CN116726034A - 化合物作为sirt1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用 - Google Patents
化合物作为sirt1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供一种化合物作为SIRT1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，具体包括一种化合物用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物的应用、一种化合物作为SIRT1激动剂的应用以及一种化合物用于制备SIRT1激动剂的应用，其中化合物是指Didymin。在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin能够作为SIRT1激动剂来改善代谢相关脂肪性肝病，有利于将Didymin用于制备SIRT1激动剂或制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种化合物作为SIRT1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物的应用。
背景技术
代谢相关脂肪性肝病(Metabolic Associated Fatty Liver Disease，MAFLD)是一种全球范围内普遍存在的慢性疾病，全球患病率达到24％，并随着全球肥胖率的增加而持续上升。它通常与生活方式、肥胖、高血压、糖尿病、高胆固醇和代谢综合征等因素相关，代谢相关因素在MAFLD的发展过程中起着重要作用，包括脂代谢紊乱、炎症和氧化应激、肠道菌群失调、胰岛素抵抗和糖代谢紊乱、以及遗传因素。代谢相关脂肪性肝病多数属于慢性进行性疾病，主要特征是肝脏中的脂肪积累(脂肪肝)，在早期往往无明显症状，但在进行肝功能检查时可能会出现轻度的异常。然而，如果不及时干预和治疗，可能会产生严重并发症。在一些患者中，代谢相关脂肪性肝病可能会进一步发展为肝炎，导致肝功能受损、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，代谢相关脂肪性肝病目前已成为全球肝硬化和肝细胞癌的主要原因。
目前，治疗代谢相关脂肪性肝病主要是通过改变生活方式和饮食习惯来减少肝脏脂肪积聚，并降低患者的体重、胆固醇和血糖水平。SIRT1(沉默信息调节因子1，silentinformation regulator1)为sirtuin蛋白家族的成员之一，SIRT1是一种重要的酶，在细胞内发挥着关键的调控作用，SIRT1通过调节蛋白质乙酰化修饰水平，参与众多生物学过程，在改善代谢相关脂肪性肝病中亦发挥重要的作用。
然而，由于代谢相关脂肪性肝病的病理生理机制复杂且不清楚，目前尚无批准用于治疗代谢相关脂肪性肝病的具体药物，一些中药虽然显示出由于代谢相关脂肪性肝病的治疗作用，但发挥作用的关键成分及其作用机制也不清晰。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种化合物作为SIRT1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用。
为此，本公开的第一方面提供一种化合物用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，所述化合物为Didymin。柑橘类水果的干皮(也称为陈皮)在历史上一直被用作治疗肝病的草药，Didymin是从柑橘类水果干皮中分离的生物活性膳食类黄酮苷，在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin能够改善代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)，为Didymin在代谢相关脂肪性肝病的应用提供了扎实的基础研究，有利于将Didymin用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物。
在本公开的第一方面所涉及的应用中，可选地，Didymin通过激活SIRT1来改善代谢相关脂肪性肝病。本公开研究和验证了药物的靶点和机制，在本公开中，Didymin能够通过激活SIRT1，促进SIRT1介导的生理效应，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在本公开的第一方面所涉及的应用中，可选地，Didymin通过激活SIRT1来增强线粒体的生物发生和功能以改善代谢相关脂肪性肝病。本公开研究和验证了药物的作用机制，在本公开中，Didymin能够通过激活SIRT1，来增强肝细胞的线粒体的数量与功能，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在本公开的第一方面所涉及的应用中，可选地，Didymin通过激活SIRT1来平衡细胞凋亡和脂质吞噬以改善代谢相关脂肪性肝病。本公开研究和验证了药物的作用机制，在本公开中，Didymin能够通过激活SIRT1，来平衡肝细胞的脂质吞噬功能和细胞凋亡，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在本公开的第一方面所涉及的应用中，可选地，所述药物为包括Didymin的药物组合物，所述药物组合物是指Didymin与药学上允许的辅料构成的药物组合物。
在本公开的第一方面所涉及的应用中，可选地，所述辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、助溶剂、缓控释剂、香味剂和甜味剂中的至少一种。由此，能够有利于提高药物组合物的性能，使药物组合物更满足临床需求。
本公开的第二方面提供一种化合物作为SIRT1激动剂的应用，所述化合物为Didymin。在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin对SIRT1的激活作用，为Didymin作为SIRT1激动剂的应用提供了扎实的基础研究，有利于将Didymin用于制备SIRT1激动剂。
在本公开的第二方面所涉及的应用中，可选地，Didymin作为SIRT1激动剂用于改善代谢相关脂肪性肝病。由此，有利于将Didymin作为SIRT1激动剂以改善代谢相关脂肪性肝病。
本公开的第三方面提供一种化合物用于制备SIRT1激动剂的应用，所述化合物为Didymin。在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin对SIRT1的激活作用，为Didymin用于制备SIRT1激动剂的应用提供了扎实的基础研究。
在本公开的第三方面所涉及的应用中，可选地，所述SIRT1激动剂用于改善代谢相关脂肪性肝病。由此，有利于将Didymin用于制备SIRT1激动剂以改善代谢相关脂肪性肝病。
根据本公开，能够提供一种化合物作为SIRT1激动剂及用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用。
附图说明
图1是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型培养基中甘油三酯(TG)含量图。
图2是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中的肝细胞脂滴图。
图3是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞油红O染色结果图。
图4是示出了本公开实施例所涉及的Didymin干预后的细胞差异表达基因散点图。
图5是示出了本公开实施例所涉及的kegg通路分析富集气泡图。
图6是示出了本公开实施例所涉及的go_p分析富集气泡图。
图7是示出了本公开实施例所涉及的SIRT1蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。
图8是示出了本公开实施例所涉及的Didymin与SIRT1的虚拟对接分析结果图。
图9是示出了本公开实施例所涉及的Didymin与SIRT1的MST实验结果图。
图10是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型裂解液中Sirtuin1去乙酰化酶活性检测结果图。
图11是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中线粒体含量检测结果图。
图12是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型的线粒体标记物免疫蛋白印迹分析结果图。
图13是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中脂噬相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。
图14是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型的TUNEL法检测结果图。
图15是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的体重变化图。
图16是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏重量变化图。
图17是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的血清甘油三酯检测结果图。
图18是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏细胞中SIRT1相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。
图19是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞透射电镜图。
图20是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞透射电镜图。
图21是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏细胞中细胞凋亡相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本公开的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本公开，而不能解释为对本公开的限制。
本领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于理解本公开，下面结合附图以具体实施例对本公开作进一步解释说明，且具体实施例并不构成对本公开实施例的限定。本领域技术人员应该理解，附图只是实施例的示意图，附图中的部件并不一定是实施本公开所必须的。
本公开涉及下述任一种应用：
一种化合物用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用；
一种化合物作为SIRT1激动剂的应用；
一种化合物用于制备SIRT1激动剂的应用。
在本公开所涉及的上述应用中，化合物可以是指Didymin。Didymin的化学式为C28H34O14，CAS编号为14259-47-3，Didymin是一种天然的黄酮类化合物，属于橙皮类黄酮(flavanones)的一种，通常存在于柑橘类水果的皮中，如柚子、橙子和柠檬。Didymin有许多潜在的药理作用和健康益处，但目前仍需要进一步的研究来确认其作用机制和在不同疾病中的应用前景。在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin对SIRT1的激活作用、以及Didymin对代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)的治疗效果，为Didymin在代谢相关脂肪性肝病的应用提供了扎实的基础研究，有利于将Didymin用于改善代谢相关脂肪性肝病。
在一些示例中，Didymin可以用于改善代谢相关脂肪性肝病。
在一些示例中，Didymin可以用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物。
在一些示例中，Didymin可以通过激活SIRT1来改善代谢相关脂肪性肝病。本实施方式研究和验证了药物的靶点和机制，发现Didymin作为SIRT1的激动剂使SIRT1激活来改善代谢相关脂肪性肝病。SIRT1(Sirtuin 1)是一种重要的酶，属于Sirtuin家族，在细胞内发挥着关键的调控作用，SIRT1通过调节蛋白质乙酰化修饰水平，参与众多生物学过程(如能量代谢、细胞衰老、DNA修复、炎症反应和细胞凋亡等)，在本实施方式中，Didymin能够通过激活SIRT1，促进SIRT1介导的生理效应，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在一些示例中，Didymin可以通过激活SIRT1来增强线粒体的生物发生和功能以改善代谢相关脂肪性肝病。本实施方式研究和验证了药物的靶点和机制，Didymin能够通过激活SIRT1，来增强肝细胞的线粒体的数量与功能，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在一些示例中，Didymin可以通过激活SIRT1来平衡细胞凋亡和脂质吞噬以改善代谢相关脂肪性肝病。本实施方式研究和验证了药物的靶点和机制，Didymin能够通过激活SIRT1，来平衡肝细胞的脂质吞噬功能和细胞凋亡，从而改善代谢相关脂肪性肝病。
在一些示例中，改善代谢相关脂肪性肝病的药物可以是药物组合物。在一些示例中，药物组合物可以包括Didymin和药学上允许的辅料。药用辅料系指生产药品和调配处方时使用的、除活性成分以外的、在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。
在一些示例中，Didymin可以从柑橘类果皮中提取得到。例如，可以通过有机溶剂萃取法对从柑橘类果皮中提取得到Didymin。在一些示例中，Didymin也可以从市售的相关产品中获取得到。
在一些示例中，辅料可以为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、助溶剂、缓控释剂、香味剂和甜味剂中的至少一种。由此，能够通过辅料起到稀释活性成分、赋形、粘合、填充、助溶、缓释、增香或增甜的作用，能够有利于提高药物组合物的性能，使药物组合物更易于满足临床需求。
在一些示例中，改善代谢相关脂肪性肝病的药物的给药方式可以是口服。由此，有利于药物的吸收与代谢。在另一些示例中，也可以是其他给药方式，例如静脉注射。可以根据临床实际需求选择给药方式。
在一些示例中，药物组合物的剂型可以是胶囊剂、混悬剂、片剂、粉剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂中的至少一种。由此，能够便于根据实际需要选择不同的剂型。
在一些示例中，Didymin可以用作SIRT1激动剂。SIRT1激动剂是指能够激活或增加SIRT1酶活性的化合物或物质。本实施方式研究和验证了Didymin能够通过激活SIRT1，促进SIRT1介导的生理效应，因此Didymin可以用作SIRT1激动剂，能够有利于后续将Didymin来应用于SIRT1通路相关疾病。
在一些示例中，SIRT1激动剂能够改善和抑制代谢相关脂肪肝病。换言之，Didymin用作SIRT1激动剂能够改善和抑制代谢相关脂肪肝病。
在一些示例中，Didymin可以用于制备SIRT1激动剂。本实施方式研究和验证了Didymin能够通过激活SIRT1，因而有利于后续应用Didymin来制备SIRT1激动剂，从而有利于Didymin应用于SIRT1通路相关疾病，例如代谢相关脂肪肝病。
在本公开中，通过细胞和动物模型验证了Didymin能够改善代谢相关脂肪性肝病，且验证了Didymin通过激活SIRT1来改善和抑制代谢相关脂肪性肝病，为Didymin在代谢相关脂肪性肝病的应用提供了扎实的基础研究，有利于实现将Didymin用于制备代谢相关脂肪性肝病的药物。
下面，结合实施例进一步对本公开所涉及的上述应用进行详细的解释，但是不应把它们理解为对本公开保护范围的限定。
[实施例]
在本实施例中，如无特别说明，所使用的材料、试剂、仪器和软件均为普通市售获得，操作流程按照试剂、仪器或软件的说明书进行。
在本实施例中，生物三次重复实验的数据以平均±标准差表示，两组数据的比较采用双尾非配对的学生t检验，采用一组方差分析法比较多组数据，P值小于0.05为有显著性差异。
构建细胞模型和动物模型：
1、细胞模型：
利用棕榈酸(palmitic acid，PA)模拟体外脂毒性环境，建立MAFLD细胞模型，具体而言：采用AML12细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD，USA))，AML12细胞是一种小鼠肝脏细胞系，将AML12细胞系在添加有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素溶液、40ng/ml地塞米松和ITS(10μg/ml胰岛素，5.5μg/mL转铁蛋白，6.7μg/l亚硒酸钠)的培养基中、在37℃含5％CO2的条件下培养。
随后，采用PA(0.5mM)对细胞进行刺激，处理AML12细胞24小时，得到高脂细胞模型，也称为PA组。此外，还设置以下各组进行实验：
(1)对照组(Control组)：不使用Didymin及不使用PA去处理AML12细胞24小时；
(2)Didymin组：使用Didymin(50μM)处理AML12细胞24小时；
(3)PA+Didymin组：同时用PA(0.5mM)和Didymin(50μM)处理AML12细胞24小时；
(4)PA+EX-527组：同时用PA(0.5mM)和EX-527(10μM)处理AML12细胞24小时；其中EX-527是一种SIRT1抑制剂。
(5)PA+Didymin+EX-527组：同时用PA(0.5mM)、Didymin(50μM)和EX-527(10μM)处理AML12细胞24小时。
2、动物模型：
采用4周龄的雄性C57BL/6J小鼠(4周龄，购自中国北京SPF生物技术有限公司)，适应1周后被随机分为6组。实验设计如下：
(1)对照组(Control组，也可以简称为ctrl)：给予正常饮食(12％脂肪，20.6％蛋白质，67.4％碳水化合物)20周，最后三周每日腹腔注射10％二甲亚砜(DMSO)+90％玉米油；
(2)对照+Didymin组：正常饮食治疗20周，最后三周每日腹腔注射Didymin(0.8mg/kg，溶于10％DMSO+90％玉米油)；
(3)高脂饮食(HFD)组：给予高脂饮食(60％脂肪，20％碳水化合物和20％蛋白质)20周，最后三周每日腹腔注射10％DMSO+90％玉米油；
(4)HFD+Didymin组：给予高脂饮食20周，最后三周每日腹腔注射Didymin 0.8mg/kg；
(5)HFD+EX-527组：给予高脂饮食20周，后三周每两天腹腔注射EX-527(5mg/kg，溶于10％DMSO+90％玉米油)；
(6)HFD+Didymin+EX-527组：高脂饮食治疗20周，后三周每日腹腔注射Didymin0.8mg/kg，每两天腹腔注射一次EX-527(5mg/kg，溶于10％DMSO+90％玉米油)。
结果：
1、Didymin抑制高脂诱导的肝细胞脂质沉积
检测细胞模型的培养基中的甘油三酯水平，图1是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型培养基中甘油三酯(TG)含量图。如图1所示，在添加有PA的AML12细胞培养基中显示出明显的脂质积累，而添加Didymin处理可降低AML12细胞培养基中的脂质积累。
对AML12细胞进行脂滴(LDs)观察，图2是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中的肝细胞脂滴图，其中标尺为20μm。如图2所示，在添加有PA的AML12细胞中脂滴显著增加，而添加有Didymin的AML12细胞的脂滴显著减少。
通过油红O实验对小鼠模型的肝细胞进行染色，图3是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞油红O染色结果图，其中标尺为50μm。如图3所示，显示高脂饮食诱导的小鼠模型的肝细胞中脂质含量增高，而添加Didymin干预对于小鼠模型的肝细胞中的脂质沉积具有积极的治疗作用。
综上，Didymin在体内及体外均能抑制高脂诱导的肝细胞脂质沉积。
2、Didymin通过激活SIRT1抑制高脂诱导的细胞模型的脂质沉积(1)Didymin通过激活SIRT1保护AML12细胞免受PA诱导的脂质沉积
收集各细胞模型培养基并提取RNA(Trizo试剂盒)进行RNA测序(文库构建和测序均由深圳华大基因有限公司进行)，结果共鉴定出977个差异表达基因(DEG)，图4是示出了本公开实施例所涉及的Didymin干预后的细胞差异表达基因散点图。如图4所示，与PA组相比，PA+Didymin组中有298个基因上调和679个基因被下调。
图5是示出了本公开实施例所涉及的kegg通路分析富集气泡图，图6是示出了本公开实施例所涉及的go_p分析富集气泡图。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)通路分析显示自噬、线粒体功能和凋亡相关基因富集(如图5所示)，GO-P(GOProcess)分析也显示与凋亡和自噬过程相关的基因被富集(如图6所示)。据目前研究可知，NAD+依赖的去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)是连接这些过程的关键蛋白。而转录组测序也显示，与PA组相比，PA+Didymin组中SIRT1的表达是上调的(如图4所示)。
图7是示出了本公开实施例所涉及的SIRT1免疫蛋白印迹分析结果图。对各细胞模型进行免疫蛋白印迹(western blot)分析，显示PA组的细胞模型中SIRT1水平降低，而添加Didymin处理(PA+Didymin组)能够抑制SIRT1水平的降低，但Didymin处理对于正常AML12细胞中SIRT1的表达没有影响(如图7所示)。
对Didymin和SIRT1蛋白进行虚拟对接分析(Virtual docking analysis)，用于预测两者的结合模式及结合能力。图8是示出了本公开实施例所涉及的Didymin与SIRT1的虚拟对接分析结果图，显示配合物的结合能为-78.509232千卡/摩尔，交互位点由Ala262、Ser265、Val266、Gly269、Ile270、Phe273、Arg274、Ser275、Ile347和Asp348组成(如图8所示)。还进行了MST实验(微尺度热法(Microscale Thermophoresis，MST))，来验证Didymin是否与SIRT1相互作用。图9是示出了本公开实施例所涉及的Didymin与SIRT1的MST实验结果图，结果显示解离常数(Kd值)为0.14683μM(如图9所示)。这些结果表明，Didymin可以与SIRT1结合，也即Didymin直接靶向SIRT1。
此外，对PA+Didymin处理的细胞模型的细胞裂解液进行了Sirtuin1去乙酰化酶活性检测(荧光法SIRT1检测试剂盒(Abcam，ab156065)，在激发波长为355nm，发射波长为450nm时监测荧光强度)，以验证Didymin是否影响SIRT1去乙酰化酶活性。图10是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型裂解液中Sirtuin1去乙酰化酶活性检测结果图，如图10所示，PA抑制SIRT1去乙酰化酶活性，而Didymin剂量依赖性地增加了PA处理的AML12细胞中SIRT1去乙酰化酶活性。
因此，Didymin通过激活SIRT1保护AML12细胞免受PA诱导的脂质沉积。
SIRT1在体内也是自噬的重要调节因子，它促进FoxO3a的去乙酰化，从而增加FoxO3a介导的自噬蛋白(Atg)基因的转录。PGC-1α是SIRT1的去乙酰化底物之一，而去乙酰化的PGC-1α是的生物激活形式，PGC-1α可以促进线粒体的增殖，通过活化线粒体生物合成相关基因的表达，提高线粒体数量，PGC-1α还能通过激活转录因子，促进多个线粒体相关基因的表达。因而Didymin通过SIRT1-FoxO3a通路和SIRT1-PGC-1α通路保护AML12细胞免受PA诱导的脂质沉积，其中，SIRT1通过FoxO3a改善自噬，通过GC-1α改善线粒体功能。
(2)Didymin通过激活PA处理的AML12细胞中的SIRT1来增强线粒体的生物发生和功能
现有的研究显示高脂饮食诱导的MAFLD通常伴有线粒体丢失和功能障碍。图11是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中线粒体含量检测结果图，通过MitoTrackerGreen染色法对AML12细胞进行染色，用于可视化线粒体的分布和形态，具体而言，使用线粒体追踪器绿色探针(Beyotime，C1048)对细胞进行线粒体标记，然后，对标记的活细胞进行共聚焦成像，以确定线粒体的数量。结果如图11所示，PA处理的AML12细胞线粒体含量明显下降，Didymin处理可以提高线粒体含量，但Didymin和EX-527(SIRT1抑制剂)共同处理时线粒体含量极低。图12是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型的线粒体标记物免疫蛋白印迹分析结果图，通过免疫组化分析显示，相较于PA处理的AML12细胞，添加Didymin处理能够提高线粒体标记物的表达，包括线粒体生物发生标记物NRF1(Nuclear RespiratoryFactor 1，核呼吸因子1)和TFAM(Mitochondrial Transcription Factor A，线粒体转录因子A)和线粒体电子传递链(ETC)的标记物NDUFB8、SDHB、MTCO2(如图12所示)。
综上，Didymin可以通过激活SIRT1来增强PA处理后的AML12细胞的线粒体含量和功能。
(2)Didymin通过激活PA处理的AML12细胞中的SIRT1来平衡细胞凋亡和脂质吞噬
现有的研究显示高脂饮食引起的脂肪毒性损害脂肪吞噬过程，加速脂质积累，而自噬是脂滴分解的一个重要过程(也称为脂噬)，凋亡和自噬信号通路与肝细胞有关，而自噬的损伤与细胞损伤和细胞死亡的积累有关。
为了确定Didymin在脂噬调控中的作用，对脂噬相关蛋白的表达水平进行了研究，脂噬相关蛋白包括微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin1(自噬素1，也称为ATG6)、p62(载体蛋白P62，也称为SQSTM1)和ATG5(人自噬相关蛋白5)，以及溶酶体膜蛋白PLIN2和LAMP1的表达水平进行了研究。其中，LC3可以通过共价连接到磷脂分子上，形成LC3-Ⅰ，然后在自噬活动开始时转化为LC3-II，，LC3-II的存在可以指示细胞自噬过程的进行，并且其水平通常与自噬活动的程度相关。图13是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型中脂噬相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图，结果如图13所示，与对照组相比，PA处理抑制了脂噬作用，表现为LC3-II/LC3-I比值和Beclin1表达降低，p62表达升高。这些结果表明，Didymin通过激活PA处理的AML12细胞中的SIRT1来增强脂质吞噬。
TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)法是一种常用的DNA断裂检测方法，用于检测细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发生。图14是示出了本公开实施例所涉及的细胞模型的TUNEL法检测结果图，其中标尺为100μm。TUNEL法检测结果如图14所示，PA处理后凋亡细胞数量明显增加，再添加Didymin处理后凋亡细胞数量下调，而Didymin和EX-527(SIRT1抑制剂)共处理后凋亡细胞数量的下调被逆转。因此，Didymin可以通过激活SIRT1来抑制PA刺激的AML12细胞的凋亡。
3、Didymin通过激活SIRT1保护小鼠免受高脂肪饮食诱导的MAFLD的影响
图15是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的体重变化图，图16是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏重量变化图。如图15和图16所示，Didymin处理后的MAFLD小鼠的体重和肝脏重量下降，而Didymin和EX-527(SIRT1抑制剂)共处理的MAFLD小鼠的体重和肝脏重量与对照组类似。
图17是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的血清甘油三酯检测结果图。如图17所示，Didymin处理后的MAFLD小鼠的血清甘油三酯(TG)含量下降。
图18是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏细胞中SIRT1相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。如图18所示，MAFLD小鼠肝脏中SIRT1、PGC-1α和FoxO3a的表达明显降低，Didymin处理完全逆转这个现象，而EX-527共同处理则消除了Didymin的作用。
图19是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞透射电镜图，标尺为1.2μm。通过透射电子显微镜(TEM)分析法对小鼠的肝细胞的超微结构进行观察，具体而言，肝组织用2.5％戊二醛固定。随后，样品用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤2次，洗涤30分钟，然后用1％的OSO4(二氧化锇)固定2小时，然后用50％、70％、80％和90％的乙醇脱水。将样品用环氧树脂混合物包埋，用超微切片机切割嵌块。结果如图19所示，肝细胞透射电镜观察显示MAFLD小鼠肝细胞线粒体膨胀，基质变浅，线粒体嵴变短甚至消失，Didymin处理完全逆转了线粒体结构的破坏，但EX-527共同处理则消除了Didymin的作用。
图20是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝细胞透射电镜图，标尺为0.6μm。通过透射电子显微镜(TEM)分析法对小鼠的肝细胞的超微结构进行观察，结果图20所示，显示Didymin处理增加了MAFLD小鼠肝细胞的自噬溶酶体数量，但EX-527共同处理消除了Didymin的作用。
图21是示出了本公开实施例所涉及的小鼠模型的肝脏细胞中细胞凋亡相关蛋白免疫蛋白印迹分析结果图。如图21所示，Didymin处理降低了PARP/PARP、半胱天冬酶3/半胱天冬酶3和Bax/Bcl-2的比值，从而抑制细胞凋亡。
根据上述实验结果可知，Didymin可以通过SIRT1途径保护小鼠免受高脂肪诱导的代谢相关脂肪肝病，促进线粒体生物发生和功能，增强脂吞噬，抑制细胞凋亡。
综上所述，Didymin能够提高SIRT1的表达水平，同时直接结合并激活SIRT1，来改善代谢相关脂肪肝病。具体而言，Didymin能够通过激活SIRT1来增强线粒体的生物发生和功能、抑制细胞凋亡、增强脂质吞噬，以改善代谢相关脂肪性肝病。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (10)
1.一种化合物用于制备改善代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，其特征在于，所述化合物为Didymin。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Didymin通过激活SIRT1来改善代谢相关脂肪性肝病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，Didymin通过激活SIRT1来增强线粒体的生物发生和功能以改善代谢相关脂肪性肝病。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，Didymin通过激活SIRT1来平衡细胞凋亡和脂质吞噬以改善代谢相关脂肪性肝病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为包括Didymin的药物组合物，所述药物组合物是指Didymin与药学上允许的辅料构成的药物组合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、助溶剂、缓控释剂、香味剂和甜味剂中的至少一种。
7.一种化合物作为SIRT1激动剂的应用，其特征在于，所述化合物为Didymin。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，Didymin作为SIRT1激动剂用于改善代谢相关脂肪性肝病。
9.一种化合物用于制备SIRT1激动剂的应用，其特征在于，所述化合物为Didymin。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SIRT1激动剂用于改善代谢相关脂肪性肝病。
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| ZHONGWEN FENG ET AL: "Didymin ameliorates dexamethasone-induced non-alcoholic fatty liver disease by inhibiting TLR4/NF-κB and PI3K/Akt pathways in C57BL/6J mice", 《INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》, vol. 88, pages 1 - 2 * |
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