CN102146127A - 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9及其编码基因和应用。

背景技术

小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。

随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。近年来，通过转录因子的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注(刘强等，2000)。Yamaguchi-Shinozaki等人的研究结果表明：利用rd29A启动子启动AtDREB1A基因的表达，能够有效提高农作物(小麦)对干旱、高盐和低温的抗性(Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002；Pellegrineschi et al.，2004)。GmDREB3基因的超量表达能提高转基因拟南芥和烟草植株对干旱和低温胁迫的耐性(Chen et al.，2007)。将棉花GhDREB基因转化小麦，转基因小麦的耐旱、耐盐性得到明显提高(Gao et al.，2009)。

NAC转录因子是新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子。1996年Aida等首先发现在矮牵牛NAM基因，拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码的蛋白N端包含一个保守的氨基酸序列，约包含150个氨基酸残基，C端为高度变异的转录调控区，CUC2基因的功能类似于NAM基因，与植物的发育相关；ATAF1/2基因与植物逆境应答相关，取三基因首字母名为NAC(Aida et al.，1997)。NAC转录因子可与MYC-like元件结合，该元件的核心序列(CATGTG)在拟南芥ERD1干旱诱导反应应答过程中起重要作用(Olsen et al.，2005)。作为一种重要的调控因子，NAC转录因子参与调节植物的生长发育、激素信号转导等各种重要的生理活动。此外，NAC类转录因子也受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达，参与植物的逆境胁迫应答反应。目前，已从拟南芥、水稻、油菜、番茄、玉米、花生等植物中分离鉴定了许多与抗逆相关的NAC类转录因子基因。

拟南芥的ANAC019、ANAC055和ANAC072基因表达受干旱、高盐和ABA的诱导，超量表达能显著增强转基因植株的耐旱能力。拟南芥ATAF1基因在干旱和ABA诱导下具有活性，但水胁迫情况下受到抑制，说明ATAF1在抗旱反应起着重要的作用，当通过T-DNA插入敲除ATAF1基因，突变体ataf1-1和ataf1-2表现了比野生型的抗旱能力提高了7倍，这些结果表明：ATAF1对干旱胁迫具有负向调控作用(Satoh et al，2003)。Tadashi等(Tadashi et al，2008)在水稻中鉴定了一个抗旱、耐盐基因SNAC1，干旱胁迫可诱导水稻气孔保卫细胞SNAC1基因特异表达，促进气孔关闭，因而，过量表达SNAC1基因的转基因水稻植株抗旱性、耐盐性明显增强。此后，在水稻IRAT109中分离到一个NAC基因SNAC2，Northern-blot启动子活性分析证实SNAC2受干旱、高盐、低温、ABA诱导表达，野生型与SNAC2过表达转基因植株同在4-8℃下低温处理5天后，野生型全部死亡，转基因植株有50％的存活率。Zhong等(Zhong et al，2007)从水稻中分离到一个OsNAC6，该基因受低温、干旱、高盐、稻瘟病诱导表达，过量表达OsNAC6转基因植株中抗旱和耐高盐能力得到了提高，抗稻瘟病能力增强。

综上所述，NAC类转录因子在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用。过量表达NAC转录因子基因提高了植物的抗逆能力，这对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆相关的NAC类转录因子基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要作用及应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋EeNAC9的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9的应用。

本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9，来源于长穗偃麦草，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的转录因子由274个氨基酸残基组成，是NAC类转录因子。自SEQ ID NO.1的氨基末端第9-132位氨基酸残基是保守的NAC结构，自SEQ ID NO.1的氨基末端第141-146位氨基酸残基为核定位序列。

SEQ ID NO.1

1      MSGGQEPNLP PGFRFHPTDE

21     ELVMHYLCRR CAGAPIAVPI

41     ITEIDLYRFD PWQLPKMALY

61     GEKEWYFFSP RDRKYPNGSR

81     PNRAAGSGYW KATGADKPVG

101    TPKPLAIKKA LVFYAGKAPK

121    GEKTNWIMHE YRLADVDRSA

141    RKKNSLRLDD WVLCRIYNKK

161    GGMEKPASVD RKPATIGGYG

181    GPPGAMVSSP PEQKPVMGMN

201    ANADSSCSEQ VLSPEFPAGE

221    VQSQPKISEW ERSFASGGDP

241    VNPAAGSILE PHGGFGGDPL

261    LQDILMYWGK PFNL^＊

为了使蛋白EeNAC9便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子EeNAC9可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

根据本发明的EeNAC9编码基因具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

SEQ ID NO.2

1      ATGAGCGGCG GACAGGAGCC GAATCTGCCG CCGGGCTTCC GGTTCCACCC GACGGACGAG

61     GAGCTGGTGA TGCACTACCT CTGCCGCCGC TGCGCCGGCG CGCCCATCGC CGTCCCCATC

121    ATCACCGAGA TCGACCTCTA CAGGTTCGAC CCCTGGCAGC TCCCAAAGAT GGCGCTGTAC

181    GGCGAGAAGG AGTGGTACTT CTTCTCCCCG CGGGACCGCA AGTACCCCAA CGGGTCCAGG

241    CCCAACCGGG CCGCCGGGTC CGGGTACTGG AAGGCGACGG GGGCCGACAA GCCCGTGGGC

301    ACCCCCAAGC CGCTGGCCAT CAAGAAGGCG CTCGTCTTCT ACGCCGGCAA GGCCCCCAAG

361    GGCGAGAAGA CCAACTGGAT CATGCACGAG TACCGCCTCG CCGACGTCGA CCGCTCCGCC

421    CGCAAGAAGA ACAGCCTCAG GTTGGATGAT TGGGTGCTGT GCCGCATCTA CAACAAGAAG

481    GGCGGCATGG AGAAGCCGGC GTCCGTGGAC CGGAAGCCGG CGACCATCGG CGGCTACGGG

541    GGTCCTCCTG GGGCCATGGT GAGCTCCCCG CCGGAGCAGA AGCCCGTCAT GGGGATGAAC

601    GCCAACGCCG ACTCGAGCTG CTCGGAGCAG GTGCTGTCGC CGGAGTTCCC AGCCGGGGAG

661    GTGCAGAGCC AGCCCAAGAT CAGCGAGTGG GAGCGCTCAT TCGCCTCCGG CGGCGACCCT

721    GTGAACCCGG CCGCCGGCTC CATCCTCGAG CCCCACGGCG GCTTCGGCGG CGACCCGCTC

781    CTCCAGGACA TCCTCATGTA CTGGGGCAAG CCGTTCAATC TCTAG

含有EeNAC9基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有EeNAC9基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用EeNAC9构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有EeNAC9基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的NAC转录因子EeNAC9的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。

本发明以抗旱、耐盐性较强的长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)为实验材料，得到了抗逆相关的NAC转录因子EeNAC9(Elytrigia elongate NAM-ATAF 1/2-CUC2 9)蛋白及其编码基因，并将EeNAC9基因导入烟草，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9编码基因的cDNA克隆，以长穗偃麦草cDNA为模板，PCR扩增含有NAC保守域的cDNA片段，1：长穗偃麦草片段；M：DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。

图2为植物表达载体构建及转基因烟草的获得。A.pBI35S-EeNAC9植物表达载体构建过程；B.双子叶植物表达载体酶切鉴定。M：DL2000Marker；1：pBI35S-EeNAC9载体酶切鉴定；C.转双子叶植物表达载体的农杆菌PCR检测。M：DL2000 marker；1-4：转pBI35S-EeNAC9质粒农杆菌PCR产物；D.转基因烟草植株生根培养；E.转基因烟草PCR检测。1，2，3，4，5，6，7，8，9：35S::EeNAC9转基因烟草；10：阳性对照；11：W38野生型对照；M：DL2000 Marker。

图3为ABA对EeNAC9转基因烟草生长的影响。A.35S::EeNAC9烟草在含有200μM ABA培养基上的生长情况；B.35S::EeNAC9转基因烟草在200μM ABA培养基上生根情况。

图4为35S::EeNAC9转基因烟草耐盐性鉴定。A.35S::EeNAC9转基因烟草在含有200mM NaCl培养基上的生长情况；B.35S::EeNAC9转基因烟草在200mM NaCl盐胁迫培养基上生根情况。

图5为35S::EeNAC9转基因烟草耐旱性鉴定。A.35S::EeNAC9转基因烟草在含有2％ PEG培养基上的生长情况；B，C.35S::EeNAC9转基因烟草在含有2％ PEG培养基上株高比较及生根情况。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：长穗偃麦草抗旱、耐盐相关EeNAC9基因的cDNA克隆。

对生长45天左右的长穗偃麦草幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取长穗偃麦草总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)获得EeNAC9基因的全长序列825bp。

用Trizol提取长穗偃麦草幼苗的总RNA，用superscript II(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据EeNAC9基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-AGATGAGCGGCGGACAGGAGC-3’，

P2：5’-GAACGGCTTGCCCCAGTACATGA-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.8-1kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的EeNAC9基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至825位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示EeNAC9基因的重组载体命名为pTE-EeNAC9，其cDNA克隆结果如图1所示。

EeNAC9基因的序列在Genabnk上进行比对，该基因与拟南芥中NAC类转录因子具有较高同源性，而在长穗偃麦草中未发现同源蛋白基因，证明EeNAC9基因是一个新的基因。

实施例2：用EeNAC9基因增强植物的抗旱、耐盐性

1、重组表达载体的构建

1)35S-EeNAC9重组表达载体的构建

以长穗偃麦草的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体p35S-EeNAC9。

引物序列如下：

EeNAC9[SmaI]5’-GTTCCCGGGATGAGCGGCGGACAGGA-3’

EeNAC9[SpeI]5’-GCGACTAGTAGAGATTGAACGGCTTGCCC-3’

2、转基因烟草的获得和功能鉴定

1)转基因烟草的获得

将上述构建的重组表达载体p35S-EeNAC9分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用叶盘法分别将整合有p35S-EeNAC9的根癌农杆菌EHA105转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选15天，得到阳性转基因植株(图3)。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物)：5’-GTTCCCGGGATGAGCGGCGGACAG-3’，

P4(下游引物)：5’-GCGGAGCTCAGAGATTGAACGGCTTGCC-3’。

对35S::EeNAC9转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得0.9Kb左右条带，结果获得转35S::EeNAC9烟草65株。

同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载体烟草(筛选获得的转基因烟草用T₀代表示)。

2)转EeNAC9基因植株ABA敏感性鉴定

将T₀代转35S::EeNAC9基因烟草植株及T₀代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有200μM ABA的培养基中进行ABA胁迫处理30天，观察表型并拍照。结果表明：胁迫处理30天后，35S::EeNAC9转基因植株和对照生长都受到抑制，叶片发黄，植株矮小，根系生长不明显；然而，对照W38植株生长势较转基因植株强，植株较高，叶片黄化程度较轻(如图3A，B所示)。说明EeNAC9基因可能参与了ABA信号传递途径，转基因植株比对照对ABA产生了较强的敏感性。

3)转EeNAC9基因植株耐盐性鉴定

将T₀代转35S::EeNAC9基因烟草植株及T₀代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有200mM NaCl进行盐胁迫处理20天，观察表型并拍照。结果表明：胁迫处理20天后，35S::EeNAC9转基因植株在盐胁迫条件下生长基本正常，生长受抑制较小，根系发达，叶片生长较大。而对照W38叶片较小，根系生长缓慢(图4A，B)。上述结果说明：EeNAC9基因的过表达使得35S::EeNAC9转基因烟草比野生型烟草表现出较强的耐盐性。

4)转EeNAC9基因植株耐旱性鉴定

将T₀代转35S::EeNAC9基因烟草植株及T₀代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有2％ PEG的培养基中进行干旱胁迫处理30天，观察表型并拍照。结果表明：胁迫处理30天后，35S::EeNAC9转基因植株在2％ PEG培养基上基本能够正常生长，叶片变小、轻度卷曲、叶色正常；而对照W38叶尖发黄、叶片卷曲，根基部叶片老化严重，植株生长高度明显受到抑制，比转基因植株矮小(图5A，B)。进一步对根系的生长观察显示：35S::EeNAC9转基因烟草在2％ PEG培养基上生根较快，根系发达，而在野生型烟草几乎不生根(图5C)。上述结果说明EeNAC9基因的过表达致使转基因烟草比野生型耐旱性显著增强。

Claims (7)

1.一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种植物抗旱、耐盐相关基因EeNAC9，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9。

3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeNAC9，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2或3所示。

4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因EeNAC9的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因EeNAC9的转基因细胞系。

6.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白EeNAC9的应用。

7.权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因EeNAC9的应用。

Images