CN105832738A - 无/低副作用的抗结核病药物复方 - Google Patents

无/低副作用的抗结核病药物复方 Download PDF

Info

Publication number
CN105832738A
CN105832738A CN201610140172.8A CN201610140172A CN105832738A CN 105832738 A CN105832738 A CN 105832738A CN 201610140172 A CN201610140172 A CN 201610140172A CN 105832738 A CN105832738 A CN 105832738A
Authority
CN
China
Prior art keywords
content
grams
milligrams
inh
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610140172.8A
Other languages
English (en)
Inventor
胡幼圃
杨东和
熊正辉
张温良
石东原
何欣恬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NATIONAL DEFENSE EDUCATION AND RESEARCH FOUNDATION
Original Assignee
NATIONAL DEFENSE EDUCATION AND RESEARCH FOUNDATION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NATIONAL DEFENSE EDUCATION AND RESEARCH FOUNDATION filed Critical NATIONAL DEFENSE EDUCATION AND RESEARCH FOUNDATION
Priority to CN201610140172.8A priority Critical patent/CN105832738A/zh
Priority claimed from CN2011800683192A external-priority patent/CN103391781A/zh
Publication of CN105832738A publication Critical patent/CN105832738A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/11—Aldehydes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/133—Amines having hydroxy groups, e.g. sphingosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin

Abstract

本发明提供了一种无/低副作用的抗结核病的药物组合物，其中包含药学有效量的选自异烟碱酰胺、立复霉素、丙基硫异烟酰胺和乙酰胺醇中的一种或多种，以及药学有效量的可降低抗结核病药物副作用的物质。

Description

无/低副作用的抗结核病药物复方
技术领域
本发明涉及一种无/低副作用的抗结核病药物复方。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)估计，全球大约有三分之一的人口感染肺结核，每年约有八百万新增病例；而台湾新登记的肺结核病患人数最近几年也不停爬升，每十万人口有六十多人感染肺结核，但其中只有大约四分之三的人接受完整治疗；根据卫生署的统计，台湾每天至少有4.2个人死于肺结核；在这么多接受肺结核药物治疗的病患中，临床上最常见的药物副作用即为肝毒性和神经系统病变(如：听神经和视神经病变)，其中又以肝毒性最为常见。再加上台湾又是B型及C型肝炎的盛行区，感染肺结核的肝炎患者也不在少数，假设每年有14,000名新增的肺结核病患，粗略估计至少有2,000名到3,000名慢性肝病患者需接受抗结核药物治疗，因此在这些病患身上所可能发生的肝毒性是吾人不可忽视的医源性疾病。
多数的第一线抗结核药物，例如：异烟碱酰胺(isoniazid，俗称敌痨克星)、丙基硫异烟酰胺(pyrazinamide，俗称敌痨新迈)及立复霉素(rifampin)等都有导致肝毒性发生的潜在不良反应；其中异烟碱酰胺(isoniazid)是目前最有效的单一抗结核药物，也最容易引起服用者产生肝毒性；在60年代末期陆续有异烟碱酰胺(isoniazid)造成肝毒性的报告；异烟碱酰胺(isoniazid)所造成具有临床症状的肝毒性约0.1-1％，而在10-20％的病患中，则可观察到无症状的肝功能异常，这些肝功能异常通常于服药后两个月内发生。
如图1所示，异烟碱酰胺(isoniazid)在肝脏中主要经由氮-乙酰氨基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)的帮助而乙酰化，产生的中间产物乙酰化异烟碱酰胺(acetylisoniazid)迅速被水解成乙酰化联胺(acetylhydrazine)；乙酰化联胺可以再经由氮-乙酰氨基转移酶(N-acetyltransferase)被乙酰化成无毒性的双乙酰化联胺(diacetylhydrazine)，或者经由细胞色素P450 2E1(CYP 450 2E1)氧化成具有肝毒性的分子，其中包括乙酰化偶氮(acetyldiazene)、乙酰铵离子(acetylonium ion)、乙酰自由基(acetylradical)、乙烯酮(ketene)等，另外在有氧及NADPH存在时，乙酰化联胺会被细胞色素P450 2E1反应生成自由基而造成氧化压力，导致细胞死亡；此外，异烟碱酰胺(isoniazid)亦可经由酰胺水解酶(amidase)直接水解成有毒性的联胺(hydrazine)，或者由上述乙酰化联胺(acetylhydrazine)经酰胺水解酶(amidase)水解成有毒性的联胺(hydrazine)。
近来有研究显示，联胺(而非异烟碱酰胺或乙酰化联胺)是在兔及鼠体内造成异烟碱酰胺引起的肝毒性(INH-induced hepatotoxicity)最可能的主因，研究者认为异烟碱酰胺引起的肝毒性的严重性与血浆中联胺的浓度成正相关；1999年Sarich等人的报导则认为对硝基苯酚磷酸二酯(bis-p-nitrophenyl phosphate,BNPP，为一种酰胺水解酶的抑制剂)可预防异烟碱酰胺引起的肝毒性的伤害，其保护机制应是通过抑制异烟碱酰胺产生联胺。
细胞色素P450 2E1(CYP2E1)在肝脏中会持续的表现，并负责许多异物质(如：肝毒素四氯化碳(CCl4)以及乙酰氨酚(acetaminophen))的代谢生物反应；然而，CYP2E1在异烟碱酰胺引起的肝毒性中所扮演的角色并不明确，异烟碱酰胺本身即为CYP2E1的一种诱导物；有些研究认为肝脏内的CYP2E1与异烟碱酰胺引起的肝毒性的机制有关。在体外试验中，双硫仑(disulfiram,DSF)及其代谢物二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamate)均被确认为老鼠及人类肝脏微粒体CYP2E1的选择性抑制剂(selective mechanism-basedinhibitors)，Brady等人的试验则显示老鼠服用单一口服剂量的双硫仑(DSF)后，会造成免疫反应肝容量(immunoreactive hepatic content)以及CYP2E1催化活性快速且完全的下降。
Sodhi等人则在1997年的报导指出，氧化压力是造成幼鼠体内异烟碱酰胺及立复霉素引起的肝毒性的因素之一。有许多的研究想要找出适当的生物标记(biomarker)以评估体内氧化伤害的速率，目前可能适用的生物标记可分为三类，分别为对脂质、蛋白质、核酸氧化伤害的标记；8-异构前列腺素F2α(8-iso-prostaglandin F2α,8-iso-PGF2α)是一种自由基引起花生四烯酸(arachidonic acid)发生脂质过氧化作用的产物，其化学性质稳定，8-iso-PGF2α含量可作为判断活体内脂质过氧化的新指标，该脂质过氧化反映可能与体内自由基的产生、氧化性的伤害(oxidative damage)及抗氧化剂的缺乏(antioxidantdeficiency)有关；目前有许多方法可用来测量8-iso-PGF2α含量，包括酵素免疫分析法(enzyme immunoassay)、放射免疫分析法(radioimmunoassay)、气相层析质谱仪(gas-chromatography mass spectrometry)以及液相层析质谱仪(liquid chromatographymass spectrometry)等；此外，人类尿液中的8-iso-PGF2α及其代谢物2,3-dinor-8-iso-PGF2α含量可利用C18固相萃取(C18 solid phase extraction,SPE)准备样品后，再以液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析。
利用侵入式及非侵入式方法测试大鼠(rat)肝功能，以监测肝损害的发展以及筛选肝脏疾病，其中最常使用的方法包含测量血清中的天门冬氨酸转胺酶(aspartateaminotransferase,AST)、丙氨酸转胺酶(alanine aminotransferase,ALT)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)数值，以及测量肝细胞产物如：胆红素(bilirubin)、白蛋白(albumin)，以及利用量测前凝血素时间(prothrombin time)来检测凝血因子(coagulation factors)等；肝功能定量测试是根据几乎只经过 肝脏代谢的受质在血清中的浓度而定，这些受质的清除是依肝门静脉、肝动脉血流量以及由肝细胞对这些受质的作用而定，肝脏血流量与提供给肝脏的受质量有关，反之，该受质的清除则决定于肝脏代谢的能力。
半乳糖(galactose)是一种具有高萃取率(extraction ratio)、90％在肝脏中代谢的醣类，在肝脏中，半乳糖是由半乳糖激酶(galactokinase)经过差向立体异构化反应(epimerization)，将之转换成1-磷酸葡萄糖(Glucose-1-phosphate)；半乳糖激酶的作用反应为肝细胞中半乳糖代谢途径的速率决定步骤(rate-limiting step)。半乳糖的高萃取率使得依赖肝脏血流量及肝脏功能的半乳糖代谢作用成为检测肝功能最主要的方式，目前并无一定的规则来评估大鼠的残余肝功能(residual liver function)，量测确切化合物(如：半乳糖)的代谢能力，可推测肝脏中代谢作用的速率决定步骤，亦可能取得残余肝功能的代表数质。
以半乳糖清除能力(galactose elimination capacity,GEC)作为人类肝功能定量测试已行之有年，然而，半乳糖清除能力测试需取得多个血液样本以建立标准曲线，在临床应用上有其困难度，因此有许多研究使用半乳糖单点法(Galactose Single Point,GSP)以评估人类肝功能；本发明发明人以半乳糖单点法测试慢性肝炎、肝硬化以及肝癌病患，结果显示半乳糖单点法可精确测出这些肝脏疾病；半乳糖单点法已被成功的应用到测试肝病患者排除如丙嗪(promazine)及抗生素头孢酮(cefoperazone)等药物的剩余肝功能。此外，半乳糖单点法已在美国食品药物管理局(FDA)所出版的指南(Guidance for Industry)中成为建议采用测试肝功能的方法之一。
由此可见，上述现有抗结核药物异烟碱酰胺(isoniazid)仍有诸多缺失，实非良好的设计，而亟待加以改良。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种无/低副作用的抗结核病药物新复方药物组合，内含药学有效量的异烟碱酰胺(isoniazid,INH)，或再并用药学有效量的立复霉素(rifampin,RIF)，或再并用药学有效量的丙基硫异烟酰胺(pyrazinamide,PZA)，或再并用药学有效量的乙酰胺醇(Ethambutol,EMB)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，以降低由异烟碱酰胺(INH)所引起的肝毒性等副作用。
可达成上述发明目的的无/低副作用的抗结核病药物新复方，内含药学有效量的异烟碱酰胺(isoniazid,INH)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量的细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，其中CYP2E1抑制剂或amidase抑制剂选自于下列化合物所组成群组：正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiareticacid)、(-)-表儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocetechin-3-gallate)、茵陈色原酮(Capillarisin)、山奈酚(Kaempferol)、根皮素(Phloretin)、橙皮素(Hesperetin)、6-姜辣醇(6-Gingerol)、没食子酸(gallic acid)、异甘草素(Isoliquritigenin)、柚皮素(Narigenin)、二氢化槲皮素((+)-Taxifolin)、汉黄芩素(Wongonin)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、儿茶素((+)-Catechin)、β-奈黄酮(β-naphthoflavone)、恩贝素(Embelin)、反式肉桂酸(trans-Cinnamic acid)、表儿茶酚((-)-Epicatechin)、根皮苷(Phloridzin)、鲸蜡醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚乙二醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 400、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLURONIC F-68、聚乙二醇PEG4000、反式肉桂醛(Trans-Cinnamaldehyde)、大豆甘元(Daidzein)、异牡荆素(Isovitexin)、β-香叶烯(β-Myrcene)、檞皮素(Quercetin)、(+)-柠檬烯((+)-Limonene)、杨梅素(Myricetin)、檞皮(Quercitrin)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-Glucoside)、桑叶素(Morin)、新橙皮苷(Neohesperidin)、橙皮苷(Hesperidin)、(-)-表没食子儿茶素((-)-Epigallocatechin)、木犀草素(Luteolin)、金丝桃苷(Hyperoside)、十四烷酸乙酯(Ethyl Myristate)、柽柳素(Tamarixetin)、黄芩素(Baicalein)、芸香素(Rutin)、黄芩(Baicalin)、芹菜素(Apigenin)、(+)-表儿茶素((+)-Epicatechin)、(-)-表儿茶素没食子酸酯((-)-Epicatechin-3-gallate)、水飞蓟宾(Silybin)、牡荆素(Vitexin)、金雀异黄酮(Genistein)、异鼠李素(Isorhamnetin)、香叶木素(Diosmin)、葛根素(Puerarin)、或伞形花内酯(Umbelliferone)、高良姜素(Galangin)、非瑟酮(fisetin)、聚氧乙烯蓖麻油、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、二水磷酸氢钙、甘露醇Mannitol、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、蔗糖素、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸树脂EudragitS100、交联羧甲基纤维素钠、薄荷脑、邻磺酰苯酰亚胺、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、葡萄糖结合剂、柠檬酸、气相二氧化硅、聚乙二醇PEG 8000、山梨酸、柠檬油、羟丙基纤维素、苯甲酸钠、乙酰磺胺酸钾、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、甲基纤维素、环己氨基磺酸钠、乳糖单水合物、麦芽糖糊精、甘油二十二烷酸酯、氧化铁红、单硬脂酸甘油酯、共聚维酮K28、淀粉乙酸酯、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、聚维酮K-30、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇硬脂酸酯15、丁基羟基茴香醚。
更进一步，本发明的无/低副作用的抗结核病药物新复方包括药学有效量的丙基硫异烟酰胺(PZA)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量的酰胺水解酶(amidase)抑制剂，其中amidase抑制剂选自于下列化合物所组成群组：檞皮素(Quercetin)、高良姜素 (Galangin)、桑叶素(Morin)、非瑟酮(fisetin)、异甘草素、杨梅素(Myricetin)、木犀草素(Luteolin)、山奈酚(Kaempferol)、茵陈色原酮(Capillarisin)、聚氧乙烯蓖麻油、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯、鲸蜡醇聚氧乙烯醚，以降低由丙基硫异烟酰胺(PZA)所引起的肝毒性等副作用。
本发明所提供的无/低副作用的抗结核病药物新复方，亦可加入药学上可接受的赋形剂至该复方，该赋形剂可为稀释剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等，例如：聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯月桂醚、鲸蜡醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLURONIC F-68、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLURONIC F-127、聚乙二醇PEG 400、聚乙二醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 4000、山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐单油酸酯、S-40聚氧乙烯(40)单硬脂酸酯、聚乙二醇PEG 8000、乙酰氨基磺酸钾、气相二氧化硅、胶态二氧化硅、丁基羟基茴香醚、玉米淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、二水磷酸氢钙、乙二胺四乙酸二钠、乳糖、乳糖单水合物、乳糖S.G、低取代羟丙基纤维素、麦芽糖糊精、甘露醇Mannitol、薄荷脑、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、瓜尔胶、黄原胶、预胶化淀粉、聚维酮K-30、羧甲基淀粉钠、十二烷基硫酸钠、蔗糖素、聚乙二醇硬脂酸酯15、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、环己氨基磺酸钠、聚维酮K90F、氧化铁红、羟丙基甲基纤维素、樱桃、柠檬油、山梨酸、苯甲醇、甘草素、苯甲酸钠、淀粉乙酸酯、柠檬酸、山梨糖醇、膜衣Opadry white、葡萄糖结合剂、硬脂酸镁、褐藻酸、丙烯酸树脂E90、丙烯酸树脂E、甘油二十二烷酸酯、月桂酸聚乙二醇甘油酯、共聚维酮K-28、氢氯酸、羥乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、丙烯酸树脂100、麦芽糖、丙烯酸树脂S100、聚乙二醇PEG 1450、共聚维酮K-90、磷酸85％、聚氧乙烯醚-40氢化蓖麻油(RH 40)、聚氧乙烯(35)蓖麻油(EL 35)、磷酸二氢钠、蔗糖素、枸橼酸三乙酯、柠檬酸三钠或其余列于美国FDAGenerally Recognized as Safe(GRAS)中的常用成分。
本发明发明人鉴于现有抗结核药物异烟碱酰胺(isoniazid)所导致肝毒性等副作用的缺点，以及承袭本实验室先前专利案(低副作用的INH新复方，案号096101545)及(含异烟碱酰胺(Isoniazid,INH)的低副作用新复方(2)，案号097141522)的发明。另外，在本发明发明人先前专利申请案，PCT申请案号PCT/CS2008/001353(低副作用的异烟碱酰胺新复方)发明中，虽已揭示INH单方并用部分本实验室揭露的CYP2E1抑制剂的药学组合物，可降低INH所导致肝毒性等副作用，但后续发明人的研究，发现并不是任意的剂量组合都可以于体内达到去 除INH肝毒性的效果，例如，在动物体内实验发现，小鼠每日合并使用山奈酚(Kaempferol)3.78mg/kg与INH/RIF 50/100mg/kg腹腔注射持续3周，可显着抑制INH所导致的肝毒性，控制组(INH/RIF 50/100mg/kg)的相关肝功能指针GOT、GPT和GSP值为571±295U/L、364±192U/L和866±339mg/L，而并用山奈酚3.78mg/kg组的GOT值则为89±19U/L、48±21U/L和245±98mg/L，接近正常值，然而山奈酚使用剂量调整为1.89mg/kg后，各项相关肝功能指针相较于控制组所下降的幅度均未达并用山奈酚3.78mg/kg所获得的成效。由以上动物试验结果可知当合并使用CYP2E1抑制剂时，对INH所导致肝毒性确实具有改善效果，但必须限定其使用剂量，因此基于实验结果，本发明着重于抑制剂使用剂量的决定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的含异烟碱酰胺(Isoniazid,INH)的无/低副作用新复方，与单独使用异烟碱酰胺(INH)，异烟碱酰胺(INH)和/或立复霉素(rifampin,RIF)、异烟碱酰胺(INH)和/或丙基硫异烟酰胺(pyrazinamide,PZA)的试验结果相互比较时，在生化分析(ALT、AST值)、病理学分析、剩余肝功能的量测(GSP值、GEC值)以及氧化压力的指标(血浆中8-iso-PGF2α的浓度)等各方面的分析结果，都有明显减少使用异烟碱酰胺(INH)所造成的肝毒性副作用的功效。
2.本发明所提供的含异烟碱酰胺(Isoniazid,INH)的无/低副作用新复方，其中亦提供可作为细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂的中药药引，相较现有细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，本发明所提供者是从天然中药药引萃取，无生理、化学毒性，且对于人类肝脏的细胞色素P450 2E1活性有明显的抑制活性。
附图说明
图1为异烟碱酰胺(INH)在肝脏中的代谢途径图；
图2为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠，天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD，*表示各试验组与对照组比较后P<0.05者；
图3为对照组(图3A及C)与INH组(图3B及D)大鼠肝脏切片：图3A，对照组相对正常肝组织的型态(HE染色,400X)；图3B，INH组在周围中央静脉(V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化(HE染色,400X)；图3C，以电子显微镜检视对照组大鼠肝切片，Nu：细胞核(9,000X)；图3D，以电子显微镜检视INH组大鼠肝切片，相较于图3C对照组的肝细胞切片，INH组大鼠肝细胞的粗内质网(rER)明显增加，Nu：细胞核(9,000X)；
图4为8-iso-PGF2α-d4(A)与8-iso-PGF2α(B)的分子结构以及子离子光谱；
图5为含有250pg 8-iso-PGF2α-d4(A)的内标准品溶液、含有100pg 8-iso-PGF2α(B)的标准品溶液与空白样本(C)，在多重反应监测模式(MRM)侦测下的液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)色谱，质荷比(m/z)357/197以及质荷比(m/z)353/193的离子偶(ion pairs)分别被用来监测8-iso-PGF2α-d4(A)(作为内标准品)以及8-iso-PGF2α(B)(作为标准品)；波峰1：空白血浆；波峰2：注入标准品的空白血浆；
图6为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度，数值的计算为mean±SD，*表示试验组与对照组比较后P<0.001者；#表示各试验组与INH组比较后P<0.05者。
图7为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD，*表示试验组与对照组比较后P<0.001者；#表示各试验组与INH组比较后P<0.001者；※表示各试验组与INH组比较后P<0.005者；
图8为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖清除能力(GEC)值，数值的计算为mean±SD，*表示试验组与对照组比较后P<0.001者；#表示各试验组与INH组比较后P<0.005者；※表示各试验组与INH组比较后P<0.05者；
图9为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单点法(GSP)值与血浆中8-iso-PGF2α的浓度具有高度相关的统计图；
图10为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单点法(GSP)值与半乳糖清除能力(GEC)值具有高度相关的统计图；
图11为对照组、PZA组、BNPP-PZA组及BNPP组大鼠，天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD，*表示各试验组与对照组比较后P<0.05者；
图12为对照组(图12A)与PZA组(图12B)大鼠肝脏切片：图12A，对照组相对正常肝组织的型态(HE染色,400X)；图12B，PZA组在周围中央静脉(V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化(H E染色,400X)；
图13为PZA组、BNPP-PZA组大鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD；
图14为对照组、INH-RIF组、INH-RIF-PZA组、Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF组、Kaempferol-INH-RIF-PZA组及Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠，天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD；
图15为对照组、INH-RIF组、INH-RIF-PZA组、Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF 组、Kaempferol-INH-RIF-PZA组及Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD；
图16为空白对照组(A)、INH-RIF-PZA控制组(B)、Quercetin-INH-RIF-PZA组(C)、Kaempferol-INH-RIF-PZA组(D)，于实验3周小鼠肝脏切片；
图17为空白对照组(A)、INH-RIF控制组(B)、Quercetin-INH-RIF组(C)、Kaempferol-INH-RIF组(D)，于实验3周小鼠肝脏切片；
图18为对照组(A)、INH-RIF组(B)、MH-INH-RIF组(C)、MM-INH-RIF(D)组及ML-INH-RIF组(E)，于实验3周小鼠肝脏切片；
图19为Chlorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone于健康受试者血中浓度图；实心方块为Rifamate控制组，给予Chlorzoxazone(500mg)+Rifamate(INH/RIF 150/300mg)；空心圆形为HUCHE033实验组，给予Chlorzoxazone(500mg)+Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol 100mg；
图20为Chlorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone于健康受试者血中浓度图；实心方块为Rifamate控制组，给予Chlorzoxazone(500mg)+Rifamate(INH/RIF 150/300mg)；空心圆形为HUCHE033实验组，给予Chlorzoxazone(500mg)+Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol 100mg。
具体实施方式
本发明将就下列实施例作进一步说明，然该等实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为实施本发明的限制。
实施例1异烟碱酰胺(INH)合并使用CYP2E1抑制剂双硫仑(DSF)及/或硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)的动物试验
一、材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，INH,BNPP,DSF以及玉米油则购自Sigma化学公司(St.Louis,MO USA)，8-iso-PGF2α以及放射线标定的8-iso-PGF2α-d4则得自Cayman化学公司(Ann Arbor,MI,USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
2.试验动物
体重为320-350公克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心(台湾)，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的大鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间大鼠体重均持续监测，所有的大鼠均以使用50毫克/公斤体重剂量的戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)进行腹腔麻醉(intraperitoneally anesthetized)，将聚乙烯导管置于大鼠右颈内静脉(internaljugular vein)内以施打半乳糖，导管以切入穿刺(cut-down technique)插入，该导管的末端置于大鼠颈后切口的皮肤下方，手术完成后，恢复期间使大鼠禁食一夜(约16小时)，但水分照常供给。
3.试验处理
试验动物随机分成5组，每组包括3种处理，第一种处理为注射25mg/kg BNPP或BNPP的基剂(vehicle,VEH1，即食盐水)，BNPP溶于加热至60℃的食盐水(0.9％NaCl)，冷却后以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第二种处理为则注射100mg/kg DSF或DSF的基剂(VEH2，即玉米油)，DSF溶于玉米油中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第三种处理为注射150mg/kg INH或INH的基剂(VEH3，即食盐水)，INH溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第一组(BNPP或VEH1)较第三组(INH或VEH3)早30分钟处理，第二组(DSF或VEH2)比第三组(INH或VEH3)早15分钟处理。
上述5组试验共包含：
(1)对照组(normal control group,NC,n＝12)：正常的大鼠每天注射1次VEH1、VEH2以及VEH3(施行腹腔内注射)共21天；
(2)INH组(INH,n＝7)：正常的大鼠每天注射1次INH、VEH1以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
(3)BNPP-INH组(BNPP-INH,n＝7)：正常的大鼠每天注射1次BNPP、INH以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
(4)DSF-INH组(DSF-INH,n＝7)：正常的大鼠每天注射1次DSF、INH以及VEH1(施行腹腔内注射)共21天；以及
(5)BNPP-DSF-INH组(BNPP-DSF-INH,n＝7)：正常的大鼠每天注射1次BNPP、DSF以及INH(施行腹腔内注射)共21天；
半乳糖单点法于第21天处理后16小时进行测试。
4.血液样本
处理完毕后，大鼠以乙醚麻醉牺牲，血液由大鼠背部主动脉抽取，置于含有EDTA的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心15分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorf tube)中并置于-80℃中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，以Synchron LXi 725系统来量测(Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析；肝脏样本以10％磷酸缓冲液配制的福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石蜡(paraffin)中，以5μm厚度切片，切片样本以苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)染色，并进行肝糖染色试验(Periodic acid Schiff stain,PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液(cacodylate buffer,0.1M pH 7.4)清洗，以20％四氧化锇水溶液(aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂(Spurrresin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰(uranyl acetate)及柠檬酸铅(leadcitrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscope,Hitachi 600,Hitachi Co.,日本)观察。
7.8-iso-PGF2α的萃取与量测
所有PGF2α的同分异构物(isomers)均以适当体积的酒精溶解或稀释以制备原液，并分装于小管中储存于-70℃，取0.5ml血浆至玻璃管中，加入10ng内标准品(internalstandard,即8-iso-PGF2α-d4)，混匀后的血浆以C18固相萃取管柱(Solid-PhaseExtraction cartridge,J.T.Baker,MA,美国)纯化，样本流洗液以氮气蒸发干燥后，以50μl乙睛:水(acetonitrile:water,15:85v/v)溶液回溶并震荡30秒，取10μl回溶后的萃取物注射至LC/MS/MS系统进行分析。
8.液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析
HPLC系统包括2个岛津LC-10ADvP泵(Shimadzu LC-10ADvP pumps)、1个岛津系统控制器(Shimadzu system control)以及1个岛津自动样本机(Shimadzu autosampler)(岛津科学仪器，日本)，以C18管柱(颗粒大小5-μm，内径50×2.1mm)进行HPLC分离，并使用含有2mM醋酸铵(ammonium acetate)及乙睛(acetonitrile,ACN)之梯度流洗液(t＝0min,15％ACN；t＝6min,70％ACN；t＝7min,90％ACN；t＝8min,90％ACN；t＝8.5min,15％ACN)流洗，LC/MS/MS的流速均维持在200μl/min，整个HPLC进行时间为13.5分钟；该HPLC系统与一三层四极质谱仪(triple stage quadrupole mass spectrometer,API3000,AppliedBiosystem,Foster City,CA,美国)介接，配备有TurboIonSpray离子源(TurboIonSprayionization source)，并使用负电电喷雾(negative electrospray)作为电离(ionization)的方法；该质谱仪通过扩散200 ng/ml 8-iso-PGF2α或8-iso-PGF2α-d4标准液以多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行最佳化，m/z 353/193以及m/z 357/197离子偶(ion pair)则个别用来监测8-iso-PGF2α以及8-iso-PGF2α-d4；测量后，计算6个8-iso-PGF2α浓度(C)的线性标准曲线(linear calibration curve)对8-iso-PGF2α比8-iso-PGF2α-d4比值的区域(Y)，得到相关系数(r,correlationcoefficient)值为0.999；血浆中8-iso-PGF2α的线性范围在0.1-2.5ng/ml之间，其回归方程式(regression equation)为Y＝-0.0517C+0.823ng/ml；所测得的结果均对照重氢化8-iso-PGF2α(deuterated 8-iso-PGF2α)内标准品计算，标准曲线的批间精密度以及准确度是以标准浓度样品分别测试6次后，经由反向计算法(Back-Calculation)来评估，其相对误差(relative errors)范围在–5.06％至3.13％之间。
9.肝功能的定量测试
所有的大鼠均进行半乳糖单点法(GSP)及半乳糖清除能力(GEC)测试，大鼠接受在30秒内的快速静脉注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后5、10、15、30、45以及60分钟各采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetricgalactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖清除能力(GEC)由下列公式计算，该公式是由Tygstrup’s方程式修改而来：
G E C = D T C = 0 + 7 ( m g / k g &CenterDot; min )
其中D为半乳糖注射量；TC＝0为半乳糖浓度达到0所需要的时间，是由注射(通常为2.22mmol/l)后20至60分钟的血液浓度-时间曲线的线性回归推得；7为依经验法则修正体内不均匀分布的校正值；半乳糖单点法(GSP)则为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。
10.统计分析
所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of theSocial Science program(Version 13,SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P<0.05。
二、结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异；生化分析结果如图2所示，只有INH组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高于对照组(对照组血浆中的AST活性为116±11IU/L；INH组血浆中的AST活性为129±10IU/L,p<0.05；对照组血浆中的ALT活性为44±6IU/L；INH组血浆中的ALT活性为52±3IU/L,p<0.05)，显示INH组产生生化上的肝损伤；对照组、BNPP-INH、DSF-INH以及BNPP-DSF-INH组血清中转胺酶浓度则为正常。
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射150mg/kg/day INH的大鼠，其体内成功的产生肝毒性；相对的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图3A所示，对照组大鼠肝实质(liverparenchyma)内的肝细胞系排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦(hepatic sinusoids)则在两肝板(anastomosing plates)之间被发现；INH组大鼠的组织切片则如图3B所示，INH组大鼠中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化，然而并无看到肝细胞坏死(necrosis)的征兆；以电子显微镜观察的结果显示，相较于对照组(如图3C所示)，INH组大鼠肝细胞内的粗内质网(rER)明显增加(如图3D所示)。根据文献报导，INH是一个强效的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的诱导物，而CYP2E1会导致超氧基(superoxide)以及氢氧自由基(hydroxyl radicals)的产生，并且会引发内质网的增加，因此本试验的结果与先前研究相符。而其它试验组：BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的肝损害程度与对照组相较，并无明显区别(未显示结果)。
3.血液样本中8-iso-PGF2α的量测
在负电电喷雾模式下，8-iso-PGF2α最大量的分子离子为质荷比(m/z)353的离子，8-iso-PGF2α-d4最大量的分子离子为质荷比(m/z)357的离子，这些负电荷分子离子经过大量碰撞诱导而产生游离，这两个目标化合物的分子结构以及产生的离子光谱如图4所示；除了8-iso-PGF2α-d4的子离子(daughter ions)恒较8-iso-PGF2α的子离子高四个单位之外，8-iso-PGF2α以及8-iso-PGF2α-d4两者的碎裂模式(fragmentation patterns)很相似，这显示大多数稳定的子离子是由A链产生而来，该A链上标示有4个氘原子(deuterium atoms)；8-iso-PGF2α最密集的子离子为质荷比(m/z)193的离子，8-iso-PGF2α-d4最密集的子离子为质荷比(m/z)197之离子。图5所示为在多重反应监测模式(MRM)侦测下，含有100pg 8-iso-PGF2α与250pg/ml 8-iso-PGF2α-d4的标准溶液，以及血液样本的典型LC/MS/MS色谱，在注入1ng 8-iso-PGF2α-d4 作为内标准品后，该标准溶液与该血液样本均经过相同的固相萃取(SPE)纯化，并以前述LC/MS/MS规程分析。
4.血浆中8-iso-PGF2α的浓度
血浆中的8-iso-PGF2α是一种氧化压力(oxidative stress)的指标，如图6所示，相较于对照组，INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度明显增加(INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为151±26pg/ml；对照组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为110±15pg/ml,p<0.001)；与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组三组则明显降低由INH引起肝脏的8-iso-PGF2α产生(BNPP-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为128±29pg/ml；DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为126±20pg/ml；BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为123±17pg/ml；INH组大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度为151±26pg/ml,p<0.005)；值得注意的是，对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间，大鼠血浆中8-iso-PGF2α的浓度无显着差异，与BNPP-INH组及DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF并不会进一步减少血浆中8-iso-PGF2α的浓度。
5.剩余肝功能的量测
如图7所示，对照组与INH组大鼠的半乳糖单点法(GSP)值具有高度的显着差异(对照组大鼠的GSP值为384±69μg/ml；INH组大鼠的GSP值为565±87μg/ml,p<0.001)，此外，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠之GSP值各为401±70μg/ml、449±45μg/ml、388±53μg/ml，与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GSP值各与INH组大鼠具有高度的显着差异(其p值各为p<0.001,p<0.005,and p<0.001)；单独施用INH的大鼠的GSP值明显增加；然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可抵抗这种改变；另一方面，与DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF显示可以降低INH引起的肝毒性，虽然两者之间的差异未达到统计上的差异(p＝0.1)，而对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GSP值无显着差异存在。
相似的结果在使用半乳糖清除能力(GEC)方法上也可观察的到，如图8所示，与对照组相较，INH组大鼠的GEC值明显减少(INH组大鼠的GEC值为3.4±0.6mg/min.kg；对照组大鼠的GEC值为4.9±0.8mg/min.kg,p<0.001)，此外，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各为4.5±0.6mg/min.kg、4.3±0.4mg/min.kg、4.7±0.5mg/min.kg；与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各与INH组大鼠具有高度的显着差异(其p值各为p<0.005,p<0.05,and p<0.005)；单独施 用INH的大鼠之GEC值明显减少；然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可恢复这种改变；与DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF者有增加GEC值的倾向(DSF-INH组与BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各为4.3±0.4mg/min.kg、4.7±0.5mg/min.kg,p＝0.29)；此外，对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GEC值无显着差异存在。
为了确定AST、ALT、血浆中8-iso-PGF2α的浓度，以及定量肝功能测试(如：GSP以及GEC)是否相关，以数种相关分析计算后，发现GSP值与血浆中8-iso-PGF2α的浓度具有高度相关(如图9所示)，相关系数为0.836；GSP值与GEC值具有高度相关(如图10所示)(p<0.001)，相关系数为-0.822；GEC值也与血浆中8-iso-PGF2α的浓度具有高度相关(相关系数为-0.743,p<0.001，如表1所示)；而GSP值、GEC值以及血浆中8-iso-PGF2α的浓度则与AST及ALT均无明显相关(如表1所示)。
表1、GSP、GEC以及8-iso-PGF2α与生化测试的相关性
以皮尔森氏相关系数(Pearson’s correlation coefficient)作为统计计算，*p<0.001
实施例2细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-
cDNA合成微粒体细胞色素P450 2E1。
一、材料与方法
1.试验材料
本实施例是使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1 HighThroughput Inhibitor Screening Kit,BD Bioscience,美国)针对22种中药药引及10种赋形剂进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选；该CYP2E1抑制剂的筛选套组的作用原理为：在含有细胞色素P450 2E1(CYP2E1)以及其荧旋旋光性受质MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin)的环境下加入测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)的生成量，并以对照组(control)的HFC生成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。
各测试样品均溶于乙腈(acentoitrile)，测试不同浓度的中药药引(66μM,33μM,16.5μM)及赋形剂(0.167％,0.08％,0.042％,w/v)对CYP2E1的抑制率，所测试的中药药引及结果如表3所列，所测试的赋形剂及结果如表4所列。
另外，本实施例使用的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1High Throughput Inhibitor Screening Kit,BD Bioscience,美国)所需的药剂如下：
(1)CYP2E1+P450 Reductase+Cytochrome b5：100 mM potassium phosphate(pH7.4)含有1.3 nmol P450以及p-Nitrophenol水解酶。
(2)Control Protein：15 mg/mL Control Protein溶于100 mM PotassiumPhosphate(pH 7.4)中。
(3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)。
(4)Stop Solution：0.5M Tris Base。
(5)Cofactors：含有1.3mM NADP+、66mM MgCl2以及66mM Glucose 6-Phosphate。
(6)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase：40 units/ml溶于5mM SodiumCitrate Buffer(pH 7.5)。
(7)MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin)：荧旋旋光性受质(fluorescence substrate)，50mM MFC溶于乙腈(acetonitrile)。
(8)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid)：CYP2E1选择性抑制剂(阳性对照组)，20mM DDTC溶于乙腈(acentoitrile)。
(9)HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)：CYP2E1代谢物标准品(metabolite standard)，0.25 mM HFC溶于0.1M Tris(pH 9.0)。
(10)NADPH-Cofactor Mix：于14.56ml无菌水中加入187.5μl Cofactors、150μlG6PDH(Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及100μl Control Protein。
(11)Cofactor/acetonitrile mix：于9.93ml NADPH-Cofactor Mix中加入66μlAcetonitrile。
(12)Enzyme/Substrate Mix：于4ml Buffer Soultion中加入5.94ml无菌水、50μlHTS-706(CYP2E1,2μM P450 content)以及28μl 50 mM MFC(7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin,荧旋旋光性受质)。
2.细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选
使用细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组(CYP2E1 High ThroughputInhibitor Screening Kit,BD Bioscience,美国)进行中药药引及赋形剂的筛选，实验步骤如下所述：
(1)制备对照组：
a.于96孔盘上第1孔井(well)内加入149μl NADPH-Cofactor Mix以及1μl 20mMDDTC并混合均匀；
b.于该96孔盘上第2至12孔井内各加入100μl Cofactor/acetonitrile mix，第1至8孔井为阳性对照组(positive control)；第9与第10孔井为对照组(control)；第11与第12孔井为空白对照组(blank)；
c.于该第1至8孔井内做连续稀释动作：自第1孔井内取50μl液体加入第2孔井内混匀，再自第2孔井内取50μl液体加入第3孔井内混匀，以此类推，至第8孔井时去除多余的50μl液体，以得到连续稀释浓度66.6、22.2、7.4、2.47、0.82、0.27、0.091、0.03μM。
(2)制备试验组：
a.于96孔盘上第1行的第1及第2孔井内各加入149μl NADPH-Cofactor Mix，以及1μl 20mM中药药引测试样品或1μl 25％(w/v)赋形剂测试样品，并混合均匀；
b.再自该第1行的第1及第2孔井内各取50μl液体加入第3孔井内混匀(即每一测试样品均为三重复)；
(3)反应起始与终止：
a.将上述对照组与试验组置于37℃静置10分钟；
b.除了该空白对照组之外，其它孔井内均加入100μl Enzyme/Substrate Mix混匀；
c.将所有对照组与试验组置于37℃静置40分钟；
d.所有的孔井内均加入75μl Stop Solution混匀；
e.紧接着于该空白对照组内加入100μl Enzyme/Substrate Mix混匀；
f.将所有对照组与试验组以萤冷光仪(Fluoroskan Ascent FL,Thermo ElectronCorporation，芬兰)读取结果，所使用的激发光(excitation)波长为405 nm，发散光(emission)波长为538 nm。
(4)结果分析：测得的荧光讯号数值换算成为CYP2E1代谢物标准品HFC生成量(pmol)后，以对照组(control)为基准，即对照组的CYP 2E1抑制率为0％，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：
二、结果
1.阳性对照组
阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表2所示，由表2可知当DDTC的浓度为66.6μM(即为0.167％,w/v)时，CYP 2E1抑制率可达97.55％，是以66.6μM作为中药药引最高测试浓度，以0.167％(w/v)作为赋形剂最高测试浓度。
表2阳性对照组的CYP 2E1抑制率
2.试验组CYP 2E1抑制率
中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表3所示，由结果可知各中药药引于不同浓度(66μM,33μM,16.5μM)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μM正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳(97.99±0.66％)。
表3中药药引的CYP 2E1抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
赋形剂所测出的CYP 2E1抑制率如表4所示，由结果可知各赋形剂于不同浓度(0.167％,0.08％,0.042％,w/v)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167％鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(97.75±0.66％)。
表4赋形剂的CYP 2E1抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
实施例3细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-人肝微粒体细胞色素P4502E1
一、材料与方法
1.试验材料
本实施例是使用人类肝脏所制备微粒体，针对细胞色素P450 2E1(CYP2E1)与39种中药药引及10种赋形剂进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选，以筛选出对于人类肝脏 的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)有效抑制剂；该CYP2E1抑制剂的筛选作用原理为：利用人类肝脏所制备微粒体中细胞色素P450 2E1(CYP2E1)与其受质Chlorzoxazone反应，加入测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品6-OH-CZX(6-Hydroxy-Chlorzoxazone)的生成量，并以对照组(control)的6-OH-CZX生成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。
各测试样品均溶于10％甲醇(methanol)或是二次水中，测试不同浓度的中药药引(66μM,33μM,16.5μM)及赋形剂(0.167％,0.08％,0.042％,w/v)对CYP2E1的抑制率，所测试的中药药引及结果如表6所列，所测试的赋形剂及结果如表7所列。
本实施例所利用人类肝脏细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂筛选所需的药剂如下：
(1)CYP2E1：100mM potassium phosphate(pH 7.4)含有10mg/ml P450 proteinconcentration。
(2)Control Protein：10mg/mL P450 Protein溶于100mM Potassium Phosphate(pH 7.4)中。
(3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)。
Stop Solution：ice-acetonitrile。
(4)Cofactors：含有100mM NADP+以及10mM Glucose 6-Phosphate。
(5)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase：2000 units/ml溶于无菌水。
(6)Chlorzoxazone：受质(substrate)，16mM Chlorzoxazone溶于10％甲醇(Methanol)。
(7)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid)：CYP2E1选择性抑制剂(阳性对照组)，20mM DDTC容于10％甲醇(Methanol)。
(8)NADPH-regenerating System：于3.42ml中加入530μl Cofactors、40μl G6PDH(Glucose6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及100μl Control Protein。
2.细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选
使用人类肝脏微粒体细胞色素P450 2E1(CYP2E1)进行细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂筛选的实验步骤如下所述：
(1)在4℃冰浴环境下，0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)包含0.5mg/ml人肝微粒体、5mMMgCl2静置15分钟；
(2)此时实验组加入细胞色素P450 2E1反应基质药物16mM Chlorzoxazone以及浓缩中药药引萃取液；对照组以甲醇：无菌水＝1：1取代中药药引；阳性对照组则以DDTC取代；
(3)最后加入辅酶1mM NADP+、10mM G6P与2IU G6PD。将反应液转移至37℃水浴预温(pre-incubation)1分钟，活性测试实验的反应时间为30分钟；
(4)反应完后以500L acetonitrile终止反应，样品静置1分钟后加入内部标准品(5g/mL4-hydroxy-tobutamide)，离心后取上层液20L以甲醇:无菌水作稀释十倍动作，取5L回溶液注入LC/MS/MS系统进行分析。
(5)结果分析：将LC/MS/MS测得的讯号数值换算成为CYP2E1代谢物标准品6-Hydroxy-Chlorzoxazone生成量(pmol)后，以对照组(control)为基准，即对照组的CYP 2E1抑制率为0％，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：
二、结果
1.阳性对照组
阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表5所示，由表5可知当DDTC的浓度为100μM时，CYP 2E1抑制率可达87.56％。
表5阳性对照组的CYP 2E1抑制率
2.试验组CYP 2E1抑制率
中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表6所示，由结果可知各中药药引于不同浓度(66μM,33μM,16.5μM)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μM正二羟愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果(96.98±0.19％)及66μM反式肉桂醛(Trans-Cinnamaldehyde)抑制效果(92.81±0.53％)最佳。
表6中药药引的CYP 2E1抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
赋形剂所测出的CYP 2E1抑制率如表7所示，由结果可知各赋形剂于不同浓度(0.167％,0.08％,0.042％,w/v)的条件下，对细胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167％鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(91.24±1.33％)。
表7赋形剂的CYP 2E1抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
实施例4酰胺水解酶(amidase)抑制剂的筛选-鼠肝微粒体酰胺水解酶(amidase)
一、材料与方法
1.试验材料
Isonicotinic acid以高效能液相层析仪(HPLC-UV)分析定量。所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，isoniazid、isonicotinic acid与nicotinic acid(内在标准品，internal standard)购自Sigma化学公司(St.Louis,MOUSA)。
2.试样处理
本实验拟以鼠肝微粒体溶液作为amidase酵素来源，isoniazid作为amidase代谢模式药物，定量isoniazid经amidase代谢生成的代谢物isonicotinic acid(INA)，作为amidase活性测量的标的，建立amidase体外活性抑制剂筛选平台，HPLC系统包括1个岛津LC-10AD泵(Shimadzu LC-10AD pump)、1个岛津系统控制器(Shimadzu system control)以及1个岛津自动样本机(Shimadzu autosampler)(岛津科学仪器，日本)，以C18管柱(颗粒大小5μm，内径50×4.6mm，25cm)并使用含有70％甲醇和30％甲酸铵(50mM,pH＝2.5)的移动相进行HPLC分离，实验步骤简述如下：
(1)鼠肝酵素微粒体溶液制备及蛋白浓度测定。
(2)取鼠肝微粒体溶液150μL加入100μL isoniazid溶液(3mM溶于)35μL 67mM磷酸钾缓冲溶液(KH2PO3,pH＝7)及15μL amidase抑制剂(控制组加入去离子水)混合均匀。
(3)置于37℃水浴槽反应30分钟。
(4)加入300μL乙晴(acetonitrile,ACN)混匀后静置6分钟。
(5)加入30μL过氯酸混匀后静置6分钟。
(6)以13000g的转速离心6分钟。
(7)取100μL离心后上清液注射入HPLC。
(8)以甲醇:甲酸铵(50mM,pH＝2.5)＝70:30(V/V)为移动相，控制流速为1ml/min，以波长270nm紫外光检测。
(9)结果分析：将HPLC-UV测得的讯号数值换算成为amidase代谢物标准品isonicotinic acid生成量(ng/mL)后，以对照组(control)为基准，即对照组的amidase抑制率为0％，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的amidase抑制率：
二、结果
中药纯成份及赋形剂所测出的Amidase抑制率如表8及表9所示，由结果可知各中药纯成分及赋形剂于不同浓度的条件下，对Amidase酵素具有不同程度的抑制效果，其中以100μM HUCHE033抑制效果最佳(75.5±2.2％)。
表8体外筛选中药纯成份所测出的Amidase抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
表9体外筛选赋形剂所测出的Amidase抑制率
*最小有效剂量：最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
实施例5丙基硫异烟酰胺(PZA)合并使用酰胺水解酶(amidase)抑制剂硝基苯酚磷酸二酯 (BNPP)的动物试验
一、材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，PZA,BNPP则购自Sigma化学公司(St.Louis,MO USA)，硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)为文献普遍使用的酰胺水解酶(amidase)抑制剂，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
2.试验动物
体重为320-350公克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心(台湾)，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的大鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间大鼠体重均持续监测。
3.试验处理
试验动物随机分成3组，每组包括2种处理，第一种处理为注射50mg/kg BNPP或BNPP的基剂(vehicle,VEH1，即食盐水)，BNPP溶于加热至60℃的食盐水(0.9％NaCl)，冷却后以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第二种处理为注射500mg/kg PZA或PZA的基剂(VEH2，即食盐水)，PZA溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第一种处理(BNPP或VEH1)较第二种处理(PZA或VEH2)早15分钟处理。
上述3组试验共包含：
(1)对照组(normal control group,NC,n＝10)：正常的大鼠每天注射1次VEH1及VEH2(施行腹腔内注射)共49天；
(2)PZA组(INH,n＝10)：正常的大鼠每天注射1次PZA及VEH1(施行腹腔内注射)共49天；
(3)BNPP-PZA组(BNPP-PZA,n＝10)：正常的大鼠每天注射1次BNPP及PZA(施行腹腔内注射)共49天；
半乳糖单点法于第49天处理后16小时进行测试。
4.血液样本
处理完毕后，大鼠以乙醚麻醉牺牲，血液由大鼠背部主动脉抽取，置于含有EDTA的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心15分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorf tube)中并置于-80℃中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测(Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析；肝脏样本以10％磷酸缓冲液配制的福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石蜡(paraffin)中，以5μm厚度切片，切片样本以苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)染色，并进行肝糖染色试验(Periodic acid Schiff stain,PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液(cacodylate buffer,0.1M pH 7.4)清洗，以20％四氧化锇水溶液(aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂(Spurrresin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰(uranyl acetate)及柠檬酸铅(leadcitrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscope,Hitachi 600,Hitachi Co.,日本)观察。
7.肝功能的定量测试
所有的大鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，大鼠接受在30秒内的快速静脉注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of theSocial Science program(Version 13,SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P<0.05。
二、结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异；生化分析结果如图11所示，PZA组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT) 活性明显高于对照组(对照组血浆中的AST活性为109±27IU/L；PZA组血浆中的AST活性为179±10IU/L,p<0.005；对照组血浆中的ALT活性为43±9IU/L；PZA组血浆中的ALT活性为91±11IU/L,p<0.005)，显示PZA组产生生化上的肝损伤；BNPP-PZA血清中转胺酶浓度则显着低于PZA组。
2.组织病理学
经过为期7周施行腹腔注射500mg/kg/day PZA的大鼠，其体内成功的产生肝毒性；相对的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图12A所示，对照组大鼠肝实质(liverparenchyma)内的肝细胞排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦(hepatic sinusoids)则在两肝板(anastomosing plates)之间被发现；PZA组大鼠的组织切片则如图12B所示，PZA组大鼠中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化，然而并无看到肝细胞坏死(necrosis)的征兆。而BNPP-PZA组大鼠的肝损害程度与对照组相较，并无明显区别(未显示结果)。
3.剩余肝功能的量测
如图13所示，对照组与PZA组大鼠的半乳糖单点法(GSP)值具有高度的显着差异(对照组大鼠的GSP值为260±50μg/ml；PZA组大鼠的GSP值为776±65μg/ml,p<0.005)，此外，BNPP-PZA组大鼠的GSP值为293±61μg/ml，与PZA组相较，具有高度的显着差异(p<0.005)；单独施用PZA的大鼠的GSP值明显增加；然而，在PZA合并施用BNPP的大鼠则可抵抗这种改变；而对照组与BNPP-PZA组之间大鼠的GSP值无显着差异存在。
实施例6异烟碱酰胺(INH)及/或立复霉素(RIF)及/或丙基硫异烟酰胺(PZA)合并使用CYP2E1抑制剂山奈酚(Kaempferol)或酰胺水解酶(amidase)抑制剂檞皮素(Quercetin)的动物试验
一、材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，INH、RIF、PZA、Kaempferol、Quercetin购自Sigma化学公司(St.Louis,MO USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
2.试验动物
体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美国)，引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验 期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
3.试验处理
试验动物随机分成7组，每组包括5种处理，第一种处理为注射Kaempferol3.78mg/kg或其基剂(vehicle,VEH1，即食盐水)，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第二种处理为则注射Quercetin 3.02mg/kg或其基剂(VEH2，即食盐水)，Quercetin溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第三种处理为注射50mg/kg INH或INH的基剂(VEH3，即食盐水)，INH溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第四种处理为注射100mg/kg RIF或其基剂(VEH4，即食盐水)，RIF溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第五种处理为注射250mg/kg PZA或其基剂(VEH5，即食盐水)，PZA溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内。
上述5组试验共包含：
(1)对照组(normal control group,NC,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次VEH1、VEH2、VEH3、VEH4以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
(2)INH-RIF组(INH-RIF,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次INH、RIF、VEH1、VEH2以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
(3)Kaempferol-INH-RIF组(Kaempferol-INH-RIF,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次Kaempferol、INH、RIF、VEH2以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
(4)Quercetin-INH-RIF组(Quercetin-INH-RIF,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次Quercetin、INH、RIF、VEH1以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
(5)INH-RIF-PZA组(INH-RIF-PZA,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次INH、RIF、PZA、VEH1以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
(6)Kaempferol-INH-RIF-PZA组(Kaempferol-INH-RIF-PZA,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次Kaempferol、INH、RIF、PZA以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
(7)Quercetin-INH-RIF-PZA组(Quercetin-INH-RIF-PZA,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次Quercetin、INH、RIF、PZA以及VEH1(施行腹腔内注射)共21天；
4.血液样本
处理完毕后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心10分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorftube)中并 置于-80℃中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测(Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析；肝脏样本以10％磷酸缓冲液配制的福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石蜡(paraffin)中，以5μm厚度切片，切片样本以苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)染色，并进行肝糖染色试验(Periodic acid Schiff stain,PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液(cacodylate buffer,0.1M pH 7.4)清洗，以20％四氧化锇水溶液(aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂(Spurrresin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰(uranyl acetate)及柠檬酸铅(leadcitrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscope,Hitachi 600,Hitachi Co.,日本)观察。
7.肝功能之定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，小鼠接受在30秒内的快速眼窝注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of theSocial Science program(Version 13,SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P<0.05。
二、结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异；生化分析结果如(图14及表10)所示，当小鼠以50/100mg/kg/day连续给予3周INH/RIF后，INH/RIF控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高于空白对照组(空白对照组血浆中的AST活性为90±15IU/L；INH/RIF控制组血浆中的AST活性为571±295IU/L,p<0.001；空白对照组血浆中的ALT活性为40±5IU/L；INH/RIF控制组血浆中的ALT活性为364±192IU/L,p<0.001)，显示INH/RIF的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤；而以50/100/250mg/kg/day连续给予3周INH/RIF/PZA的小鼠，INH/RIF/PZA控制组血浆中的AST和ALT活性分别为702±172IU/L及464±72IU/L，显着高于空白对照组及INH/RIF控制组，显示INH/RIF/PZA的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤，且损伤程度高于INH/RIF造成的伤害；同时给予CYP2E1抑制剂Kaempferol或酰胺水解酶抑制剂Quercetin的Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF、Quercetin-INH-RIF-PZA、Kaempferol-INH-RIF-PZA实验组血清中转胺酶浓度则接近正常值。
表10对照组、INH-RIF组、KH-INH-RIF组、KM-INH-RIF组、KL-INH-RIF组、MH-INH-RIF组、MM-INH-RIF组及ML-INH-RIF组Total HAI score、天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD。
Data are shown as mean±SD.
＊p<0.05,＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.005:Study compare to control group.
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF及50/100/250mg/kg/dayINH/RIF/PZA的小鼠，其体内确实成功的产生肝毒性；相对的，在空白对照组小鼠体内的肝结构则较正常；相较于INH-RIF-PZA组，Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完整，空泡明显较少，发炎细胞亦较少。
在评估肝脏病理组织切片严重程度的HAI-score方面，小鼠在连续给予INH/RIF或INH/RIF/PZA 3周后，确实在Intralobular Degeneration and Focal Necrosis与Inflammation这两个项目得到积分，且在INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组中发现有Piecemeal necrosis，而Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组与INH/RIF控制组相比则有明显的改善(图16、图17)。
1.剩余肝功能的量测
INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋势；空白对照组与INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组小鼠的GSP值具有高度的显着差异(空白对照组小鼠的GSP值为177±22mg/L；给药3周后，INH-RIF及INH-RIF-PZA小鼠的GSP值各为866±339mg/L,p<0.001与858±172mg/L,p<0.001，此外，在Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠之GSP值为401±178mg/L、203±76mg/L、273±61mg/L、216±67mg/L，与INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组小鼠具有高度的显着差异(p<0.001)；显示施用INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组小鼠的GSP值明显增加；然而，并用Kaempferol或Quercetin的小鼠则可抵抗这种改变，空白对照组与Kaempferol或Quercetin实验组相比时，小鼠之间的GSP值无显着差异存在(图15)。
实施例7异烟碱酰胺(INH)及立复霉素(RIF)合并使用CYP2E1抑制剂山奈酚(Kaempferol)、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、蔗糖素、Dicalcium phosphate、交联聚乙烯吡咯烷酮的动物试验
一、材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，INH、RIF、Kaempferol、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、蔗糖素、Dicalcium phosphate、交联聚乙烯吡咯烷酮购自Sigma化学公司(St.Louis,MO USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
2.试验动物
体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美国)，引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
3.试验处理
试验动物随机分成13组，每组包括3种处理，第一种处理为口服Kaempferol1.67mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服Kaempferol 4.27mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服Kaempferol 8.33mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服甘露醇Mannitol0.17mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服甘露醇Mannitol 1.67mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服蔗糖素1.67mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；或为口服邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg+甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，或为口服Dicalcium phosphate 0.83mg/kg，或处理为口服交联聚乙烯吡咯烷酮2.83mg/kg，第二种处理为注射50mg/kg INH或INH的基剂(VEH1，即食盐水)，INH溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第三种处理为注射100mg/kg RIF或其基剂(VEH2，即食盐水)，RIF溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内。
上述5组试验共包含：
(1)对照组(normal control group,NC,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次VEH1、VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
(2)INH-RIF组(INH-RIF,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(3)KL-INH-RIF组(n＝8)：正常的小鼠每天口服一次Kaempferol 1.67mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(4)KM-INH-RIF组(n＝6)：正常的小鼠每天口服一次Kaempferol 4.17mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(5)KH-INH-RIF组(n＝6)：正常的小鼠每天口服一次Kaempferol 8.33mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(6)ML-INH-RIF组(n＝8)：正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.17mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(7)MM-INH-RIF组(n＝6)：正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(8)MH-INH-RIF组(n＝6)：正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 1.67mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(9)SA-INH-RIF组(n＝4)：正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(10)SU-INH-RIF组(n＝4)：正常的小鼠每天口服一次蔗糖素1.67mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(11)SAM-INH-RIF组(n＝4)：正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg+甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(12)D-INH-RIF组(n＝4)：正常的小鼠每天口服一次Dicalcium phosphate0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
(13)C-INH-RIF组(n＝4)：正常的小鼠每天口服一次交联聚乙烯吡咯烷酮2.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
4.血液样本
处理完毕后，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心10分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorftube)中并置于-80℃中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测(Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析；肝脏样本以10％磷酸缓冲液配制的福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石蜡(paraffin)中，以5μm厚度切片，切片样本以苏木精(hematoxylin)与伊红(eosin)染色，并进行肝糖染色试验(Periodic acid Schiff stain,PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液(cacodylate buffer,0.1M pH 7.4)清洗，以20％四氧化锇水溶液(aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂(Spurrresin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰(uranyl acetate)及柠檬酸铅(leadcitrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscope,Hitachi 600,Hitachi Co.,日本)观察。
7.肝功能的定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，小鼠接受在30秒内的快速眼窝注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of theSocial Science program(Version 13,SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P<0.05。
二、结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异；生化分析结果如表11所示，当小鼠以50/100mg/kg/day连续给予3周INH/RIF后，INH/RIF控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高于空白对照组(空白对照组血浆中的AST活性为80±13IU/L；INH/RIF控制组血浆中的AST活性为420±66IU/L,p<0.001；空白对照组血浆中的ALT活性为46±10IU/L；INH/RIF控制组血浆中的ALT活性为358±67IU/L,p<0.001)，显示INH/RIF的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤；同时给予CYP2E1抑制剂Kaempferol、甘露醇Mannitol各剂量实验组、血清中转胺酶浓度皆显着低于INH/RIF控制组。
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF的小鼠，其体内确实成功的产生肝毒性；相对的，在空白对照组小鼠体内的肝结构则较正常；相较于INH-RIF组，甘露醇Mannitol各剂量实验组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完整，空泡明显较少，发炎细胞亦较少(图18)。
在评估肝脏病理组织切片严重程度的HAI-score方面，小鼠在连续给予INH/RIF 3周后，Kaempferol、甘露醇Mannitol各剂量实验组与INH/RIF控制组相比则有明显的改善。
3.剩余肝功能的量测
INH-RIF控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋势；空白对照组与INH-RIF控制组小鼠的GSP值具有高度的显着差异(空白对照组小鼠3周的GSP值为192±18mg/L；给药3周后，INH-RIF小鼠的GSP值为666±126mg/L,p<0.001，然而，Kaempferol、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、蔗糖素、Dicalcium phosphate各剂量实验组的小鼠则可抵抗这种改变，其中空白对照组与KH-INH-RIF组、KM-INH-RIF组、MH-INH-RIF组、MM-INH-RIF组、SU-INH-RIF组相比时，小鼠之间的GSP值无显着差异存在(如表11)。
表11、为对照组、INH-RIF组、KH-INH-RIF组、KM-INH-RIF组、KL-INH-RIF组、MH-INH-RIF组、MM-INH-RIF组、ML-INH-RIF组、SA-INH-RIF组、SU-INH-RIF组、SAM-INH-RIF组、D-INH-RIF组及C-INH-RIF组小鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD。
Data are shown as mean±SD.
＊p<0.05,＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.005:Study compare to control group.
实施例8异烟碱酰胺(INH)及立复霉素(RIF)及丙基硫异烟酰胺(PZA)合并使用CYP2E1抑制剂甘露醇Mannitol的动物试验
一、材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司(Fairfield,OH,USA)，INH、RIF、PZA、甘露醇Mannitol购自Sigma化学公司(St.Louis,MO USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
2.试验动物
体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美国)，引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
3.试验处理
试验动物随机分成3组，每组包括4种处理，第一种处理为口服为口服甘露醇Mannitol 1.67mg/kg，以0.1ml/kg的体积给药；第二种处理为注射50mg/kg INH或INH的基剂(VEH1，即食盐水)，INH溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第三种处理为注射100mg/kg RIF或其基剂(VEH2，即食盐水)，RIF溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第四种处理为注射250mg/kgPZA或其基剂(VEH3，即食盐水)，PZA溶于食盐水(0.9％NaCl)中，以1ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内。
上述3组试验共包含：
(1)对照组(normal control group,NC,n＝10)：正常的小鼠每天注射1次VEH1、VEH2、VEH3(施行腹腔内注射)共21天；
(2)INH-RIF-PZA组(INH-RIF,n＝6)：正常的小鼠每天注射1次INH、RIF、PZA(施行腹腔内注射)共21天；
(3)M-INH-RIF-PZA组(n＝6)：正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 1.67mg/kg，注射1次INH、RIF、PZA(施行腹腔内注射)共21天。
4.血液样本
处理完毕后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管中，血浆(plasma)以13,000g于4℃离心10分钟，分离后的血浆分装到微量小管(Eppendorftube)中并置于-80℃中储存。
5.肝功能的定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，大鼠接受在30秒内的快速眼窝注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg；自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法(colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1,000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差(standard deviation)以及变异系数(coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10％CV；日间差异(day-to-day variation)则由比较校正曲线(calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖浓度。
6.统计分析
所有的数据皆以平均±标准偏差(SD)表示，试验结果以单因子变异数分析(ANOVA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of theSocial Science program(Version 13,SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较(post hoc test)最小差异显着性(least significant difference)方法做多重比较，以确认族群间的显着差异；族群平均的显着差异为P<0.05。
二、结果
1.剩余肝功能的量测
INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋势；空白对照组与INH-RIF-PZA控制组小鼠的GSP值具有高度的显着差异(空白对照组小鼠3周的GSP值为570±293mg/L；给药3周后，INH-RIF-PZA小鼠的GSP值为948±236mg/L,p<0.001，然而，甘露醇Mannitol实验组的小鼠则可抵抗这种改变(如表12)。
表12、为对照组、INH-RIF-PZA组、M-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean±SD。
Data are shown as mean±SD.
＊p<0.05,＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.005:Study compare to control group.
实施例9低副作用INH/RIF剂型于健康受试者体内对INH相关代谢酶的影响研究
一、材料与方法
1.试验处理
利用CYP2E1 phenoytping药物Chlorzoxazone 500mg与Rifamate(Isoniazid150mg/Rifampin 300mg)并服CYP2E1抑制剂甘露醇Mannitol 100mg，于健康受试者进行药动学比较研究。试验过程中，监测受试者血浆中Chlorzoxazone(CZX)及其代谢物的变化情形，并掌握ALT、AST及GSP值等生化值变化，进而评估健康受试者在有无并服CYP2E1抑制剂下，研究CYP2E1在健康受试者体内的活性变化情形。
2.试验分组
本试验全程于三军总医院临床研究中心执行，试验共有2次阶段性给药，每次试验间隔一周。第1次给药，口服给予国外原厂Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)与Chlorzoxazone(500mg)，第1次给药后一周，同一批受试者进行第2次给药，给予国外原厂Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)+甘露醇Mannitol(100mg)与Chlorzoxazone(500mg)。
3.评估及统计方法
受试者的试验数据及统计分析结果将会作一个整合性概述，药物动力学数据以平均值及标准差描述，试验中所得到的药动学参数及数据上的显着差异，将会以ONE WAYANOVA或其它更适切的统计分析方法进行分析。
二、结果
1.血液分析结果
已完成18人次临床试验，控制组(Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg)9人次与实验组(Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg+HUCHE033 180mg)9人次。结果显示，并用HUCHE033组，Chlorzoxazone原型药的药物动力学参数未有显着影响，但其经CYP2E1代谢的代谢物6-OH Chlorzoxazone的Cmax显着较低，其6-OH-Chlorzoxazone/Chlorzoxazone代谢比亦显着低于控制组(图19、图20及表13)。
表13 Chlorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone及其代谢物6-OH Chlorzoxazone于健康受试者的药物动力学参数，数值的计算为mean±SD
Data represent mean±S.D..▲p＜0.05,▲▲p＜0.01,▲▲▲p<0.005
＊Metabolic Ratio:AUCt6OH-CZX/AUCtCzX
上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，例如：异烟碱酰胺(INH)、细胞色素P450 2E1抑制剂、酰胺水解酶(amidase)抑制剂施用的浓度及比例，以及细胞色素P450 2E1抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂选用的种类等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种无/低副作用的抗结核病药物复方，其特征在于，包含：
(a)抗结核病药物，其是立复霉素、或丙基硫异烟碱酰胺、或乙酰胺醇、或前述任两种以上的组合；以及
(b)至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质，其特征在于，所述降低抗结核病药物副作用的物质选自于下列化合物所组成的群组：正二羟愈疮酸，所述正二羟愈疮酸的含量为17毫克至10克、(-)-表没食子儿茶素，所述(-)-表没食子儿茶素的含量为25毫克至10克、茵陈色原酮，所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10克、山奈酚，所述山奈酚的含量为16毫克至10克、根皮素，所述根皮素的含量为15毫克至10克、橙皮素，所述橙皮素的含量为17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、没食子酸，所述没食子酸的含量为9毫克至10克、异甘草素，所述异甘草素的含量为18毫克至10克、柚皮素，所述柚皮素的含量为9毫克至10克、二氢化槲皮素，所述二氢化槲皮素的含量为17毫克至10克、汉黄芩素，所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、原儿茶酸，所述原儿茶酸的含量为8毫克至10克、儿茶素，所述儿茶素的含量为16毫克至10克、β-奈黄酮，所述β-奈黄酮的含量为15毫克至10克、恩贝素，所述恩贝素的含量为16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反式肉桂酸的含量为8毫克至10克、表儿茶酚，所述表儿茶素的含量为16毫克至10克、根皮苷，所述根皮苷的含量为24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、大豆苷元，所述大豆苷元的含量为14毫克至10克、异牡荆素，所述异牡荆素的含量为24毫克至10克、β-香叶烯，所述β-香叶烯的含量为8毫克至10克、檞皮素，所述檞皮素的含量为0.9毫克至10克、(+)-柠檬烯，所述(+)-柠檬烯的含量为7毫克至10克、杨梅素，所述杨梅素的含量为17毫克至10克、檞皮，所述檞皮的含量为24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、桑叶素，所述桑叶素的含量为16毫克至10克、新橙皮苷，所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量为33毫克至10克、(-)-表没食子儿茶素，所述(-)-表没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、木犀草素，所述木犀草素的含量为16毫克至10克、金丝桃苷，所述金丝桃苷的含量为25毫克至10克、柽柳素，所述柽柳素的含量为17毫克至10克、黄芩素，所述黄芩素的含量为15毫克至10克、芸香素，所述芸香素的含量为15毫克至10克、黄芩，所述黄芩的含量为24毫克至10克、芹菜素，所述芹菜素的含量为15毫克至10克、(+)-表儿茶素，所述(+)-表儿茶素的含量为16毫克至10克、(-)-表儿茶素没食子酸酯，所述(-)-表儿茶素没食子酸酯的含量为24毫克至10克、牡荆素，所述牡荆素的含量为24毫克至10克、金雀异黄酮，所述金雀异黄酮的含量为15毫克至10克、异鼠李素，所述异鼠李素的含量为14毫克至10克、香叶木素，所述香叶木素的含量为33毫克至10克、葛根素，所述葛根素的含量为23毫克至10克、或伞形花内酯，所述伞形花内酯的含量为9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非瑟酮的含量为0.8毫克至10克。
2.如权利要求1所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方还加入药学上可接受的赋形剂。
3.如权利要求2所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、结合剂、崩解剂或润滑剂。
4.如权利要求1所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方的剂型为口服锭剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、芳香水剂、糖浆剂、醑剂、酏剂、酊剂、流浸膏剂、软膏、乳霜剂、糊剂、注射剂或栓剂。
5.一种无/低副作用的抗结核病药物复方，其特征在于，包含：
(a)抗结核病化合物，其是异烟碱酰胺合併选自于由立复霉素、丙基硫异烟碱酰胺以及乙酰胺醇所组成的群组；以及
(b)至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质，其特征在于，所述降低抗结核病药物副作用的物质选自于下列化合物所组成的群组：正二羟愈疮酸，所述正二羟愈疮酸的含量为17毫克至10克、(-)-表儿茶素没食子酸酯，所述(-)-表儿茶素没食子酸酯的含量为25毫克至10克、茵陈色原酮，所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10、山奈酚，所述山奈酚的含量为16毫克至10克、根皮素，所述根皮素的含量为15毫克至10克、橙皮素，所述橙皮素的含量为17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、没食子酸，所述没食子酸的含量为9毫克至10克、异甘草素，所述异甘草素的含量为18毫克至10克、柚皮素，所述柚皮素的含量为9毫克至10克、二氢化槲皮素，所述二氢化槲皮素的含量为17毫克至10克、汉黄芩素，所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、原儿茶酸，所述原儿茶酸的含量为8毫克至10克、儿茶素，所述儿茶素的含量为16毫克至10克、β-奈黄酮，所述β-奈黄酮的含量为15毫克至10克、恩贝素，所述恩贝素的含量为16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反式肉桂酸的含量为8毫克至10克、表儿茶素，所述表儿茶素的含量为16毫克至10克、根皮苷，所述根皮苷的含量为24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、大豆苷元，所述大豆苷元的含量为14毫克至10克、异牡荆素，所述异牡荆素的含量为24毫克至10克、β-香叶烯，所述β-香叶烯的含量为8毫克至10克、檞皮素，所述檞皮素的含量为0.9毫克至10克、(+)-柠檬烯，所述(+)-柠檬烯的含量为7毫克至10克、杨梅素，所述杨梅素的含量为17毫克至10克、檞皮，所述檞皮的含量为24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、桑叶素，所述桑叶素的含量为16毫克至10克、新橙皮苷，所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量为33毫克至10克、(-)-表没食子儿茶素，所述(-)-表没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、木犀草素，所述木犀草素的含量为16毫克至10克、金丝桃苷，所述金丝桃苷的含量为25毫克至10克、柽柳素，所述柽柳素的含量为17毫克至10克、黄芩素，所述黄芩素的含量为15毫克至10克、芸香素，所述芸香素的含量为15毫克至10克、黄芩，所述黄芩的含量为24毫克至10克、芹菜素，所述芹菜素的含量为15毫克至10克、(+)-表儿茶素，所述(+)-表儿茶素的含量为16毫克至10克、(-)-表儿茶素没食子酸酯，所述(-)-表儿茶素没食子酸酯的含量为24毫克至10克、牡荆素，所述牡荆素的含量为24毫克至10克、金雀异黄酮，所述金雀异黄酮的含量为15毫克至10克、异鼠李素，所述异鼠李素的含量为14毫克至10克、香叶木素，所述香叶木素的含量为33毫克至10克、葛根素，所述葛根素的含量为23毫克至10克、或伞形花内酯，所述伞形花内酯的含量为9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非瑟酮的含量为0.8毫克至10克。
6.如权利要求5所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方还加入药学上可接受的赋形剂。
7.如权利要求6所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、结合剂、崩解剂或润滑剂。
8.如权利要求5所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方的剂型为口服锭剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、芳香水剂、糖浆剂、醑剂、酏剂、酊剂、流浸膏剂、软膏、乳霜剂、糊剂、注射剂或栓剂。
9.一种化合物用於制备无/低副作用的抗结核病药物复方用途；
该抗结核病药物是立复霉素、或丙基硫异烟碱酰胺、或乙酰胺醇、或前述任两种以上的组合；
该化合物係选自于下列物质所组成的群组：正二羟愈疮酸、(-)-表没食子儿茶素、茵陈色原酮、山奈酚、根皮素、橙皮素、6-姜辣醇、没食子酸、异甘草素、柚皮素、二氢化槲皮素、汉黄芩素、原儿茶酸、儿茶素、β-奈黄酮、恩贝素、反式肉桂酸、表儿茶酚、根皮苷、反式肉桂醛、大豆苷元、异牡荆素、β-香叶烯、檞皮素、(+)-柠檬烯、杨梅素、檞皮、木犀草素-7-葡萄糖苷、桑叶素、新橙皮苷、橙皮苷、(-)-表没食子儿茶素、木犀草素、金丝桃苷、柽柳素、黄芩素、芸香素、黄芩、芹菜素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、牡荆素、金雀异黄酮、异鼠李素、香叶木素、葛根素、伞形花内酯、高良姜素、非瑟酮。
10.如权利要求9所述的用途；
该化合物的特征为，所述正二羟愈疮酸的含量为17毫克至10克、所述(-)-表没食子儿茶素的含量为25毫克至10克、所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10克、所述山奈酚的含量为16毫克至10克、所述根皮素的含量为15毫克至10克、所述橙皮素的含量为17毫克至10克、所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、所述没食子酸的含量为9毫克至10克、所述异甘草素的含量为18毫克至10克、所述柚皮素的含量为9毫克至10克、所述二氢化槲皮素的含量为17毫克至10克、所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、所述原儿茶酸的含量为8毫克至10克、所述儿茶素的含量为16毫克至10克、所述β-奈黄酮的含量为15毫克至10克、所述恩贝素的含量为16毫克至10克、所述反式肉桂酸的含量为8毫克至10克、所述表儿茶素的含量为16毫克至10克、所述根皮苷的含量为24毫克至10克、所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、所述大豆苷元的含量为14毫克至10克、所述异牡荆素的含量为24毫克至10克、所述β-香叶烯的含量为8毫克至10克、所述檞皮素的含量为0.9毫克至10克、(+)-柠檬烯，所述(+)-柠檬烯的含量为7毫克至10克、所述杨梅素的含量为17毫克至10克、所述檞皮的含量为24毫克至10克、所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、所述桑叶素的含量为16毫克至10克、所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、所述橙皮苷的含量为33毫克至10克、所述(-)-表没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、所述木犀草素的含量为16毫克至10克、所述金丝桃苷的含量为25毫克至10克、所述柽柳素的含量为17毫克至10克、所述黄芩素的含量为15毫克至10克、所述芸香素的含量为15毫克至10克、所述黄芩的含量为24毫克至10克、所述芹菜素的含量为15毫克至10克、所述(+)-表儿茶素的含量为16毫克至10克、所述(-)-表儿茶素没食子酸酯的含量为24毫克至10克、所述牡荆素的含量为24毫克至10克、所述金雀异黄酮的含量为15毫克至10克、所述异鼠李素的含量为14毫克至10克、所述香叶木素的含量为33毫克至10克、所述葛根素的含量为23毫克至10克、所述伞形花内酯的含量为9毫克至10克、所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、所述非瑟酮的含量为0.8毫克至10克。
CN201610140172.8A 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方 Pending CN105832738A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610140172.8A CN105832738A (zh) 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011800683192A CN103391781A (zh) 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方
CN201610140172.8A CN105832738A (zh) 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800683192A Division CN103391781A (zh) 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105832738A true CN105832738A (zh) 2016-08-10

Family

ID=56610228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610140172.8A Pending CN105832738A (zh) 2011-04-20 2011-04-20 无/低副作用的抗结核病药物复方

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105832738A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109060472A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 上海市农业科学院 一种适于荧光染色的草菇菌褶组织切片的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010009572A1 (zh) * 2008-07-23 2010-01-28 国防教育研究基金会 含异烟碱酰胺（isoniazid, inh）低副作用的新复方

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010009572A1 (zh) * 2008-07-23 2010-01-28 国防教育研究基金会 含异烟碱酰胺（isoniazid, inh）低副作用的新复方

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
楼航芳等: "利福平致大鼠肝损伤模型肝组织CYP2E1表达的动态观察", 《浙江中西医结合杂志》 *
薛洪源等: "黄芩苷对异烟肼和利福平肝损害小鼠的保护作用", 《解放军药学学报》 *
连小娟等: "水飞蓟宾胶囊预防抗结核药物性肝损害疗效观察", 《中国现代药物应用》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109060472A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 上海市农业科学院 一种适于荧光染色的草菇菌褶组织切片的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108465110A (zh) 无/低副作用的抗结核病药物复方
US8535735B2 (en) Identification of free-B-ring flavonoids as potent COX-2 inhibitors
US20040092458A1 (en) Identification of free-b-ring flavonoids as poten cox-2 inhibitors
JP5133064B2 (ja) ウリジン２リン酸（ｕｄｐ）−グルクロン酸転移酵素２ｂ（ｕｇｔ２ｂ）の抑制剤及び促進剤
CN102137671B (zh) 含异烟碱酰胺(isoniazid，INH)低副作用的新复方
WO2013049365A2 (en) Selective metabolic approach to increasing oral bioavailability of phenylephrine and other phenolic bioactives
Sandström et al. The absence of stereoselective P-glycoprotein-mediated transport of R/S-verapamil across the rat jejunum
Adam et al. Troxerutin protects the isolated perfused rat liver from a possible lipid peroxidation by coumarin
KR102017550B1 (ko) 간에 대한 부작용이 없는 신규의 아세트아미노펜 화합물 조성물
Li et al. The effects of Chuanxiong on the pharmacokinetics of warfarin in rats after biliary drainage
US7169763B2 (en) Cytochrome P450 3A inhibitors and enhancers
CN105832738A (zh) 无/低副作用的抗结核病药物复方
Sun et al. Studies on the acute toxicity, pharmacokinetics and pharmacodynamics of paliperidone derivatives–comparison to paliperidone and risperidone in mice and rats
TWI517848B (zh) 無／低副作用之抗結核病藥物新複方
Ford et al. The use of a systems approach to increase NAD+ in human participants
TWI299002B (zh)
CN116726034A (zh) 化合物作为sirt1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用
Cott Interaction of herbs with other medicines: The example of St John’s wort
CN109157506A (zh) 一种异烟肼口服液及其制备方法
Cott 8 Interaction of herbs with other medicines
Pradabsang Bioequivalence Study of a Generic Quetiapine (Ketipinor®) and the Innovator Preparation (Seroquel®) 200 mg Given Orally in Healthy Thai Male Volunteers
Cott The example of StJohn's wort
TW201707694A (zh) 一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Taiwan County, Taipei, China store new town 9 Lane 35 No. 3 Building

Applicant after: NATIONAL DEFENSE EDUCATION AND RESEARCH FOUNDATION

Address before: Taiwan County, Taipei, China store new town 9 Lane 35 No. 3 Building

Applicant before: National Defense Education and Research Foundation

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160810