CN102146461B

CN102146461B - 一种检测tp53基因点突变方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN102146461B
Application number: CN 201110029800
Authority: CN
Inventors: 孙万平; 王伟大; 肖莉; 李凯
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2011-01-27
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-01-27
Also published as: CN102146461A

Abstract

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性的TP53基因点突变检测方法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：1）按照常规技术提取DNA；2）然后配置含有特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件的PCR反应体系；3）对步骤1）所得DNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行分析，判断是否发生突变；其中特异性引物对中正义引物的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基；所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶Pfu；本发明具有快速，特异性高，可靠性高，灵敏，条件依赖少，适用平台广等优点。

Description

一种检测TP53基因点突变方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性的TP53基因点突变检测方法及其试剂盒。

背景技术

TP53基因（gene）在1979年发现，是迄今为止与肿瘤相关性最强的基因之一。该基因位于17号染色体（chromosome），其蛋白（protein）产物具有转录（transcription ）因子的功能。TP53蛋白所控制的基因参与细胞分裂与生存过程。与其它肿瘤抑制基因一样，TP53蛋白的功能是阻止细胞生长的失控。

TP53蛋白与DNA有直接的相互作用，与其它支配细胞行为方式的蛋白亦有相互作用。当发现DNA受损或其它细胞受损时，TP53立即启动细胞凋亡（apoptosis）机制。TP53蛋白在维持细胞正常调控方面起着关键性作用，约半数的肿瘤，不论其类型或起源如何，都存在TP53基因的缺陷。

在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基点突变占了相当大的比例，特别是对已知有义突变的检测，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。基于PCR扩增基础上的突变检测技术，可一定程度上克服检测靶DNA（目的DNA）含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足的难题。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、ASO以及OLA、COP、PEX等点突变的检测方法。

目前可用的高敏感突变分析方法主要有两类：(1) 美国NIH国家肿瘤中心Dr. Sommer实验室开发的焦磷酸水解激活的DNA聚合反应技术系列；（2）基于单分子扩增的新一代测序技术。方法(1)中技术虽然较现有的突变检测方法敏感，但其所需无活性引物昂贵，敏感性仍偏低，对单一拷贝的DNA分子常需40-50个PCR循环，且该方法对突变识别存在序列歧视现象，即Taq酶的焦磷酸水解活性不能水解某些特定序列因而难以结合惰性引物，故无或甚少发生与之偶连的DNA聚合反应。而方法（2）虽然具有高敏感和可靠的特征，但新一代测序技术在技术上尚有待成熟，且其依赖昂贵的设备和检测过程较长等因素，目前仍局限于实验研究而未能实际应用于临床诊断。

因此，需要研发一种高敏感性的检测TP53基因点突变方法。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种高敏感性的检测TP53基因点突变方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种高敏感性的检测TP53基因点突变方法，包括以下步骤：

1）按照常规技术提取DNA；

2）配置含有特异性引物对、高保真DNA聚合酶（Pfu DNA聚合酶）、PCR常规组件的PCR反应体系；

3）对步骤1）所得DNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行分析，判断是否发生突变；

其中，步骤2）中所述特异性引物对选自下述三对特异性引物对：

特异性引物对1由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:1和反义引物SEQ ID NO:2构成；

特异性引物对2由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:3和反义引物SEQ ID NO:4构成；

特异性引物对3由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:5和反义引物SEQ ID NO:6构成；

其中正义引物SEQ ID NO:1、正义引物SEQ ID NO:3和正义引物SEQ ID NO:5的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基，例如：SEQ ID NO:1：5'-ACATGACGGAGGTTGTGAGGCAT-3'中，A碱基为硫代修饰的碱基；

所述DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶，属高保真DNA聚合酶；

所述PCR常规组件包括：dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。

上述技术方案中，具体步骤2）中，每20 μLPCR反应体系中的组分如下：

正义引物 0.5μL，反义引物 0.5μL，模板DNA 1μL，10×Pfu缓冲液（含硫酸镁）2μL，dNTP混合液（每种10mM）0.4μL，高保真DNA聚合酶Pfu 0.2μL，余量为去离子水；其中，dNTP 终浓度为200μM/L，Pfu 1U，每条引物终浓度为250pM，模板浓度约为0.1μg。

上述技术方案中，步骤3）中，PCR反应的条件为：94℃3min, 94℃ 20s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 72℃ 5min；30个循环。

上述技术方案中，步骤3）中，对PCR产物进行分析，判断是否发生突变的方法具体为：采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，如果观察到泳带中出现180-250bp的DNA条带时，则判定相应引物对应的DNA片段存在相应的点突变。

上述技术方案中，所述TP53基因点突变的突变热点为密码子175（由CGC突变为CAC）、密码子248（由CGG突变为CAG）、密码子273（由CGT突变为TGT），其中特异性引物对1是针对密码子175设计的，扩增得到的PCR产物大小为250bp；特异性引物对2是针对密码子248设计的，扩增得到的PCR产物大小为188bp；特异性引物对3是针对密码子273设计的，扩增得到的PCR产物大小为240bp。

优选的技术方案中，采用多重PCR技术，应用上述三对特异性引物一次性扩增3个位点，提高检测效率。

本发明同时要求保护一种检测TP53基因点突变的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件；

其中，所述特异性引物对包括特异性引物对1、特异性引物对2、特异性引物对3，其中，特异性引物对1由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:1和反义引物SEQ ID NO:2构成；特异性引物对2由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:3和反义引物SEQ ID NO:4构成；特异性引物对3由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:5和反义引物SEQ ID NO:6构成；并且，正义引物SEQ ID NO:1、正义引物SEQ ID NO:3和正义引物SEQ ID NO:5的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基；

所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶（Pfu）；

本发明的原理是：本发明利用高保真酶介导的分子开关检测突变，因为对硫化磷酸修饰的碱基特异性引物而言，高保真聚合酶分子中的聚合中心和3'→5'外切酶酶解中心既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能。对于配对的引物，则直接在该酶的聚合中心进行DNA聚合反应；而对于三末端错配的引物，则从该酶的聚合中心转移至3'→5'外切酶的酶解中心，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶的聚合中心空转而“关”闭DNA聚合反应。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，完美地满足了突变分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：1）快速，1-2小时内可快速诊断；2）特异：PCR中采用的高保真聚合酶较普通PCR使用的低保真聚合酶识别效率高出两个数量级，大大提高了PCR的识别特异性；3）可靠性高：高保真聚合酶分子的3′→5′外切酶活性及高识别效率，大大降低了低保真DNA 聚合酶产生的较高假阳性；4）灵敏：PCR技术本身具有的高扩增效率；5）条件依赖少：操作简便，成本较低，所需仪器少，适用于基础医疗机构大规模开展；6）适用平台广：可结合多重PCR技术，增加一次性扩增位点，提高检测效率。

附图说明

图1为实施例三中Pfu DNA聚合酶介导的PCR反应体系的电泳图，其中1号泳道为检出的肺癌TP53密码子175阳性突变，2号泳道为阴性对照；

图2为实施例三中Pfu DNA聚合酶介导的PCR反应体系的电泳图，其中1号泳道为阴性对照，2号泳道为检出的肺癌TP53密码子248阳性突变；

图3为实施例三中Pfu DNA聚合酶介导的PCR反应体系的电泳图，其中1号泳道为阴性对照，2号泳道为检出的肺癌TP53密码子273阳性突变。

具体实施例

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

分别针对TP53热点突变密码子175（由CGC突变为CAC）、248（由CGG突变为CAG）、273（由CGT突变为TGT）设计特异性引物对1、特异性引物对2、特异性引物对3，具体如下表所示，其中，带有下划线标记的碱基为硫代修饰的碱基：

	正义引物	反义引物
			特异性引物对1	ACATGACGGAGGTTGTGAGGCAT	TCAGGCGGCTCATAGGGCAC
特异性引物对2	TCCTGCATGGGCGGCATGAACCAT	GGATGTGATGAGAGGTGGATGG
			特异性引物对3	ACGGAACAGCTTTGAGGTGTA	AGAGGAGCTGGTGTTGTTGG

上表中所述特异性引物对相应的PCR产物大小分别为250bp, 188bp, 240bp。

实施例二：

一种用以检测TP53基因点突变的试剂盒，包括：10× Pfu缓冲液（含硫酸镁MgSO₄）10 μL，dNTP(每一种10 mM) 2μL，高保真DNA聚合酶（Pfu） 1μL，实施例一所述特异性引物对1、特异性引物对2、特异性引物对3各2μL，其中正义引物和反义引物各1μL，双重蒸馏水（Milli-Q级别）50 μL。

实施例三：

一种检测TP53基因点突变的方法，具体检测步骤为：

1）以人体肺癌病变组织为对象，从病变组织中提取DNA（按常规方法提取），共20份标本；

2）采用实施例二所述试剂盒，将实施例一所述三组TP53对应外显子DNA片段的特异性引物对分别与获取的DNA、4种dNTP混合物、含镁离子的缓冲液、高保真DNA聚合酶（Pfu）、双重蒸馏水混合构成单独的PCR反应体系。PCR反应体系如下：

10×Pfu缓冲液（含MgSO₄）	2μL
		dNTP(每一种10 mM)	0.4μL
Pfu	0.2μL
		正义引物	0.5μL
反义引物	0.5μL
		DNA	1μL
双重蒸馏水	15.4μL
		总体积	20μL

其中，dNTP 终浓度为200uM/L，Pfu 1U，每条引物终浓度为250pM，模板DNA浓度为0.1μg。dNTP，Pfu均为Fermentas公司，引物由Invitrogen公司合成。

3）PCR反应反应条件为：94℃ 3min, 94℃ 20s, 60℃ 30s, 72℃30s, 72℃5min；30个循环。

采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，得到电泳图，如图1、图2和图3所示；观察到泳带中出现250bp、188bp及240bp的DNA条带，说明检测的肺癌组织中存在175、248和273的单点突变。为进一步确认检出结果是否出现假阳性，分别对相应的肺癌阳性突变检测结果进行测序，在所检出的样本中未出现假阳性。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种检测TP53基因点突变方法及其试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acatgacgga ggttgtgagg cat 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcaggcggct catagggcac 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcctgcatgg gcggcatgaa ccat 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggatgtgatgagaggtggatgg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acggaacagc tttgaggtgt a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agaggagctg gtgttgttgg 20

Claims

1.一种检测TP53基因点突变的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件；其特征在于，所述特异性引物对由特异性引物对1、特异性引物对2、特异性引物对3组成，其中，特异性引物对1由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:1和反义引物SEQ ID NO:2构成；特异性引物对2由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:3和反义引物SEQ ID NO:4构成；特异性引物对3由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO:5和反义引物SEQ ID NO:6构成；并且，正义引物SEQ ID NO:1、正义引物SEQ ID NO:3和正义引物SEQ ID NO:5的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基；

所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶Pfu。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述PCR常规组件包括：dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。