CN102137671B - 含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方 - Google Patents

Abstract

一种含异烟酰胺低副作用的新复方制剂，其包含药学有效量的异烟酰胺，在治疗中，合并使用药学有效量的细胞色素P450 2E1抑制剂，其中所述的细胞色素P450 2E1抑制剂优选为双硫仑。另外，本发明还公开了一种含异烟酰胺低副作用的新复方制剂，包括药学有效量的异烟碱酰胺，在治疗中，合并使用药学有效量的双硫仑，以及药学有效量的硝基苯酚磷酸二酯。

Description

含异烟碱酰胺(isoniazid,INH)低副作用的新复方

技术领域

本发明是关于一种含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)估计，全球大约有三分之一的人口感染肺结核，每年约有八百万新增病例；而中国台湾新登记的肺结核病患人数最近几年也不停爬升，每十万人口有六十多人感染肺结核，但其中只有大约四分之三的人接受完整治疗；根据卫生署的统计，中国台湾每天至少有4.2个人死于肺结核；在这么多接受肺结核药物治疗的病患中，临床上最常见的药物副作用即为肝毒性和神经系统病变(如：听神经和视神经病变)，其中又以肝毒性最为常见。再加上台湾又是B型及C型肝炎的盛行区，感染肺结核的肝炎患者也不在少数，假设每年有14,000名新增的肺结核病患，粗略估计至少有2,000名到3,000名慢性肝病患者需接受抗结核药物治疗，因此在这些病患身上所可能发生的肝毒性是我们不可忽视的医源性疾病。

多数的第一线抗结核药物，例如：异烟碱酰胺(isoniazid，俗称敌痨克星)、丙基硫异烟酰胺(pyrazinamide，俗称敌痨新迈)及立复霉素(rifampin)等都有导致肝毒性发生的潜在不良反应；其中异烟碱酰胺(isoniazid)是目前最有效的单一抗结核药物，也最容易引起服用者产生肝毒性；在60年代末期陆续有异烟碱酰胺(isoniazid)造成肝毒性的报告；异烟碱酰胺(isoniazid)所造成具有临床症状的肝毒性约0.1-1％(参见：Kopanoff DE et al.，Isoniazid-related hepatitis：a U.S.Public Health Service cooperative surveillance study.，1978.Am.Rev Respir Dis 117：991-1001；Nolan CM et al.，Hepatotoxicity associated with isoniazidpreventive therapy：a 7-year survey from a public health tuberculosis clinic.1999.JAMA 281：1014.)，而在10-20％的病患中，则可观察到无症状的肝功能异常(Steele MA et al.，Toxichepatitis with isoniazid and rifampin：A meta-analysis.1991.Chest.99：465.)，这些肝功能异常通常于服药后两个月内发生。

如图1所示，异烟碱酰胺(isoniazid)在肝脏中主要经由氮-乙酰氨基转移酶(N-acetyltransferase，NAT)的帮助而乙酰化，产生的中间产物乙酰化异烟碱酰胺(acetylisoniazid)迅速被水解成乙酰化联胺(acetylhydrazine)；乙酰化联胺可以再经由氮-乙酰氨基转移酶(N-acetyltransferase)被乙酰化成无毒性的双乙酰化联胺(diacetylhydrazine)，或者经由细胞色素P450 2E1(CYP 450 2E1)氧化成具有肝毒性的分子，其中包括乙酰化偶氮(acetyldiazene)、乙酰铵离子(acetylonium ion)、乙酰自由基(acetylradical)、乙烯酮(ketene)等，另外在有氧及NADPH存在时，乙酰化联胺会被细胞色素P450 2E1反应生成自由基而造成氧化压力，导致细胞死亡；此外，异烟碱酰胺(isoniazid)亦可经由酰胺水解酶(amidase)直接水解成有毒性的联胺(hydrazine)，或者由上述乙酰化联胺(acetylhydrazine)经酰胺水解酶(amidase)水解成有毒性的联胺(hydrazine)。

近来有研究显示，联胺(而非异烟碱酰胺或乙酰化联胺)是在兔及鼠体内造成异烟碱酰胺引起的肝毒性(INH-induced hepatotoxicity)最可能的主因(Sarich TC，Youssefi M，Zhou T，Adams SP，Wall RA，Wright JM.Role of hydrazine in the mechanism of isoniazidhepatotoxicity in rabbits.1996.Arch Toxicol 70：835-840；Yue J，Peng RX，Yang J，Kong R，Liu J.CYP2E1 mediated isoniazid-induced hepatotoxicity in rats.2004.Acta Pharmacol Sin.25：699-704.)，研究者认为异烟碱酰胺引起的肝毒性的严重性与血浆中联胺的浓度成正相关；1999年Sarich等人(Sarich TC，Adams SP，Petricca G，Wright JM.Inhibition of isoniazid-induced hepatotoxicity in rabbits by pretreatment with an amidase inhibitor.1999.J PharmacolExp Ther.289：695-702.)的报导则认为对硝基苯酚磷酸二酯(bis-p-nitrophenyl phosphate，BNPP，为一种酰胺水解酶的抑制剂)可预防异烟碱酰胺引起的肝毒性的伤害，其保护机制应是透过抑制异烟碱酰胺产生联胺。

细胞色素P450 2E1(CYP2E1)在肝脏中会持续的表现，并负责许多异物质(如：肝毒素四氯化碳(CCl₄)以及乙酰氨酚(acetaminophen))的代谢生物反应(Lee SS，Buters JT，Pineau T，Fernandez-Salguero P，Gonzalez FJ.Role of CYP2E1 in the hepatotoxicity ofacetaminophen.1996.J Biol Chem 271：12063-12067；Wong FW，Chan WY，Lee SS.Resistance to carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice which lack CYP2E1expression.1998.Toxicol Appl Pharmacol.153：109-118.)；然而，CYP2E1在异烟碱酰胺引起的肝毒性中所扮演的角色并不明确，异烟碱酰胺本身即为CYP2E1的一种诱导物(Ramaiah SK，Apte U，Mehendale HM.Cytochrome P4502E1 induction increases thioacetamideliver injury in diet-restricted rats.2001.Drug Metab Dispos.29：1088-1095.)；有些研究认为肝脏内的CYP2E1与异烟碱酰胺引起的肝毒性的机制有关(Yue J，Peng RX，Yang J，Kong R，Liu J.CYP2E1 mediated isoniazid-induced hepatotoxicity in rats.2004.Acta Pharmacol Sin.25：699-704；Huang YS，Chern HD，Su WJ，Wu JC，Chang SC，Chiang CH，Chang FY，et al.Cytochrome P450 2E1 genotype and the susceptibility to antituberculosis drug-induced hepatitis.2003.Hepatology 37：924-930.)。在体外试验中，双硫仑(disulfiram，DSF)及其代谢物二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamate)均被确认为老鼠及人类肝脏微粒体CYP2E1的选择性抑制剂(selective mechanism-based inhibitors)(Guengerich FP，Kim DH，Iwasaki M.Role ofhuman cytochrome P-450 IIE1 in the oxidation of many low molecular weight cancer suspects.1991.Chem Res Toxicol.4：168-179；Hunter AL，Neal RA.Inhibition of hepatic mixed-functionoxidase activity in vitro and in vivo by various thiono-sulfur-containing compounds.1975.Biochem Pharmacol.24：2199-2205.)，Brady(Brady JF，Xiao F，Wang MH，Li Y，Ning SM，Gapac JM，Yang CS.Effects of disulfiram on hepatic P450IIE1，other microsomal enzymes，andhepatotoxicity in rats.1991.Toxicol Appl Pharmacol.108：366-373.)等人的试验则显示老鼠服用单一口服剂量的双硫仑(DSF)后，会造成免疫反应肝容量(immunoreactive hepatic content)以及CYP2E1催化活性快速且完全的下降。

Sodhi(Sodhi CP，Rana SV，Mehta SK，Vaiphei K，Attari S，Mehta S.Study of oxidative-stress in isoniazid-rifampicin induced hepatic injury in young rats.1997.Drug Chem Toxicol 20：255-269)等人则在1997年的报导指出，氧化压力是造成幼鼠体内异烟碱酰胺及立复霉素引起的肝毒性的因素之一。有许多的研究想要找出适当的生物标记(biomarker)以评估体内氧化伤害的速率，目前可能适用的生物标记可分为三类，分别为对脂质、蛋白质、核酸氧化伤害的标记；8-异构前列腺素F_2α(8-iso-prostaglandin F_2α，8-iso-PGF_2α)是一种自由基引起花生四烯酸(arachidonic acid)发生脂质过氧化作用的产物，其化学性质稳定，8-iso-PGF_2α含量可作为判断活体内脂质过氧化的新指标，该脂质过氧化反映可能与体内自由基的产生、氧化性的伤害(oxidative damage)及抗氧化剂的缺乏(antioxidant deficiency)有关(Morrow JD，Hill KE，Burk RF，Nammour TM，Badr KF，Roberts LJ，2nd.A series ofprostaglandin F2-like compounds are produced in vivo in humans by a non-cyclooxygenase，freeradical-catalyzed mechanism.1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9383-9387；Morrow JD.Theisoprostanes：their quantification as an index of oxidant stress status in vivo.2000.Drug MetabRev.32：377-385.)；目前有许多方法可用来测量8-iso-PGF_2α含量，包括酵素免疫分析法(enzyme immunoassay)(Devaraj S，Hirany SV，Burk RF，Jialal I.Divergence between LDLoxidative susceptibility and urinary F(2)-isoprostanes as measures of oxidative stress in type 2diabetes.2001.Clin.Chem.47：1974-1979.)、放射免疫分析法(radioimmunoassay)(Helmersson J，Basu S.F2-isoprostane excretion rate and diurnal variaion in human urine.1999.Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 61：203-205.)、气相层析质谱仪(gas-chromatography mass spectrometry)(Morrow JD，Roberts LJ，2nd.Mass spectrometricquantification of F2-isoprostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidant stress.1999.Methods Enzymol.300：3-12.)以及液相层析质谱仪(liquid chromatography massspectrometry)(Li H，Lawson JA，Reilly M，Adiyaman M，Hwang SW，Rokach J，FitzGerald GA.Quantitative high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometric analysis of thefour classes of F(2)-isoprostanes in human urine.1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：13381-13386.)等；此外，人类尿液中的8-iso-PGF_2α及其代谢物2，3-dinor-8-iso-PGF_2α含量可利用C18固相萃取(C18 solid phase extraction，SPE)准备样品后，再以液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析(Liang Y，Wei P，Duke RW，Reaven PD，Harman SM，Cutler RG，Heward CB.Quantification of 8-iso-prostaglandin-F_2αand 2，3-dinor-8-iso-prostaglandin-F_2αin human urineusing liquid chromatography-tandem mass spectrometry.2003.Free Radic.Biol.Med 34：409-418.)。

利用侵入式及非侵入式方法测试大鼠(rat)肝功能，以监测肝损害的发展以及筛选肝脏疾病，其中最常使用的方法包含测量血清中的天门冬氨酸转胺酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸转胺酶(alanine aminotransferase，ALT)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)数值，以及测量肝细胞产物如：胆红素(bilirubin)、白蛋白(albumin)，以及利用量测前凝血素时间(prothrombin time)来检测凝血因子(coagulation factors)等(Carlisle R，Galambos JT，Warren WD.The relationship between conventional liver tests，quantitative function tests，andhistopathology in cirrhosis.1979.Dig.Dis.Sci.24：358-362.)；肝功能定量测试是根据几乎只经过肝脏代谢的受质在血清中的浓度而定，这些受质的清除是依肝门静脉、肝动脉血流量以及由肝细胞对这些受质的作用而定，肝脏血流量与提供给肝脏的受质量有关，反之，该受质的清除则决定于肝脏代谢的能力(Herold C，Heinz R，Niedobitek G，Schneider T，Hahn EG，Schuppan D.Quantitative testing of liver function in relation to fibrosis in patientswith chronic hepatitis B and C.2001.Liver 21：260-265.)。

半乳糖(galactose)是一种具有高萃取率(extraction ratio)、90％在肝脏中代谢的醣类，在肝脏中，半乳糖是由半乳糖激酶(galactokinase)经过差向立体异构化反应(epimerization)，将之转换成1-磷酸葡萄糖(Glucose-1-phosphate)；半乳糖激酶的作用反应为肝细胞中半乳糖代谢途径的速率决定步骤(rate-limiting step)。半乳糖的高萃取率使得依赖肝脏血流量及肝脏功能的半乳糖代谢作用成为检测肝功能最主要的方式，目前并无一定的规则来评估大鼠的残余肝功能(residual liver function)，量测一确切化合物(如：半乳糖)的代谢能力，可推测肝脏中代谢作用的速率决定步骤，亦可能取得残余肝功能的代表数质(Keiding S，Johansen S，Tonnesen K.Kinetics of ethanol inhibition of galactose elimination in perfused pigliver.1977.Scand J.Clin.Lab Invest.37：487-494；Keiding S，Johansen S，Winkler K.Hepaticgalactose elimination kinetics in the intact pig.1982.Scand J.Clin.Lab Invest.42：253-259)。

以半乳糖清除能力(galactose elimination capacity，GEC)作为人类肝功能定量测试(Lindskov J.The quantitative liver function as measured by the galactose elimination capacity.I.Diagnostic value and relations to clinical，biochemical，and histological findings in patients withsteatosis and patients with cirrhosis.1982.Acta Med.Scand.212：295-302)已行有年，然而，半乳糖清除能力测试需取得多个血液样本以建立标准曲线，在临床应用上有其困难度，因此有许多研究使用半乳糖单点法(Galactose Single Point，GSP)以评估人类肝功能；本案发明人以半乳糖单点法测试慢性肝炎、肝硬化以及肝癌病患，结果显示半乳糖单点法可精确测出这些肝脏疾病(Tang HS，Hu OY.Assessment of liver function using a novelgalactose single point method.1992.Digestion 52：222-231)；半乳糖单点法已被成功的应用到测试肝病患者排除如丙嗪(promazine)及抗生素头孢酮(cefoperazone)等药物的剩余肝功能(Hu OY，Tang HS，Chang CL.The influence of chronic lobular hepatitis on pharmacokinetics ofcefoperazone--a novel galactose single-point method as a measure of residual liver function.1994.Biopharm Drug Dispos 15：563-576；Hu OY，Hu TM，Tang HS.Determination ofgalactose in human blood by high-performance liquid chromatography：comparison with anenzymatic method and application to the pharmacokinetic study of galactose in patients withliver dysfunction.1995.J.Pharm.Sci.84：231-235；Hu OY，Tang HS，Sheeng TY，Chen TC，Curry SH.Pharmacokinetics of promazine in patients with hepatic cirrhosis--correlation with anovel galactose single point method.1995.J.Pharm.Sci.84：111-114)。此外，半乳糖单点法已在美国食品药物管理局(FDA)所出版的指南(Guidance for Industry)中成为建议采用测试肝功能的方法之一(FDA Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Pharmacokineticsin patients with impaired hepatic function：Study design，data analysis，and impact on dosing andlabeling.Guidance for Industry，U.S.Department of Health and Human Service.2003 pp5)。

由此可见，上述习用抗结核药物异烟碱酰胺(isoniazid)仍有诸多缺失，实非良善之设计者，而亟待加以改良。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，将异烟碱酰胺(INH)合并使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的抑制剂，以降低由异烟碱酰胺(INH)所引起的肝毒性等副作用。

本发明的次一目的是在于提供一种含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，将异烟碱酰胺(INH)合并使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的选择性抑制剂双硫仑(DSF)，以及酰胺水解酶的抑制剂硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)，以降低由异烟碱酰胺(INH)所引起的肝毒性等副作用。

为达成上述发明目的的含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，本发明首先以异烟碱酰胺(INH)诱导大鼠(rat)产生肝毒性为模式，研究细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂双硫仑(DSF)，以及酰胺水解酶(amidase)抑制剂硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)对大鼠体内异烟碱酰胺(INH)引发的肝毒性的影响；除了使用一般肝毒性标记、半乳糖单点法(GSP)以及半乳糖清除能力(GEC)进行大鼠的残余肝功能的定量量测外，本案发明人更利用改良式液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析量测大鼠血浆中8-iso-PGF2α浓度，以进一步判断8-iso-PGF2α是否与大鼠体内INH引发的肝毒性有关。

可达成上述发明目的的含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，是包括药学有效量的异烟碱酰胺(isoniazid，INH)，合并使用药学有效量的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂。

其中该细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂是选自于下列化合物所组成群组：正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)、反式肉桂醛(Trans-Cinnamaldehyde)、大豆甘元(Daidzein)、异牡荆素(Isovitexin)、山奈酚(Kaempferol)、双硫仑(disulfiram)、β-香叶烯(β-Myrcene)、懈皮素(Quercetin)、(-)-Epigallocatechin-3-gallate、(+)-柠檬烯((+)-Limonene)、杨梅素(Myricetin)、懈皮(Quercitrin)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-Glucoside)、桑叶素(Morin)、新橙皮苷(Neohesperidin)、橙皮苷(Hesperidin)、茵陈色原酮(Capillarisin)、((-)-Epigallocatechin)、木犀草素(Luteolin)、金丝桃苷(Hyperoside)、十四烷酸乙酯(EthylMyristae)、柽柳素(Tamarixetin)、根皮素(Phloretin)、黄芩素(Baicalein)、芸香素(Rutin)、黄芩(Baicalin)、芹菜素(Apigenin)、柚皮素(Naringenin)、橙皮素(Hesperetin)、(+)-Epicatechin、(-)-Epicatechin-3-gallate、异甘草素(Isoliquritigenin)、水飞蓟宾(Silybin)、牡荆素(Vitexin)、金雀异黄酮(Genistein)、异鼠李素(Isorhamnetin)、没食子酸(gallic acid)、香叶木素(Diosmin)、6-姜辣醇(6-Gingerol)、二氢化槲皮素((+)-Taxifolin)、汉黄芩素(Wongonin)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、儿茶素((+)-Catechin)、β-奈黄酮(β-naphthoflavone)、恩贝素(Embelin)、反式桂皮酸(Trans-Cinnamic acid)、表儿茶酚((-)-Epicatechin)、根皮苷(Phloridzin)、葛根素(Puerarin)、伞形花内酯(Umbelliferone)、Brij58、Brij 76、Brij 35、Tween 20、Tween 80、Tween 40、PEG 2000、PEG 400、PluornicF68、PEG 4000。

可达成上述发明目的的含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，是包括药学有效量的异烟碱酰胺(isoniazid，INH)，合并使用药学有效量的双硫仑(disulfiram，DSF)，以及药学有效量的硝基苯酚磷酸二酯(bis-p-nitrophenyl phosphate，BNPP)。

本发明所提供的含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，亦可加入药学上可接受的赋形剂至该复方，该赋形剂可为稀释剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等。

附图说明

请参阅以下有关本发明较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效。有关该实施例的附图为：

图1为异烟碱酰胺(INH)在肝脏中的代谢途径图；

图2为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠，天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD，^*表示各试验组与对照组比较后P＜0.05者；

图3为对照组(图3A及C)与INH组(图3B及D)大鼠肝脏切片：图3A，对照组相对正常肝组织的型态(HE染色，400X)；图3B，INH组在周围中央静脉(V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化(H E染色，400X)；图3C，以电子显微镜检视对照组大鼠肝切片，Nu：细胞核(9,000X)；图3D，以电子显微镜检视INH组大鼠肝切片，相较于图3C对照组的肝细胞切片，INH组大鼠肝细胞的粗内质网(rER)明显增加，Nu：细胞核(9,000X)；

图4为8-iso-PGF_2α-d₄(A)与8-iso-PGF_2α(B)的分子结构以及子离子光谱；

图5为含有250pg 8-iso-PGF_2α-d₄(A)的内标准品溶液、含有100pg 8-iso-PGF_2α(B)的标准品溶液与空白样本(C)，在多重反应监测模式(MRM)侦测下的液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)色谱，质荷比(m/z)357/197以及质荷比(m/z)353/193的离子偶(ion pairs)分别被用来监测8-iso-PGF_2α-d₄(A)(作为内标准品)以及8-iso-PGF_2α(B)(作为标准品)；波峰1：空白血浆；波峰2：注入标准品的空白血浆；

图6为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度，数值的计算为mean±SD，^*表示试验组与对照组比较后P＜0.001者，^#表示各试验组与INH组比较后P＜0.05者；

图7为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD，^*表示试验组与对照组比较后P＜0.001者，^#表示各试验组与INH组比较后P＜0.001者，^※表示各试验组与INH组比较后P＜0.005者；

图8为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖清除能力(GEC)值，数值的计算为mean±SD，^*表示试验组与对照组比较后P＜0.001者，^#表示各试验组与INH组比较后P＜0.005者，^※表示各试验组与INH组比较后P＜0.05者；

图9为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单点法(GSP)值与血浆中8-iso-PGF_2α的浓度具有高度相关的统计图；以及

图10为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单点法(GSP)值与半乳糖清除能力(GEC)值具有高度相关的统计图。

具体实施方式

本发明将就下列实施例作进一步说明，然该等实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为实施本发明的限制。

实施例一异烟碱酰胺(INH)合并使用CYP2E1抑制剂双硫仑(DSF)及/或硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)的动物试验

一、材料与方法

1.试验材料

所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield，OH，USA)，INH，BNPP，DSF以及玉米油则购自Sigma化学公司(St.Louis，MO USA)，8-iso-PGF_2α以及放射线标定的8-iso-PGF_2α-d₄则得自Cayman化学公司(Ann Arbor，MI，USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。

2.试验动物

体重为320-350公克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心(台湾)，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的大鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间大鼠体重均持续监测，所有的大鼠均以使用50毫克/公斤体重剂量的戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)进行腹腔麻醉(intraperitoneally anesthetized)，将聚乙烯导管置于大鼠右颈内静脉(internal jugular vein)内以施打半乳糖，导管是以切入穿刺(cut-down technique)插入，该导管的末端是置于大鼠颈后切口的皮肤下方，手术完成后，恢复期间使大鼠禁食一夜(约16小时)，但水分照常供给。

3.试验处理

试验动物随机分成5组，每组包括3种处理，第一种处理为注射25mg/kg BNPP或BNPP的基剂(vehicle，VEH1，即食盐水)，BNPP是溶于加热至60℃的食盐水(0.9％NaCl)，冷却后以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第二种处理为则注射100mg/kg DSF或DSF的基剂(VEH2，即玉米油)，DSF是溶于玉米油中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第三种处理为注射150mg/kg INH或INH的基剂(VEH3，即食盐水)，INH是溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第一组(BNPP或VEH1)较第三组(INH或VEH3)早30分钟处理，第二组(DSF或VEH2)比第三组(INH或VEH3)早15分钟处理。

上述5组试验共包含：

(1)对照组(normal control group，NC，n＝12)：正常的大鼠每天注射1次VEH1、VEH2以及VEH3(施行腹腔内注射)共21天；

(2)INH组(INH，n＝7)：正常的大鼠每天注射1次INH、VEH1以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；

(3)BNPP-INH组(BNPP-INH，n＝7)：正常的大鼠每天注射1次BNPP、INH以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；

(4)DSF-INH组(DSF-INH，n＝7)：正常的大鼠每天注射1次DSF、INH以及VEH1(施行腹腔内注射)共21天；以及

(5)BNPP-DSF-INH组(BNPP-DSF-INH，n＝7)：正常的大鼠每天注射1次BNPP、DSF以及INH(施行腹腔内注射)共21天；

半乳糖单点法于第21天处理后16小时进行测试。

4.血液样本

处理完毕后，大鼠以乙醚麻醉牺牲，血液由大鼠背部主动脉抽取，置于含有EDTA的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心15分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorf tube)中并置于-80℃中储存。

5.生化分析

肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测(Beckman Instruments，美国)。

6.光学显微镜与电子显微镜

大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析；肝脏样本以10％磷酸缓冲液配制的福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石蜡(paraffin)中，以5μm厚度切片，切片样本以苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)染色，并进行肝糖染色试验(Periodicacid Schiff stain，PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液(cacodylate buffer，0.1M pH 7.4)清洗，以20％四氧化锇水溶液(aqueous osmiumtetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂(Spurr resin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰(uranyl acetate)及柠檬酸铅(lead citrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscope，Hitachi 600，Hitachi Co.，日本)观察。

7.8-iso-PGF2α的萃取与量测

所有PGF_2α的同分异构物(isomers)均以适当体积的酒精溶解或稀释以制备原液，并分装于小管中储存于-70℃，取0.5ml血浆至玻璃管中，加入10ng内标准品(internal standard，即8-iso-PGF_2α-d₄)，混匀后的血浆以C18固相萃取管柱(Solid-Phase Extraction cartridge，J.T.Baker，MA，美国)纯化，样本流洗液以氮气蒸发干燥后，以50μl乙睛∶水(acetonitrile：water，15∶85v/v)溶液回溶并震荡30秒，取10μl回溶后的萃取物注射至LC/MS/MS系统进行分析。

8.液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析

HPLC系统包括2个岛津LC-10ADvP泵(Shimadzu LC-10ADvP pumps)、1个岛津系统控制器(Shimadzu system control)以及1个岛津自动样本机(Shimadzu autosampler)(岛津科学仪器，日本)，以C18管柱(颗粒大小5-μm，内径50×2.1mm)进行HPLC分离，并使用含有2mM醋酸铵(ammonium acetate)及乙睛(acetonitrile，ACN)的梯度流洗液(t＝0min，15％ACN；t＝6min，70％ACN；t＝7min，90％ACN；t＝8min，90％ACN；t＝8.5min，15％ACN)流洗，LC/MS/MS的流速均维持在200μl/min，整个HPLC进行时间为13.5分钟；该HPLC系统与一三层四极质谱仪(triple stage quadrupole mass spectrometer，API3000，Applied Biosystem，Foster City，CA，美国)介接，配备有一TurboIonSpray离子源(TurboIonSpray ionizationsource)，并使用负电电喷雾(negative electrospray)作为电离(ionization)的方法；该质谱仪通过扩散200ng/ml 8-iso-PGF2α或8-iso-PGF2α-d4标准液以多重反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)模式进行最佳化，m/z 353/193以及m/z 357/197离子偶(ion pair)则个别用来监测8-iso-PGF2α以及8-iso-PGF2α-d4；测量后，计算6个8-iso-PGF2α浓度(C)的线性标准曲线(linear calibration curve)对8-iso-PGF2α比8-iso-PGF2α-d4比值的区域(Y)，得到相关系数(r，correlation coefficient)值为0.999；血浆中8-iso-PGF2α的线性范围在0.1-2.5ng/ml之间，其回归方程式(regression equation)为Y＝-0.0517C+0.823ng/ml；所测得的结果均对照重氢化8-iso-PGF2α(deuterated 8-iso-PGF2α)内标准品计算，标准曲线的批间精密度以及准确度是以标准浓度样品分别测试6次后，经由反向计算法(Back-Calculation)来评估，其相对误差(relative errors)范围在-5.06％至3.13％之间。

9.肝功能的定量测试

所有的大鼠均进行半乳糖单点法(GSP)及半乳糖清除能力(GEC)测试，大鼠接受在30秒内的快速静脉注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后5、10、15、30、45以及60分钟各采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetricgalactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient ofvariation，CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖清除能力(GEC)是由下列公式计算，该公式是由Tygstrup’s方程式(Tygstrup N.The Galactose Elimination Capacityin Control Subjects and in Patients with Cirrhosis of the Liver.1964.Acta Med.Scand 175：281-289)修改而来：

$\mathrm{GEC}=\frac{D}{T_{C=0}+7}(\mathrm{mg}/\mathrm{kg}\·\min )$

其中D为半乳糖的注射量；T_C＝0为半乳糖浓度达到0所需要的时间，是由注射(通常为2.22mmol/l)后20至60分钟的血液浓度-时间曲线的线性回归推得；7为依经验法则修正体内不均匀分布的校正值；半乳糖单点法(GSP)则为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。

10.统计分析

所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Scienceprogram(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P＜0.05。

二、结果

1.生化分析结果

试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异；生化分析结果如图2所示，只有INH组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高于对照组(对照组血浆中的AST活性为116±11IU/L；INH组血浆中的AST活性为129±10IU/L，p＜0.05；对照组血浆中的ALT活性为44±6IU/L；INH组血浆中的ALT活性为52±3IU/L，p＜0.05)，显示INH组产生生化上的肝损伤；对照组、BNPP-INH、DSF-INH以及BNPP-DSF-INH组血清中转胺酶浓度则为正常。

2.组织病理学

经过为期三周施行腹腔注射150mg/kg/day INH的大鼠，其体内成功的产生肝毒性；相对的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图3A所示，对照组大鼠肝实质(liverparenchyma)内的肝细胞是排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦(hepatic sinusoids)则在两肝板(anastomosing plates)之间被发现；INH组大鼠的组织切片则如图3B所示，INH组大鼠中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化，然而并无看到肝细胞坏死(necrosis)的征兆；以电子显微镜观察的结果显示，相较于对照组(如图3C所示)，INH组大鼠肝细胞内的粗内质网(rER)明显增加(如图3D所示)。根据文献报导，INH是一个强效的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的诱导物(Ryan DE，Ramanathan L，Iida S，Thomas PE，Haniu M，Shively JE，Lieber CS，et al.Characterization of a major form of rat hepaticmicrosomal cytochrome P-450induced by isoniazid.1985.J.Biol.Chem.260：6385-6393)，而CYP2E1会导致超氧基(superoxide)以及氢氧自由基(hydroxyl radicals)的产生(Ekstrom G，Ingelman-Sundberg M.Rat liver microsomal NADPH-supported oxidase activity and lipidperoxidation dependent on ethanol-inducible cytochrome P-450(P-450IIE1).1989.Biochem.Pharmacol.38：1313-1319.)，并且会引发内质网的增加(Sodhi CP，Rana SV，Mehta SK，Vaiphei K，Attri S，Thakur S，Mehta S.Study of oxidative stress in isoniazid-induced hepaticinjury in young rats with and without protein-energy malnutrition.1996.J Biochem Toxicol.11：139-146.)，因此本试验的结果与先前研究相符。而其它试验组：BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的肝损害程度与对照组相较，并无明显区别(未显示结果)。

3.血液样本中8-iso-PGF2α的量测

在负电电喷雾模式下，8-iso-PGF_2α最大量的分子离子为质荷比(m/z)353的离子，8-iso-PGF_2α-d₄最大量的分子离子为质荷比(m/z)357的离子，这些负电荷分子离子是经过大量碰撞诱导而产生游离，这两个目标化合物的分子结构以及产生的离子光谱如图4所示；除了8-iso-PGF_2α-d₄的子离子(daughter ions)恒较8-iso-PGF_2α的子离子高四个单位之外，8-iso-PGF_2α以及8-iso-PGF_2α-d₄两者的碎裂模式(fragmentation patterns)很相似，这显示大多数稳定的子离子是由A链产生而来，该A链上标示有4个氘原子(deuterium atoms)；8-iso-PGF_2α最密集的子离子为质荷比(m/z)193的离子，8-iso-PGF_2α-d₄最密集的子离子为质荷比(m/z)197的离子。图5所示为在多重反应监测模式(MRM)侦测下，含有100pg 8-iso-PGF_2α与250pg/ml 8-iso-PGF_2α-d₄的标准溶液，以及一血液样本的典型LC/MS/MS色谱，在注入1ng 8-iso-PGF_2α-d₄作为内标准品后，该标准溶液与该血液样本均经过相同的固相萃取(SPE)纯化，并以前述LC/MS/MS规程分析。

4.血浆中8-iso-PGF2α的浓度

血浆中的8-iso-PGF_2α是一种氧化压力(oxidative stress)的指标，如图6所示，相较于对照组，INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度明显增加(INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为151±26pg/ml；对照组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为110±15pg/ml，p＜0.001)；与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组三组则明显降低由INH引起肝脏的8-iso-PGF_2α产生(BNPP-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为128±29pg/ml；DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为126±20pg/ml；BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为123±17pg/ml；INH组大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度为151±26pg/ml，p＜0.005)；值得注意的是，对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间，大鼠血浆中8-iso-PGF_2α的浓度无显着差异，与BNPP-INH组及DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF并不会进一步减少血浆中8-iso-PGF_2α的浓度。

5.剩余肝功能的量测

如图7所示，对照组与INH组大鼠的半乳糖单点法(GSP)值具有高度的显着差异(对照组大鼠的GSP值为384±69μg/ml；INH组大鼠的GSP值为565±87μg/ml，p＜0.001)，此外，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GSP值各为401±70μg/ml、449±45μg/ml、388±53μg/ml，与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GSP值各与INH组大鼠具有高度的显着差异(其p值各为p＜0.001，p＜0.005，and p＜0.001)；单独施用INH的大鼠的GSP值明显增加；然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可抵抗这种改变；另一方面，与DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF显示可以降低INH引起的肝毒性，虽然两者之间的差异未达到统计上的差异(p＝0.1)，而对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GSP值无显着差异存在。

相似的结果在使用半乳糖清除能力(GEC)方法上也可观察的到，如图8所示，与对照组相较，INH组大鼠的GEC值明显减少(INH组大鼠的GEC值为3.4±0.6mg/min.kg；对照组大鼠的GEC值为4.9±0.8mg/min.kg，p＜0.001)，此外，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各为4.5±0.6mg/min.kg、4.3±0.4mg/min.kg、4.7±0.5mg/min.kg；与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各与INH组大鼠具有高度的显着差异(其p值各为p＜0.005，p＜0.05，and p＜0.005)；单独施用INH的大鼠的GEC值明显减少；然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可恢复这种改变；与DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF者有增加GEC值的倾向(DSF-INH组与BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各为4.3±0.4mg/min.kg、4.7±0.5mg/min.kg，p＝0.29)；此外，对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GEC值无显着差异存在。

为了确定AST、ALT、血浆中8-iso-PGF_2α的浓度，以及定量肝功能测试(如：GSP以及GEC)是否相关，以数种相关分析计算后，发现GSP值与血浆中8-iso-PGF_2α的浓度具有高度相关(如图9所示)，相关系数为0.836；GSP值与GEC值具有高度相关(如图10所示)(p＜0.001)，相关系数为-0.822；GEC值也与血浆中8-iso-PGF_2α的浓度具有高度相关(相关系数为-0.743，p＜0.001，如表一所示)；而GSP值、GEC值以及血浆中8-iso-PGF_2α的浓度则与AST及ALT均无明显相关(如表一所示)。

表一GSP、GEC以及8-iso-PGF_2α与生化测试的相关性

以皮尔森氏相关系数(Pearson’s correlation coefficient)作为统计计算，

^*p＜0.00

实施例二细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-cDNA合成微粒体细胞色素P4502E1

一、材料与方法

1.试验材料

本实施例是使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1 HighThroughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美国)针对22种中药药引及10种赋型剂进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选，该筛选套组中之微粒体细胞色素P4502E1(CYP2E1)系以cDNA合成之(BD Bioscience，美国)；该CYP2E1抑制剂的筛选套组的作用原理为：在含有细胞色素P450 2E1(CYP2E1)以及其荧旋光性受质MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin)的环境下加入测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)的生成量，并以对照组(control)的HFC生成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。

各测试样品均溶于乙腈(acentoitrile)，测试不同浓度的中药药引(66μM，33μM，16.5μM)及赋形剂(0.167％，0.08％，0.042％，w/v)对CYP2E1的抑制率，所测试的中药药引及结果如表三所列，所测试的赋型剂及结果如表四所列。

另外，本实施例使用的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1 HighThroughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美国)所需的药剂如下：

(1)CYP2E1+P450Reductase+Cytochrome b5：100mM potassium phosphate(pH 7.4)含有1.3nmol P450以及p-Nitrophenol水解酶。

(2)Control Protein：15mg/mL Control Protein溶于100mM Potassium Phosphate(pH 7.4)中。

(3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)。

(4)Stop Solution：0.5M Tris Base。

(5)Cofactors：含有1.3mM NADP⁺、66mM MgCl₂以及66mM Glucose 6-Phosphate。

(6)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase：40units/ml溶于5mM Sodium CitrateBuffer(pH 7.5)。

(7)MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin)：荧旋光性受质(fluorescencesubstrate)，50mM MFC溶于乙腈(acetonitrile)。

(8)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid)：CYP2E1选择性抑制剂(阳性对照组)，20mM DDTC溶于乙腈(acentoitrile)。

(9)HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)：CYP2E 1代谢物标准品(metabolite standard)，0.25mM HFC溶于0.1M Tris(pH 9.0)。

(10)NADPH-Cofactor Mix：于14.56ml无菌水中加入187.5μl Cofactors、150μlG6PDH(Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及100μl Control Protein。

(11)Cofactor/acetonitrile mix：于9.93ml NADPH-Cofactor Mix中加入66μlAcetonitrile。

(12)Enzyme/Substrate Mix：于4ml Buffer Soultion中加入5.94ml无菌水、50μlHTS-706(CYP2E1，2μM P450content)以及28μl 50mM MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethylcoumarin，荧旋光性受质)。

2.细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选

使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1 High ThroughputInhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美国)进行中药药引及赋型剂的筛选，实验步骤如下所述：

(1)制备对照组：

a.于96孔盘上第1孔井(well)内加入149μl NADPH-Cofactor Mix以及1μl20mM DDTC并混合均匀；

b.于该96孔盘上第2至12孔井内各加入100μl Cofactor/acetonitrilemix，第1至8孔井为阳性对照组(positive control)；第9与第10孔井为对照组(control)；第11与第12孔井为空白对照组(blank)；

c.于该第1至8孔井内做连续稀释动作：自第1孔井内取50μl液体加入第2孔井内混匀，再自第2孔井内取50μl液体加入第3孔井内混匀，以此类推，至第8孔井时去除多余的50μl液体，以得到连续稀释浓度66.6、22.2、7.4、2.47、0.82、0.27、0.091、0.03μM。

(2)制备试验组：

a.于96孔盘上第1行的第1及第2孔井内各加入149μl NADPH-CofactorMix，以及1μl 20mM中药药引测试样品或1μl 25％(w/v)赋形剂测试样品，并混合均匀；

b.再自该第1行的第1及第2孔井内各取50μl液体加入第3孔井内混匀(即每一测试样品均为三重复)；

(3)反应起始与终止：

a.将上述对照组与试验组置于37℃静置10分钟；

b.除了该空白对照组之外，其它孔井内均加入100μl Enzyme/SubstrateMix混匀；

c.将所有对照组与试验组置于37℃静置40分钟；

d.所有的孔井内均加入75μl Stop Solution混匀；

e.紧接着于该空白对照组内加入100μl Enzyme/Substrate Mix混匀；

f.将所有对照组与试验组以萤冷光仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoElectron Corporation，芬兰)读取结果，所使用的激发光(excitation)波长为405nm，发散光(emission)波长为538nm。

(4)结果分析：测得的荧光讯号数值换算成为CYP2E1代谢物标准品HFC生成量(pmol)后，以对照组(control)为基准，即对照组的CYP 2E1抑制率为0％，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：

二、结果

1.阳性对照组

阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表二所示，由表二可知当DDTC的浓度为66.6μM(即为0.167％，w/v)时，CYP 2E1抑制率可达97.55％，是以66.6μM作为中药药引最高测试浓度，以0.167％(w/v)作为赋型剂最高测试浓度。

表二阳性对照组的CYP 2E1抑制率

2.试验组CYP 2E1抑制率

中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表三所示，由结果可知各中药药引于不同浓度(66μM，33μM，16.5μM)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μM正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳(97.99±0.66％)。

表三中药药引的CYP 2E1抑制率

赋型剂所测出的CYP 2E1抑制率如表四所示，由结果可知各赋型剂于不同浓度(0.167％，0.08％，0.042％，w/v)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167％Brij 58的抑制效果最佳(97.75±0.66％)。

表四赋型剂的CYP 2E1抑制率

实施例三细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-人肝微粒体细胞色素P450 2E1

一、材料与方法

1.试验材料

本实施例是使用人类肝脏所制备微粒体，针对细胞色素P450 2E1(CYP2E1)与39种中药药引及10种赋型剂进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选；该CYP2E1抑制剂的筛选作用原理为：系利用人类肝脏所制备微粒体中细胞色素P450 2E1(CYP2E1)与其受质Chlorzoxazone反应，加入测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品6-OH-CZX(6-Hydroxy-Chlorzoxazone)的生成量，并以对照组(control)的6-OH-CZX生成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。

各测试样品均溶于10％甲醇(methanol)或是二次水中，测试不同浓度的中药药引(66μM，33μM，16.5μM)及赋形剂(0.167％，0.08％，0.042％，w/v)对CYP2E1的抑制率，所测试的中药药引及结果如表三所列，所测试的赋型剂及结果如表四所列。

本实施例所利用人类肝脏细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂筛选所需的药剂如下：

(1)CYP2E1：100mM potassium phosphate(pH 7.4)含有10mg/ml P450 proteinconcentration。

(2)Control Protein：10mg/mL P450 Protein溶于100mM Potassium Phosphate(pH7.4)中。

(3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)。

Stop Solution：ice-acetonitrile。

(4)Cofactors：含有100mM NADP+以及10mM Glucose 6-Phosphate。

(5)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase：2000units/ml溶于无菌水。

(6)Chlorzoxazone：受质(substrate)，16mM Chlorzoxazone溶于10％甲醇(Methanol)。

(7)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid)：CYP2E1选择性抑制剂(阳性对照组)，20mM DDTC容于10％甲醇(Methanol)。

(8)NADPH-regenerating System：于3.42ml中加入530μl Cofactors、40μl G6PDH(Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及100μl Control Protein。

2.细胞色素P4502E1(CYP2E1)抑制剂的筛选

使用人类肝脏微粒体细胞色素P450 2E1(CYP2E1)进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂筛选的实验步骤如下所述：

(1)在4℃冰浴环境下，0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)包含0.5mg/ml人肝微粒体、5mM MgCl₂静置15分钟；

(2)此时实验组加入细胞色素P4502E1反应基质药物16mM Chlorzoxazone以及浓缩中药药引萃取液；对照组以甲醇∶无菌水＝1∶1取代中药药引；阳性对照组则以DDTC取代；

(3)最后加入辅酶1mM NADP⁺、10mM G6P与2IU G6PD。将反应液转移至37℃水浴预温(pre-incubation)1分钟，活性测试实验的反应时间为30分钟；

(4)反应完后以500L acetonitrile终止反应，样品静置1分钟后加入内部标准品(5g/mL 4-hydroxy-tobutamide)，离心后取上层液20L以甲醇∶无菌水作稀释十倍动作，取5L之回溶液注入LC/MS/MS系统进行分析。

(5)结果分析：将LC/MS/MS测得的讯号数值换算成为CYP2E1代谢物标准品6-Hydroxy-Chlorzoxazone生成量(pmol)后，以对照组(control)为基准，即对照组的CYP 2E1抑制率为0％，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：

二、结果

1.阳性对照组

阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表二所示，由表二可知当DDTC的浓度为100μM时，CYP 2E1抑制率可达87.56％。

表二阳性对照组的CYP 2E1抑制率

2.试验组CYP 2E1抑制率

中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表三所示，由结果可知各中药药引于不同浓度(66μM，33μM，16.5μM)的条件下，对细胞色素P4502E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μM正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳(96.98±0.19％)。

表三中药药引的CYP 2E1抑制率

赋型剂所测出的CYP 2E1抑制率如表四所示，由结果可知各赋型剂于不同浓度(0.167％，0.08％，0.042％，w/v)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167％Brij 58的抑制效果最佳(91.24±1.33％)。

表四赋型剂的CYP 2E1抑制率

本发明所提供的含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方，与单独使用异烟碱酰胺(INH)的试验结果相互比较时，在生化分析(ALT、AST值)、病理学分析、剩余肝功能的量测(GSP值、GEC值)以及氧化压力的指标(血浆中8-iso-PGF_2α的浓度)等各方面的分析结果，都有明显减少使用异烟碱酰胺(INH)所造成的肝毒性副作用的功效。

上列详细说明是针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，例如：异烟碱酰胺(INH)、细胞色素P450 2E1抑制剂、双硫仑(DSF)、硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)施用的浓度及比例，以及细胞色素P450 2E1抑制剂选用的种类等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (2)

1.一种含异烟碱酰胺低副作用的新复方，包括药学有效量的异烟碱酰胺，还包含药学有效量的细胞色素P450 2E1抑制剂，其中所述细胞色素P450 2E1抑制剂是选自于下列化合物所组成群组：正二羟愈疮酸、反式肉桂醛、大豆甘元、异牡荆素、山奈酚、β- 香叶烯、檞皮素、(-)-Epigallocatechin-3-gallate、(+)- 柠檬烯、杨梅素、檞皮、木犀草素-7-葡萄糖苷、桑叶素、新橙皮苷、橙皮苷、茵陈色原酮、(-)-Epigallocatechin、木犀草素、金丝桃苷、十四烷酸乙酯、柽柳素、根皮素、芸香素、芹菜素、柚皮素、橙皮素、(+)-Epicatechin、(-)-Epicatechin-3-gallate、异甘草素、牡荆素、金雀异黄酮、异鼠李素、没食子酸、香叶木素、6-姜辣醇、二氢化槲皮素、汉黄芩素、原儿茶酸、儿茶素、β-奈黄酮、恩贝素、反式桂皮酸、表儿茶酚、根皮苷、葛根素、伞形花内酯、Brij 58、Brij 76、Brij 35、Tween 20、Tween 80、Tween 40、PEG 2000、PEG 400、Pluornic F68、PEG 4000。

2.根据权利要求1所述含异烟碱酰胺低副作用的新复方，其特征是，所述新复方中还加入药学上可接受的赋形剂。

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