CN102127550A - 植物一个npr1基因及其所编码的蛋白质与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物的一个NPR1基因，其特征在于具有下述核苷酸序列：a)序列表中的Seq ID No.1的DNA序列；b)在高严谨条件下与序列表中Seq ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件为在0.1×SSPE、0.1×SSC或0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜；c)编码与序列表中Seq ID No.2相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。本发明的基因及其编码的蛋白能够增强植物抗病性，尤其是对小麦白粉病、纹枯病和赤霉病的抗性。

Description

植物一个NPR1基因及其所编码的蛋白质与应用

技术领域

本发明涉及一个植物NPR1基因及其所编码的蛋白质与应用，特别是涉及一个来源于荆州黑麦的NPR1基因及其所编码的蛋白质，以及其在培育抗病性提高的转基因植物中的应用。属于分子生物学和生物技术领域。

技术背景

植物病害一直是制约农作物生长发育和增产增收的重要因素。植物在长期的进化过程中，逐渐形成了一系列免疫系统以低御病原物侵染。植物的先天免疫系统存在相互联系的两个分支，即病原相关的分子模式触发的免疫和病原物无毒基因触发的免疫。前者是通过植物细胞表面的模式识别受体识别病原相关的分子模式而激发，进而引起促分裂原活化蛋白激酶级联反应。后者是通过植物抗病基因识别和它对应的病原物无毒基因产生的一种高效特异性反应，即系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。SAR是一种对多种真菌具有广谱抗性的诱导防卫反应抗性。SAR的发生伴随着系统性水杨酸(salicylic acid，SA)含量的增加和病程相关(pathogenesis-related，PR)蛋白的表达。病程相关基因非表达子1(non-expresser of PR1，NPR1)是SAR的重要转录因子，NPR1与细胞核内的包含碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)的TGA转录因子相互作用，引起下游抗病基因的表达。研究发现，AtNPR1基因突变后，拟南芥突变体影响了SAR的激活从而提高了多种病菌的感病性^[1-4]。相反，过量表达AtNPR1基因的拟南芥中增强了对细菌和线虫抗性^[5]。同样，AtNPR1基因在番茄中过量表达后，转基因番茄对真菌和细菌具有广谱抗性^[6]，过量表达AtNPR1基因提高了转基因水稻植株对白叶枯病菌的抗性^[7]。

荆州黑麦(Secale cereale cv Jingzhouheimai)是原产我国的优异小麦近缘种资源，具有良好的赤霉病、纹枯病和白粉病抗性。因此，分离与克隆荆州黑麦中NPR1同源基因，不仅有利于揭示荆州黑麦的抗病机制，还可通过基因操作的手段进行植物抗病分子育种以提高植物抗病性。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的在于提供一个来源于荆州黑麦的NPR1类基因及其所编码的蛋白质。

植物的一个NPR1基因，名称为Secale cereale cv Jingzhouheimai non-expresser of PR1(简称ScNPR1)，来源于荆州黑麦(Secale cereale cv Jingzhouheimai)，其特征在于：

a)序列表中Seq ID No.1的DNA序列；

b)在高严谨条件下可与序列表中Seq ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE、0.1×SSC或0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

c)编码与序列表中Seq ID No.2相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列；

其中：列表中的SEQ ID No：1由3185脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第1518位至3041位脱氧核苷酸，编码具有序列表中Seq ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

植物的一个NPR1基因所编码的蛋白，其特征在于：

a)序列表中的Seq ID No.2；

b)将序列表中Seq ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的氨基酸残基序列。

其中，序列表中的Seq ID No.2由507个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第165位至第300位氨基酸残基为保守的NPR1保守结构域。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ScNPR1任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的是提供一种将本发明中的ScNPR1在调控植物抗病中的应用。

本发明所提供的调控植物抗病性的应用，是将所述荆州黑麦NPR1类基因导入植物组织或细胞，植物抗病性得到提高。

所述的ScNPR1基因可通过含有ScNPR1的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25或其他衍生植物表达载体；使用本发明的ScNPR1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记(卡那霉素、潮霉素等)或抗化学试剂标记基因(如抗除草剂bar基因等)及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。

携带有ScNPR1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用，既可适用于单子叶植物(小麦、水稻、玉米等)，也可以适用双子叶植物(烟草、棉花等)。

本发明提供的ScNPR1基因来自荆州黑麦，实时定量PCR检测结果表明ScNPR1在荆州黑麦的根、茎、叶、节、穗中均有表达，其中在叶中的表达量最高；在白粉病菌、赤霉病菌和纹枯病菌接种后，ScNPR1在荆州黑麦叶片中的表达量明显提高，表明该基因受病原菌的强烈诱导。转基因烟草实验证明该基因的超量表达提高了烟草对赤霉病的抗性。因此，ScNPR1可作为目的基因导入植物(包括单子叶和双子叶植物)，提高植物抗病性，具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1为ScNPR mRNA在不同组织器官中表达丰度的实时定量PCR检测结果

图2为不同病原菌处理对ScNPR mRNA表达影响的实时定量PCR检测结果

图3为mpCAMBIA2301载体物理图谱

图4为mpCAMBIA2301::ScNPR植物表达载体物理图谱

图5为mpCAMBIA2301::ScNPR转基因烟草的PCR验证照片

图6为mpCAMBIA2301::ScNPR转基因烟草的RT-PCR验证照片

图7为mpCAMBIA2301::ScNPR转基因烟草的抗病实验结果，其中左为转基因，右为对照

具体发明实施方式：

下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：荆州黑麦ScNPR1的克隆

利用生物信息学和常规聚合酶链式反应(PCR)相结合的方法克隆荆州黑麦ScNPR1的DNA序列，具体方法为：

取接种白粉病菌12h的荆州黑麦叶片作为实验材料，采用SV Total RNA lysis试剂盒(Promega公司，美国)提取总RNA。按照TaKaRa公司提供的方法(PrimeScript^TM Reverse Transcriptase)合成cDNA第一条链，并用其作模板进行PCR扩增。根据已知的NPR1保守序列设计一对简并引物(引物由上海生物工程公司合成)：

正向引物N-F1：5’-CTTGACTCTGAC(T)GATGTA(T)GAGCTA-3’，见Seq ID No.3

反向引物N-R1：5’-AC C(T)TGAGCAATA(G)TCCATTGCTAC-3’，见Seq ID No.4。

通过RT-PCR方法扩增获得ScNPR1基因片段。25μlPCR反应体系：2.5μl含MgCl₂的10×PCR缓冲液，正、反向10μM的引物各1.0μl，1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)，2.0μl cDNA样品，0.25μlLA-Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，17.5μl双蒸水。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。将扩增得到的约500bp的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)按试剂盒提供的方案进行回收并克隆到pEASY-T1(Clontech)载体上，进行测序分析，测序由上海invitrogen公司完成。序列分析表明该序列编码的氨基酸序列与NPR1类蛋白的保守区片段高度同源，因此确定获得了ScNPR1基因片段。

根据已获得的ScNPR1保守区段设计两条特异性引物(由上海生物工程公司合成)作为3’-RACE的5’引物：

P1：5’-AGGGCAGACTAACCTTGATGATG-3’，见Seq No.5；

P2：5’-AAGAAAAGCAGTTCAAATCGCAAAG-3’，见Seq No.6。

3’端引物由试剂盒提供。取1μg总RNA进行3’RACE，RACE程序按照invitrogen公司(美国)提供的3’RACE试剂盒说明书进行。

用P1与3’端引物进行第一轮PCR扩增，所得PCR产物经稀释100倍后取1ul做为模板，用P2与3’端引物进行第二轮PCR扩增，获得该基因的cDNA的3′端。25μl PCR反应体系含5.0μl 5×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各0.5μl、1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和17.0μl双蒸水，以及0.25μl PrimerSTAR^TM HS DNA Polymeras酶(宝生物工程(大连)有限公司)。第一轮与第二轮PCR反应条件均为：98℃预变性3min后，98℃10s，58℃20s，72℃2min30s，共30个循环；然后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并克隆到pEASY-T1载体上，送往invitrogen公司进行测序分析。

根据已获得的ScNPR1保守区段设计合成四条5’RACE引物。取1μg总RNA进行5’RACE，RACE程序按照invitrogen公司(美国)提供的5’RACE试剂盒说明书进行。

5’RACE逆转录引物

Oligo(dT)₁₅-AUAP：GGCCACGCG TCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT，见Seq No.7。

5’RACE的四条3’端特异引物分别为：

P3：5’-ATGTCCATTGCTACTCTTGCCTCA-3’，见Seq No.8；

P4：5’-CCACGAAGACAGTCACCAGCCAAT-3’，见Seq No.9；

P5：5’-TCCATCAAATGTAAAATCGGAAGGC-3’见Seq No.10；

P6：5’-ATTTTTGAGTCACAGTGTTCTACGGC-3’见Seq No.11。

P3与试剂盒提供的5’端通用引物AAP：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGIIGGGIIG，见Seq No.12(其中所述n为I)，进行第一轮PCR扩增，所得PCR产物经稀释100倍后取1ul做为模板，用P4与试剂盒提供的5′sites Adaptor Primer AUAP：GGCCACGCGTCGACTAGTAC引物进行第二轮PCR扩增，所得PCR产物经稀释100倍后取1ul做为模板，用P5与试剂盒提供的5′sites Adaptor Primer AUAP引物进行第三轮PCR扩增，所得PCR产物经稀释100倍后取1ul做为模板，用P6与试剂盒提供的5′sites Adaptor Primer AUAP引物进行第四轮PCR扩增，获得该基因cDNA约2300bp的5’端。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并克隆到pEASY-T1载体上，送往invitrogen公司进行测序分析。测序结果表明该序列就是目的序列。25μl PCR反应体系含5.0μl 5×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各0.5μl、1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和17.0μl双蒸水，以及0.25μl PrimerSTAR^TM HSDNA Polymeras酶(宝生物工程(大连)有限公司)。四轮PCR反应条件均为：98℃预变性3min后，98℃10s，58℃(5’RACE第二轮开始每轮反应增加2℃)20s，72℃2min30s，共30个循环，然后72℃延伸10min。

将克隆的cDNA片段、3’末端核苷酸序列及5’末端核苷酸序列进行拼接(采用DNAMAN生物学软件进行序列拼接)，获得了荆州黑麦ScNRP1基因全长cDNA序列。用1μg荆州黑麦叶片总RNA经反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法反转录得到的cDNA为模板，根据ScNRP1基因全长cDNA序列设计一对引物如下(引物由上海生物工程公司合成)：

P7：5’-ATGCTCTCCATGCGGAGTCCCTACCTTC-3’，见Seq No.13，

P8：5’-TCATCTCCTGGTCCGACCTGTCAAGTTC-3’，见Seq No.14。

25μl PCR反应体系含5.0μl 5×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各0.5μl、1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和17.0μl双蒸水，以及0.25μl PrimerSTAR^TMHS DNA Polymeras酶(宝生物工程(大连)有限公司)。PCR反应条件为：98℃预变性3min后，98℃10s，62℃20s，72℃2min30s，共35个循环，然后72℃延伸10min。将扩增得到的约1500bp DNA片段用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，并克隆到pEASY-T1载体上，送往invitrogen公司进行测序。测序结果表明该序列就是目的序列，该基因命名为Secale cereale cv Jingzhouheimai non-expresser of PR1(简称ScNPR1)。

实施例2：ScNPR1转录本的时空分布与病原菌诱导下对ScNPR1基因表达的影响

用实时定量PCR的方法检测ScNPR1在荆州黑麦植株中的组织分布情况，并采取以下措施保证检测结果的可靠性：用扩增级别DNase I消化提取的总RNA中可能存在的少量的基因组DNA的污染，为检测基因组DNA是否消除干净，可取出一部分用DNase I消化的总RNA样品进行常规PCR反应，当发现没有扩增条带产生时，再进行反转录步骤；由于ScNPR1基因没有内含子，且在荆州黑麦中可能有其同家族成员，所以扩增产物选在了特异性强的靠近5’端的cDNA编码区，同时为了进一步验证实时定量PCR扩增的条带是否就是ScNPR1，将PCR产物切胶回收进行测序。具体方法为：取荆州黑麦成株期根、茎、叶、节和穗等材料提取总RNA为模板，依据所获得的cDNA全长序列设计ScNPR1基因实时定量PCR的引物(引物由上海生物工程公司合成)：

ScNPR1-F(上游引物)：5’-CTAAAATCATCGTCTCCCT-3’，见Seq No.15；

ScNPR1-R(下游引物)：5’-ATTCCCAAAATAATCCCCA-3’，见Seq No.16；

以荆州黑麦的actin(激动蛋白)cDNA为内参，实时定量PCR引物为(引物由上海生物工程公司合成)：

actin-F(上游引物)：5’-TACTCCCTCACAACAACC-3’，见Seq No.17

actin-R(下游引物)：5’-GCTCCTGCTCATAATCAA-3’，见Seq No.18；

实验步骤如下：先取1μg总RNA加入扩增级别DNase I(Sigma，USA)室温放置30分钟来去除基因组DNA的污染，然后加入停止缓冲液(50mM EDTA)，70℃加热10分钟变性DNase I和RNA；然后采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒按照试剂盒说明书进行反转录，每个样品取1μg总RNA，在42℃下反应1小时，在70℃加热10分钟后取出，置于冰上，以使反转录酶使活；最后取1μl翻转录产物进行实时定量PCR扩增。用SYBR Green I染料，在荧光定量PCR仪Light Cycler 2.0(Roche公司)上进行。数据处理采用Light Cycler 2.0中的2^-△△cp方法进行基因相对表达量分析。PCR反应条件为：95℃5s，60℃10s，72℃20s，共40个循环。检测结果表明ScNPR1在所检测的组织中呈现一种组成型表达的模式，而在叶中的表达量最高，茎其次，根、节和穗的表达量较低(图1)，说明该基因是功能型表达。

为了研究ScNPR1对病原菌胁迫的响应，用实时定量PCR的方法检测ScNPR1基因在小麦白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌处理条件下的表达模式。将三叶期的荆州黑麦叶片分别以白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌诱导处理0、2、4、8、12、24、36、48和72h，以未做任何处理的三叶期的荆州黑麦为对照，然后用与上述相同的方法检测ScNPR1的表达情况，同样以荆州黑麦的actin(激动蛋白)cDNA为内参。检测结果表明，ScNPR1在正常情况下仅有微量表达，但在白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌诱导下表达明显增强(图2A、2B和2C)。在白粉病菌诱导下(图2A)，ScNPR1在诱导2h时表达量第一次达到最高峰，随后降低，但在12h和36h时又再次上升；然而ScNPR1对纹枯病菌诱导的反应速度相对白粉病菌较慢(图2B)，直到48h时表达量才急剧上升，达到最高峰。但是在禾谷镰刀菌的诱导下(图2C)，短时间内(2h内)NPR1基因的表达量有所降低，但随着处理时间的延长，NPR1基因的表达量急剧上升，并在36h时达到最高峰。这些结果表明：ScNPR1在白粉病菌、纹枯病菌和禾谷镰刀菌诱导下的表达模式有所不同。

实施例3：ScNPR1的植物表达载体的构建及转基因烟草的抗病性实验

(1)表达载体的构建

以ScNPR1cDNA全长序列为模板，在含有酶切位点的引物(上海生物工程公司合成)

P9：5′-GCCTCTAGA ATGCTCTCCATGCGGAGTCCCTACCTTC-3′，见Seq No.19，(带下划线碱基为限制内切酶Xba I识别位点)和

p10：5′GCCCCCGGG TCATCTCCTGGTCCGACCTGTCAAGTTC-3′，见Seq No.20，(带下划线碱基为限制内切酶Sma I识别位点)的引导下，PCR扩增5’端添加Xba I识别位点、3’端添加Sma I识别位点的ScNPR1 cDNA全长序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1500bp的目的片段，将其用Xba I和Sma I酶切后，与经相同酶双酶切的载体mpCAMBIA2301(图3)用T₄DNA连接酶16℃连接过夜(20ul反应体系含1×T₄DNA连接酶缓冲液，mpCAMBIA2301片段0.03pmol，ScNPR1片段0.3pmol，350u T₄DNA连接酶)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992)，转化后得大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含80mg/L卡那霉素的平板，对抗卡那霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采取酶切和测序的方法验证连接的正确性得到植物表达载体mpCAMBIA2301::ScNPR1(图4)。用冻融转化法将此载体转化根癌农杆菌EH105，得到含有mpCAMBIA2301::ScNPR1的农杆菌菌株，命名为TmpCAMBIA2301::ScNPR1；将质粒mpCAMBIA2301转化根癌农杆菌EH105，得到含有mpCAMBIA2301空载体的农杆菌菌株TmpCAMBIA2301。

(2)农杆菌介导的烟草转化与筛选鉴定

从培养平板中挑取单个农杆菌菌落，在含有50mg/L卡那霉素、30mg/L链霉素的2ml YEB培养基中培养过夜；以1％的量接种于100ml YEB培养基中(50mg/L卡那霉素，30mg/L链霉素)培养过夜，6000rpm离心收集菌体，用侵染培养基重新悬浮，菌液浓度调整至OD₆₀₀约0.5做为侵染菌液。采用叶圆盘转化法，用无菌刀片将无菌烟草试管苗叶片切成4～6mm的叶盘，叶盘外植体分别在OD₆₀₀约0.5的TmpCAMBIA2301::ScNPR1和TmpCAMBIA2301(转空载体对照)农杆菌侵染溶液中感染10min，取出后用无菌滤纸吸干表面液体，放入含有共培养液(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)的滤纸上黑暗条件下，25℃共培养2天。经共培养2天的叶盘用含有500mg/L的头孢霉素水溶液洗涤3次，用无菌滤纸吸干表面液体转入筛选分化培养基中，25℃光照培养。转化体的筛选在筛选分化培养基(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、卡那霉素80mg/L、头孢霉素400mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)中进行。待叶片边缘长出丛生再生芽至2-3cm时，用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基(MS基本培养基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH 5.8)中培养25天。转化细胞再生的植株具有卡那霉素抗性，为正常绿色植株，共得15株转基因植株和10株转空载体植株。

用基因组提取试剂盒(Takara)提取TmpCAMBIA2301::ScNPR1和TmpCAMBIA2301烟草基因组DNA，以100ng提取的基因组DNA为模板进行PCR反应。鉴定用PCR为实例1中的引物P7和P8，25μl PCR反应体系含2.5μl含MgCl₂的10×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各1.0μl、1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)、1.0μl基因组DNA模板和18.5μl双蒸水，以及0.25μl rTaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)。扩增反应条件为：95℃预变性4分钟；95℃30秒，62℃50秒，72℃1分30秒，35次循环，72℃延伸10分钟。将扩增产物进行凝胶电泳，在鉴定的15株烟草中，有12株阳性转TmpCAMBIA2301::ScNPR1烟草扩增产物在预计的1527bp处有清晰的条带，而其余假阳性转TmpCAMBIA2301::ScNPR1烟草和转TmpCAMBIA2301烟草(空载体对照)无PCR产物条带(图5)。为了进一步鉴定转基因植株，采用SV Total RNA lysis试剂盒(Promega公司，美国)提取通过基因组检测为阳性的转TmpCAMBIA2301::ScNPR1及转TmpCAMBIA2301烟草(空载体对照)叶片总RNA，用1μg叶片总RNA经反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法反转录得到的cDNA为模板，PCR引物为实例1中的引物P7和P8，25μl PCR反应体系含2.5μl含MgCl₂的10×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各1.0μl、1.0μl 10mM的dNTP(脱氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和18.5μl双蒸水，以及0.25μl rTaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)。扩增反应条件为：95℃预变性4分钟；95℃30秒，62℃50秒，72℃1分30秒，35次循环，72℃延伸10分钟。将扩增产物进行凝胶电泳，鉴定结果如图6所示，在鉴定的12株转TmpCAMBIA2301::ScNPR1烟草阳性植株中，有9株的RT-PCR扩增产物在1527处有清晰的条带，说明该基因在烟草中已进行了转录表达，而有3株转TmpCAMBIA2301::ScNPR1烟草及转TmpCAMBIA2301烟草(空载体对照)的RT-PCR无PCR产物条带，说明该基因在烟草中没有进行转录表达。

(3)基因功能分析

将大小生长一致的转ScNPR1基因T1代阳性烟草苗与转入mpCAMBIA2301空质粒的T1代对照烟草苗在开花期在花基部接种禾谷镰刀菌，7天后进行观察，转基因植株生长正常，对照的花则出现了枯萎死亡的现象。由此可见，ScNPR1在烟草中的过量表达能够提高烟草转基因植株对赤霉病菌侵染的抗性，见图7。

实施例4：高严谨条件下的序列杂交条件

高严谨条件下的序列杂交条件主要参照《分子克隆实验指南》(第二版，P474-490页，科学出版社，1992)。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，本领域的普通技术人员结合本领域的惯用技术手段，借助本发明公开的氨基酸残基序列蛋白质及其编码基因对单子叶植物或双子叶植物进行植物抗病性的调控，均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.植物的一个NPR1基因，其特征在于具有下述核苷酸序列：

a)序列表中的Seq ID No.1的DNA序列；

b)在高严谨条件下与序列表中Seq ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件为在0.1×SSPE、0.1×SSC或0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜；

c)编码与序列表中Seq ID No.2相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的植物的一个NPR1基因所编码的蛋白，其特征在于：

a)所述蛋白质具有序列表中Seq ID No.2的氨基酸残基序列；

b)将序列表中Seq ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的提高植物抗病性的氨基酸残基序列。

3.根据权利要求2所述的一个NPR1基因所编码的蛋白，其特征在于几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

4.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述编码基因的细胞系。

6.含有权利要求1所述编码基因的宿主菌。

7.一种如权利要求1或2所述的植物的一个NPR1基因的应用，其特征在于：将NPR1基因导入植物组织或细胞，提高植物的抗病性。

8.根据权利要求7所述的植物的一个NPR1基因的应用，其特征在于：所述的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述的抗病性为抗白粉病、赤霉病或纹枯病。

9.根据权利要求8所述的植物的一个NPR1基因的应用，其特征在于：所述的双子叶植物为烟草。 

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