CN102135527A

CN102135527A - 利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法

Info

Publication number: CN102135527A
Application number: CN 201010617661
Authority: CN
Inventors: 陈立钢; 王霆; 佟佳
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102135527B

Abstract

利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，涉及一种检测土壤中抗生素残留的方法。本发明要解决目前检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理过程复杂，费时，选择性低的问题。方法：一、制备分子印迹聚合物；二、将土壤样品与分子印迹聚合物研磨，混合均匀；三、把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入萃取柱内，用淋洗剂淋洗；四、沥干，洗脱，得到洗脱液；五、用氮气将洗脱液吹干，得到残渣；六、溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测。本发明简化了检测中前处理的步骤，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，并且大大提高了检测分析方法的选择性。应用于抗生素残留检测领域。

Description

利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法

技术领域

本发明涉及一种检测土壤中抗生素残留的方法。

背景技术

抗生素是世界上用量最大、使用最广泛的药物之一。我国每年有成千上万吨的抗生素类药物被用于畜禽养殖业和人的医疗中。然而，大部分抗生素不能完全被机体吸收，有高达85％以上抗生素以原形或代谢物形式经由病人和畜禽粪尿排入环境，经不同途径对环境造成污染。土壤是抗生素重要的归属场所，虽然抗生素在环境中存在浓度极低，但其对环境的影响不容忽视。抗生素及其代谢产物在土壤中能维持很长时间的活性，对土壤中的微生物、植物、动物均产生不同程度的影响。因此，我们要对土壤中的抗生素残留进行监测。然而，土壤样品非常复杂，里面抗生素的含量往往又很低，因此，在仪器检测之前，样品前处理是极为重要的步骤。传统的检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理大多需要多次操作，需要消耗大量有机溶剂，花费大量时间，而且选择性较低。

分子印迹技术是从仿生角度，采用人工方法制备对特定分子具有特异性结合作用和特定空间结构空穴的聚合物——分子印迹聚合物。近年来，材料科学和分离技术两大领域的研究发展大大推动了分子印迹技术的发展。由于分子印迹聚合物具有构象预定性、特异识别性、长期稳定性及实施简便性等优点，在分离提纯、免疫分析、以及生物模拟传感器等许多方面显示出广泛的应用前景。

基质固相分散是一种新的萃取净化技术，其优点在于：依靠机械剪切力和分散剂的去垢效应及巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，简化了传统检测方法中前处理的过程，避免了样品匀浆、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物损失，提高了净化效率。然而，常用的基质固相分散技术所用的分散剂为硅胶、氧化铝、C18、佛罗里硅等，缺乏选择性。

发明内容

本发明要解决目前检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理过程复杂，费时，选择性低的问题，提供利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法。

本发明利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行：一、制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；二、将土壤样品与步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨5～20min，混合均匀，土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1∶1～4；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用淋洗剂以1～2mL/min的流速淋洗，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为1g∶5～20mL；四、然后沥干，用洗脱剂以1～2mL/min的流速洗脱，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为1g∶5～20mL，得到洗脱液；五、在30～50℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1.0mL的溶剂溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测；其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂总体积的10％～50％；步骤四中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的1％～5％；步骤六中的溶剂为甲醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇或乙腈中的任意一种占溶剂总体积的20％～60％。

本发明以选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物作为基质固相分散技术中的分散剂，并将基质固相分散技术用于检测土壤中抗生素残留，简化了检测中前处理的步骤，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，并且大大提高了检测分析方法的选择性。使用本发明的方法，经检测抗生素在土壤中的加标回收率为70％～95％，精密度(RSD)小于15％，抗生素在土壤中的检出限为2～10ng·g^-1。

附图说明

图1为青霉素V与具体实施方式十一步骤一制备的分子印迹聚合物的结合等温线图；图2为评价青霉素V与具体实施方式十一步骤一制备的分子印迹聚合物结合性质的Scatchard曲线图；图3为具体实施方式十一得到的液相色谱串联质谱图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行：一、制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；二、将土壤样品与步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨5～20min，混合均匀，土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1∶1～4；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用淋洗剂以1～2mL/min的流速淋洗，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为1g∶5～20mL；四、然后沥干，用洗脱剂以1～2mL/min的流速洗脱，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为1g∶5～20mL，得到洗脱液；五、在30～50℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1.0mL的溶剂溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测；其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂总体积的10％～50％；步骤四中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的1％～5％；步骤六中的溶剂为甲醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇或乙腈中的任意一种占溶剂总体积的20％～60％。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物的具体步骤为：a、将抗生素作为模板分子与溶剂以及功能单体混合，搅拌30～120min，得到预组装溶液，抗生素与功能单体的摩尔比为1∶4～10，抗生素的质量与溶剂的体积比为1g∶10～80mL；b、然后向预组装溶液中加入交联剂和引发剂，混匀，预组装溶液中的抗生素与交联剂的摩尔比为1∶10～30，引发剂的质量与预组装溶液中溶剂的体积比为1g∶100～500mL；c、然后超声处理5～20min，再冲入氮气除氧5～20min，然后密封，置于40～70℃环境下加热12～36h，得产物；d、然后将产物研磨，置于索氏提取器中，用洗脱剂反复洗脱，至洗脱液经紫外光谱或色谱检测后无抗生素为止，然后于60～90℃干燥至恒重，即得到选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；其中步骤a中的溶剂为去离子水、甲醇、乙醇或乙腈，步骤a中的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶或丙烯酰胺，步骤b中的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，步骤b中的引发剂为偶氮二异丁腈，步骤d中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的20％～25％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中研磨10～15min。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1∶2～3。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中用淋洗剂以1mL/min的流速淋洗。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为1g∶10～15mL。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中用洗脱剂以1mL/min的流速洗脱。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为1g∶10～15mL。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中在40℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行：一、制备选择性吸附金霉素的分子印迹聚合物：将1mmol金霉素作为模板分子与10mL乙醇以及10mmol甲基丙烯酸混合，搅拌30min，得到预组装溶液；然后向预组装溶液中加入26mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.06g偶氮二异丁腈，混匀；然后超声处理15min，再冲入氮气除氧10min，然后密封，置于60℃环境下加热24h，得产物；然后将产物研磨，置于索氏提取器中，用25％(体积)醋酸的甲醇溶液反复洗脱，至洗脱液经色谱检测后无金霉素为止，然后于70℃干燥至恒重，即得到选择性吸附金霉素的分子印迹聚合物；二、将0.2g土壤样品与0.5g步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨10min，混合均匀；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用8mL的20％(体积)的甲醇水溶液以1mL/min的流速淋洗；四、然后沥干，用8mL的3％(体积)醋酸的甲醇溶液以1mL/min的流速洗脱，得到洗脱液；五、在40℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1.0mL的25％(体积)的甲醇水溶液溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测。

本实施方式得到的金霉素在土壤中的加标回收率为82.4％～91.9％，精密度(RSD)小于10.4％，测定的线性范围为15～1500ng·g^-1，金霉素在土壤中的检出限为4.1ng·g^-1。

具体实施方式十一：本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行：一、制备选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物：将1mmol青霉素V作为模板分子与8mL乙醇以及8mmol甲基丙烯酸混合，搅拌30min，得到预组装溶液；然后向预组装溶液中加入20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.05g偶氮二异丁腈，混匀；然后超声处理10min，再冲入氮气除氧10min，然后密封，置于60℃环境下加热24h，得产物；然后将产物研磨，置于索氏提取器中，用20％(体积)醋酸的甲醇溶液反复洗脱，至洗脱液经色谱检测后无青霉素V为止，然后于60℃干燥至恒重，即得到选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物；二、将0.5g土壤样品与1g步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨10min，混合均匀；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用10mL的10％(体积)的甲醇水溶液以1mL/min的流速淋洗；四、然后沥干，用10mL的5％(体积)醋酸的甲醇溶液以1mL/min的流速洗脱，得到洗脱液；五、在40℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1.0mL的20％(体积)的甲醇水溶液溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测。

本实施方式得到的青霉素V在土壤中的加标回收率为79.2％～89.7％，精密度(RSD)小于8.2％，测定的线性范围为20～2000ng·g^-1，青霉素V在土壤中的检出限为5.5ng·g^-1。

图1为青霉素V与本实施方式步骤一制备的分子印迹聚合物的结合等温线图，纵坐标中Q为结合到分子印迹聚合物上的青霉素V的量。由图1可知，随着青霉素V初始浓度的增加，所制备的分子印迹聚合物对青霉素V的吸附量也逐渐增大，说明分子印迹聚合物对青霉素V具有很强的选择性吸附作用。

图2为评价青霉素V(PENV)与本实施方式步骤一制备的选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物结合性质的Scatchard曲线图。由图2中的Scatchard曲线可知，Q/[PENV]对Q明显是非线性关系，表明该分子印迹聚合物对青霉素V的结合位点并不是等价的，但是，在图的两端分别有较好的线性关系，这表明在所研究的青霉素V浓度范围内，所制备的分子印迹聚合物主要存在两类不同的结合位点，即高亲和力结合点和低亲和力结合点。根据公式(Q/[PENV])＝(Q_max-Q)/K_d(其中Q为结合到选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物上的PENV的量，[PENV]为青霉素V在吸附溶液中的平衡浓度，K_d为结合位点的离解常数，Q_max为最大表观结合量)，可以得到K_d1＝461.0μmol·L^-1，Q_max1＝47.0μmol·g^-1；K_d2＝2330μmol·L^-1，Q_max2＝125.2μmol·g^-1。由此结果可知，分子印迹聚合物对青霉素V的吸附量很大。

图3为本实施方式得到的液相色谱串联质谱图。由图3可知，在测定过程中，没有产生任何干扰，说明本发明的检测方法抗干扰能力强。并且测定谱图的基线平稳，充分说明了本发明的方法选择性很高。

Claims

1.利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行：一、制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；二、将土壤样品与步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨5～20min，混合均匀，土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1∶1～4；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用淋洗剂以1～2mL/min的流速淋洗，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为1g∶5～20mL；四、然后沥干，用洗脱剂以1～2mL/min的流速洗脱，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为1g∶5～20mL，得到洗脱液；五、在30～50℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1.0mL的溶剂溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测；其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂总体积的10％～50％；步骤四中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的1％～5％；步骤六中的溶剂为甲醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇或乙腈中的任意一种占溶剂总体积的20％～60％。

2.根据权利要求1所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤一中制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物的具体步骤为：a、将抗生素作为模板分子与溶剂以及功能单体混合，搅拌30～120min，得到预组装溶液，抗生素与功能单体的摩尔比为1∶4～10，抗生素的质量与溶剂的体积比为1g∶10～80mL；b、然后向预组装溶液中加入交联剂和引发剂，混匀，预组装溶液中的抗生素与交联剂的摩尔比为1∶10～30，引发剂的质量与预组装溶液中溶剂的体积比为1g∶100～500mL；c、然后超声处理5～20min，再冲入氮气除氧5～20min，然后密封，置于40～70℃环境下加热12～36h，得产物；d、然后将产物研磨，置于索氏提取器中，用洗脱剂反复洗脱，至洗脱液经紫外光谱或色谱检测后无抗生素为止，然后于60～90℃干燥至恒重，即得到选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；其中步骤a中的溶剂为去离子水、甲醇、乙醇或乙腈，步骤a中的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶或丙烯酰胺，步骤b中的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，步骤b中的引发剂为偶氮二异丁腈，步骤d中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的20％～25％。

3.根据权利要求1或2所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤二中研磨10～15min。

4.根据权利要求3所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤二中土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1∶2～3。

5.根据权利要求4所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤三中用淋洗剂以1mL/min的流速淋洗。

6.根据权利要求5所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤三中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为1g∶10～15mL。

7.根据权利要求6所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤四中用洗脱剂以1mL/min的流速洗脱。

8.根据权利要求7所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤四中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为1g∶10～15mL。

9.根据权利要求8所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤五中在40℃条件下用氮气将得到的洗脱液吹干。