CN102138918A - 山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 - Google Patents
山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102138918A CN102138918A CN201110098010XA CN201110098010A CN102138918A CN 102138918 A CN102138918 A CN 102138918A CN 201110098010X A CN201110098010X A CN 201110098010XA CN 201110098010 A CN201110098010 A CN 201110098010A CN 102138918 A CN102138918 A CN 102138918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kaempferol
- cell
- preparation
- preventing
- cardiovascular diseases
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N kaempferol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 162
- UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N Demethoxycapillarisin Natural products C1=CC(O)=CC=C1OC1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- 235000008777 kaempferol Nutrition 0.000 title claims abstract description 81
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 8
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 claims description 13
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 6
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 claims 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 abstract description 23
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 13
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 16
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 6
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 208000006906 Vascular Ring Diseases 0.000 description 4
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 3
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 3
- -1 Polyphenols chromocor compound Chemical class 0.000 description 3
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 210000004782 brain capillary endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 3
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 3
- 230000001196 vasorelaxation Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N (+)-borneol Chemical compound C1C[C@@]2(C)[C@@H](O)C[C@@H]1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010010254 Concussion Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000294142 Vascellum Species 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229940097572 chloromycetin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 210000002451 diencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 201000006828 endometrial hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 239000008246 gaseous mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 1
- 210000003446 pia mater Anatomy 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000009288 screen filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012109 statistical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了山萘酚的新用途。该新用途：一方面是其在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物或保健品中的应用；另一方面是其在制备血管舒张药物或保健品中的应用。实验证明，山萘酚能够明显舒张心脑血管、有效吸收和透过血脑屏障且对血管内皮细胞影响小，本品具有疗效确切、安全方便、无毒副作用、价格低廉的特点。本发明的药物具有明显的预防和治疗心脑血管疾病的作用，可用于多种原因引起的心脑血管疾病的预防与治疗。
Description
技术领域
本发明涉及山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用。
背景技术
山萘酚(kaempferol)属于多酚类黄酮化合物(flavonoids)，在自然界中广泛存在。山萘酚多存在于植物的叶、花和果实中。山萘酚的化学名称为3，4，5，7-四羟基黄酮，其3、4、5、7位置的4个羟基和C2＝C3双键决定了其独特的物理化学特性和药理学效应。山萘酚具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗肿瘤等多种药理作用，备受广大学者的青睐。
长期以来，心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是在中老年人中发生的常见病，心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手，也是影响人们健康的“无声凶煞”。现代医学科学研究证实，目前严重危害人类健康的心脑血管病发生主要来自血管内膜增生、血管内皮功能障碍、血管痉挛等，从而使心脑供血不足，甚至供血中断引发心脑血管病。而对于心脑血管的疾病发生，血管病变、血管痉挛是最为直接的因素。因此，增加药物的舒血管活性对于此类疾病的预防治疗具有直接的影响。
发明内容
本发明的目的是提供山萘酚的新用途。
本发明所提供的山萘酚的新用途：一方面是其在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物或保健品中的应用；另一方面是其在制备血管舒张药物或保健品中的应用。
上述预防和/或治疗心脑血管疾病的药物以及血管舒张药物可以直接口服或者注射，或者与药学上可接受的载体辅料混合在一起制成多用药用剂型，包括：滴丸、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、冲剂、膏剂、丹剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、纳米制剂、缓释制剂和控释制剂等。
本发明的药物山萘酚的用药剂量可为1.76g/kg体重以下(该剂量为小鼠口服最大耐受剂量(MTD)的换算剂量，小鼠的MTD＞16g/kg，因此其LD50＞16g/kg)
口服制剂是山萘酚药物一种重要的给药剂型，口服药物的主要吸收部位在小肠，而吸收是评价药物生物利用度的重要手段。本发明利用Caco-2细胞模型来研究山萘酚的吸收程度，结果表明，山萘酚在通过Caco-2细胞膜时有着很高的表观渗透系数(Papp)，并随着时间的变化其通透率呈现良好的时间依赖关系。血脑屏障是影响脑血管药物疗效的主要阻碍之一，本发明采用大鼠脑微血管内皮细胞和星形细胞联合培养的方法建立了体外血脑屏障模型来研究山萘酚的跨膜转运，结果表明，山萘酚在通过血脑屏障时有着很高的表观渗透系数(Papp)，并随着时间的变化其通透率亦呈现良好的时间依赖关系。上述实验证明，本发明的药物能够有效预防和治疗心脑血管疾病，而且安全性很高，具有疗效确切、毒副作用低、安全方便和价格低廉的特点。
附图说明
图1为实施例2中山萘酚在Caco-2细胞单层模型中的转运渗透率与时间的关系；给药浓度为山萘酚40μM，实验结果以mean±S.D.表示(n＝3-5)。
图2为实施例3中山萘酚在BBB细胞模型中的转运渗透率与时间的关系；给药浓度为山萘酚40μM，实验结果以mean±S.D.表示(n＝3-5)。
图3为实施例4中山萘酚对RBMECs的活力影响；实验结果以mean±S.D.表示，与正常对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，C代表正常细胞对照组。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1、山萘酚对大鼠离体胸主动脉的血管舒张作用
1、材料和方法
1.1实验动物
雄性SD大鼠，体重在250-280克，由军事医学科学院提供。动物合格证号为SCXK(京)2007-0001。动物自由饮食，被饲养于清洁室内。
1.2试剂配制
标准品山萘酚由中国药品生物制品检定所提供。山萘酚为黄色粉末，精密称取山萘酚2.86mg置于1ml容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液。所有给药浓度均用三蒸水将母液稀释而成，所需浓度分别为0.8μM、4μM、20μM。
1.3方法
将SD大鼠麻醉后脱臼处死后，迅速打开胸腔，取出胸主动脉放入4℃的KH液中。仔细拨除血管周围脂肪和结缔组织，分成长约3-5mm的血管环，悬挂在两个平行的三角环上置于5ml、37℃的KH液中，并持续通以95％O2-5％CO2混合气。以Powerlab生物信号处理系统记录血管环张力，血管环悬挂后稳定10分钟加1g静息张力平衡1h，在此期间每隔20分钟换1次KH液，并不断调整张力在1g左右。1h后加3M的KCl 100μl，刺激血管收缩连续三次，用KH液冲洗至平台后加2.5×10-3M的苯肾上腺素(PE)50μl达到收缩平台后，加10-2M的乙酰胆碱(ACh)以检查血管内皮是否完整。若加ACh后使PE预收缩的血管环舒张60％以上，可认为内皮完整；反之，则认为内皮受损。已完全去内皮的血管，用ACh后不产生舒张。
取内皮完整血管，加PE使终浓度为10-6M，达最大收缩平台后，先后加入山萘酚，使终浓度达0.8μM、4μM、20μM，记录张力随时间变化曲线，至舒张反应达最大，计算舒张百分率(Rex％)。与加入浓度为20μM的生理盐水溶液的空白对照组比较。
2、数据统计学处理
所有数据用mean±S.D.表示，统计学分析采用SPSS 11.5分析软件。以PE 10-6M诱发最大收缩幅度为100％，以加入药物后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。所有数据均通过正态性检验，采用独立样本t检验进行分析，以P＜0.05为有显著性差异。舒张百分比的计算公式为：
3、实验结果
山萘酚在不同浓度时对PE预收缩血管有着不同的舒张百分率，且呈现一定得线性关系(y＝1.920x+21.89)。结果见表1。
表1不同浓度的山萘酚对PE预收缩胸主动脉环的血管舒张作用(n＝6)
(**与正常对照组相比，P＜0.01)
4、结论
结果表明，在本实验条件下，山萘酚在完整内皮的血管上均可剂量依赖性地减小PE预收缩血管张力。且当其浓度为0.8μM的低剂量时，对血管的舒张还能维持在20％以上，故说明山萘酚具有血管舒张作用，对由血管痉挛等因素所引起的心血管疾病具有显著的预防和治疗作用。
实施例2、山萘酚在体外Caco-2细胞单层模型中的转运吸收
1、材料与试剂
1.1细胞来源
Caco-2细胞购于协和细胞中心(源于美国ATCC公司)
1.2试剂配制及给药
精密称取山萘酚2.86mg置于1ml容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液。用新鲜配制的pH≈7.4的HBSS溶液稀释成40μM进行给药。
2、方法
2.1体外Caco-2细胞单层模型的建立
将状态甚好的43代Caco-2细胞接种于多聚碳酸酯膜12孔Transwell培养池中的AP侧，密度为6～8×104/孔，在供给池中加入0.8ml培养基，在接受池加入1ml培养基培养21天，前一周隔天换液，以后每天换液。记录的TEER值、酚红试漏和扫描电镜的细胞单层图片、以及阳性药维拉帕米Papp是鉴定模型成功与否的指标。
2.2山萘酚在Caco-2单层细胞模型中的转运吸收
从温箱将细胞板取出，测量各孔的TEER值(达600Ωcm2以上则满足条件)。将各孔的AP、BL面的培养基全部吸走，用之前在孵箱预热好的HBSS(pH≈7.4)洗2遍后，在AP、BL侧分别加入0.8ml、1ml的HBSS放入恒温摇床平衡30min(37℃，55rpm)。
1)为了得到山萘酚的表观渗透率Papp，则弃去该HBSS，在一部分细胞培养池的AP侧加入所配制好的山萘酚溶液(浓度为40μM)0.5ml，BL侧加HBSS 1ml。按90min从BL侧取液100μl，所得的样品放于-20℃冰箱保存待测。
2)为了测定山萘酚的渗透率与时间的关系，则弃去该HBSS，在另一部分细胞培养池的AP侧(绒毛面)加入所配制好的山萘酚溶液(浓度为40μM)0.5ml，BL侧加HBSS 1ml。按15、30、60、90、120、180min从BL侧(基底面)取液100μl，并立即加入100μl HBSS，180min后测TEER值。所得的样品放于-20℃冰箱保存待测。
HPLC进样前，往以上样品中加入同等体积的甲醇100μl，涡漩振荡后，高速离心(13,000g，5min)，取上清液50μl进样。HPLC进样检测的色谱条件如下：XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，i.d.5μm，美国Agilent公司)，流动相为甲醇和1％冰醋酸水溶液(from 30∶70 to 40∶60，v/v)，流速为1.0ml/min，柱温为59℃，进样量为50μl。山萘酚的检测波长为368nm。
3、数据处理和分析方法
表观渗透系数的计算公式为：
ΔQ/Δt表示单位时间药物的转运量(μM/s)，代表在BL侧接受药物的速率；C0代表所给药物AL侧的初始浓度(40μM/cm3)；A是多聚碳酸酯膜的表面积(1.13cm2)。在做山萘酚的渗透率与时间关系的实验时，由于每次取样后都要补液，对药物的通透性产生了稀释作用，因而药物的累积通透浓度可用以下公式校正：
各指标的检测数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析(ANOVA)检验。实验结果以mean±S.D.表示。
4、实验结果
根据以上表观渗透系数公式和山萘酚的标准曲线(y＝109.683 1x+2.7641)，所得山萘酚在体外Caco-2细胞单层模型中表观渗透率(Papp＝3.57±1.03×10-6cm/s，n＝3-5)。山萘酚在此模型的渗透率和时间的关系结果见图1。
5、结论
一般认为Papp＞1×10-6cm/s的药物被认为是吸收比较完全的药物(Artursson P，Palm K，Luthman K.Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drugtransport[J].Adv Drug Delivery Rev 2001；46(1-3)：27-43.)。山萘酚在体外Caco-2细胞单层模型中有着很高的Papp，这可能与山萘酚的化学结构以及其相应的脂水分布系数较高有关。同时，山萘酚在此模型中的渗透率和时间也呈现一定的依赖关系。故可推测出山萘酚在体内有着良好的吸收，这为山萘酚在预防和治疗心脑血管疾病时口服吸收或直接注射有着直接的指导作用。
实施例3、山萘酚在体外血脑屏障模型中的转运吸收研究
(一)原代脑微血管内皮细胞(RBMECs)的分离培养
1、材料和方法
1.1实验动物
雄性Sprague-Dawley大鼠，三周，购自军事医学科学院，合格证号SCXK(军)2007-004。
1.2原代细胞培养方法
SD大鼠脱臼处死后，无菌条件下取出的脑组织放入盛有冷的PBS的培养皿中，解剖去除小脑、间脑(包括海马)，软脑膜、脑膜大血管及大脑白质后仅保留大脑皮质，将脑皮质剪碎后移入匀浆器中匀浆，600×g，10℃，10min离心后弃去上清液，加入20％BSA悬浮混匀后离心(4000×g，20min，4℃)去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀，加入2ml 0.1％胶原酶II悬浮混匀后37℃水浴消化1h，离心(600×g，10℃，10min)，去上清液，加入2ml ECM(endothelial cell medium，内皮细胞培养基)含20％FBS、1％ECGF的培养液悬浮后，74μm滤网再次过滤2次后所得纯化的微血管段。接种于涂布生物基质的25cm2一次性塑料培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养，12～24h后换液，随后隔天换液。第3-4d可见微血管段周围有脑微血管内皮细胞游出，细胞折光性强，形态主要为梭形，也见多角形，单层生长并有接触抑制现象，符合内皮细胞生长特性。7-10d左右细胞生长至融合时呈现出铺卵石状。
2、免疫荧光鉴定RBMECs细胞纯度
采用第VIII因子相关抗原免疫细胞组织化学鉴定方法(范祥.血脑屏障体外模型的建立及冰片对其影响的研究[D].天津：天津中医学院，2004.)来鉴定原代RBMECs的纯度。取状态甚好的RBMECs，4％多聚甲醛室温固定1小时，PBS洗3次每次5分钟，加含0.3％Triton X-100的山羊血清封闭1小时，滴加兔抗人第VIII因子相关抗原抗体(1∶100)4℃过夜，PBS洗3次每次5分钟，滴加FITC 37℃孵育2小时，PBS洗3次每次5分钟，加入Hochest染核2分钟后，利用共聚焦显微镜观察。细胞经第VIII因子相关抗原染色95％以上均为细胞浆着色，表明采用以上方法获得的细胞为脑微血管内皮细胞，纯度高。2代用于共培养的体外BBB模型研究。
(二)原代星形胶质细胞(AS)的分离培养
1、材料和方法
1.1实验动物
雄性Sprague-Dawley大鼠，1-2天，购自军事医学科学院，合格证号SCXK(军)2007-004。
1.2原代细胞培养方法
新生1-2天SD大鼠乳鼠，无菌条件下去除脑膜及大血管。分离两侧大脑皮质并剪成1mm3大小，加入0.25％胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10min，离心去上清，用含10％FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75μm筛网过滤两次，收集滤液，离心收集沉淀用含10％FBS的DMEM培养基重悬，种植于25cm2培养瓶，经1小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的培养瓶继续培养，两天换液一次。7天后将培养瓶放入水平摇床，(260rpm，2h，37℃)后，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1小时，重新置于水平摇床，(260rpm，18h，37℃)后，换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2遍，加入0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA体积比1∶1混合液消化、传代备用。
2、免疫荧光鉴定星形胶质细胞纯度
采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取满足条件的星形胶质细胞，4％多聚甲醛室温固定1小时，PBS洗3次每次5分钟，加含0.3％Triton X-100的山羊血清封闭1小时，滴加胶质纤维酸性蛋白抗体(1∶50)4℃过夜，PBS洗3次每次5分钟，滴加FITC 37℃孵育2小时，PBS洗3次每次5分钟，加入Hochest染核2分钟后，利用共聚焦显微镜观察。细胞经anti-GFAP染色95％以上均为细胞浆着色，表明采用以上方法获得的细胞为星形胶质细胞，纯度高。2代用于共培养的体外BBB模型研究。
(三)山萘酚在体外BBB模型中的转运吸收
1、体外血脑屏障模型的建立
将原代星型胶质细胞消化得到的2代细胞，调整细胞密度至8×104/孔种植于预先包被生物基质的细胞培养池多聚碳酸酯膜的下侧100μl，依靠表面张力培养1.5h，然后将培养池放入24孔培养板，置于5％CO2、37℃培养箱继续培养，2天换液一次，待星型胶质细胞融合至80％时，即3-5天后在共培养池接种RBMECs，后者密度为1×105/孔种植于预先包被生物基质的细胞培养池多聚碳酸酯膜的上侧进行两种细胞的共培养。每天记录跨细胞间电阻(TEER)。3-5天后至两种细胞分别在多聚碳酸酯膜膜两侧成单层生长时，TEER值、酚红试漏和扫描电镜检测其单层的致密性。当体外BBB模型建立完成后，方可进行山萘酚在BBB细胞模型上的转运实验研究。BBB模型给药实验所选用的阳性、阴性标杆药分别是氯霉素和酮康唑。
2、山萘酚在体外BBB模型中的转运吸收
从温箱将共培养的细胞板取出，测量各孔的TEER值(达300Ωcm2，满足条件)。将各孔的AP、BL面的培养基全部吸走，用之前在孵箱预热好的HBSS(pH≈7.4)洗2遍后，在AP、BL侧分别加入0.4ml、0.6ml的HBSS放入恒温摇床平衡30min(37℃，55rpm)。1)为了得到山萘酚的表观渗透率Papp，则弃去该HBSS，在一部分细胞培养池的AP侧加入所配制的山萘酚溶液(将实施例1中配制的10mM母液用HBSS稀释至浓度为40μM)0.4ml，BL侧加HBSS 0.6ml。按90min从BL侧取液60μl。所得的样品放于-20℃冰箱保存待测。2)为了测定山萘酚的转运速率与时间的关系，则弃去该HBSS，在另一部分细胞培养池的AP侧加入所配制的山萘酚溶液(浓度为40μM)0.4ml，BL侧加HBSS 0.6ml。按15、30、60、90、120、180min从BL侧取液60μl，并立即加入60μl HBSS。180min后测TEER值。所得的样品放于-20℃冰箱保存待测。
HPLC进样检测前，往以上样品中加入同等体积的甲醇60μl，涡漩振荡后，高速离心(13,000g，5min)，取上清液50μl进样。
(四)数据处理和分析方法
表观渗透系数的计算公式为：
ΔQ/Δt表示单位时间药物的转运量(μM/s)，代表在BL侧接受药物的速率；C0代表所给药物AL侧的初始浓度(40μM/cm3)；A是多聚碳酸酯膜的表面积(0.60cm2)。在做山萘酚渗透率与时间的关系实验时，由于每次取样后都要补液，对药物的通透性产生了稀释作用，因而药物的累积通透浓度可用以下公式校正：
各指标的检测数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析(ANOVA)检验。实验结果以mean±S.D.表示。
(五)实验结果
根据以上表观渗透系数公式和山萘酚的标准曲线(y＝109.683 1x+2.7641)，所得山萘酚在体外BBB模型中表观渗透率(Papp＝4.48±0.38×10-6cm/s，n＝3-5)。山萘酚在此模型的转运速率和时间关系结果见图2。
(六)结论
山萘酚在体外BBB细胞模型中有着很高的Papp，即表明山萘酚比较容易透过血脑屏障，这可能与山萘酚的化学结构以及其相应的脂水分布系数较高有关。同时，山萘酚在此模型中的渗透率和时间也呈现一定的依赖关系。且山萘酚的Papp比其在Caco-2中要偏高，相同时间的转运速率几乎差不多。故可推测出山萘酚在体内穿透血脑屏障时有着良好的转运，这为山萘酚在预防和治疗脑血管疾病时的广泛应用奠定了理论基础。
实施例4、山萘酚对脑微血管内皮细胞的细胞活力影响
1、材料与方法
1.1细胞来源
来自实施例3中原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的2代细胞。
1.2试剂配制及给药
精密称取山萘酚2.86mg置于1ml容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液。用新鲜配制的pH≈7.4的DMEM溶液稀释成4μM、20μM、40μM、70μM、100μM进行给药。
1.3方法
采用MTT法测定大鼠BMECs细胞活力。其原理为活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解，产生不溶于水的蓝色甲瓒颗粒，甲瓒的形成量与活细胞数和细胞活力呈正比。取生长状态良好的2-3代BMECs，用胰酶消化制成6×104个/ml的细胞悬液，种于96孔板内，每孔100μl。培养24h后，更换为无血清的DMEM培养液，继续培养24h，使细胞的生长同步。山萘酚浓度为(4，20，40，70，100μM)。培养48h后，加入5mg/ml，10％MTT 200μl，孵育4h，加入150μl DMSO，振荡3分钟，全自动酶标仪570nm波长处测吸光度值(OD)。
2、统计学处理
各指标的检测数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用Least Significant Difference Procedure(LSD)检验。实验结果以mean±S.D.表示，P＜0.05说明差异具有显著性意义。
3、实验结果
采用MTT实验研究山萘酚对大鼠脑微血管内皮细胞活力影响的结果见图3。
4、结论
在本实验条件下，与正常对照组相比，山萘酚对大鼠BMECs细胞的活力抑制作用呈现一定的剂量依赖关系。当浓度为70μM时，其活力抑制率为32.5％，当浓度为100μM时，其活力抑制率为48.75％。一般来说，BMECs是形成BBB的最主要细胞，而BMECs间形成的紧密连接是构成BBB的结构基础。因而考察不同浓度山萘酚对BMECs的细胞活力影响，从而判断出不同浓度山萘酚对血脑屏障的相对安全剂量，进而能更准确地得到山萘酚在BBB体外细胞模型中的转运吸收数据，这为临床治疗心脑血管疾病的安全用药提供了重要保证。结果表明，山萘酚具有安全性很高、毒副作用较低的特点。活力抑制率的计算公式为：
Claims (4)
1.山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品。
3.山萘酚在制备具有血管舒张功能产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110098010XA CN102138918A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110098010XA CN102138918A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102138918A true CN102138918A (zh) | 2011-08-03 |
Family
ID=44406862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110098010XA Pending CN102138918A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102138918A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111297848A (zh) * | 2018-12-11 | 2020-06-19 | 香港科技大学深圳研究院 | 山奈酚及其类似物的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1403080A (zh) * | 2002-10-21 | 2003-03-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 山奈酚及其衍生物用于制备防治心脑血管疾病药物的用途 |
| CN1435424A (zh) * | 2003-03-13 | 2003-08-13 | 石雁羽 | 高含量银杏提取物及制作工艺 |
-
2011
- 2011-04-19 CN CN201110098010XA patent/CN102138918A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1403080A (zh) * | 2002-10-21 | 2003-03-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 山奈酚及其衍生物用于制备防治心脑血管疾病药物的用途 |
| CN1435424A (zh) * | 2003-03-13 | 2003-08-13 | 石雁羽 | 高含量银杏提取物及制作工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《European Journal of Pharmacology》 20051231 Eugenia Padillaa et al Relationship between vasodilation capacity and phenolic content of Spanish wines 第84-91页 3-4 第517卷, * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111297848A (zh) * | 2018-12-11 | 2020-06-19 | 香港科技大学深圳研究院 | 山奈酚及其类似物的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103735728B (zh) | 地骨皮醇提物、地骨皮甲素及乙素在制备具有神经保护作用的药物中的用途 | |
| CN110312515A (zh) | 新的抗血管生成细胞外囊泡 | |
| CN102247339B (zh) | 异甘草素在制备具有血管舒张功能的药物中的应用 | |
| CN101292971B (zh) | 菊苣酸在制备治疗痴呆疾病药物中的用途 | |
| CN102526073A (zh) | 罗汉果醇h9在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN102138918A (zh) | 山萘酚在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 | |
| CN102218054A (zh) | 芹菜素在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用 | |
| CN108392575B (zh) | 廖氏化风丹在制备抗白血病药物中的应用 | |
| CN102755343A (zh) | 胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用 | |
| CN101474383B (zh) | 大蒜总皂苷的制备方法及其产品和应用 | |
| CN102895278A (zh) | 牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用 | |
| CN1249072C (zh) | 一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途 | |
| CN102727581B (zh) | 一种对伤口具有修复作用的药物组合物 | |
| CN101292972B (zh) | 3,4-二羟基咖啡酰基酒石酸在制备治疗痴呆疾病药物中的用途 | |
| CN106512022B (zh) | 羟基红花黄色素a-红细胞黏附硫酸软骨素a受体蛋白多肽复合物在制备抗肿瘤药物的应用 | |
| CN101623286B (zh) | 包含葫芦素类活性成分的经皮给药组合物 | |
| CN103127061A (zh) | 银线草醇m的药物用途 | |
| CN107056874A (zh) | 一种积雪草酸替诺福韦二吡呋酯的化合物及其制备方法 | |
| CN101897738B (zh) | 狗枣猕猴桃叶总黄酮在制备预防与治疗血管性痴呆药物中的应用 | |
| CN101239057A (zh) | 丹酚酸b及其盐类在治疗帕金森病中的用途 | |
| CN103127062A (zh) | 13’-乙酰基银线草醇c在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN104312969A (zh) | 脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用 | |
| CN114933635B (zh) | 纳米小肽fh及其在制备治疗及预防眼底血管疾病药物中的应用 | |
| CN102772418B (zh) | 富贵草胺碱g的用途 | |
| CN103083330B (zh) | 澳洲茄胺在制备抗肿瘤药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110803 |