CN102127570A - 半乳糖激酶在合成n-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用 - Google Patents

半乳糖激酶在合成n-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用 Download PDF

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陈蕾蕾
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Abstract

本发明涉及半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用，属于生物技术技术领域。包括：(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶配制成半乳糖激酶溶液；(2)将与N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物配制成N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；(3)将半乳糖激酶溶液与N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按比例混合，并加入MgCl2和ATP；反应后，经纯化步骤，获得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。本发明克服了现有研究中由于半乳糖激酶不能合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸或者合成葡萄糖-1-磷酸的效率非常低，无法应用于实际生产中的技术偏见。

Description

半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用
技术领域
本发明涉及半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用，属于生物技术技术领域。
背景技术
目前许多的天然产物和药物都带有糖基，糖基的改变会影响这些糖缀合物的生物学功能及性质，如影响其稳定性，半衰期等。对糖缀合物的糖基进行改变首先需要得到糖基供体，因此，如何得到糖基供体成为研究中的关键步骤。
N-乙酰半乳糖(GalNAc)是一种重要的糖基，在生物体内广泛存在并且参与许多的生物功能。合成含有N-乙酰半乳糖(GalNAc)的糖缀合物需要核苷乙酰半乳糖(UDP-GalNAc)作为糖基供体。UDP-GalNAc可以通过核苷乙酰葡萄糖(UDP-GlcNAc)转换得到，但是这种生产方法产量很低，成本较高。一个更有效的方法是：利用激酶将GalNAc作为底物生产N-乙酰半乳糖-1-磷酸(GalNAc-1-P)，然后在焦磷酸化酶的作用下，生成UDP-GlcNAc。
目前生产得到GalNAc-1-P的激酶主要是通过GalNAc激酶，还未见有其它激酶用于生产GalNAc-1-P的报道。
作为GalNAc-1-P的衍生物，葡萄糖-1-磷酸也具有重要的生物功能。目前得到葡萄糖-1-磷酸步骤非常复杂。生物体内一般是先合成葡萄糖-6-磷酸，然后在激酶pgm的作用下，再合成葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)。目前还没有发现有直接利用Glc产生Glc-1-P的激酶。利用本发明中的半乳糖激酶(Galk)，可以直接将葡萄糖直接生成Glc-1-P。本发明提供了一种非常有效简便的合成Glc-1-P的方法。
半乳糖激酶(EC 2.7.1.6，ATP：D-galactose-1-phosphototransferase，GalK)主要是可以催化MgATP依赖的磷酸化作用，使半乳糖C-1位的羟基磷酸化从而得到Gal-1-P(半乳糖-1-磷酸)。由于其在酶法制备磷酸糖的过程中具有应用价值，因此，对不同来源的半乳糖激酶的进行底物适应性研究引起了广泛关注。
目前对已有的Galk底物适应性研究表明，D-半乳糖，2-脱氧-半乳糖，3-脱氧-半乳糖，2-氨基-2-脱氧-半乳糖，D-岩藻糖，ATP，2’-dATP，3’-dATP都是GalKs可能的底物。但是目前发现的GalK不能利用N-乙酰半乳糖(GalNAc)生成GalNAc-1-P及其衍生物。
同时，目前仅仅发现只有来源于乳酸菌的Galk具有非常微弱的合成Glc-1-P的能力。由于其微弱的活性(对gal的利用是对glc利用率的26倍)，因此利用来源于乳酸菌的GalK生产Glc-1-P基本不可能。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的应用。
术语解释
酶活(U)：是指在40℃，pH 8.0的条件下，半乳糖激酶在1分钟内能转化1微摩尔底物生成N-乙酰半乳糖的酶量。
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物的应用。
上述应用，步骤如下：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶用Tris-HCl溶液配制成半乳糖激酶溶液；
(2)将与N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物用Tris-HCl溶液配制成N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；
(3)将半乳糖激酶溶液与N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按6～10mmol/U的比例混合，并加入MgCl2和ATP；然后在40～45℃反应3～4h，经纯化步骤，获得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。
所述的N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物为葡萄糖-1-磷酸。
所述的Tris-HCl溶液浓度为50mM、pH 8.0。
所述步骤(3)中，MgCl2终浓度为5mM，ATP终浓度为5mM。
所述步骤(1)中的半乳糖激酶采用如下步骤制得：
<1>将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段插入到质粒pMCSG7中，制得重组质粒pMCSG7-GalK；
<2>将步骤<1>制得的经验证目的基因被正确插入的重组质粒pMCSG7-GalK转化到E.coli BL21(DE3)中的菌体进行蛋白表达，得到酶液；
<3>将步骤<2>制得的酶液经纯化步骤，制得半乳糖激酶。
所述步骤<2>中的蛋白表达，条件如下：
培养基为LB培养基中培养，培养温度为37℃，转速220rpm摇床培养；当OD600nm达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行蛋白诱导表达12小时，即得。
所述步骤<3>中的纯化步骤，具体如下：
将酶液冷冻离心收集菌体，用平衡缓冲液洗涤重悬细胞，破壁后；离心取上清，经层析和透析，然后经浓缩后获得。
上述平衡缓冲液成分如下：500mM NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH 8.0；破壁条件为：400w超声破壁10分钟；离心条件为：12000g冷冻离心30分钟；层析为镍离子亲和柱层析，洗脱缓冲液为：500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM咪唑；透析用20mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液透析。
上述浓缩，步骤如下：
先用低压旋转蒸发仪浓缩，得到的浓缩液用硅胶柱进行纯化，用CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液浓度梯度混合物作为洗脱液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液的比例变化从1∶1到0∶1，再将含有产物的洗脱液进行合并，并用低压旋转蒸发仪进行浓缩。
本发明有益效果如下：
利用本发明的来源于S.pneumoniae TIGR4的半乳糖激酶(GalK)(GenBank accession No.AAK75925)，可以高效的合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物，克服了现有研究中由于半乳糖激酶不能合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸或者合成葡萄糖-1-磷酸的效率非常低，无法应用于实际生产中的技术偏见，本发明中所述的来源于S.pneumoniae TIGR4的半乳糖激酶(galK)对gal的利用是对glc利用率的3倍，远远低于其他来源的半乳糖激酶对gal与glc利用率之间的差距，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 GalKSpe4蛋白表达纯化；
其中：(A)GalKSpe4蛋白纯化；
(B)SDS-PAGE电泳结果图；
其中M：蛋白分子量；泳道1：全细胞提取物泳道2：洗涤后电泳；泳道3：洗脱后电泳；泳道4：洗脱后电泳；
图2 酶活最适温度及pH
(A)最适温度；(B)最适pH
图3 TLC检测结果
其中泳道1：ATP；泳道2：Gal；泳道3：Glc；泳道4：GlcNAc；泳道：GalNAc；泳道6：GlcNAc-1-P；泳道7：Glc-1-P；泳道8：以Gal为底物的酶反应；泳道9：以Glc为底物的酶反应as substrate；泳道10：GlcNAc为底物的酶反应；泳道11：GalNAc为底物的酶反应；
图4 Gal-1-P MS结果
图5 GalNAc-1-P MS结果
图6 Glc-1-P MS结果
图7 Gal-1-P NMR结果
图8 GalNAc-1-P NMR结果
图9 Glc-1-P NMR结果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
实施例
1 材料和方法
1.1 菌种与方法
E.coli DH5α购买于Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)，蛋白表达菌株E.coli BL21(DE3)F- ompT hsdSB(r- Bm- B)gal dcm(DE3)购买于Novagen(Carlsbad，CA)。pMCSG7质粒来自于Novagen(Madison，WI)。PCR所使用的试剂和各种限制性酶来自Invitrogen(Carlsbad，CA)。Qiagen(Valencia，CA)。质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购买于Qiagen公司(Valencia，CA)。镍离子亲和层析柱(5ml)及HiLoad_16/60_superdex 200柱购买于Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。
1.2 从S.pneumonia TIGR4中克隆galK基因。
基因galK的DNA序列(GenBank accession No.AAK75925)从S.pneumoniae TIGR4基因组中提取出来，PCR引物如下：
GalKS：5’-TACTTCCAATCCAATGCGATGGCACAACATCTTACT-3’    (SEQ ID NO.3)
GalKA：5’-TTATCCACTTCCAATGCTAGTCAAGGACGCGAG-3’       (SEQ ID NO.3)。
扩增得到1100-bp的DNA片段，通过DNA测序证明了该序列的正确性。PCR片段被克隆到质粒pMCSG7中。随后，重组质粒pMCSG7-GalK被转化到E.coli DH5α细胞中。挑取的单菌落用限制图谱和DNA测序分析。测序正确的重组载体被转化到E.coli BL21(DE3)中进行蛋白表达。
1.3 GalKSpe4的过表达及蛋白纯化。
含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)菌株在1L LB培养基中培养，培养温度为37℃，转速220rpm。当OD600nm达到0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行蛋白诱导表达。在16℃下过夜，冷冻离心收集菌体。蛋白的表达情况通过SDS-PAGE方法检测。
蛋白纯化：平衡缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM咪唑)，洗涤重悬细胞，400w超声破壁10分钟。12,000g冷冻离心30分钟取上清，将上清加到预先平衡过的镍离子亲和层析柱中。洗脱缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集目的蛋白并用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)透析。目的蛋白的纯度及分子量，用12％SDS-PAGE进行检测。Bradford法测定蛋白浓度。纯化出来的蛋白命名为GalKSpe4，酶液中加入20％甘油并保存在-20冰箱中待用。
1.4 酶活性质检测及酶动力学性质描述
蛋白GalKSpe4对Gal的活性：反应体系(8mM Gal，10mM ATP，5mM MgCl2，6μM GALK)在Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中在45℃下孵育180分钟。在反应中被消耗的还原糖用DNS方法定量测定，以D-Gal作为参比。温度(25-50℃)和pH(3.0-11.0)对GalKSpe4的影响均在以Gal为底物的情况下测定。
动力学数据是通过测定反应过程(2分钟，每隔30秒取样测定)中线性部分的斜率得到的。
1.5 GalKSpe4的底物适应性
GalKSpe4催化Gal、Glc、GalNAc的能力是在45℃条件下孵育混合物3h检测，混合物中含有50mM Tris-HCl，pH 8.0，5mM MgCl2，5mM ATP和适量的酶GalKSpe4。通过沸水浴5分钟终止反应，随后离心去除蛋白沉淀。上清用薄层层析法分析产物生成情况，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1(体积比)。
1.6 纯化磷酸化的产物
反应混合物(10ml)中包括40mM Gal/Glc/GalNAc，50mM ATP，5mM MgCl2，1.5mg/ml GalKSpe4，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。45℃条件下孵育3h后，反应液沸水浴5分钟，离心除去蛋白沉淀。上清用低压旋转蒸发仪浓缩，得到的浓缩液用硅胶柱进行纯化，用CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液浓度梯度混合物作为洗脱液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液的比例变化从1∶1到0∶1。将含有产物的洗脱液进行合并，并用低压旋转蒸发仪进行浓缩。
1.7 鉴定产物
薄层层析分析法在硅胶板上进行的。200-400目的硅胶用来纯化产物。纯化得到的所有化合物均用质谱和氢谱做了充足的分析和鉴定。质谱在Bruker Micro TOF分光仪上进行。氢谱在400MHz下用Bruker DPX 400分光仪分析的。
2 试验结果
2.1 GalKSpe4表达与纯化
为了研究GalKSpe4酶学性质，将克隆的GalKSpe4基因转入pMCSG7载体中。重组酶在E.coli中表达，并用镍柱纯化。收集纯酶并用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)进行透析脱盐。纯化得到的GalKSpe4分子量为37KD，这与通过氨基酸序列计算得到的理论分子量相吻合(图1)
2.2 酶活性质研究
经研究温度及pH对酶活的影响，发现，GalKSpe4的最适温度为45℃，在25℃时也有酶活。但是当温度在45℃以上是，酶会迅速失活，温度达到55℃时，酶几乎没有了活性。如图4B所示，不同pH下GalKSpe4的酶活性质研究表明，该酶在中性pH环境下可催化Gal的磷酸化，最适pH为8.0(图2)。
2.3 利用GalKSpe4合成糖-1-磷酸及其衍生物
通过TLC实验和DNS反应测定了糖/糖-1-磷酸的转化率(图3)。已证明，通过普通硅胶柱从反应液上清中成功分离得到了产物，并进一步通过LC-MS和NMR鉴定了产物的性质。GalKSpe4的底物适应性研究表明，该酶对Gal具有很高的活性，同时，它也可以利用Glc和GalNAc。利用GalKSpe4可以有效的合成Gal-1-P，Glc-1-P，GalNAc-1-P(图4-8).
同时还检测了GalKSpe4对于不同的底物(Gal、Glc、GalNAc)的动力学参数，其结果与底物适应性研究相吻合。该酶对于Gal的kcat/Km值(4.22mM-1min-1)约是对于Glc(1.42mM-1 min-1)和GalNAc(1.37mM-1 min-1)的3倍(表1)。
表1 GalKSpe4对不同糖的动力学性质
Figure BSA00000349816000051
Figure ISA00000349816200041

Claims (10)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶用Tris-HCl溶液配制成半乳糖激酶溶液；
(2)将与N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物用Tris-HCl溶液配制成N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；
(3)将半乳糖激酶溶液与N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按6～10mmol/U的比例混合，并加入MgCl2和ATP；然后在40～45℃反应3～4h，经纯化步骤，获得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的Tris-HCl溶液浓度为50mM、pH 8.0。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，MgCl2终浓度为5mM，ATP终浓度为5mM。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的半乳糖激酶采用如下步骤制得：
<1>将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段插入到质粒pMCSG7中，制得重组质粒pMCSG7-GalK；
<2>将步骤<1>制得的经验证目的基因被正确插入的重组质粒pMCSG7-GalK转化到E.coli BL21(DE3)中的菌体进行蛋白表达，得到酶液；
<3>将步骤<2>制得的酶液经纯化步骤，制得半乳糖激酶。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤<2>中的蛋白表达，条件如下：
培养基为LB培养基中培养，培养温度为37℃，转速220rpm摇床培养；当OD600nm达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行蛋白诱导表达12小时，即得。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤<3>中的纯化步骤，具体如下：
将酶液冷冻离心收集菌体，用平衡缓冲液洗涤重悬细胞，破壁后；离心取上清，经层析和透析，然后经浓缩后获得。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述平衡缓冲液成分如下：500mM NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH 8.0；破壁条件为：400w超声破壁10分钟；离心条件为：12000g冷冻离心30分钟；层析为镍离子亲和柱层析，洗脱缓冲液为：500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM咪唑；透析用20mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液透析。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述浓缩，步骤如下：
先用低压旋转蒸发仪浓缩，得到的浓缩液用硅胶柱进行纯化，用CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液浓度梯度混合物作为洗脱液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液的比例变化从1∶1到0∶1，再将含有产物的洗脱液进行合并，并用低压旋转蒸发仪进行浓缩。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物为葡萄糖-1-磷酸。
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