CN102127528A - 一种利用宇佐美曲霉生产纤维素酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用宇佐美曲霉生产纤维素酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明以麸皮和稻草等农副产品为发酵基料，并添加适量的无机氮源和无机盐等，利用宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001菌株固态发酵生产纤维素酶。本发明提供了宇佐美曲霉E001菌株实验室小试生产纤维素酶的固态发酵培养基配方和培养条件，其成熟发酵曲料的纤维素酶活性达到了1205～1915U/g干曲。本发明具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低、对环境友好以及纤维素酶活性较高等特点，有利于纤维素的开发和利用，具有较高的经济和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用宇佐美曲霉生产纤维素酶(Cellulases)的方法，具体而言是指利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵生产纤维素酶的新工艺，属于生物工程技术领域。
背景技术
纤维素酶是一类降解纤维素生成葡萄糖的复合酶系，主要包括β-内切葡聚糖酶、β-外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，因此目前常用羧甲基纤维素(CMC)酶活性、滤纸(FPA)酶活性以及β-大麦葡聚糖(BBG)酶活性来表示纤维素酶的活性。纤维素酶的应用已从传统的医药、食品深加工、饲料、酿造等行业，扩展到单细胞发酵、纺织工业、造纸工业、环境污染治理等新领域。目前用于生产纤维素酶的真菌有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉属丝状真菌是公认产纤维素酶较好的菌种之一。
国内已有许多利用微生物发酵生产纤维素酶的文献报道，但发酵酶活性普遍较低，从而限制了该酶的广泛应用。国内外学者通过优化发酵条件使纤维素酶的产量有所提高，张德强等优化绿色木霉产纤维素酶发酵条件，使其CMC酶活达1630.1U/g，FPA酶活达138.2U/g；Latifian M等通过响应面优化使里氏木霉QM9414所产的FPA酶活提高了2.5倍；Kang S W等优化麸皮与稻草比例使黑曲霉产纤维素酶CMC酶活力达到129U/g。有些研究者利用各种物理、化学方法对微生物进行诱变育种以获取高产菌株，邱雁临等通过紫外诱变和亚硝基胍处理将绿色木霉耐高温菌株的CMC酶活和FPA酶活提高到29.6U/g和129.6U/g；杜娟等将灰绿木霉XC9经紫外线、氯化锂和甲基磺酸乙酯等多重诱变，使其液体发酵产CMC酶活达24.2U/ml，提高为原来的两倍；Gadgil N J等通过紫外诱变和亚硝酸钠处理将里氏木霉QM9414液体发酵所产CMC酶活和FPA酶活分别达到6.5U/ml和0.54U/ml，提高了50％和80％。但目前未见有利用宇佐美曲霉固态发酵生产纤维素酶的文献或专利报道。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用麸皮和稻草等农副产品为固态发酵基料，并添加适量的无机氮源、无机盐等，在实验室小试规模上，利用宇佐美曲霉E001菌株固态发酵生产纤维素酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下：
1.菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株，由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2008年在《生物加工过程》杂志的Vo1.6，No.2，Pg.38公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
2.斜面种子培养：去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH 6.0；121℃灭菌20min，放置试管斜面；冷却后接种E001菌株，30℃培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等，每3个月转接1次。
3.麸曲种子制备：250mL三角瓶装10g基料(麸皮10g)，(NH4)2SO4100mg，自来水12mL，pH 6.0；充分混匀，121℃灭菌40min；冷却后接种E001试管斜面种子，30℃静置培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
4.固态发酵：250mL三角瓶装10g基料(麸皮3～8g，稻草2～7g)，(NH4)2SO450～100mg，MgSO45～10mg，CaCl25～10mg，KH2PO430～50mg，自来水10～16mL，pH 4.0～7.0；培养基121℃灭菌40min；冷却后接种一菌耳E001麸曲种子，30～34℃培养72～96h，期间分别于20～24h和40～44h各翻曲一次。
5.粗酶液提取：固态发酵结束后称取发酵曲料1g，加入9mL pH 5.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，室温浸泡1h，滤纸过滤，所得滤液即为纤维素酶粗酶液。
6.分析方法：
BBG酶活性的测定：于25mL具塞试管A和B中，分别加入用pH 5.0、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的β-大麦葡聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应20min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，混匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖(以葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义为：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个纤维素酶活性单位(U)。
还原糖测定：采用DNS法，以葡萄糖为标准。
曲料水分测定：称取一定量的固态发酵培养物(曲料)，105℃烘干至恒重。
7.菌株产酶条件的优化：试验了麸皮与稻草的比例、培养基料水比以及不同起始pH值等参数对宇佐美曲霉E001菌株产酶的影响，得出了较优的产酶条件。
本发明的有益效果：本发明利用宇佐美曲霉E001菌株，采用固态发酵生产纤维素酶，实验室小试产纤维素酶活性可达1205～1915U/g干曲。本发明突出的优点有：①采用优化的培养基配方和发酵条件，充分挖掘了E001菌株产纤维素酶的潜力；②采用较廉价的农副产品如麸皮和稻草等作为固态发酵的主原料，充分地利用了自然界的可再生资源；③固态发酵法对环境友好，是一种绿色环保的生产方式；④与利用微生物液体发酵法相比较，固态发酵法生产纤维素酶具有设备简单、投资少、生产成本低等优势。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述内容的范围仅局限于下述实施例。
实施例1麸皮与稻草比例对产酶的影响
菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株。
固态发酵培养基：250mL三角瓶装10g基料(不同比例的麸皮和稻草)，(NH4)2SO4100mg，MgSO410mg，CaCl210mg，KH2PO450mg，自来水12mL，pH 6.0。
固态发酵条件：发酵培养基(麸皮与稻草比例取3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2)121℃灭菌40min，冷却后接种E001麸曲种子，32℃培养96h，期间于24h和44h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，在麸皮与稻草比例为5∶5时，E001成熟固态发酵曲料的纤维素酶平均酶活性达到1205U/g干曲。
实施例2料水比对产酶的影响
菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株。
固态发酵培养基：250mL三角瓶装10g基料(麸皮5g，稻草5g)，(NH4)2SO4100mg，MgSO410mg，CaCl210mg，KH2PO450mg，自来水10～16mL，pH 6.0。
固态发酵条件：发酵培养基(料水比取1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5和1∶1.6)121℃灭菌40min，冷却后接种一菌耳E001麸曲种子，32℃静置培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，当料水比例为1∶1.4时，E001成熟固态发酵曲料的纤维素酶平均酶活性达到1500U/g干曲。
实施例3培养基起始pH对产酶的影响
菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株。
固态发酵培养基：250mL三角瓶装10g基料(麸皮5g，稻草5g)，(NH4)2S04100mg，MgSO410mg，CaCl210mg，KH2PO450mg，自来水14mL，不同起始pH。
固态发酵条件：发酵培养基(起始pH取4、4.5、5、5.5、6、6.5和7.0)121℃灭菌40min，冷却后接种E001麸曲种子，32℃静置培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，当起始pH为5.0时，E001成熟固态发酵曲料的纤维素酶平均酶活性达到1915U/g干曲。
Claims (5)
1.一种实验室小试规模生产纤维素酶的新方法，其特征在于：以麸皮和稻草等农副产品为固态发酵培养基的基料，并添加适量的无机盐、无机氮源等，在250mL三角瓶中，利用宇佐美曲霉(Asp2ergillus usamii)E001菌株固态发酵生产纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的菌种是宇佐美曲霉E001菌株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用的发酵工艺是固态发酵。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的固态发酵培养基配方为：250mL三角瓶装10g基料(麸皮3～8g，稻草2～7g)，(NH4)2SO450～100mg，MgSO45～10mg，CaCl25～10mg，KH2PO430～50mg，目来水10～16mL，pH 4.0～7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用的固态发酵培养条件为：发酵培养基121℃灭菌40min，冷却后接种一菌耳宇佐美曲霉E001麸曲种子，30～34℃培养72～96h，期间分别于20～24h和40～44h各翻曲一次。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103146587A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-06-12 | 江南大学 | 一种原产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉诱导发酵产角蛋白酶的方法 |
| CN112890024A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-06-04 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种含连翘的青储饲料及其制备方法 |
| CN112890025A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-06-04 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种产纤维素酶的霉菌与乳酸菌联合制备青贮饲料的方法 |
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2010
- 2010-12-10 CN CN2010105813185A patent/CN102127528A/zh active Pending
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