经0.22μm有机膜过滤后，进样20μL。记录峰面积，代入标准线性方程中，求出浓度，再依据稀释倍数和体积计算出大黄脂质体溶液中大黄素总量，公式如下：

大黄素总量＝(X×20×35)/1000mg

注：X为峰面积代入标准方程后得到的浓度值。

2.5、大黄脂质体溶液中游离药物和脂质体的分离

2.5.1葡聚糖凝胶微柱的制备

称取0.3g Sephadex G-50葡聚糖颗粒，置于烧杯中，用纯化水充分溶胀12h后，装填于1mL注射针筒内(下面垫一张与注射器内径差不多大小的圆形小滤纸)，垂直放置，待葡聚糖凝胶颗粒沉降均匀，再次装填，反复至柱子上表面接近注射针筒上口，于2000r/min离心3min，重复操作3次，得到与壁分离的一个完整葡聚糖凝胶微柱，待用。

2.5.2空白脂质体的制备

按重量比1∶1的比例分别精密称取称取一份卵磷脂50.0mg和一份胆固醇50.0mg，移取15ml氯仿将胆固醇和卵磷脂都充分溶解并混合均匀，滴加入40ml无水乙醇中，39-42摄氏度，20r/min转速下，旋蒸除去氯仿，滴入35ml葡萄糖溶液中分散，47-52摄氏度，20r/min转速下，旋蒸除去乙醇，制得空白脂质体。

2.5.3柱子预饱和及游离药物与大黄脂质体分离

移取0.5ml空白脂质体，置微柱顶端，于2000r/min离心3min，弃去离心液；精密移取0.5ml空白脂质体，置微柱顶端，于2000r/min离心3min，重复操作3次，合并3次的离心液于10ml容量瓶中。

2.5.4包封的大黄素量的测定

用甲醇将离心液(2.3.3)定容至刻度线，摇匀，超声5min，得澄透的破乳后的脂质体溶液，经0.22μm有机膜过滤后进样20μL，记录峰面积，代入标准线性方程中，求出浓度，再依据稀释倍数和体积计算出包封大黄素量。公式如下：

包封大黄素量＝(X×20×35)/1000mg

注：X为峰面积代入标准方程后得到的浓度值。

2.5.5大黄脂质体包封率的测定

按实施例1的方法制备三批大黄脂质体，分别测定这三批脂质体的总大黄素含量和脂质体包封的大黄素含量，按如下公式计算得到包封率：

包封率＝(包封药物量/总药物量)×100％

3、稳定性观察

按实施例1制得的脂质体溶液样品，置于冷藏条件下，观察四周内是否出现沉淀。

4.结果：

4.1.大黄脂质体粒径及外观

按实施例1制得的脂质体溶液为有乳光的黄色澄明液体。平均粒径为86.12d.nm，从分布图(见图1)可见脂质体粒径值在70到100d.nm，峰值集中。

2.1脂质体外观特征及平均粒径测定(见表.1)

表1

4.2.标准曲线

标准品浓度及测定所得峰面积见表.2。

经回归分析(见图2)得标准曲线方程：y＝61973x-24204，r＝0.9999(n＝9)。由此可知，大黄素在0.8-80.0μg/mL范围内，峰面积与浓度线性关系好。

表2

4.3精密度

高、中、低浓度分别连续5次进样后所得峰面积及求算所得RSD值见表.3。

表.3精密度测定结果

4.4回收率

高、中、低浓度的大黄素对照品加入空白脂质体中，破乳后测定浓度。回收率见表4。

表.4回收率测定结果表

4.5投药量

提取液进样后测得峰面积为5007598，计算得投药量为6.48mg。

4.6大黄脂质体包封率

包封率测定结果见表5。

表5.大黄素的包封率测定结果表

注：A_总：总药物峰面积，A_包：包封药物峰面积。

4.7稳定性

在4-8℃冷藏条件下，按1.3法制得的脂质体溶液，四周内均为黄色澄明液体，有乳光，未出现沉淀。

实施例7本发明大黄脂质体中大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定结果

色谱柱：phenomenex C₁₈柱，250×460mm 5mioron；流动相：甲醇-0.1％磷酸93∶7；检测波长：254nm；流速：1ml/min；柱温：25℃。

混合对照品溶液的制备取大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，配制成浓度分别为80μg/ml、64μg/ml、150μg/ml、80μg/ml储备。取对照品储备液适量，稀释制成浓度分别为8.00、3.97、18.03、6.3μg/mL的大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品溶液。

样品测定取3批大黄脂质体样品，每批3份，在上述色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，按外标一点法计算含量，结果见表6。

表6.含量测定结果(n＝3)

大黄素(mg/g)	大黄酸(mg/g)	大黄酚(mg/g)	大黄素甲醚(mg/g)
				0.31	0.37	0.55	0.22
0.53	0.67	0.89	0.37
				0.22	0.24	0.39	0.15

综上所述，本发明大黄脂质体的平均粒径为86.12nm，在60g.L^-1的葡萄糖分散介质中能稳定存在，脂质体粒径分布小且均匀，质量稳定，可控性强，包封率高，以大黄素为指标的包封率可达83.52％，稳定性好。能提高大黄的透皮吸收效率，并能通过对其进行不同的后期修饰达到不同的靶向性，同时也为制成直接涂敷的各种制剂打下基础。

Claims

1.一种大黄脂质体，其特征在于：它是由下述重量配比的原料及辅料制备而成，其重量配比为：

大黄无水乙醇提取物，以大黄药材计：6000-25000份、卵磷脂30-70份、胆固醇30-70份；

它是由如下步骤制备而成：

b、取卵磷脂和胆固醇，加入氯仿，混匀，得膜材氯仿溶液；

d、除尽氯仿，得含药乙醇膜材；

2.根据权利要求1所述的大黄脂质体，其特征在于：它是由下述重量配比的原料制备而成：

3.根据权利要求1或2所述的大黄脂质体，其特征在于：所述的大黄无水乙醇提取物中含有大黄素0.1-0.3mg/ml。

4.根据权利要求1或2所述的大黄脂质体，其特征在于：它含有大黄素0.22-0.53mg/g、大黄酸0.24-0.67mg/g、大黄酚0.39-0.89mg/g、大黄素甲醚0.15-0.37mg/g。

5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的大黄脂质体的方法，它包括如下步骤：

b、取卵磷脂和胆固醇，加入氯仿，混匀，得膜材氯仿溶液；

d、除尽氯仿，得含药乙醇膜材；

6.根据权利要求5所述的大黄脂质体的制备方法，其特征在于：d步骤所述的除尽氯仿的方法为水浴旋蒸法，操作步骤为：先在水浴温度37℃，转速20r/min，真空度0.07MPa的条件下旋蒸至旋转蒸发仪冷凝管上无液滴滴下，再升温至42℃，继续旋蒸。

7.根据权利要求5所述的大黄脂质体的制备方法，其特征在于：f步骤所述的除去乙醇的方法为水浴旋蒸法，操作步骤为：先在水浴温度47℃，转速20r/min，真空度0.07Mpa条件下旋蒸至旋转蒸发仪的冷凝管上无液滴滴下，再升温至52℃-65℃。

8.权利要求1-4任意一项所述的大黄脂质体在制备止痛、消炎、消肿的外用药物中的用途。

9.一种用于止痛、消炎、消肿的外用药物组合物，它是由权利要求1-4任意一项所述的大黄脂质体，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的外用制剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于；所述的外用制剂是散剂、膏剂、喷雾剂。