CN102127167A

CN102127167A - 全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用

Info

Publication number: CN102127167A
Application number: CN2010100228414A
Authority: CN
Inventors: 倪健
Original assignee: SUZHOU INDUSTRIAL PARK CHENJIAN ANTIBODY GROUP PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT CO LTD
Current assignee: Youjian Biopharmaceutical Technology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2030-01-15
Also published as: CN102127167B; WO2011085574A1

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用。本发明采用了全人抗体技术，获得了抗人TNFa全人抗体，对该抗体的理化及生物活性的初步分析表明，该抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对L929细胞的杀伤。本发明的全人TNFa单克隆抗体对人体的免疫原性降低到最低。采用PEG化表面改性技术，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗TNFa活性的同时，使之更适合体内应用。

Description

全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNFa结合蛋白及其应用。

背景技术

自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病。类风湿性关节炎(RA)是最常见的自身免疫病之一，我国类风湿关节炎患病率约为0.32-0.36％，在60岁以上人群发病率高达30％～40％。面对每人每年几十万元的进口药物治疗费用，患者往往只能长期忍受痛苦的化学治疗，却又收效甚微。

RA的患病人群多，用药量大，使其治疗性药物的市场巨大，2005年全球市场达到60亿美元。目前临床治疗RA的方案很多，首选用大剂量非甾体抗炎药可控制症状，如无效，则临床首选氨甲蝶呤等免疫抑制药治疗。约四分之一的患者首次发病后经及时治疗可终生不再复发，约二分之一的患者经治疗后症状暂时得以缓解，但仍会反复发作，部分最终发展为关节功能障碍；约四分之一的患者对目前所有的常规治疗均无效。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是类风湿性关节炎病变过程中起主要作用的细胞因子，实验和临床结果均证实TNF是治疗该病的适合靶点。国外对RA的发病机理进行了充分的研究，发现肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)在该疾病的病理进程中起十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高。TNFα和TNFβ是哺乳动物细胞中的一类同源分泌型蛋白质，它们相互之间具有很高的同源性，二者都可以对许多细胞类型造成多方面的影响。这两种蛋白都可以通过与细胞膜上的受体作用而影响细胞的生物学功能。肿瘤坏死因子TNFα能够引起肿瘤组织出血坏死并具有多方面功能。成熟分子由157个氨基酸组成，含有两个二硫键，没有糖基化位点。其前体为233个氨基酸组成的多肽，N-端76个氨基酸组成的多肽不是信号肽，它可以把前体固定在细胞膜上，使成熟的分泌型保留在细胞膜上。前体的成熟mRNA长度为1.7kb。在体内主要由单核巨噬细胞产生。

针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。代表药物如Wyeth/Amgen公司Enbrel(etanercept)，Johnson & Johnson，Schering Plough/Centocor公司Remicade(infliximab)，Cambridge Antibody Technology/Abbott的Humira(adalimumab)。Enbrel为Amgen公司开发的制剂，是TNF-α受体和Fc的融合蛋白，不仅对风湿性关节炎有非常不错的疗效，且对牛皮癣及牛皮癣型关节炎也有明显的治疗作用，同时在促进脊椎炎愈合的研究上，Enbrel也进入了二期临床。2004年销售额是25亿美元，预计2008年可达34亿美元。Remicade是一种人鼠嵌合性的抗TNF-α单克隆抗体，可特异性结合可溶性及膜结合型TNF-α，其适应症包括Crohn’病，风湿性关节炎(RA)，重症强直性脊柱炎(AS)。在2003年和2004年全球销售额分别是22.7亿和28.9亿美元，是生物医药领域的“重磅炸弹”。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个获准用于减轻成人中到重度活动期RA的病征和症状及抑制关节结构损伤进展的全人单克隆抗体。由于是全人抗体，避免了Remicade会产生免疫反应的缺点。Humira与Remicade及Enbrel相比的另一个优势是给药方法的便利上。Humira每月只需注射两次，而Remicade和Enbrel必须每周注射两次。Humira市场占有率正逐年提高，2003年和2004年的销售额分别是2.8亿和8.5亿美元。2006年，全球三大抗TNF-α拮抗剂Humira与Remicade及Enbrel 3个药物已近80亿美元，2008年Enbrel(64.9)、Remicade(53.3)、Humira(45.2)、Cimzia合计为163亿美元。

这三个代表药物的疗效均比较确定，并且随着大规模临床试验的不断开展，除RA以外的克隆氏病、强直性脊柱炎、银屑病等其他自身免疫病也相继成为新的适应症，使其市场更加庞大。这些生物产品的特异性高，靶向性好使其副作用较其他同类药物明显降低，逐渐地与甲氨蝶呤合用作为RA的一线用药，并增强它们对目前中至重度的风湿性疾病等其他自身免疫病市场的渗透。目前处于开发末期阶段的新药主要有UCB/Celltech公司的CDP-870(PEG化人源化抗TNF抗体Fab片段)和CDP571(人源化抗TNF单抗)，Bristol-Myers Squibb公司的CTLA4lg(Abatacept)，Roche公司的Rituxan和MRA等。其中进展最迅速的是CDP-870，目前已经进入临床III期，CDP-870于2006年底进入市场，CDP-870应用大肠杆菌进行生产，使其成本降低至其他TNF抑制剂药物的四分之一。

虽然现有的TNF抗体类药物被认为较其它任何药物的效果都好，但它们也存在很大的缺点。第一，它们均来自哺乳动物细胞表达和纯化，由于表达水平较低和生产能力有限远远不能满足市场的需求，即便是Amgen斥资5亿美金创建了全球最大的20,000升细胞培养生物反应器，这一问题依然存在(据2004年美国biopharma报告)；第二，这些抗体的高昂成本使很大一部分患者被拒之门外，据估计，常规应用Enbrel、Remicade和Humira治疗RA一年的费用分别是11400、14200和16776美金，且需反复使用(据2004年美国biopharma报告)；第三，这些抗体所携带的Fc段具有结合补体和ADCC等活性，体内应用会导致表达TNF的细胞的凋亡，会产生一系列副作用；第四，Remicade是人鼠嵌合性单抗，含有1/3的鼠源蛋白成分，连续注射可以在10％以上的病人中激发人抗鼠源蛋白抗体反应或人抗嵌合蛋白抗体反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。即将上市的CDP870是PEG化人源化抗TNF抗体Fab段[17]，其鼠源蛋白成分下降到10％，但仍然有免疫原性。而Humir的可变区的氨基酸序列和相应的DNA序列来自于CAT公司开发的人源抗体库，其Fc片段的编码区来自人的IgG1。由此可见，该产品的可变区序列并非直接来自人，而是来自起源于人B细胞的抗体库。

此外，虽然人类免疫系统能够产生种类极其庞大的抗体，但是人或全人抗体技术却遇到了瓶颈：人体内产生特异性抗体的前体细胞丰度很低，即使在抗体阳性的个体中，能够产生特异性抗体的前体细胞也远远低于人杂交瘤技术所需要的能够产生特异性抗体细胞数量。因此，分离、纯化和富集特异性分泌抗体的B细胞成为建立全人抗体平台的关键技术之一。

发明内容

本发明用全人抗体技术从类风湿关节炎病人体的B细胞中获得抗人TNFa单克隆抗体，发酵、纯化后，采用聚乙二醇化(PEG化)方法体外改造和修饰，在保持其抗TNF活性的同时，使之更适合体内应用。

本发明第一方面公开了一种抗人TNFa单克隆抗体，包括重链与轻链，其轻链具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列，其重链具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

进一步的，所述抗人TNFa单克隆抗体经PEG化修饰。

本发明第二方面公开了一种多核苷酸，该多核苷酸含有编码前述抗人TNFa单克隆抗体的重链和/或轻链的多核苷酸序列。

进一步的，编码前述抗人TNFa单克隆抗体的轻链的多核苷酸的序列为SEQ ID NO：1，编码前述抗人TNFa单克隆抗体的重链的多核苷酸的序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5，编码抗人TNFa单克隆全长抗体的重链和轻链的多核苷酸的序列同时含有SEQ ID NO：1与SEQ IDNO：2或者同时含有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：5。

本发明第三方面公开了一种遗传工程化的宿主细胞，它被含有编码前述抗人TNFa单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸的载体所转化或转导。任何适用于对表达盒进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可以是：中国仓鼠的卵巢细胞CHO；幼仓鼠的肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；幼鼠的塞尔托利细胞(sertoli cells)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴的肾脏细胞(COS细胞)；通过SV40(COS-7，ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞；人的胚肾细胞(HEK-293，Graham et al.J.GenVirol.36：59(1977))；猴肾脏细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人的子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)等。其他细胞系在本学科领域的文献中也比较常见。从美国模式菌种收集中心(ATCC)可以获得多种细胞系。

把核酸导入细胞的方法有许多种。比较常用的方法包括电穿孔技术、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境。在某些情况下，可以采用多阴离子转染脂质体和钙离子调节的细胞质基因转化技术。

本发明第四方面公开了抗人TNFa单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：1)在适合表达抗人TNFa单克隆抗体的条件下培养所述宿主细胞；2)分离纯化获得所述单克隆抗体。

在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。例如将含有编码目标抗体的核酸的载体直接导入宿主细胞，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导出被编码抗体的表达。

一旦获得本发明所说的单克隆抗体，就可以采用本领域技术人员所知的常规方法对抗体分子进行纯化。具体纯化方法包括色谱法，比如，离子交换，亲和层析，尤其与蛋白质A的特定抗原进行亲和层析，以及尺寸柱层析、离心过滤法、差异溶解度等。在很多情况下，细胞分泌的抗体进入培养液，并在培养液中收获。

本发明第四方面对抗人TNFa单克隆抗体通过体外活性测定和动物实验研究了该抗体在动物体内的治疗有效性，进一步公开了上述抗人TNFa单克隆抗体的制药用途。抗人TNFa单克隆抗体可用于制备治疗与TNFa相关的炎症的药物，如制备治疗类风湿性关节炎的药物。将本发明的抗人TNFa抗体用于治疗类风湿性关节炎等与TNFa相关的炎症时的用法用量，可参照现有的TNFa抗体的常规用法用量。

本发明第五方面，还提供了一种医药组合物，其包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体以及医药学上可接受的载体。可作为医药学上可接受的载体及其组分的物质包括糖类；纤维素及其衍生物；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂；多元醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂；着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。

本发明有益效果：

本发明采用了全人抗体技术，获得了抗人TNFa全人抗体，对该抗体的理化及生物活性的初步分析表明，该抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对L929细胞的杀伤。一方面，由于其全部氨基酸序列均与人抗体完全一致，使其对人体的免疫原性降低到最低。其次，采用PEG化表面改性技术，以减小其被内皮系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗TNFa活性的同时，使之更适合体内应用。与现有的单抗药物相比，可以大大降低用药频率。这不但进一步降低了病人的经济负担，而且大大减少了病人注射的痛苦，减少了劳动力损失。

具体实施方式

以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1抗人TNFa抗体基因的获得

取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养，根据ELISA结果鉴定阳性克隆。

1.选择血样

为了获得分泌抗人TNFa的人B细胞，首先用人TNFa(购自深圳晶美公司)常规包被96孔板，每孔用该蛋白250ng，包被过夜。然后，用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，奶粉用pH7.2PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清100微升，室温温育1小时。然后加入过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温放置1小时。洗涤至少5遍后，加入含TMD或其他显色剂，室温或37度处理20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入10分钟后，用50μl1N的硫酸终止反应，读取450nm光密度值。选取阳性且OD值高的血清作为获选血样。

2.分离并富集分泌抗TNF抗体的人B-细胞

3.在适当条件下对分泌抗TNF抗体的人B-细胞进行培养

4.抗体-反应ELISA筛选

用ELISA检测抗TNFa IgG的分泌。对人B细胞培养液上清的样品进行筛选。其中，选择出具有最好的结合能力的两个阳性克隆，且为IgG1。

取阳性克隆细胞各5000-10000个，分别用Trizol(GIBCO)分离总RNA，用MMLV反转录酶(Promega公司产品)以获取cDNA。上述操作均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为ClonTech的Pfu以确保扩增过程中减少可能的突变。

轻链上游引物：GAAATTGTGCTCACACAGTC(SEQ ID NO：7)

轻链下游引物：CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQ ID NO：8)

重链上游引物：GAAGTCCAGCTGGTCGAGAG(SEQ ID NO：9)

重链下游引物：GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTC(SEQ ID NO：10)

PCR条件：

a)反应体系的组成：

b)反应条件：

预变性：94度2分钟

主循环：94度1分钟，55度1分钟，72度3分钟。

循环数：20

后延伸：72度5分钟

PCR过程在PROGENE Genium热循环仪上进行。

c)电泳鉴定与胶回收

按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在1％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，两个PCR的产物分别为650bp和670bp左右，与理论大小相符。用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行，各得DNA约2微克。

克隆与测序：

上述产物常规克隆到pUC57，鉴定出正确克隆后进行测序。克隆方法采用MBI公司试剂盒，操作按照说明书进行。对阳性克隆进行测序，结果显示，该两个克隆分别为人IgG1抗体的重链和轻链的编码基因。

实施例2抗人TNFa抗体的制备

1.重链和轻链编码序列的获得

为了进行全长抗体的基因表达，根据实施例1的测序结果，分别合成了人IgG1的全长重链及轻链序列，以便构成完整的抗人TNFa抗体-01基因。

以下片段为轻链编码区，长度为：645bp。(SEQ ID NO：1)GAAATTGTGCTCACACAGTCACCAGACTTTCAGTCTGTCACCCCTAAGGAGAAAGTGACCATCACTTGCAGGGCCTCTCAGTTCGTCGGCTATAGTATCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGATCAGTCCCCTAAACTGCTGATCAAGTACGCCTCTGAATCAAGGTCAGGTGTCCCCAGTCGATTTTCTGGATCAGGATCTGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAATAGCTTGGAGGCCGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAACAAAGCCACAGCTGGCACTTTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTTGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

其编码的轻链氨基酸序列为(SEQ ID NO：3)：EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQFVGYSIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWHFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

以下片段为全长的重链编码区，长度为：1353bp。(SEQ ID NO：2)GAAGTCCAGCTGGTCGAGAGCGGTGGCGGGCTGGTGCAACCCGGTGGATCACTGCGGCTCAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTTCCCTTCTCTAACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGTGAGATCAGGAGTAAGTCTATGAACTCCGCCACACACTATGCTGAAAGCGTGAAAGGGCGCTTCACAATCTCTAGAGACGATTCAAAGAACTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGAAAACAGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCTCGGAACTACTACGGTTCAACTTACGACCACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

其编码的重链全长氨基酸序列为(SEQ ID NO：4)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSNHWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRSKSMNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARNYYGSTYDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

还有一个抗体TNFa抗体-02，轻链及重链可变区和TNFa抗体-01一致，重链恒定区与TNFa抗体-02相比有三个氨基酸不同。

TNFa抗体-02的全长重链编码区为：(SEQ ID NO：5)GAAGTCCAGCTGGTCGAGAGCGGTGGCGGGCTGGTGCAACCCGGTGGATCACTGCGGCTCAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTTCCCTTCTCTAACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGTGAGATCAGGAGTAAGTCTATGAACTCCGCCACACACTATGCTGAAAGCGTGAAAGGGCGCTTCACAATCTCTAGAGACGATTCAAAGAACTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGAAAACAGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCTCGGAACTACTACGGTTCAACTTACGACCACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

其编码的重链全长氨基酸序列为(SEQID NO：6)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSNHWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRSKSMNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARNYYGSTYDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

3.抗人TNFa单克隆抗体全长真核表达载体的构建

将两个TNF抗体的重链全长编码区(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5)，轻链编码区(SEQ IDNO：1)，polyA和PCMV按照常规Overlapping PCR方法分别进行拼接，拼接后的片段为lightchain+polyA+PCMV+heavy chain。克隆到Promega公司的pCI载体上构建的载体分别命名为pCI-TNF-01和pCI-TNF-02。

4.CHO细胞的转染与筛选

本研究采用脂质体法(LipoFemine 2000，Invitrogen)对CHO细胞进行转染，转染试剂盒购自Invitrogen公司，转染时分别取上述纯化的分别带有重链和轻链的质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。

转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，并逐步添加MTX 2nM、5nM、20nM、40nM、80nM、120nM、160nM、200nM、250nM、300nM进行筛选，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为：15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO₂培养箱中培养。在此过程中取细胞培养上清进行ELISA检测，经过三次ELISA检测，得到阳性的混合克隆并冻存部分细胞。

然后按照常规极度稀释法进行单克隆化，对混合克隆用96孔板极限稀释法进行第一次单克隆培养，稀释细胞密度为2.5个细胞/ml，每孔加入200ul细胞悬液，挑选得到200个单克隆，经过ELISA检测挑选出89个阳性克隆。取ELISA结果中前35个单克隆进行放大培养，并分别冻存部分细胞。对单克隆进行第二次极限稀释法进行亚克隆培养，细胞培养上清经过两次的ELISA鉴定得到826个单克隆，取ELISA检测的前35个单克隆进行第三次亚克隆，细胞培养上清经过ELISA鉴定得到1026个单克隆，取ELISA结果中前30个进行放大培养，并冻存部分细胞。取单克隆细胞提取RNA，进行目的基因的检测，确认所得到的单克隆细胞的目的基因拷贝数，验证为抗人TNF抗体。进行抗体蛋白N端测序，结果与设计氨基酸一致。

5.基因表达水平的研究

经ELISA上述部分克隆的表达强度进行了研究，数据显示，通过MTX筛选，获得了明显提高的抗体表达量。

根据表达量，确定具有较好的生长特性和表达量的克隆作为继续研究的对象。

将上述的表达细胞株培养后用Protein A-Sepharose进行亲和层析，获得纯度达95％以上的抗体蛋白。

实施例3抗人TNFa单克隆抗体的PEG化

将实施例2获得的抗人TNFa抗体进行结构改造引入游离巯基，在第229位氨基酸C后加入两个保护剂氨基酸AA形成游离巯基，并进一步PEG化，PEG化和纯化方法参照APChampman等[参考文献：Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo halflife.Nature Biotech.V17 1999 August，Page 780-783]的方法进行，获得PEG化的抗人TNFa单克隆抗体。ELISA鉴定后证实与TNFa反应呈阳性。制备的PEG化抗体以L929细胞(ECACC 85011425)进行保护性试验(参考实施例5)，发现PEG化抗体具有很好的保护作用。

实施例4抗人TNFa单克隆抗体生物学活性检测

1.ELISA测试方法：

1)将抗体用PBS稀释到同一个浓度1mg/mL

2)按照倍比稀释法将1mg/mL的倍比稀释

3)设立阴性对照，空白对照以及阳性对照(humiria)

4)数据处理OD450-稀释倍数

结论：在以0.1ug/孔包被的酶标板中，与一系列浓度梯度的抗体共温育，ELISA检测OD值，结果如下：ELISA检测到的humira最低浓度为0.25ug/mL；抗人TNFa抗体-01和抗人TNFa抗体-02检测的最低浓度为0.125ug/mL，是对照humira的1/2倍。结果显示实施例3所获得的抗体活性明显高于对照。

3.用Biacore T100分析所获得的抗人TNFa单克隆抗体与抗原结合的亲和力

(1)芯片偶联

a、用pH5的Acetate buffer稀释样品(抗原TNFa)溶液，使样品浓度分别为2μg/ml。

b、按照Biacore X100 control software的kinetics/affinity assay程序中immobilize方法将TNFa偶联至芯片上。设置偶联水平为3000RU。

根据其自动运行的结果报告偶联水平，自动报告偶联结果。最终偶联为3847.5RU.

(2)抗体检测方法以及步骤

a、将抗体分别用HBS-EP缓冲液稀释抗体，使抗体浓度分别为0、1，2，4，8，16，32，64，400nmol/L

b、进样：结合时间120s，解离900s.再生缓冲液为50nmNaOH。按照Biacore X100 controlsoftware的kinetics/affinity程序运行kinetics/affinity assay。

c、数据分析

按照Biacore X100 Evaluation软件分析结果。选择曲线比较平稳的浓度进行亲和力数据分析，至少选择5个不同浓度的曲线。分析目标是使U值尽可能接近1.如果U值大于15此结果则不可信。

抗体名称	Ka(M^-1s^-1)	Kd(s^-1)	Kd(M)
				抗人TNFa-01	5.685×10⁵	1.854×10^-4	3.260×10^-10
抗人TNFa-02	5.707×10⁵	1.881×10^-4	3.297×10^-10
				humira	1.289×10⁵	2.593×10^-4	2.012×10^-9

结果显示实施例3所获得的抗体结合常数比较、解离常数比较和亲和力比较明显高于对照。

实施例5抗人TNFa单克隆抗体效应功能-L929细胞保护试验

测定方法说明：

1.96孔板，每孔20000细胞，培养过夜；

2.抗体用梯度稀释后过滤除菌，每孔加入50微升，并辅以Actinomycin D至终浓度1ug/ml；

3.加入hTNFa至终浓度80pg/ml；

4.5％CO2培养箱中37度培养过夜；

5.用CellTiter Aqueous One Solution Reagent显色后，492nm测定光密度；

6.光密度对抗体浓度作图。

humira	IC50(pM)	抗人TNFa-01	IC50(pM)	抗人TNFa-02	IC50(pM)
						实验1	1.37	实验1	0.56	实验1	0.234
实验2	2.52	实验2	0.938	实验2	0.34
						实验3	2.324	实验3	0.46	实验3	0.25
平均值	2.42±0.1	平均值	0.51±0.05	平均值	0.275±0.06

结果表明：抗人TNFa-01的IC50大约是humira的1/5，中和活性相当于对照humira的5倍，抗人TNFa-02的IC50大约是humira的1/10，中和活性相当于对照humira的10倍。

实施例6抗人TNFa单克隆抗体一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况

分别取抗人TNFa-01和抗人TNFa-02以100倍临床剂量(50mg/ml)注射，未发现明显副作用。

--注射部位反应(ISRs)：瘙痒、红肿等均轻微。

--非注射部位反应：萎靡不振等，均轻微。

试验材料：

动物：17-22g的健康小鼠(同次试验体重相差不超过4g)，大鼠体重一般120-150g(同次试验体重相差不超过10g)

受试物：液体或粉末剂(不溶于水的可用0.5％羧甲基纤素钠，10％阿拉伯胶制成的混悬剂)。

试验方法：

1.剂量选择：一般选用4-5个剂量组，各剂量组间间距应根据受试物毒性大小和预试结果而定，一般以0.65-0.85为宜。

2.给受试物途径及体积：二种途径，其中一种必须是该受试物推荐临床研究的给药途径。小鼠口服灌胃(po)、静脉注射(iv)、腹腔注射(ip)和皮下注射(sc)的体积，应以0.5-0.8、0.5、0.5和0.5ml为宜。大鼠上述途径给受试物体积应小于或等于3、1、3和1ml为好。

3.实验分组和观察：试验时，将动物按体重随机分成4-5组，每组至少10只动物(雌雄各半)，给受试物后即刻观察动物反应情况，继续观察7-14天，记录动物毒性反应情况和死亡动物分布，死亡动物应及时进行尸检，记录病变情况。若有肉眼可见变化时则需进行病理检查。

结果处理：

用Bliss统计法计算LD50值大于900mg/kg。

实施例7抗人TNFa单克隆抗体交叉性反应性实验

分别取抗人TNFa-01和抗人TNFa-02用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测，西安陕西超英科技有限公司提供的正常多器官组织芯片(NC00-01-003)。

·用间接免疫荧光法检测抗体在正常多器官组织芯片中的表达.

-一抗分别为抗人TNFa单克隆抗体和空白对照，

-二抗为分别为兔抗人Ig-FITC和山羊抗小鼠Ig-FITC。

结果：与正常的心、脑、肝、肺、肾、眼、食道、胰腺、乳腺、睾丸、卵巢组织没有结合。

实施例8抗人TNFa单克隆抗体竞争抑制实验

方法概要：

1.实验采用ELISA方法进行，包被人TNFα量为0.1ug/孔。

2.抗人TNFa-01和抗人TNFa-02的工作浓度恒定为500ng/ml。

3.各种来源的TNFα的竞争浓度梯度为2000-15.6ng/ml。

结果：

1.人TNFα对抗人TNFa-01和抗人TNFa-02结合人TNFα具有很好的竟争抑制作用。

2.猴TNFα对抗人TNFa-01和抗人TNFa-02结合人TNFα具有弱的竟争抑制作用。小鼠TNFα具有较弱的竟争抑制作用

3.大鼠TNFα未体现出竟争抑制作用。

4.抗人TNFa-01和抗人TNFa-02对不同来源的TNFα的结合能力是人＞猴＞小鼠＞大鼠。

5.提示将来的药理/毒理模型以猴为好。

实施例9抗人TNFa单克隆抗体保护人TNFa攻击小鼠试验

实验一、TNF对小鼠致死剂量大范围的探索

1、试剂与耗材

D-半乳糖胺批号：079K1502 EC 217-198-1

EDGE 1ml灭菌注射器批号：YZB/国0265-2007 有效期：三年Balb/c小鼠 12只

2、实验步骤

(1)、7ml 20mg/ml D-半乳糖胺致敏剂的制备：

准确称取D-半乳糖胺粉末140mg，打开超净工作台，紫外照射30min，在超净工作台中量取7ml灭菌后PBS，将140mg粉末溶于PBS中，用0.22μm过滤器精密过滤。

(2)、实验准备

a、实验设为对照组与实验组，随机抓取3只小鼠分为一笼，共4笼，其中④号为对照组，①②③号为实验组。

b、分别对①②③④号的小鼠腹腔注射D-半乳糖胺致敏剂，10mg/只，即每只小鼠注射0.5ml。

(3)、24h后腹腔注射TNF-α

a、TNF-α总溶液：将1mg的TNF-α粉末用1ml无菌PBS溶解，配制成1mg/ml的溶液。

b、按照下列方法配制不同浓度的TNF-α溶液，并腹腔注射小鼠，每只0.5ml。

实验组①：100μg/0.5ml/只小鼠：300μl TNF-α+1200μl无菌PBS

实验组②：30μg/0.5ml/只小鼠：90μl TNF-α+1410μl无菌PBS

实验组③：10μg/0.5ml/只小鼠：30μl TNF-α+1470μl无菌PBS

对照组④：1.5ml无菌PBS(0.5ml/只小鼠，共3只)

注射6小时后观察小鼠死亡情况。

3、实验结果

实验组①：死亡3只，

实验组②：2只萎靡不振，1只正常

实验组③：3只正常

对照组无死亡

4、结论：

TNFa致死剂量范围在5mg/kg～1.5mg/Kg

实验二、TNFa对小鼠致死剂量小范围的探索

1、6ml 20mg/ml D-半乳糖胺致敏剂的制备：

准确称取D-半乳糖胺粉末120mg，打开超净工作台，紫外照射30min，在超净工作台中量取6ml灭菌后PBS，将120mg粉末溶于PBS中，用0.22μm过滤器精密过滤。

2、实验准备：

(1)、实验设为对照组与实验组，随机抓取3只小鼠分为一笼，共4笼，其中④号为对照组，①②③号为实验组。

(2)、分别对①②③④号的小鼠腹腔注射D-半乳糖胺致敏剂，500mg/kg只，即每只小鼠注射0.5ml。

3、24h后腹腔注射TNF-α：

b、按照下列方法配制不同浓度的TNF-α溶液，并腹腔注射小鼠，每只小鼠体重20g±1g，每只0.5ml。

实验组①：80μg/0.5ml/只小鼠：240μl TNF-α+1260μl无菌PBS

实验组②：60μg/0.5ml/只小鼠：180μl TNF-α+1320μl无菌PBS

实验组③：40μg/0.5ml/只小鼠：120μl TNF-α+1380μl无菌PBS

对照组④：1.5ml无菌PBS(0.5ml/只小鼠，共3只)

注射12小时后观察小鼠死亡情况。

4、实验结果

实验组①：48h后3只全死亡

实验组②：72h后3只全死亡

实验组③：无死亡

对照组④：无死亡

5、结论：

TNFa的致死剂量最佳为：4mg/Kg

实验三、抗肿瘤坏死因子抗体对小鼠保护作用

1、试剂与耗材

D-半乳糖胺批号：079K1502 EC 217-198-1

EDGE 1ml灭菌注射器批号：YZB/国0265-2007 有效期：三年Balb/c小鼠 60只

2、实验步骤

(1)、27ml 20mg/ml D-半乳糖胺致敏剂的制备：

准确称取D-半乳糖胺粉末540mg，打开超净工作台，紫外照射30min，在超净工作台中量取27ml灭菌后PBS，将540mg粉末溶于无菌PBS中，用0.22μm过滤器精密过滤。

(2)、实验准备：

实验设为对照组与实验组，随机抓取6只小鼠分为一笼，共10笼，其中⑩号为对照组，①～⑨号为实验组。

(3)、分别对①～⑩号的小鼠腹腔注射D-半乳糖胺致敏剂，10mg/只，即每只小鼠注射0.5ml。

(4)、24h后腹腔注射TNF-α

a、TNF-α总溶液：将1mg的TNF-α粉术用1ml无菌PBS溶解，配制成1mg/ml的溶液。

b、根据肿瘤坏死因子致死剂量的探索后所得结果，设定TNF-α浓度为80μg/0.5ml/只小鼠

(5)、注射抗体

2小时后注射抗体。每种抗体剂量按照高中低剂量分为三组，设置humiria抗体为阳性对照组。设置PBS为阴性对照组。每组小鼠6只，每只小鼠体重20±1g.

3、结论

初步实验结论得出抗人TNFa-01和抗人TNFa-02保护剂量小于11ug/小鼠/1ugTNFa。

序列表

<110>苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司

<120>全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用

<130>091674

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>645

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体轻链核苷酸序列

<400>1

gaaattgtgc tcacacagtc accagacttt cagtctgtca cccctaagga gaaagtgacc 60

atcacttgca gggcctctca gttcgtcggc tatagtatcc actggtacca gcagaaaccc 120

gatcagtccc ctaaactgct gatcaagtac gcctctgaat caaggtcagg tgtccccagt 180

cgattttctg gatcaggatc tggtaccgac ttcaccctca ccatcaatag cttggaggcc 240

gaggacgctg ctacctacta ctgccaacaa agccacagct ggcactttac ttttggccag 300

gggaccaagc ttgagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210>2

<211>1353

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体重链核苷酸序列

<400>2

gaagtccagc tggtcgagag cggtggcggg ctggtgcaac ccggtggatc actgcggctc 60

agctgcgctg ctagtggctt tcccttctct aaccactgga tgaattgggt ccggcaggct 120

ccaggaaagg gtctggagtg ggtgggtgag atcaggagta agtctatgaa ctccgccaca 180

cactatgctg aaagcgtgaa agggcgcttc acaatctcta gagacgattc aaagaactct 240

ctgtacctgc agatgaacag tctgaaaaca gaggacaccg ctgtgtatta ctgtgctcgg 300

aactactacg gttcaactta cgaccactgg ggccaaggta cactggtcac cgtctcgagt 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ccctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

<210>3

<211>214

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体轻链氨基酸序列

<400>3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Tyr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp His Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>4

<211>450

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体重链氨基酸序列

<400>4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn His

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ser Met Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210>5

<211>1353

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体重链核苷酸序列

<400>5

gaagtccagc tggtcgagag cggtggcggg ctggtgcaac ccggtggatc actgcggctc 60

agctgcgctg ctagtggctt tcccttctct aaccactgga tgaattgggt ccggcaggct 120

ccaggaaagg gtctggagtg ggtgggtgag atcaggagta agtctatgaa ctccgccaca 180

cactatgctg aaagcgtgaa agggcgcttc acaatctcta gagacgattc aaagaactct 240

ctgtacctgc agatgaacag tctgaaaaca gaggacaccg ctgtgtatta ctgtgctcgg 300

aactactacg gttcaactta cgaccactgg ggccaaggta cactggtcac cgtctcgagt 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

<210>6

<211>450

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>抗人TNFa单克隆抗体重链氨基酸序列

<400>6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn His

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ser Met Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>7

gaaattgtgc tcacacagtc 20

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>8

ctaacactct cccctgttga agc 23

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>9

gaagtccagc tggtcgagag 20

<210>10

<211>27

<212>DNA

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<220>

<223>引物

<400>10

gtgagttttg tcacaagatt tgggctc 27

Claims

1.一种抗人TNFa单克隆抗体，包括重链与轻链，其轻链具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其重链具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述抗人TNFa单克隆抗体，其特征在于，所述抗人TNFa单克隆抗体经PEG化修饰。

3.一种多核苷酸，该多核苷酸含有编码权利要求1所述抗人TNFa单克隆抗体的重链和/或轻链的多核苷酸序列。

4.如权利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述编码抗人TNFa单克隆抗体的轻链的多核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码抗人TNFa单克隆抗体的重链的多核苷酸序列为SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：5，编码抗人TNFa单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸序列同时含有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2或者同时含有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：5。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，它被含有编码权利要求1所述抗人TNFa单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸的载体所转化或转导。

6.如权利要求5所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述编码抗人TNFa单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸的序列同时含有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2或者同时含有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：5。

7.如权利要求5或6所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。

8.如权利要求7所遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为CHO细胞。

9.一种抗人TNFa单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：1)在适合表达抗人TNFa单克隆抗体的条件下培养权利要求5-8任一权利要求所述宿主细胞；2)分离纯化获得所述单克隆抗体。

10.如权利要求1或2所述抗人TNFa单克隆抗体的用途，为用于制备治疗与TNFa相关的炎症的药物。

11.如权利要求10所述抗人TNFa单克隆抗体的用途，其特征在于，所述治疗与TNFa相关的炎症的药物为治疗类风湿性关节炎的药物。

12.一种医药组合物，其包含权利要求1或2所述抗人TNFa单克隆抗体以及医药学上可接受的载体。