CN102146137A

CN102146137A - β-淀粉样多肽的抗体及其用途

Info

Publication number: CN102146137A
Application number: CN2010191140361A
Authority: CN
Inventors: 梁平; 常德; 张建华
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2030-02-05
Also published as: CN102146137B

Abstract

本发明涉及β-淀粉样多肽的抗体及其用途。本申请的发明人发明了重链可变区序列为SEQ ID No：3，轻链可变区序列为SEQ ID No：4的β-淀粉样多肽的抗体；分泌上述抗体的杂交瘤；对上述抗体人源化后的抗体以及进一步改进从而降低人抗鼠抗体反应的抗体；编码本发明抗体的多核苷酸；本发明抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。本发明的抗体特异性强、亲和力高并且不引起人抗鼠抗体反应。

Description

β-淀粉样多肽的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种新的抗体及其用途。具体而言，本发明涉及β-淀粉样多肽的单克隆抗体、该抗体的人源化以及所述的抗体在治疗阿尔茨海默病等疾病的药物中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以老年人中进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑、神经元纤维缠结和神经元丢失是AD的三大主要病理特征。其中老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(beta-amyloid peptide，Aβ)聚集形成的纤维，而Aβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质^[1]。Aβ主要包括Aβ40和Aβ42两种分子，由39～43个氨基酸组成。一般认为Aβ是由于编码APP的基因发生突变或其他原因导致β-分泌酶活性异常增高时，与γ-分泌酶共同切割产生。现在也有观点认为：AD患者脑内高于正常人浓度的Aβ可能是由于Aβ的转运清除发生障碍所致。研究证实大脑及脑脊液中Aβ含量的增高与认知能力下降密切相关。Aβ结构中的疏水区域对于调节Aβ纤维的形成起着重要的作用，其1～28位氨基酸为亲水的氨基末端，29位之后为疏水的羧基末端。由于疏水氨基酸主要位于羧基端，所以羧基端的长度决定其溶解性的高低，并影响聚集成纤维的速度。Aβ相互聚集形成的纤维具有毒性，能够促发炎症级联反应、轴突损伤、突触丢失和细胞凋亡等病理改变，是导致神经元变性乃至形成痴呆的重要因素^[2]。

随着全世界人口老龄化程度的不断提高，这种疾病的发病率也在逐渐的上升，给社会和家庭在物质和精神上都带来了巨大的影响。如何找到一种可以治疗这种疾病的药物是一个紧迫的需求。但至今尚无特效的治疗措施，临床上主要以对症治疗和康复疗法为主，如应用乙酰胆碱酯酶抑制剂，以弥补因神经细胞退化而带来的乙酰胆碱神经介质下降。但这些疗法不能从根本上治疗AD。而针对Aβ多肽在发病中的关键作用，研究开发抗Aβ多肽抗体就具有治疗AD的实际应用价值。

抗Aβ抗体治疗AD，主要通过两种途径清除体内的Aβ^[3]。一是抗体经过血脑屏障进入脑内与老年斑中的Aβ纤维结合，小胶质细胞通过Fc受体与抗体的Fc片段结合，吞噬、清除其中的Aβ纤维；二是抗体在外周循环中与可溶性的Aβ结合，增大血脑屏障内外Aβ的浓度差，促进脑内的Aβ外流，从而降低脑内的Aβ水平，减少Aβ在脑内的聚集和沉积。目前，已证明抗Aβ抗体(包括多抗、单抗、抗体片段等)在体外试验及动物体内对清除Aβ有肯定的效果，抗Aβ抗体治疗具有潜在的应用价值。

体外试验研究进展主要是观察抗Aβ抗体中和或清除Aβ的作用。Legleiter等分别用m266和3D6单克隆抗体与Aβ1-42以1∶10的摩尔比一起孵育，几天之后用原子力显微镜(AFM)观察Aβ纤维形成情况发现：两种单抗都能有效抑制Aβ纤维的形成，其中m266效果更好一些^[4]。抗Aβ抗体可以提高细胞对Aβ的耐受性、对培养的PC12细胞及海马神经元具有保护作用^[5，6]。为了检测抗体清除斑块的效应，Bard等用抗Aβ单抗(10D5、3D6)经腹腔注射给PDAPP转基因小鼠，六个月后处死小鼠，其冰冻脑切片与小胶质细胞一起孵育24小时，通过免疫染色发现外源小胶质细胞可以吞噬斑块中的Aβ纤维；而对照组，斑块保持完整且未见小胶质细胞的吞噬现象^[7]。有文献报道健康人体内提取的静注免疫球蛋白(IVIG，intravenous immunoglobulin)中含有抗Aβ抗体^[8]，这些抗体不仅能抑制Aβ聚集成纤维，还能使已经形成的Aβ纤维降解，同时还可以提高小胶质细胞向淀粉样斑块迁移的能力，并介导小胶质细胞吞噬、降解Aβ^[9，10]。Fukuchi等提出，抗Aβ抗体的scFv片段也可以抑制Aβ寡聚体(Aβoligomers)对HEK293细胞的毒性作用^[11]。上述体外试验表明，抗Aβ抗体可以通过Fc受体介导小胶质细胞吞噬、降解Aβ纤维，也可以通过其他方式来抑制Aβ聚集成纤维或斑块。

动物试验是抗体进入临床研究的前提，目前大多数实验动物采用APP转基因鼠。抗体经外周(如静脉、腹腔)或经颅腔导入动物体内，然后观察抗体在体内的分布、发挥作用的部位及作用效果。1999年Schenk等发现抗Aβ抗体可以清除小鼠脑内老年斑并可预防老年斑的形成^[12]。DeMattos等将抗Aβ单克隆抗体m266经外周静脉注入仅能在脑组织中表达APP的PDAPP转基因小鼠体内，结果显示血浆中Aβ浓度增高1000倍，脑组织中Aβ蓄积明显减少，说明抗体能中和外周循环中的Aβ，使脑内的Aβ逐步扩散入血液而被清除^[13]。Bard等将抗Aβ抗体经腹腔注射到PDAPP转基因小鼠体内，六个月后影像学发现脑内斑块减少80％以上，抗体能通过血脑屏障结合淀粉样斑块，并激活小胶质细胞，促进了先前已存在的淀粉样斑块的清除。Chauhan等直接将抗体注射到第三脑室中，并且在注射后不同时间段检查小鼠的大脑组织，检测结果表明，到第四周时，治疗组淀粉样蛋白的密度比对照组小鼠减少了67％，同时也证明了抗Aβ单抗脑室内注射后第四周效果达到高峰，八周后开始消失^[14，15]。近来发现脑内Aβ寡聚体也有较强的毒性，Ma等将抗Aβ抗体注射到Tg2576转基因小鼠脑内，发现其可以清除小鼠脑内Aβ寡聚体，对保护动物脑神经损伤有积极意义^[16]。Levites等发现，抗Aβ1-40及Aβ1-42的单克隆抗体注入APP转基因小鼠体内后，脑内淀粉样斑块总量减少50％左右^[17，18]。除了上述全抗体以外，抗体片段也能在动物体内发挥效应。研究人员已经成功应用抗Aβ单克隆抗体片段，如特异F(ab′)2片段、scFv片段等，经腹腔注射、颅内注射或经腺病毒介导等不同给药途径导入APP转基因小鼠体内，都明显减少了脑内的老年斑块^[19，20]。

抗Aβ抗体治疗AD在体外试验和动物试验中是比较成功的。但最终要用于人体治疗的抗体必须是经过人源化的，以克服鼠单克隆抗体在人体引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的局限性。在获得人源化抗体时，最新的方法是利用噬菌体抗体库技术，通过链更替将鼠单抗Fab片段换成完全人源化抗体，这种形式抗体具有100％的人抗体序列，但是其不能解决经免疫的人B细胞来源，所得抗体往往亲和力较低，该方法还需要进一步改善。

因此，需要要获得特异性强、亲和力高并且不引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的人源化抗体。

发明内容

本发明人发明了分泌的抗Aβ特异性鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株mZ1(该杂交瘤细胞株于2009年12月28日在中国科学院微生物保藏中心保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3547)，在此基础上，采用RT-PCR扩增出其全长基因，经过序列比对分析、设计引物，再通过PCR扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段，并将鼠源性V区基因和人源C区基因拼接后分别与PCDNA3.1(+)，PCDNA3.1(-)真核表达载体连接并将人IgG1 Fc段的234L、235L和237G突变为234A、235A和237A，转染至COS-7细胞内成功表达，进一步降低机体免疫反应。此外，在嵌合抗体基础上，发明人对可变区上的FR区进一步人源化改造，真核表达后的抗体人源化达到90％以上。在拼接V区基因与人源C区基因以及Fc段定点突变过程中，本试验利用重组PCR技术，与利用设计酶切位点连接方法相比，前者完全保持原抗体的基因序列，后则可能会改变整个抗体基因序列从而改变抗体的结构。此外，在各种表达体系中，原核，酵母表达系统虽然周期短，成本低，表达量高，但是不能正确装配，折叠，糖基化，难以表达出完全有生物功能的蛋白质。而哺乳动物表达的蛋白质尽管周期长，表达量低，但是能够表达出正确折叠完全有生物学功能的蛋白质，以成为基因工程抗体表达的常选宿主。在本研究中，利用脂质体2000共转染含有轻重链嵌合基因和人源化基因的表达载体至CHO细胞，使用G418和Zeocin筛选，得到稳定且高表达嵌合抗体和人源化抗体的细胞株，其所分泌的抗体出具有良好生物学活性。

因此，本发明一方面提供一种β-淀粉样多肽的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQ ID No：3，轻链可变区序列为SEQ ID No：4。

本发明另一方面提供一种对上述的抗体人源化后的抗体，其重链全长序列为SEQ ID No：7，轻链全长序列为SEQ ID No：8。

本发明又一方面提供一种上述抗体人源化后的抗体，其重链可变区序列为SEQ ID No：9，轻链可变区序列为SEQ ID No：10。

优选地，本发明提供的人源化抗体的恒定区是人IgG抗体恒定区。

优选地，本发明提供的人源化抗体的恒定区序列为SEQ ID No：13。

本发明又一方面提供本发明的抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

本发明又一方面提供编码本发明的抗体的多核苷酸。

本发明又一方面提供分泌本发明抗体的杂交瘤，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3547。

本发明又一方面提供分泌嵌合抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3546。

本发明又一方面提供分泌人源化抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3545。

本发明获得的抗Aβ人鼠嵌合抗体和Fc段突变后的嵌合抗体(约70％为人源的)，以及人源化抗体(约90％为人源的)，降低了鼠源性恒定区引起HAMA反应，并且ELISA结果检测显示其能特异地与Aβ结合。

保藏信息

本发明所用的杂交瘤mZ1已于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3547。

本发明所用的嵌合抗体稳定转染细胞株CB3，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3546。

本发明所用的人源化抗体的稳定转染细胞株HE10，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3545。

附图说明

图1：嵌合抗体重轻链可变区、恒定区及全长基因PCR结果。其中M：标记物；1：PVH；2：PVL；3：PCH；4：PCL；5：PCHmZ1；6：PCLmZ1。

图2：嵌合抗体和人源化抗体重链Fc段突变PCR结果。其中M：标记物；1：PHCFcf；2：PHHFcf；3：PHCFcb；4：PMCHmZ1；5：PMHHmZ1。

图3：嵌合抗体的特异性检测和人源化检测。

图4：人源化抗体的生物活性检测。

图5：真核细胞稳定分泌的嵌合抗体及人源化抗体生物活性检测。

图6：嵌合抗体及人源化抗体均能与AD病变鼠脑切片中老年斑结合。图6A：抗Aβ人鼠嵌合抗体；图6B：抗Aβ人源化抗体。

具体实施方式

主要材料：分泌抗Aβ的杂交瘤细胞株mZ1由本室制备(具体制备过程见实施例，该杂交瘤细胞株于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3547)，COS-7细胞和CHO细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，PCDNA3.1(+)、PCDNA3.1/zeo(+)载体购自invitrogen公司，Lipofectamine 2000

购自Invitrogen公司，各种限制性内切酶，T4连接酶，Pyrobest酶购自大连TaKaRa公司，DH5α感受态细菌购自天根公司，小量质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自美国OMEGA，BIO-TEK公司，基因重组人β-淀粉样多肽Aβ，由北京三元生物科技发展有限公司提供，AD病变鼠脑切片由中国医学科学院实验动物研究所提供，HRP标记羊抗鼠IgG抗体、生物素化山羊抗人IgG、辣根酶标记链亲和素、DAB显色试剂盒均购于北京中衫金桥生物公司，引物均在北京奥科生物公司合成，本发明使用的引物详细见下表：

引物	引物序列
		IgG1型重链特异性3′引物(GSP-H)	5’-CTATGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’SEQ ID No：15
κ型轻链特异性3′引物(GSP-L1)	5′-CTATGAATTCTCAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3′SEQ ID No：16
		λ型轻链特异性3′引物(GSP-L2)	5’-CTATGAATTCTCAGRRACAKTCWGCASGRGACA-3’SEQ ID No：17
重链可变区5′引物(VHf)	5’-CCCAAGCTTCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTC-3’SEQ ID No：18

重链可变区3′引物(VHb)	5’-CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’SEQ ID No：19
		重链恒定区5′引物(CHf)	5’-ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3’SEQ ID No：20
重链恒定区3′引物(CHb)	5’-GCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAGGGAGAG-3’SEQ ID No：21
		轻链可变区5′引物(VLf)	5’-CCCAAGCTTCACCATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGG-3’SEQ ID No：22
轻链可变区3′引物(VLb)	5’-TGCAGCCACAGTTTTGATCTCTACCTTGGTG-3’SEQ ID No：23
		轻链恒定区5′引	5’-GTAGAGATCAAACTGTGGCTGCACCATCTG-3’
物(CLf)	SEQ ID No：24
		轻链恒定区3′引物(CLb)	5’-GCTCTAGAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’SEQ ID No：25
重链Fc段突变前端3′引物(Fcf)	5’-GACGGCGCCCCGGCCGCTTCAGGTGCTGGGCACGG-3’SEQ ID No：26
		重链Fc段突变后端5′引物(Fcb)	5’-CCGTGCCCAGCACCTGAAGCGGCCGGGGCGCCGTC-3’SEQ ID No：27

实施例1：抗Aβ42单抗的制备与鉴定：

Aβ1-42多肽100μg/0.1ml PBS(0.01M，PH7.2)作为免疫原加等体积弗氏完全佐剂(CFA)混合，通过注射器互推混匀，至乳化，腹部皮下多点(6点)免疫5-6周雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射200μl；基础免疫后每隔两周5次重复注射以加强免疫并监测血清抗体水平变化；挑选效价最高的致敏小鼠，在细胞融合前三天尾静脉注射Aβ1-42多肽50μg/0.1ml生理盐水，10天后进行细胞融合。常规分离脾脏单细胞，将免疫小鼠脾细胞(1×10⁸)与SP2/0骨髓瘤细胞(1×10⁷)混合，1000rpm离心5分钟，吸尽上清轻弹管底使细胞团松散呈糊状，置于37℃水浴中。加入1ml 50％PEG(MW4000)进行细胞融合，边加边搅拌，于1分钟内加完，再静置1分钟，然后开始加入IMDM，前2分钟内缓慢加入2ml，后2分钟内再加入8ml。800rpm离心5分钟。离心后弃上清，加入HAT选择性培养基15ml悬浮沉淀细胞，再加入2％甲基纤维素半固体培养基25ml，充分混匀。将混合的细胞倒入直径35mm平皿中，每皿约2ml。37℃5％CO₂温箱中培养。7-10天后，在解剖镜下观察培养基中有许多白色小点状的细胞克隆，直径约为0.5-1mm。将克隆转移至96孔板继续培养，7天后，用ELISA方法开始筛选，挑选出效价高的克隆为Z1细胞系作为继续研究的材料。

实施例2：抗Aβ42单抗可变区扩增与测序

采用BD SMART^TM RACE cDNA试剂盒中5’-RACE方法来获取抗Aβ1-42鼠源单抗mZ1的可变区编码序列，引物设计如下：

GSP-L1：5’-CTATGAATTCTCAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3’

GSP-L2：5’-CTATGAATTCTCAGRRACAKTCWGCASGRGACA-3’

GSP-H：5’-CTATGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’

用TRIZOL一步法提取1×10⁷杂交瘤细胞mZ1的总RNA。按照5’-RACE试剂盒说明书(BD公司)以5’一CDS与BD SMART II oligo为引物扩增出第一条链，然和在第一条链cDNA的3’末端加上ploy(C)尾巴，加尾后用通用引物UPM和基因特异性引物GSP扩增鼠抗体基因序列。反应条件为：94℃30秒，72℃3分钟，5个循环，94℃30秒，70℃30秒，72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟25个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(重链长度约为1.5kb，轻链长度约为0.75kb)。通过TA克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌DH5α后在IPTG/X-gal平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落与含氨苄青霉素的LB培养基中扩增，然后行菌液PCR及质粒提取后限制性内切酶分析筛选阳性克隆，并进行序列测定，利用PubMed数据库中的Blastn来进行序列比对，确定了mZ1的重链和轻链可变区序列，并据此得到其氨基酸序列。根据测序和blast比对结果确定重链可变区基因VH，长414bp，编码138个氨基酸，轻链可变区基因VL，长378bp，编码126个氨基酸。根据可变区序列设计引物，利用聚合酶链反应扩增出与恒定区拼接的重链可变区PCR产物PVH，长439bp，和轻链可变区PCR产物PVL，长403bp。见图1。

mZ1重链可变区(VH)DNA序列(414个核苷酸)：SEQ ID No：1。

mZ1轻链可变区(VL)DNA序列(378个核苷酸)：SEQ ID No：2。

mZ1重链可变区(VH)蛋白序列(138个氨基酸)：SEQ ID No：3。

mZ1轻链可变区(VL)蛋白序列(126个氨基酸)：SEQ ID No：4。

实施例3：人源化嵌合单克隆抗体表达载体的构建

采用重组PCR的方法分别将鼠单抗mZ1重轻链可变区与人IgG抗体恒定区重组形成全长抗体，同时设计引物时对重轻链末端罕见氨基酸进行突变，并利用引物中预先设计好的酶切位点连入PCDNA3.1(+)和PCDNA3.1(-)表达载体，其中5’端酶切位点为Hind III，3’端酶切位点为XbaI.所设计引物如下：

轻链可变区正向引物VLf(23bp)：5’-cccAAGCTTcaccATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGG-3’

轻链可变区反向引物VLb(31bp)：5’-TGCAGCCACAGTTTTGATCTCTACCTTGGTG-3’

轻链恒定区正向引物CLf(31bp)：5’-GTAGAGATCAAActgtggctgcaccatctg-3’

轻链恒定区反向引物CLb(32bp)：5’-GCTCTAGAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’

重链可变区正向引物VHf(40bp)：5’-cccAAGCTTcaccATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTC-3’

重链可变区反向引物VHb(35bp)：5’-CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGG TTC-3’

重链恒定区正向引物CHf(32bp)：5’-ACCGTCTCCTCAGcctccaccaagggcccatc-3’

重链恒定区反向引物CHb(32bp)：5’-GCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAGGGAGAG-3’

以h1HIgG1-pcDNA3.1(h1L-Kappa pcDNA3.1zeo)为模板，CHf和CHb(CLf和CLb)为引物扩增出人IgG1重(轻)链恒定区序列IgG1 Ch(IgG1 Cl)；以H-mZ1-PGEM-T(L-mZ1-PGEM-T)为模板，VHf和VHb(VLf和VLb)为引物扩增出鼠mZ1重(轻)链可变区序列mZ1-Vh(mZ1-Vl)。然后利用引物将IgG1 Ch(IgG1 Cl)与mZ1-Vh(mZ1-Vl)拼接，反应条件为：94°预变性5min，94°变性30s，50°退火45s，以0.07°/S下降，72度延伸2min，共5个循环，72度延伸5min，反应结束后加Vhf(Vlf)和Chb(Clb)各2ul，94度变性30s，退火温度从68°开始做降落PCR，每循环减低0.5度，72度延伸2min，共28个循环，最后72度延伸5min。扩增出的人IgG1的重链恒定区PCR产物PCH，长1013bp，轻链恒定区PCR产物PCL，长342bp，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，分别与重轻链可变区PCR产物PVH和PVL拼接后得到嵌合抗体重链全长基因PCR产物PCHmZ1，长1428bp，嵌合抗体轻链全长基因PCR产物PCLmZ1，长722bp。见图1：利用琼脂糖凝胶电泳将PCHmZ1和PCLmZ1分离纯化，分别插入pGEM

-T载体后，转化DH5a后送北京奥科生物公司测序，结果显示鼠抗Aβ抗体VH和VL分别与人IgG1的CH和CL正确连接。再通过酶切、连接、转化DH5a和挑克隆鉴定后将其送北京奥科生物公司测序，结果显示重轻链基因分别成功连入表达载体PCDNA3.1(+)和PCDNA3.1(-)。至此，构建成了嵌合抗体的表达载体CHmZ1-PCDNA3.1(+)和CLmZ1-PCDNA3.1(-)。所得到的嵌合抗体序列如下：

抗Aβ1-42嵌合抗体(CHmZ1)重链全长DNA序列(1407个核苷酸)：SEQID No：5。

抗Aβ1-42嵌合抗体(CLmZ1)轻链全长DNA序列(699个核苷酸)：SEQ IDNo：6。

抗Aβ1-42嵌合抗体(CHmZ1)重链全长氨基酸序列(468个氨基酸)：SEQID No：7。

抗Aβ1-42嵌合抗体(CLmZ1)轻链全长氨基酸序列(232个氨基酸)：SEQ IDNo：8。

实施例4：人源化重组单克隆抗体VL和VH的设计及合成

利用固定模板方案和同源模板方案，对抗Aβ1-42鼠单克隆抗体mZ1重轻链可变区VH和VL人源化设计，同时考虑哺乳动物细胞使用密码子的偏好性，设计方案如下：

重链FR区模板改造后人源化抗体可变区(huHZ1)蛋白质序列：SEQ ID No：9。

轻链FR区改造后人源化抗体可变区(huLZ1)蛋白质序列：SEQ ID No：10。

重链FR区改造后人源化抗体(huHZ1)可变区编码序列：SEQ ID No：11。

轻链FR区改造后人源化抗体可变区(huLZ1)编码序列：SEQ ID No：12。

在不同人源化方案的重轻链5’端加入Hind III，3’端加入XbaI酶切位点，将人源化后序列送上海生工合成，合成后的序列连接在PUC57上。

实施例5：人源化单克隆抗体表达载体的构建

利用Hind III和XbaI将合成后的重轻链编码序列从载体PUC57后分别连入PCDNA3.1(+)和PCDNA3.1(-)表达载体，转化、挑克隆、提质粒并送测序鉴定，得到人源化单克隆抗体表达载体huHZ1-PCDNA3.1(+)和huLZ1-PCDNA3.1(-)。

实施例6：嵌合抗体及人源化抗体基因恒定区定点突变

采用重组PCR方法，将重链Fc段的234L、235L、237G突变为234A、235A和237A，设计的重组PCR引物如下：

前端引物FCF：5’-GACGGCGCCCCGGCCGCTTCAGGTGCTGGGCACGG-3’

后端引物FCB：5’-CCGTGCCCAGCACCTGAAGCGGCCGGGGCGCCGTC-3’

分别以嵌合抗体和人源化抗体重链基因为模板，在定点突变处设计引物，分别扩增出前段及后段序列，再利用重组PCR将两段DNA序列拼接，得到的突变后Fc段前端DNA片段PHCFcf和PHHFcf序列，长792bp，Fc段后端DNA片段PHCFcb序列，长671bp，分别将PHCFcf、PHHFcf与PHCFcb利用重组PCR拼接后得到产物PMCHmZ1和PMHHmZ1，长1428bp，与理论相符，见图2。重组PCR方法和条件同前，再将得到的Fc段突变后重链全长基因经Hind III和XbaI双酶切后连入表达载体PCDNA3.1(+)，得到Fc段突变后的嵌合抗体重链表达载体MCHmZ1-PCDNA3.1(+)、人源化抗体重链表达载体MhuHZ1-PCDNA3.1(+)。Fc段突变后的序列如下：

Fc段定点突变后的蛋白质序列(330个氨基酸)：SEQ ID No：13。

Fc段定点突变后的编码序列(993个核苷酸)：SEQ ID No：14。

实施例7：嵌合抗体的生物活性鉴定

按照脂质体2000说明书，转染前一天，接种1×10⁵个COS-7细胞于24孔板，在无抗生素的DMEM培养基中培养细胞24小时，第二天细胞达到90％-95％融片。取2ul脂质体2000混合于50ul无血清无双抗DMEM培养基，室温孵育5min，分别将嵌合抗体重轻链表达载体各0.4ug混合于50ul无血清无双抗DMEM培养基，再将二者混合充分混匀，室温孵育20min，弃尽24孔板中培养基，并用PBS充分洗去残存的培养基，加入500ul无双抗无血清DMEM培养基，再将DNA-脂质体混合物加入，37度温箱孵育6h后换成无双抗含血清的DMEM培养基。48h后收集细胞上清进行检测。

嵌合抗体的结合特异性检测：以抗原Aβ(0.4ug/孔)包被酶标板，4℃放置过夜；次日每孔加300ul 10％BSA，37℃封闭2h；弃上清，洗孔后，每孔加入100ul转染48h后收集的COS-7细胞培养上清，37℃孵育2h；洗涤后加入1∶5000的HRP标记羊抗人IgG抗体，37℃温育1h。阴性对照为人IgG、空载体转染组培养上清和未转染COS-7细胞培养上清，以OPD为底物，2M硫酸终止反应，经酶标仪OD492nm检测。以OD值大于阴性对照的2倍，判断为阳性。ELISA结果显示共转染的嵌合抗体和Fc段突变后的嵌合抗体细胞上清呈强阳性反应，而人IgG组、空转染组及未转染组细胞上清呈阴性，表明所分泌的嵌合抗体不与无关抗原结合，见图3。说明所分泌的嵌合抗体和Fc段定点突变后的嵌合抗体均具有生物学活性且后者仍保持突变前端结合特异性。因此，共转染重轻链表达载体的COS-7细胞能分泌抗人Aβ特异性嵌合抗体。

嵌合抗体的人源化检测：以羊抗人IgG(1ug/孔)包被酶标板，加48h后收集的COS-7细胞培养上清反应后，再加HRP标记羊抗人IgG抗体，37℃孵育后，以OPD为底物，2M硫酸终止反应，经酶标仪检测OD492nm吸光值，实验以人IgG为阳性对照，空载体转染组细胞培养上清和正常COS-7细胞培养上清为阴性对照，具体实验操作方法同前。采用重组PCR构建的嵌合抗体基因含有鼠单抗的可变区和人IgG1的恒定区，有70％是人源的。以羊抗人IgG包被酶标板、羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体为二抗的ELISA结果显示共转染的嵌合抗体组、Fc段突变后的嵌合抗体组和人IgG组为阳性，而空转染组和未转染组细胞上清为阴性，见图3。说明所分泌的嵌合抗体的恒定区为人源的且Fc段定点突变未降低其人源化程度。因此，共转染重轻链表达载体的COS-7细胞上清中所分泌的抗体含有人的恒定区。

实施例8：人源化抗体的生物活性检测：

步骤同嵌合抗体的结合特异性检测，按照脂质体2000说明书，将人源化抗体重轻链表达载体(MhuHZ1-PCDNA3.1(+)和huLZ1-PCDNA3.1)共转染至COS-7细胞，48h后收集上清。然后以抗原Aβ(0.4ug/孔)包被酶标板，一抗为共转染人源化抗体重轻链表达载体的细胞上清，二抗为1∶5000的HRP标记羊抗人IgG抗体，阳性对照为共转染嵌合抗体重轻链表达载体的细胞上清，阴性对照为未转染和空转染的细胞上清。夹心ELISA结果显示共转染嵌合抗体和人源化抗体组细胞上清均呈阳性反应，而未转染和空转染细胞上清为阴性反应，表明所分泌的人源化抗体不与无关抗原结合，人源化后仍能特异性地与Aβ结合，见图4。

实施例9：嵌合抗体及人源化抗体在真核细胞的稳定表达

按前述转染方法，将Fc段突变的嵌合抗体及人源化抗体重轻链分别共转染CHO细胞，48h后采用含G418(600ug/ml)和Zeocin(800ug/ml)的培养基筛选，培养约28天克隆形成。各选取四个克隆，嵌合抗体为CA1、CB3、CE1和CH3，人源化抗体为HA9、HC11、HE10和HF7，每种克隆按1×10⁴细胞接种至96板，每孔150ul培养基，培养24h后收集上清，ELISA显示分泌嵌合抗体的克隆CB3和分泌人源化抗体的HE10所表达的抗体量较高，见图5。

实施实例10：嵌合抗体及人源化抗体的免疫组织化学研究

将小鼠脑组织切片放至60度恒温箱中过夜烘烤，第二天进行脱蜡和水化，并进行抗原微波热修复，一抗为含嵌合抗体和人源化抗体的细胞培养上清(1∶100稀释)，二抗为生物素化山羊抗人IgG(1∶200稀释)，三抗为辣根酶标记链亲和素(1∶200稀释)，DAB显色5分钟，蒸馏水洗终止染色，苏木素复染、盐酸酒精分化、脱水、透明、封片。结果显示嵌合抗体和人源化抗体均能与鼠脑切片中淀粉样斑块结合，见图6。

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序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>β-淀粉样多肽的抗体及其用途

<130>890270CG

<160>27

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>414

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgaagttgt ggctgaactg gattttccct gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

gtgaagctgg tggagtctgg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 120

tgtgcaactt ctgggttcac cttcagtgat tactacatga actgggtccg ccagcctcca 180

ggaaaggcac ttgagtggat ggcttttatt agaaacagag ctaatggtta ctcaacagag 240

tacagtgcat ctgtgagggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aaacatcctc 300

tatcttcaaa tgaacaccct gagagttgag gacagtgcca cttattattg tacaagaatg 360

gggccgaggg gctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414

<210>2

<211>378

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgtcctctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

gtccagatga cacagtctac atcctccctg tctgcctctc taggcgacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct gcagcaagga 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt cattcgcttc ctcggacgtt cggtggaggc 360

accaagctgg aaatcaca 378

<210>3

<211>138

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Pro Val Thr Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Met Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Ser Thr Glu

65 70 75 80

Tyr Ser Ala Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Gln Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Val Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Met Gly Pro Arg Gly Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210>4

<211>126

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn

85 90 95

Leu Gln Gln Gly Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Ser

100 105 110

Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

<210>5

<211>1407

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atgaagttgt ggctgaactg gattttccct gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

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ggaaaggcac ttgagtggat ggcttttatt agaaacagag ctaatggtta ctcaacagag 240

tacagtgcat ctgtgagggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aaacatcctc 300

tatcttcaaa tgaacaccct gagagttgag gacagtgcca cttattattg tacaagaatg 360

gggccgaggg gctttgacta ctggggccaa ggcacccttg tcacagtctc ctcagcctcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

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gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtccccggg taaatga 1407

<210>6

<211>699

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgtcctctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

gtccagatga cacagtctac atcctccctg tctgcctctc taggcgacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct gcagcaagga 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt cattcgcttc ctcggacgtt cggtggaggc 360

accaaggtag agatcaaaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420

gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480

gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540

gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600

aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag 699

<210>7

<211>468

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Pro Val Thr Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Prc Pro Gly Lys Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Met Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Ser Thr Glu

65 70 75 80

Tyr Ser Ala Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Gln Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Val Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Met Gly Pro Arg Gly Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210>8

<211>232

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

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Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

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Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

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Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val

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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

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165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

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<211>138

<212>PRT

<213>人工序列

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Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Pro Val Thr Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

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Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

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Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Ser Thr Glu

65 70 75 80

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Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210>10

<211>126

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Lau Ser Ala

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Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Ser

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<210>11

<211>414

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atgaagttgt ggctgaactg gattttccct gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gaagctctcc 120

tgtgcaactt ctgggttcac cttcagtgat tactacatga actgggtccg ccaggcttca 180

ggaaagggac ttgagtgggt gggttttatt agaaacagag ctaatggtta ctcaacagag 240

tacagtgcat ctgtgagggg tcggttcacc atctccagag atgattccaa aaacaccgcc 300

tatcttcaaa tgaactccct gaaaactgag gacactgccg tttattattg tacaagaatg 360

gggccgaggg gctttgacta ctggggccaa ggcacccttg tcacagtctc ctca 414

<210>12

<211>378

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atgtcctctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

gtccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc taggcgacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ccactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaegg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aecagattat tctctcacca ttagcaacct ggaacaagag 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt cattcgcttc ctcggacgtt cggtggaggc 360

accaagctag agatcaaa 378

<210>13

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<400>13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>14

<211>993

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc ggccggggcg 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 993

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ctatgaattc tcatttacca ggagagtggg agag 34

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ctatgaattc tcaacactca ttcctgttga agc 33

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ctatgaattc tcagrracak tcwgcasgrg aca 33

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cccaagcttc accatgaagt tgtggctgaa ctggattttc 40

<210>19

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cttggtggag gctgaggaga cggtgaccag ggttc 35

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

accgtctcct cagcctccac caagggccca tc 32

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gctctagatc atttacccgg ggacagggag ag 32

<210>22

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cccaagcttc accatgtcct ctgctcagtt ccttgg 36

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tgcagccaca gttttgatct ctaccttggt g 31

<210>24

<211>30

<212>.DNA

<213>人工序列

<400>24

gtagagatca aactgtggct gcaccatctg 30

<210>25

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gctctagagc ctaacactct cccctgttga ag 32

<210>26

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gacggcgccc cggccgcttc aggtgctggg cacgg 35

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

ccgtgcccag cacctgaagc ggccggggcg ccgtc 35

Claims

1.一种β-淀粉样多肽的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQ ID No：3，轻链可变区序列为SEQ ID No：4。

2.一种对如权利要求1所述的抗体人源化后的抗体，其重链全长序列为SEQ IDNo：7，轻链全长序列为SEQ ID No：8。

3.一种对如权利要求1所述的抗体人源化后的抗体，其重链可变区序列为SEQID No：9，轻链可变区序列为SEQ ID No：10。

4.如权利要求3所述抗体，所述抗体的恒定区为人IgG抗体恒定区。

5.如权利要求4所述的抗体，所述的人IgG抗体恒定区序列为SEQ ID No：13。

6.如权利要求1-5中任意一项所述的抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

7.编码如权利要求1-5中任意一项所述的抗体的多核苷酸。

8.分泌如权利要求1所述抗体的杂交瘤，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3547。

9.分泌嵌合抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3546。

10.分泌人源化抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3545。