CN102135526B - 一种烘烤花生特征风味物质的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烘烤花生特征风味物质的提取方法。该鉴定方法，包括如下步骤：以烘烤花生为原料，采用固相微萃取法或动态顶空吹扫法制备待测样品，再将所述待测样品利用气相色谱法、质谱法、嗅觉辨别法及保留指数确定烘烤花生的挥发性物质，再用香气抽提物稀释法确定所述烘烤花生的挥发性物质对所述烘烤花生整体风味贡献的大小，完成所述烘烤花生特征风味物质的鉴定。提取方法，包括如下步骤：利用超临界二氧化碳流体方法对烘烤花生进行提取，得到所述烘烤花生中的风味物质；所述提取步骤中，萃取釜的压力为20-30MPa，萃取釜的温度为45-55℃，萃取时间为60-120分钟，分离釜的压力为6MPa，温度为35℃。

Description

一种烘烤花生特征风味物质的提取方法

技术领域

本发明涉及食品领域，特别是涉及一种烘烤花生特征风味物质的提取方法。 

背景技术

中国是世界上重要的花生生产国，种植面积列印度之后，居第2位，但总产占世界花生的40％，居第1位，其中国内消费占总产的95％以上，出口仅占3～5％。花生榨油是我国花生最主要的利用途径，占50％～60％。目前市场上销售的花生油主要有冷榨花生油(普通花生油)和热榨花生油(浓香花生油)(盛峰，路福绥，1999)两种，热榨花生油由20％的熟花生及80％的生花生制得，其色重，花生粕的蛋白变性较大，但香气浓郁，深受现代家庭的喜爱。冷榨花生油是以生花生为原料，经冷榨制得，色淡，透明，且花生粕的蛋白变性较小，可加工性能强，是一种优质的植物蛋白来源。但利用冷榨技术生产出的普通型花生油香气弱，无法满足人们对花生油的风味需求。为了获得香味浓郁的花生油，又能充分开发利用冷榨花生的副产物，开展烘烤花生特征风味物质的研究对开发新型的花生制品和满足人们的需求都具有重要的意义。 

国内外学者在改进花生油的生产工艺上研究较多，但对其风味研究较少，目前报道的大多为风味物质的简单检测或者生产工艺过程中的风味变化，对烘烤花生的风味还没有深入研究，未见对烘烤花生中各挥发性化合物对整体风味轮廓的贡献大小的报道。对烘烤花生的风味活性成分的鉴别研究有助于评定花生制品的等级、评价烘烤花生风味料的品质，同时对花生油生产工艺的优化及生产过程中的品质控制管理也有指导意义。 

挥发性物质的常规提取方法主要有水蒸气蒸馏提取法和有机溶剂提取法。水蒸气提取法不仅效率低，而且因其高温加热而导致热敏性物质分解；有机溶剂提取法提取率较高，但产品含有有机溶剂，不利于进一步利用。超临界二氧化碳萃取法(SFE-CO₂)具有操作温度低、分离效率高且无溶剂残留等优点，特别适用于热敏性、易氧化、易分解物质的提取，有效地改进了传统方法耗时长、易分解、易污染等缺点，在生产工艺上有很强的实用性。 

目前用SFE-CO₂提取风味物质的物料包括奶酪(Larrayoz，P 2000)、米饭(Bhattacharjee P，2003)、咖啡(Ramos，E1998；吴建生等，1995)、洋葱(DronA，GuyerD E，1997)、大蒜(王欣等，2003；臧志清等，1998)、烘烤花生(Leunissen，M，Davidson V J，1996)、香料(Best D，1989)、胡荽(Anitescu G，1997)、薄荷(Reverchon E，1994)、金华火腿(田怀香等，2007)、双轮底酒醅(余有贵等，2006)、毛尖茶(任健等，2004)等；仅有Leunissen，M(1996)，Santerre，C R(1994)初步采用SFE-CO₂提取样品中的风味物质，但是这些文献中均是将 SFE-CO₂作为一种样品制备方法，它们的样品量都很小，制备的样品仅供仪器分析，不涉及提取率等问题，目前还未见有采用SFE-CO₂技术大量提取制备烘烤花生风味物质的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种烘烤花生特征风味物质的提取方法。 

本发明提供的烘烤花生特征风味物质的鉴定方法，包括如下步骤：以烘烤花生为原料，采用固相微萃取法或动态顶空吹扫法制备待测样品，再将所述待测样品利用气相色谱法、质谱法、嗅觉辨别法及保留指数确定烘烤花生的挥发性物质，再用香气抽提物稀释法确定所述烘烤花生的挥发性物质对所述烘烤花生整体风味贡献的大小，完成所述烘烤花生特征风味物质的鉴定；所述气相色谱法检测完毕的样品按照体积比1∶1的比例分成两份分别进行所述质谱法和嗅觉辨别法进行检测。 

上述鉴定方法的所述固相微萃取步骤中，时间为20-60分钟，优选40分钟，温度为35-75℃，优选55℃，萃取头为75μm CAR/PDMS。 

所述动态顶空吹扫法步骤中，吹扫时间为40-80分钟，优选60分钟，平衡温度为40-80℃，优选60℃，氮气流速为10-500mL/min，优选100mL/min。 

所述气相色谱法中，载气流速均为0.8mL/min，柱温均为40℃，进样口温度均为230℃，进样量均为10μL，载气均为氦气；程序升温步骤均为：设定初始温度为40℃，稳定3min后，以5℃/min的升温速率升至120℃，然后以10℃/min的升温速率升至230℃，稳定5min后，开始上样检测，检测结束后柱温自动降回40℃；气相色谱柱均为DB-WAX石英毛细管柱；所述氦气的纯度均为99％。 

所述质谱法中，离子源为70eV的EI源，所述离子源的温度为200℃，接口温度为250℃，扫描范围为33～450amu。 

所述嗅觉辨别法、所述香气抽提物稀释法及利用该方法确定保留指数的方法均为常规方法。 

其中，所述嗅觉辨别法具体可为：将固相微萃取法或动态顶空吹扫法制备得到的待测样品至气相进样口解吸，样品经气相色谱柱分离后，流出物在质谱及嗅闻器(ODP)间被1∶1分开，由三位熟悉烘烤花生风味的感官评价员进行嗅闻。记录从ODP出口闻到的气味特性及时间，每种化合物的香味及时间必须至少有其中2名评价员的描述一致才可确定。 

所述香气抽提物稀释法(AEDA法)具体可为：将SPME所得待测样品的气相色谱萃取时间按1∶3ⁿ进行稀释；将DHS所得待测样品的气相色谱萃取时间按1∶5ⁿ进行稀释，将经气相色谱柱每次吸附后的物质进行GC-MS及GC-O分析，直到评价员在ODP末端不再闻到气味则停止稀释，每种香味化合物的最高稀释倍数为其稀释影响因子(即为FD因子)。一般来说，FD因子越高说明其在萃取物中浓度越大或是香气强度较强，可能属于重要的香味化合物，需要进一步深入 的研究，而相对较低的FD因子，说明其可能对整体香气并无贡献。由3位评价员操作AEDA，记录从ODP出口闻到的气味特性及时间，每种化合物的香味及时间必须至少有其中2名评价员的描述一致才可确定。所得试验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库(107kcompounds)和Wiley谱库(320k Compounds，version 6.0)相匹配，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)、化合物的保留指数RI(Retention index)(赵晨曦等，2005)及气味特性芳香特性(Rychlik，Schieberle，1998)(评价员嗅闻结果)来完成鉴定。 

保留指数RI的计算公式如下： 

$\mathrm{RI}=100\×(\frac{t-t_n}{t_{n+1}-t_n}+n)$

式中，t为所述气相色谱检测方法所得化合物的保留时间；t_n为出峰在该化合物之前且与该化合物保留时间最接近的烷烃的保留时间；t_n+1为出峰在该化合物之后且与该化合物保留时间最接近的烷烃的保留时间；n为该化合物前一个烷烃的碳原子总数。 

本发明提供的提取烘烤花生中特征风味物质的方法，包括如下步骤：利用超临界二氧化碳流体方法对烘烤花生进行提取，得到所述烘烤花生中的特征风味物质。 

所述提取步骤中，萃取釜的压力为20-30MPa，优选25MPa，萃取釜的温度为45-55℃，优选55℃，萃取时间为60-120分钟，优选120分钟，分离釜的压力为6MPa，温度为35℃。该提取步骤中，所用烘烤花生的样品量优选为100g。 

本发明采用气相色谱-质谱法、气相色谱-嗅觉辨别法及保留指数联用的鉴定方法，可以鉴定出常规方法(也即质谱法)无法检测而可以被闻到的风味物质，同时采用香气抽提物稀释法分析各风味物质对烘烤花生整体贡献率的大小。本发明提供的烘烤花生特征风味物质的提取方法，与常规方法相比(如溶剂提取法等)操作温度低、分离效率高且无溶剂残留等优点，具有重要的应用价值。 

附图说明

图1为萃取纤维头对萃取效果的影响。 

图2为萃取温度对萃取效果的影响。 

图3为正交试验中感官评价秩和与样品偏差值拟合图。 

图4为烘烤花生原样挥发性物质总离子流图。 

图5为超临界最优条件萃取物挥发性物质总离子流图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 

实施例1、烘烤花生特征风味物质的鉴定 

鉴定方法的第一步：利用固相微萃取法制备待测样品： 

试验材料：将花生在170℃烘烤30min后，备用。 

主要试验仪器： 

SPME萃取头：85μm PA、100μm PDMS、75μm CAR/PDMS，美国Supelco公司制造。 

气相色谱质谱联用仪：Trace MS，美国Finngina质谱公司制造。 

试验设计： 

通过对SPME法各样品制备条件进行GC-MS分析，确定烘烤花生各分析方法的最优条件，为进行烘烤花生特征风味物质的分析提供依据。 

试验分析方法： 

试剂制备方法：无水Na₂SO₄：将分析纯Na₂SO₄，在530～570℃下灼烧3h，冷却，包装备用。 

样品制备方法： 

萃取头的老化：萃取头第一次使用时，在气相色谱进样口在氮气保护下于270℃老化2h以上，第二次以后使用在上述温度下老化30min，以确保脱去其残留的挥发性成分。老化后的萃取头在GC-MS上检测略有极少量的萃取头固有杂质峰(硅氧烷类化合物)出现，在样品质谱检索的时候去除，不计入最终结果。在20mL的样品瓶中装入粉碎的烘烤花生8g，置于55℃的水浴中保温15min后吸附一定时间，设定温度下顶空吸附预制时间，气相进样口250℃下解吸2min。 

测试条件： 

色谱条件：载气流速为0.8mL/min，柱温为40℃，进样口温度为230℃，进样量为10μL，载气为氦气；程序升温步骤为：设定初始温度为40℃，稳定3min后，以5℃/min的升温速率升至120℃，然后以10℃/min的升温速率升至230℃，稳定5min后，开始上样检测，检测结束后柱温自动降回40℃；气相色谱柱为DB-WAX石英毛细管柱；所述氦气的纯度为99％。 

质谱条件：离子源为70eV的EI源，离子源的温度为200℃，接口温度为250℃，扫描范围为33～450amu。 

化合物鉴定：试验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库(107k compounds)和Wiley谱库(320k Compounds，version6.0)相匹配，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以报道。 

试验结果： 

1)固相微萃取(SPME)法中萃取头的选择 

由不同固定相所构成的萃取头对物质的萃取吸附能力是不同的，故萃取头是整个SPME装置的核心。按照聚合物的极性固定相涂层可分为三大类：一类为极 性涂层，如聚丙烯酰胺(polyacrylate PA)、聚乙二醇(Polyethylene glyeol，PEG)，适于极性化合物，已用于有机氮农药、脂肪酸、食品中香味、酚等的分析检测；另一类为非极性涂层，如聚二甲基硅氧烷(poly(dimethysiloxnae)，PDMS)，适于非极性和弱极性化合物，己用于有机氯、有机磷、有机氮农药，药品和麻醉品，食品中的香味、咖啡因等的分析检测；第三类为中等极性混合型涂层，包括聚乙二醇聚-二乙烯基苯(carbowax-divinylbenzene，CW-DVB)、Carboxen divinylbenzene(CAR-DVB)、CAR-DVB-PDMS等。为选择适合 

烘烤花生风味组分分析的最佳萃取头，可采用三种萃取头，其中85μm PA是极性涂层的，100μm PDMS是非极性涂层的，75μm CAR/PDMS是中等极性混合型涂层的。采用相同的吸附(55℃下吸附30min)和解吸条件(250℃下解吸2min)以及仪器测试条件进行考察。 

由图1可知，75μmCAR/PDMS的总峰面积为3.967×10⁸，约为85μmPA(2.136×10⁸)和100μmPDMS(1.978×10⁸)的两倍。说明75μmCAR/PDMS的吸附能力比其它萃取头效果好。同时从检出的有效化合物的个数来看，75μmCAR/PDMS能检出53种化合物，而85μmPA和100μmPDMS检出化合物分别为44和39种，这主要是因为涂层的极性缘故，萃取头对所分析的化合物有选择性，对烘烤花生而言，复合涂层的萃取头75μmCAR/PDMS更加适合，不仅分析的化合物比较全面，而且其强度也很大，色谱分析响应值高，因此75μmCAR/PDMS萃取效果较好。 

2)固相微萃取(SPME)法中萃取温度的优化 

萃取温度对吸附采样的影响具有两面性，一方面，温度升高会加快样品分子运动，有利于吸附；另一方面，温度升高也会降低萃取头吸附分析组分的能力，使得吸附量下降。并且温度升高也会增加萃取头固有组分的解析，从而降低萃取头萃取分析组分的能力。固定萃取头为75μmCAR/PDMS，萃取时间为30min，优化萃取温度，选取萃取温度分别为35℃、55℃、75℃。从图2可以看出，温度在75℃时，SPME对部分物质的吸附能力反而下降。此外在试验过程中随着温度的升高，样品顶空体积中水蒸气的浓度也随之增加，影响了萃取头对目标化合物的吸附。温度太低，样品中的气味物质不能完全挥发，因此萃取温度选择55℃。 

3)固相微萃取(SPME)法中萃取时间的优化 

萃取时间主要指达到或接近平衡所需要的时间。在萃取的初始阶段，待分析组分很容易且很快富集到SPME的纤维头上，随着时间的延长，富集的速度越来越慢，因此萃取过程中不必达到完全平衡，在平衡之前萃取头涂层中吸附的物质量与其最终浓度就已存在一个比例关系，所以在接近平衡时即可完成萃取过程。固定萃取头为75μmCAR/PDMS，萃取温度为55℃，采用不同的萃取时间，分别为20min、40min和60min进行萃取。试验结果见表1。 

表1、萃取时间对萃取效果的影响 

由表1可知，萃取时间延长总的萃取量略有增加，但幅度不大，由于存在吸附-解吸平衡问题，时间从20min增加到40min时检出的化合物增加较明显，时间进一步增加到60min时检出的化合物个数却减少了，因此选择40min萃取就己足够，而且正好和样品分析的时间也比较一致，提高了单位时间内样品分析效率。 

由上可知，SPME法最佳条件为：萃取头为75μmCAR/PDMS，萃取时间为40min，萃取温度为55℃。 

鉴定方法的第二步：将前述第一步固相微萃取法制备得到的待测样品用气相色谱法、质谱法、嗅觉辨别法及保留指数确定烘烤花生的挥发性物质，再用香气抽提物稀释法确定烘烤花生的挥发性物质对烘烤花生整体风味贡献的大小，完成烘烤花生特征风味物质的鉴定；其中，所述气相色谱法检测完毕的样品按照体积比1∶1的比例分成两份分别进行质谱法和嗅觉辨别法检测。 

具体步骤为：将前述第一步固相微萃取法制备得到的待测样品，至气相进样口解吸，样品经气相色谱柱分离后，流出物在质谱及嗅闻器(ODP)间被1∶1分开，由三位熟悉烘烤花生风味的感官评价员进行嗅闻。记录从ODP出口闻到的气味特性及时间，每种化合物的香味及时间必须至少有其中2名评价员的描述一致才可确定； 

香气抽提物稀释法(AEDA法)的步骤为：将SPME所得待测样品的气相色谱萃取时间按1∶3ⁿ进行稀释；将DHS所得待测样品的气相色谱萃取时间按1∶5ⁿ进行稀释，将经气相色谱柱每次吸附后的物质进行GC-MS及GC-O分析，直到评价员在ODP末端不再闻到气味则停止稀释，每种香味化合物的最高稀释倍数为其稀释影响因子(即为FD因子)。一般来说，FD因子越高说明其在萃取物中浓度越大或是香气强度较强，可能属于重要的香味化合物，需要进一步深入的研究，而相对较低的FD因子，说明其可能对整体香气并无贡献。由3位评价员操作AEDA，记录从ODP出口闻到的气味特性及时间，每种化合物的香味及时间必须至少有其中2名评价员的描述一致才可确定。所得试验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库(107k compounds)和Wiley谱库(320k Compounds，version 6.0)相匹配，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)、化合物的保留指数RI(Retention index)(赵晨曦等，2005)及气味特性芳香特性(Rychlik，Schieberle，1998)(评价员嗅闻结果)来完成鉴定，该保留指数RI的计算公式如下： 

$\mathrm{RI}=100\×(\frac{t-t_n}{t_{n+1}-t_n}+n)$

式中，t为所述气相色谱检测方法所得化合物的保留时间；t_n为出峰在该化合物之前且与该化合物保留时间最接近的烷烃的保留时间；t_n+1为出峰在该化合物之后且与该化合物保留时间最接近的烷烃的保留时间；n为该化合物前一个烷烃的碳原子总数。 

用SPME法所得的待测样品经前述气相色谱-质谱检测仪之后，用GC-O嗅闻实验结果，如表7所示。 

表7、SPME法制备样品经气相色谱-质谱仪分离后GC-O嗅闻实验结果 

注：MS质谱鉴定结果，RI保留指数，odour评价员的嗅闻结果，Unknown未确定是什么化合物；***为气味较浓，**为中等强度*为气味较弱。 

通过表7可知，SPME法共分析出烘烤花生中的50多种风味物质，这些化合物包括很多风味，如巧克力味、土豆味、塑料味、青草味、甜香味、蘑菇味、爆米花味、泥土味、烘烤味、坚果味、酸味、咖啡味、辛辣味等。其中有29种化合物对烘烤花生风味贡献较大：3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、己醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、2-(2-羟乙基)-3-甲基-4-噻唑、吡啶、甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、吡咯、2-甲基-1H-吡咯、2，3-戊二酮、乙酸、2-甲基丁基辛酸。 

用前述AEDA法考察各风味活性化合物对样品整体风味的贡献大小，所得结果见表8。 

表8、SPME法中各风味活性组分对烘烤花生整体风味的贡献 

注：MS质谱鉴定结果，RI保留指数，odour评价员的嗅闻结果，Unknown未确定是什么化合物：稀释影响因子为稀释倍数的对数值。 

从表8中可以看出，对烘烤花生风味物质贡献较大的化合物依次为：3-甲基丁醛＝2-甲基丁醛＝乙基吡嗪＝糠醛＝苯乙醛＞2，5-二甲基吡嗪＝2，6-二甲基吡嗪＞2-(2-羟乙基)-3-甲基-4-噻唑＝己醛＝2-乙基-5-甲基吡嗪＝3-乙基-2，5-二甲基吡嗪＝二乙基硫化物＞2，3-戊二酮＝甲基吡嗪＝2-乙基-6-甲基吡嗪＞吡啶＝三甲基吡嗪＝乙酸＝1-甲基苯噁唑＞2，3-二乙基-5-甲基吡嗪＝吡咯＞苯甲醛＝2-甲基丁基辛酸＝2-甲基-1H-吡咯。 

对整体风味贡献大小取决于两方面的因素：化合物在该样品中的含量以及该化合物的风味阈值。通过质谱可以得出各物质的含量，但是各风味物质的阈值不同，因此对烘烤花生整体风味物质的贡献不同，因而即使它们的含量不是很高，但是它们对烘烤花生风味的整体贡献极大，因此在评价风味化合物的重要性时，应该由嗅闻结果较大为依据。 

由上可知，SPME法共分析出烘烤花生中的50多种风味物质，这些化合物包括很多风味，如巧克力味、土豆味、塑料味、青草味、甜香味、蘑菇味、爆米花味、泥土味、烘烤味、坚果味、酸味、咖啡味、辛辣味等。其中29种化合物对烘烤花生风味贡献较大：3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、己醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、2-(2-羟乙基)-3-甲基-4-噻唑、吡啶、甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、吡咯、2-甲基-1H-吡咯、2，3-戊二酮、乙酸、2-甲基丁基辛酸。通过AEDA法可以鉴别烘烤花生中的气味活性组分对烘烤花生整体风味的贡献大小。其中FD因子＞6的物质为：3-甲基丁醛＝2-甲基丁醛＝乙基吡嗪＝糠醛＝苯乙醛＞2，5-二甲基吡嗪＝2，6-二甲基吡嗪＞2-(2-羟乙基)-3-甲基-4-噻唑＝己醛＝2-乙基-5-甲基吡嗪＝3-乙基-2，5-二甲基吡嗪＝二乙基硫化物。 

实施例2 

1)鉴定方法的第一步：利用动态顶空吹扫法制备待测样品 

试验材料：将花生在170℃烘烤30min后，备用。 

主要试验仪器： 

动态顶空吹扫：吹扫捕集容器(280mL，美国GMS公司出品)，Tenax柱、一除水分仪器中(德国Gerstel公司出品)、Tenax柱老化仪器(德国Gerstel公司出品)。 

气相色谱质谱联用仪：Trace MS，美国Finngina质谱公司制造。 

试验设计： 

通过对DHS法各样品制备条件进行GC-MS分析，确定烘烤花生各分析方法的最优条件，为进行烘烤花生特征风味物质的分析提供依据。 

试验分析方法： 

试剂制备方法：无水Na₂SO₄：将分析纯Na₂SO₄，在530～570℃下灼烧3h，冷却，包装备用。 

样品制备方法： 

置20g烘烤花生粉末于吹扫捕集容器中，容器用60℃的水浴平衡60min后，用氮气流速为100mL/min吹扫样品表面一定时间，容器上安装Tenax柱以捕集容器内的顶空气体，此气体为混合物，含有样品香气物质、水蒸气和氮气。将吸附气体后的Tenax柱置于一除水分仪器中，除水后以备进GC-MS分析鉴定。 

测试条件： 

色谱条件：载气流速为0.8mL/min，柱温为40℃，进样口温度为230℃，进样量均为10μL，载气为氦气；程序升温步骤为：设定初始温度为40℃，稳定3min后，以5℃/min的升温速率升至120℃，然后以10℃/min的升温速率升至230℃，稳定5min后，开始上样检测，检测结束后柱温自动降回40℃；气相色谱柱为DB-WAX石英毛细管柱；所述氦气的纯度为99％。 

质谱条件：离子源为70eV的EI源，离子源的温度为200℃，接口温度为250℃，扫描范围为33～450amu。 

化合物鉴定：试验数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库(107k compounds)和Wiley谱库(320k Compounds，version 6.0)相匹配，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以报道。 

试验结果： 

1)动态顶空吹扫(DHS)法中平衡水浴温度的优化 

固定平衡时间1h、吹扫时间1h、氮气流速100mL/min，采用不同的水浴温度，考察其对提取结果的影响，所得结果见表9。 

表9、萃取温度对烘烤花生挥发性物质提取效果的影响 

从表9可以看出，平衡水浴温度对试验结果影响较大，随着平衡温度的升高，萃取物的总峰面积逐渐增大，但有效化合物的个数有所降低，可能是随着温度的升高，烘烤花生中风味物质的挥发性增大，但增大到一定程度时，虽然有些化合物的挥发性增大，但烘烤花生中的挥发性物质可能会分解而产生其他一些负面影响，因此综合以上各方面的考虑，选择60℃为最佳温度。 

2)动态顶空吹扫(DHS)法中吹扫时间的优化 

固定平衡时间1h、水浴温度60℃、氮气流速100mL/min，采用不同的吹扫时间，考察其对试验结果的影响，所得结果见表10。 

表10、吹扫时间对烘烤花生挥发性物质提取效果的影响 

从表10可以看出，随着吹扫时间的延长，检测结果中总峰面积逐渐增大，但检测出的有效化合物个数减少，因随着吹扫时间的增加，挥发性化合物吸附到Tenax柱的量逐渐增加，但随着时间的延长，有些化合物又解析下来，因此综上得出60min为最佳吹扫时间。 

3)动态顶空吹扫(DHS)法中氮气流速的优化 

固定经优化好的平衡温度60℃，吹扫时间60min，对氮气流速进行优化，氮气流速分别为10mL/min、100mL/min、500mL/min，考察其对提取结果的影响，所得结果见表5。 

表11、氮气流速对烘烤花生挥发性物质萃取率的影响 

由表11可以看出，随着吹扫时间的增多，总峰面积增加，检测出有效化合物的个数增大到一定程度即减少，一方面是因为随着吹扫时间的增多，会有更多的物质吸附到聚合体上，另一方面，随着吹扫时间的增加，由于吸附-解析平衡问题，有些化合物将从吸附体上解析下来，因此，随着时间的延长，检测出化合物的个数逐渐减少。综合以上结果，采取100mL/min为最佳吹扫时间。 

由上可知，DHS法的最佳萃取条件为：吹扫时间为60min，平衡温度为60℃，氮气流速为100mL/min。 

鉴定方法的第二步：将前述第一步动态顶空吹扫法制备得到的待测样品用气相色谱法、质谱法、嗅觉辨别法及保留指数确定烘烤花生的挥发性物质，再用香气抽提物稀释法确定烘烤花生的挥发性物质对烘烤花生整体风味贡献的大小，完成烘烤花生特征风味物质的鉴定；其中，气相色谱法检测完毕的样品按照体积比1∶1的比例分成两份分别进行质谱法和嗅觉辨别法检测。具体步骤与实施例1完全相同，仅将待测样品替换为第一步动态顶空吹扫法制备得到的待测样品。用DHS法所得的待测样品经前述气相色谱-质谱检测仪之后，用GC-O嗅闻实验结果，如表12所示。 

表12、DHS法制备样品经气相色谱质谱分离人工嗅辨的风味活性化合物 

注：MS质谱鉴定结果，RI保留指数，odour评价员的嗅闻结果，Unknown未确定是什么化合物；***为气味较浓，**为中等强度*为气味较弱。 

由表12可知，DHS法可萃取出烘烤花生中的很多风味物质如：巧克力味、奶油味、青草味、花香、糊味、蘑菇味、烤坚果风味、焦糖香、咸菜味、坚果味、焦霉味、酸味、脂肪香，烤香、生土豆味、糊咖啡味、杏仁味、饼干味、青菜味等。共检测出22种化合物对烘烤花生风味贡献较大的物质，他们是3-甲基丁醛、2，3-丁二酮、己醛、1-丁醇、甲基吡嗪、1-羟基2-丙酮、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基四氢噻吩-3-硫醇、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、乙酸、糠基硫醇、糠醛、3，5-二乙基-2-甲基吡嗪、苯甲醛、吡咯、5-乙基-4-甲基噻唑。 

用前述AEDA法考察各风味活性化合物对样品整体风味的贡献大小，所得结果见表13。 

表13、DHS法中各风味活性组分对烘烤花生整体风味的贡献 

注：MS质谱鉴定结果，RI保留指数，odour评价员的嗅闻结果，Unknown未确定是什么化合物；稀释影响因子为稀释倍数的对数值。 

由表13可知，对烘烤花生风味贡献较大的化合物依次为：3-甲基丁醛＝2，3-丁二酮＝1-羟基2-丙酮＝2，3-二甲基吡嗪＝糠基硫醇＝糠醛＝3，5-二乙基-2-甲基吡嗪＞2，5-二甲基吡嗪＞甲基吡嗪＝2-乙基-6-甲基吡嗪＞己醛＝三甲基吡嗪＝乙酸＞1-丁醇＝苯甲醛＝吡咯＝5-乙基-4-甲基噻唑。可知，DHS法可以萃取出烘烤花生中的很多风味物质，包括巧克力味、奶油味、青草味、花香、糊味、蘑菇味、烤坚果风味、焦糖香、咸菜味、坚果味、焦霉味、酸味、脂肪香，烤香、生土豆味、糊咖啡味、杏仁味、饼干味、青菜味等。检测出22种化合物对烘烤花生风味贡献较大的物质，他们是：3-甲基丁醛、2，3-丁二酮、己醛、1-丁醇、甲基吡嗪、1-羟基-2-丙酮、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基四氢噻吩-3-硫醇、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、乙酸、糠基硫醇、糠醛、3，5-二乙基-2-甲基吡嗪、苯甲醛、吡咯、5-乙基-4-甲基噻唑。通过AEDA法可以鉴别烘烤花生中的气味活性组分对烘烤花生整体风味的贡献大小。其中FD因子＞6的物质为：3-甲基丁醛＝2，3-丁二酮＝1-羟基-2-丙酮＝2，3-二甲基吡嗪＝糠基硫醇＝糠醛＝3，5-二乙基-2-甲基吡嗪＞2，5-二甲基吡嗪＞甲基吡嗪＝2-乙基-6-甲基吡嗪。 

实施例1中SPME和实施例2中DHS方法检出有效化合物种类，所得结果如表22所示。由表22可知，SPME法检出的有效化合物最多，为54种，DHS法只能检出29种化合物，但DHS法对低沸点化合物的检出效果较佳。两方法均对低分子量的醛、酸和醇等化合物检出效果良好，香气成分没有发生变化。 

表22、正交试验超临界萃取物、最优条件萃取物及烘烤花生原样风味物质SPME-GC-MS分析 

实施例1中SPME和实施例2中DHS方法分析结果重现性比较 

看一个分析方法是否能普遍应用，通常希望它能简单、快速和可靠，而最重要的还是数据是否可靠，这主要通过它检测样品时数据的重现性来考察。分别采用上述三种方法最优的操作条件，对烘烤花生的挥发性风味组分进行分析，每个实验做三次平行。结果见表6。 

表6、方法重现性的比较 

对检测结果计算平行样之间的相对标准偏差，再根据检出的样品个数计算该方法的平均相对标准偏差以表示该方法的数据重现情况。从表6中可以看出，SPME法的重现性最好，平均相对标准偏差为17.36％，DHS法为19.38％。总的来讲，这两种方法用于研究烘烤花生的风味时平均相对标准偏差均较小，说明重现性较好，均能够较好的测量烘烤花生的挥发性风味组分。 

由上述结果可以看出，SPME法检测出来的有效化合物个数为54种，DHS法检测出的化合物个数为29种，它们分析出了烘烤花生中挥发性较大的物质，综合以上几方面可知，SPME法分析烘烤花生中的挥发性物质效果最好。 

实施例3、利用超临界二氧化碳流体方法提取烘烤花生中的风味物质 

试验材料：将花生在170℃烘烤30min后，备用。 

主要试验仪器： 

SFE-CO₂流体萃取装置：HA221-50-06(购自江苏南通华安超临界萃取有限公司)； 

SPME：75μm CAR/PDMS，美国SUPELCO公司； 

FINNIGAN Trace MS气相色谱-质谱联用仪：美国FINNIGAN公司。 

试验设计： 

1、SFE-CO₂单因素试验：对SFE-CO₂各萃取因素，萃取时间、萃取温度、萃取压力进行单因素试验，确定各萃取条件对烘烤花生萃取物重量及萃取物风味物质的影 响。 

2、SFE-CO₂正交试验：对SFE-CO₂各因素进行正交试验，将各正交试验样品进行萃取物重量分析、GC-MS分析及感官评价分析，综合挥发性成分总量的变化与香气协调性变化两个方面确定超临界萃取烘烤花生风味物质的最优条件。 

3、SFE-CO₂正交试验的验证试验：将试验得最优条件与正交表中结果进行比较，以进一步确证试验结果的可靠性。 

试验分析方法： 

1、SFE-CO₂萃取 

基本流程：CO₂钢瓶→冷却系统→高压泵→萃取斧→分离斧冷却系统→(循环)。 

将烘烤后的花生100g粉碎至30～40目，装入萃取釜中，将CO₂冷却后由高压泵加压到预定压力，在预定的萃取温度、萃取压力、萃取时间等条件下萃取。由于本方法的目的是萃取烘烤花生中的挥发性风味物质，因此要求分离釜的温度不能太高，固定分离釜的压力为6MPa，温度为35℃。 

2、利用固相微萃取(SPME)法对SFE-CO₂萃取后的样品进行制备和并用气相色谱-质谱仪进行分析测试：在20mL的样品瓶中装入粉碎的烘烤花生8g，置于55℃的水浴中保温15min后吸附一定时间，气相进样器内250℃下解吸2min。萃取头第一次使用时，在气相色谱进样口在氮气保护下于270℃老化2h以上，第二次以后使用在上述温度下老化30min，以确保脱去其残留的挥发性成分。老化后的萃取头在GC-MS上检测略有极少量的萃取头固有杂质峰(硅氧烷类化合物)出现，在样品质谱检索的时候去除，不计入最终结果； 

色谱条件：毛细管柱为DB-WAX柱，程序升温， 

120℃10℃/min 230℃(5min)，汽化室温度250℃；载气为He，流速0.8mL/min。 

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70eV，灯丝发射电流为200μA，离子源温度为200℃，接口温度250℃，扫描范围33～450amu。 

3、GC-MS检测数据的数学归纳方法与烘烤花生原样香气协调性的评价方法 

采用样品偏差值描述样品与标样相比整体香气协调性的变化。样品偏差值为0时，表明样品处于与标样香气协调性完全一致的理想状态；样品偏差值越大，表明样品与标样在香气成分百分含量上的总体差异越大。样品偏差值的计算方法如下： 

(1)以烘烤花生原样为标准样品，通过GC-MS检测样品中的挥发性成分，计算各挥发性成分占样品总挥发性组分含量的百分数； 

(2)通过GC-MS检测样品(超临界萃取物)中的挥发性成分，计算各挥发性成分占其样品总挥发性组分含量的百分数； 

(3)以标准样品为零变化基准，分析不同萃取条件下各样品中各挥发性成分含量相对于标样挥发性成分含量的变化程度； 

(4)计算样品与标样中各对应组分百分含量的差值，将得到的数组称为差值数组。各样品的每项差值代表了该样品中该组分与标样相对应组分的差异。然后对每个样品与标样的差值数组进行数值分析，将差值数组中各项差值的平均平方和开平方所得数值定义为样品偏差值。样品偏差值的数学表达见下面的公式(刘凌，崔明学等2005)。 

$S=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(x_{\mathrm{ij}}-x_{i1})}^2}{n}}$

式中，j表示检测样品，j＝1表示标样，其它样品依次编号为j＝2～m；每个样品中检测到的组分i按色谱检测时的保留时间依次编号为i＝1～n；x为GC-MS检测到的各组分的相对百分含量，用x_ij表示第j样品第i个组分的百分含量。X_ij-X_i1表示第j个样品与标样的差值。 

感官评价方法： 

10名感官评价员对超临界萃取物的风味进行评价，主要考察指标是被评价样品与烘烤花生原样风味的接近程度。评分标准：非常接近为10分，接近为8分，比较接近为6分，稍微有点接近为4分，很不接近为2分。并对所评价的样品按照考察指标进行排序，评分相同的样品秩和取平均值。 

按照上述方法进行分析检测，所得结果如下： 

1、单因素试验结果 

1.1)萃取压力对萃取效果的影响 

表14、不同萃取压力萃取效果的影响 

在萃取温度分别为40、50、60℃，CO₂流量为40-50Kg/L，萃取压力为15-35MPa时萃取60min，计算不同压力对烘烤花生萃取效果的影响，试验数据见表5-1。 

从表14知，在一定萃取温度下，随着萃取压力增大，SFE-CO₂密度增大，从而使溶解能力增大，萃取物重量增加。随着萃取压力的继续增加，萃取物重量增加不明显，即在萃取压力较高时压力对出油率的影响并不显著。过高的萃取压力不仅能耗高而且也会影响超临界萃取设备的使用寿命。从表14中可以看出，在同一温度下，压力对萃取物的感官评价不是很明显。因此考虑到萃取物重量及仪器消耗情况，下一步采用20-30MPa范围进行研究。 

1.2)萃取温度对萃取效果的影响 

在萃取压力分别为15、25、35MPa，CO₂流量为40-50Kg/L，萃取温度为30-60℃时萃取花生60min，计算不同温度下的萃取效果，萃取试验数据见表15。 

表15、不同萃取温度对萃取效果的影响 

由表15知，温度对萃取物重量影响较小，但随着温度的升高，萃取物的感官评价评分不断增加，其烘烤花生风味越来越浓，主要是因为升高温度提高了风味化合物在SFE-CO₂中的溶解度。萃取温度在45℃以上时，萃取物的风味都很接近烘烤花生的原始风味。考虑到温度进一步升高可能会使风味化合物发生变化产生一些后生物，本试验主要萃取烘烤花生风味物质，因此，综合考虑采取45-55℃作为下一步正交试验优化范围。 

1.3)萃取时间对萃取效果的影响 

在萃取温度分别为40、50、60℃，CO₂流量为40～50Kg/L，萃取压力为25MPa，萃取时间为20～140min时，计算不同萃取时间的萃取效果，萃取试验数据见表5-3。由表5-3可知，开始随着萃取时间的增加萃取物重量逐渐增加，当萃取时间增加到120min后萃取物的重量增加不明显；当萃取时间增加到100min后，萃取物的感官评价改变不是很明显，因此，将采用萃取时间60-120min为下一步试验范围。 

表16、不同萃取时间对萃取效果的影响 

2、正交试验结果 

2.1)萃取条件的正交优化 

通过一系列的单因素试验，初步确定了试验范围，以下将对各萃取因素设计正交试验设计见表5-4。 

表17、正交试验设计L₉(3⁴)因素水平表 

将正交表中九次试验的萃取物以及烘烤花生原样经GC-MS分析得到总的风味强度，通过比较各挥发性风味组分的相对百分含量，计算样品偏差值。 

2.2)超临界萃取物的感官评价结果 

以烘烤花生原始风味为对照，通过排序法得到感官评价秩和表征萃取物感官品质的优劣，越接近烘烤花生原始风味则认为样品感官品质越优。将正交表试验中的萃取物的风味与烘烤花生的原始风味作对比，对接近程度进行评分并进行排序。试验结果见表18。 

表18、正交表感官评分评定结果 

注：A-I为正交试验号 

根据表18中10名感官评价员的评价总分，如果萃取物风味与烘烤花生原样风味完全一致则应得100分，正交试验的样品中有三个得分在八十分以上，表示这些萃取物的风味与原料烘烤花生的风味很接近，说明超临界流体技术只要条件控制得当，是能够保证萃取物的风味与烘烤花生原样风味基本一致。同时各样品间的合计评分相差较大，说明SFE-CO₂萃取时，操作条件对萃取物的风味品质非常关键，因此操作条件的优化非常重要。按感官评价评分进行排序，将结果转化为秩次，并求秩和，结果见表5-6。 

样品秩和的统计：当每个评价员对各样品排出的秩次当中有相同秩次时，则取平均秩次。(吴谋成，2003) 

$L_i=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{L}_i}{n}$

式中：L——秩次，N——相同秩样品个数； 

对感官评价结果进行显著性检验，采用Friedman秩和检验法。样品显著差异分析：采用Friedman检验将F与查表所得F₀相比较，从而获得结果。Friedman检验原理： 

求出F值： 

$F=\frac{12}{A\·S(S+1)}[{L_1}^2+{L_2}^2+......+{L_S}^2]-3A(S+1)=27.44$

式中：A为评价员人数；S为样品数；L_i为各样品的秩和数。 

b.因为评定中有相同评秩，可以用校正后的F′代替F进行判断。 

$F^{\′}=\frac{F}{1-[V/\mathrm{AS}(S^2-1)]}=87.73$

式中：V＝(n₁ ³-n₁)+(n₂ ³-n₂)+......+(n_k ³-n_k) 

n₁、n₂、n₃......n_k为出现相同秩次的样品数，若没有相同秩次，则n_k＝1 

c.比较：F(或F′)＞F₀样品之间有显著差异；F(或F′)＜F₀样品之间没有显著差异。查Friedman秩和临界值表知，本文中F′＞F_0.01，表明9个样品风味之间有极显著的差别(α＝0.01)。说明正交实验所选的条件对超临界萃取物的风味轮廓有显著影 响，因此SFE-CO₂技术用于烘烤花生香气组分提取时，操作条件对萃取物的风味品质影响很大，必须经过优化。 

表19、感官评定秩次和秩和 

2.3)正交试验结果 

对样品香气变化的评价应该包括挥发性成分总量的变化与香气协调性的变化两个方面。萃取物重量和风味物质提取量可以用来描述挥发性成分总量的变化；样品偏差值和感官评价秩和从客观、主观两方面来综合评价香气协调性的变化。 

表20、正交试验结果表 

注：风味总强度是GC-MS测得各样品的，以相应峰面积表示。样品偏差值是各萃取物中各挥发性物质与烘烤花生原样中各挥发性组分之间差别的均方值。感官评价秩和是各萃取物与烘烤花生原样之间风味的接近程度。 

从表20直观分析知，对于萃取物重量来说，萃取时间和萃取压力对其影响较大，而萃取温度对其影响较小，这与单因素试验结果相吻合。从萃取物风味物质总强度来说，萃取温度对其影响较大，而萃取时间和萃取压力对其影响较小。由于本试验主要是萃取烘烤花生风味物质，仅从萃取物重量来判断是片面的，因此将样品偏差值和感官评价结果相结合起来进行评价。采用样品偏差值来评价超临界萃取物的风味协调性变化，可以将GC-MS分析数据通过数学归纳法以一个综合数据的形式给出来，不仅增加了仪器分析数据的利用程度，而且使分析结果更加直观。同时采用常规的感官评定方法(排序法)对萃取物的风味进行评价，将评价员的主观感官评价秩和和仪器的客观分析数据进行拟合，感官评价秩和数值越大，表明萃取物的风味越接近烘烤花生的原始风味，而样品偏差值则以小为好，表明萃取物的风味与烘烤花生的原有风味更加接近。 

2.4)感官评价评分与样品偏差值拟合图 

感官评价秩和高说明该样品与烘烤花生原样风味接近，样品偏差值越低说明该样品与烘烤花生原有风味越接近。所得感官评价评分与样品偏差值拟合图如图3所示，由图可知，样品感官评价结果与样品偏差值吻合，感官评价秩和高的样品偏差值低，反之样品感官品价值低的样品偏差值高。因此，二者结合作为评价超临界萃取烘烤花生风味物质的方法是完全可行的。 

综合考虑萃取物重量、感官评价秩和、风味物质总强度及样品偏差值确定烘烤花生风味物质提取的最优条件A₂B₂C₃。 

2.5)正交试验的验证试验 

本试验中确定的最优条件，在正交试验表中并不存在，因此在该最优条件下进行 

与正交试验结果进行比较，结果见表21。 

表21正交试验验证试验 

从表21中结果可以看出，该萃取条件优于正交试验结果，因此，确定萃取釜压力25MPa，萃取釜温度55℃，萃取时间120min。并且在该萃取条件下，SFE-CO₂萃取烘烤花生风味物质进行GC-MS分析，发现SFE-CO₂萃取技术可以萃取出烘烤花生中85％以上的风味物质，说明SFE-CO₂萃取技术可以萃取出花生中的大部分风味物质。 

2.6)萃取物及烘烤花生原料风味物质分析 

烘烤花生原样挥发性物质总离子流图和超临界最优条件萃取物挥发性物质总离子流图分别见图4和5。 

从图4和5中可以看出超临界萃取物中有的峰高于烘烤花生原样，说明SFE-CO2萃取方法具有浓缩作用，3-甲基-4-羟基丁醛、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、乙基吡嗪、糠醛、2-乙酰基噻唑、2，3-戊二酮、己醛、吡啶、甲基吡嗪、3-戊醇、2-乙基-6-吡嗪、2-乙基-5-吡嗪、苯甲醛、2-甲基-1H-吡咯、苯乙醛等对烘烤花生风味物质贡献较大，在SFE-CO₂萃取中基本可以检测到(具体检测结果见表22)；整体来讲，SFE-CO₂萃取方法能将烘烤花生中的大部分挥发性风味物质提取出来。 

综上所述，对正交试验结果分析，对萃取物重量及萃取物的风味物质进行感官评价及GC-MS确定超临界提取烘烤花生风味物质的最优条件为萃取温度55℃，萃取压力25MPa，萃取时间120min。 

经样品感官评价结果与样品偏差值结果知，感官评价秩和高的样品偏差值低，反之样品感官品价值低的样品偏差值高。经试验证实，样品偏差值与感官评价结果呈现较好的相关性，说明该方法作为客观的仪器测量分析数据，整体评价操作过程对产品风味轮廓的影响是切实可行的。 

SFE-CO₂萃取技术可以萃取出烘烤花生中85％的挥发性风味组分。并且通过选择合适的萃取条件，可以使萃取物的风味轮廓与原料烘烤花生的风味轮廓非常接近。说明利用SFE-CO₂萃取烘烤花生挥发性香气组分是完全可行的。 

Claims (3)

1.一种烘烤花生特征风味物质的鉴定方法，包括如下步骤：以烘烤花生为原料，采用固相微萃取法或动态顶空吹扫法制备待测样品，再将所述待测样品利用气相色谱法、质谱法、嗅觉辨别法及保留指数确定烘烤花生的挥发性物质，再用香气抽提物稀释法确定所述烘烤花生的挥发性物质对所述烘烤花生整体风味贡献的大小，完成所述烘烤花生特征风味物质的鉴定；所述气相色谱法检测完毕的样品按照体积比1∶1的比例分成两份分别进行所述质谱法和嗅觉辨别法检测；

所述固相微萃取法步骤中，时间为20-60分钟，温度为35-75℃，萃取头为75μmCAR/PDMS；

所述动态顶空吹扫法步骤中，吹扫时间为40-80分钟，平衡温度为40-80℃，氮气流速为10-500mL/min；

所述气相色谱法中，载气流速均为0.8mL/min，柱温均为40℃，进样口温度均为230℃，进样量均为10μL，载气均为氦气；

所述质谱法中，离子源为70eV的EI源，所述离子源的温度为200℃，接口温度为250℃，扫描范围为33～450amu；

所述气相色谱法中，程序升温步骤均为：设定初始温度为40℃，稳定3min后，以5℃/min的升温速率升至120℃，然后以10℃/min的升温速率升至230℃，稳定5min后，开始上样检测，检测结束后柱温自动降回40℃；

所述气相色谱法中，气相色谱柱均为DB-WAX石英毛细管柱；所述氦气的纯度均为99％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相微萃取法步骤中，时间为40分钟，温度为55℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动态顶空吹扫法步骤中，吹扫时间为60分钟，平衡温度为60℃，氮气流速为100mL/min。

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