CN102123725A

CN102123725A - 用作精神刺激剂的Opiorphin

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Publication number: CN102123725A
Application number: CN2009801281531A
Authority: CN
Inventors: C·鲁诺
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 2008-05-26
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2011-07-13
Also published as: AU2009256765B2; AU2009256765A1; US20110178021A1; EP3009142A1; US20150329608A1; RU2526819C2; EP4218786A2; CA2725243A1; KR20110020857A; IL209462A; FR2931362A1; CA2725243C; JP2011521002A; WO2009150040A3; BRPI0909592A2; MX2010012856A; WO2009150040A2; RU2010153244A; EP2307039A2; EP4218786A3

Abstract

本发明涉及用作精神刺激剂的衍生自人碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的肽，特别是opiorphin。这些肽用于治疗或预防疾病如强迫性障碍(OCD)、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、在成人中和在儿童中的注意缺陷和/或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍的疾病。

Description

用作精神刺激剂的Opiorphin

本发明涉及用作精神刺激剂的衍生自由Prol1基因编码的人BPLP(碱性富脯氨酸泪蛋白，Basic Proline-rich Lacrimal Protein)蛋白的肽，特别是opiorphin。本发明还涉及这种肽用于制备精神刺激剂的用途。

精神刺激剂是被认为是精神性刺激剂的精神治疗性物质，其促进神经系统的活性并刺激动机(motivation)和幸福感(well-being)。根据由Delay和Deniker建立的精神治疗剂的分类，精神刺激剂特别包括智能兴奋剂(nooanaleptics)，如警觉度(alertness)刺激剂(安非他明)，抗抑郁剂情感兴奋剂(thymoanaleptics)，以及各种刺激剂如阿拉伯茶(khat)和咖啡因。

精神刺激剂通过刺激神经传递而起作用。它们被用于治疗各种症状，包括警觉下降、发作性睡病、肥胖症、儿童中的注意缺陷和/或活动过度、强迫性障碍(OCD)、抑郁，躁狂和双极疾病(bipolar disease)。

但是，精神刺激剂经常与副作用相关联，如依赖、耐受、突然撤药(sudden withdrawal)后抑郁以及焦虑。因此，需要具有有限和/或最小副作用的精神刺激剂。

在1988年鉴定了由雄激素调节的主要在成年大鼠下颌下腺和前列腺中表达的基因(Rosinski-Chupin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85(22)：8553-7；EP 0 394 424)。这个基因编码前体，“下颌下大鼠1蛋白”(SMR1)。此前体于体内在多基位点(multibasic sites)被剪切，产生3个结构上接近的肽(Rougeot et al.，Eur.J.Biochem.1994；219(3)：765-73)。

已经确定序列为QHNPR(SEQ ID NO：6)的衍生自SMR1的称作sialorphin的肽是细胞通讯的激素信使。因此，sialorphin是外分泌和内分泌激素肽，其表达由雄激素以及由肾上腺素能信号介导的环境紧张下引起的分泌来调节(Rougeot et al.，Am.J.Physiol.1997；273(4Pt2)：R1309-20)。

sialorphin在成年雄性大鼠中是应对环境紧张而分泌的这个事实导致如下假说，这个肽可能在与生殖相关的生理学和行为信号的整合中起作用。评估了sialorphin在性行为中所起的作用，实验数据显示sialorphin具有根据环境背景调节雄性大鼠性行为的能力。国际专利申请WO 01/00221描述了SMR1的成熟产物在治疗精神和/或行为障碍包括性障碍中的用途。

另外，发现SMR1成熟产物识别器官中的特定位点，所述位点涉及矿物质的浓缩。国际专利申请WO 98/37100描述了SMR1成熟产物用于治疗或预防与矿物质失衡相关的疾病的治疗用途。

Rougeot et al.，Proc.Natl.Aca.Sci.USA 2003；100(14)：8549-54)已证实sialorphin在体内所结合的表面受体是NEP内肽酶(中性溶酶Neprilysin；EC 3.4.24.11)。另外，已证实sialorphin是NEP活性的配体及生理学拮抗剂。因此，sialorphin是在哺乳动物中鉴定出且在大鼠疼痛模型中展示强止痛作用的第一个NEP脑啡肽酶生理学抑制剂(欧洲专利申请EP 1 216 707)。

欧洲专利申请EP 1 577 320描述了sialorphin的人功能性同系物。序列为SEQ ID NO：2的这种肽称为opiorphin。计算机上的基因组分析已揭示其对应序列SEQ ID NO：5的BPLP蛋白的成熟片段。该BPLP蛋白也称为“碱性富脯氨酸泪蛋白”、“富脯氨酸蛋白1”或“PRL1”，并且由人基因Prol1编码。已示出opiorphin抑制生理学NEP和APN底物即P物质和甲硫氨酸脑啡肽的降解。欧洲专利申请EP 1 577 320表明opiorphin具有止痛性质并且其可以特别用于治疗或预防疼痛。

opiorphin的止痛作用随后由Rougeot和Messaoudi确认(Med.Sci.(Paris)2007；23(1)：37-9)。还显示出这种止痛作用不伴随抗蠕动作用，不像用吗啡时发生的那样，吗啡是目前使用的最强的止痛剂(Rougeot C，Proceedings of the 4th International Peptide Symposium；J.Wilce(Editor)onbehalf of the Australian Peptide Society，2007)。

本发明人发现，opiorphin令人惊奇地不仅具有止痛性质，而且具有精神刺激作用。另外，这种精神刺激作用不与健忘、镇静、活动过度或成瘾性类型的任何副作用相关联。最后，发现opiorphin的止痛能力与吗啡一样强，以及其精神刺激能力与丙米嗪一样强。

因此，opiorphin及衍生肽可以有利地用作精神刺激剂用于治疗或预防疾病，如发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、成人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、强迫性障碍(OCD)及心境障碍如抑郁、双极疾病、心境恶劣障碍和循环型情感障碍(cyclothymic disorder)。

本发明的肽

本发明涉及肽的治疗应用，所述肽包含或者由称为参照肽或序列的序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产物的衍生物组成。这种肽在本申请文字中被称为“本发明的肽”。

在本发明范围内，“肽”是指包含通过肽键互相结合的氨基酸线性链的分子。所述链可以是环状，即线性肽两端或者氨基酸侧链基团通过化学键结合。本发明的肽具有少于100个氨基酸。优选地，所述肽由4-40、4-35、4-30、4-20、4-10、5-40、5-35、5-30、5-20、5-10、5-8或5-6个氨基酸组成。

“成熟产物”是指通过前体蛋白质在成熟共有位点经激素原转变酶的选择性蛋白酶剪切而获得的肽。激素原转变酶将无活性前体转化为活性肽并且包括例如弗林蛋白酶(furin)、PC转变酶或者PACE 4。所述成熟共有位点的序列优选符合下述共有区：[H/R/K]-X₃-[R/K]-[R/K]，其中[H/R/K]是指该氨基酸是H、R或者K，X₃代表三个氨基酸的链，[R/K]是指该氨基酸是R或者K。激素原转变酶剪切二元残基(dibasicresidues)[R/K]-[R/K]之间的共有区单元。激素原转变酶是本领域技术人员所公知的并且特别经Scamuffa et al.(2006FASEB J.20(12)：1954-63)描述。

序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的一个成熟产物是序列SEQ ID NO：2的QRFSR肽。前蛋白原BPLP的序列含有信号肽的切口共有位点，其剪切产生蛋白原QRFSRRX(n)。此蛋白原QRFSRRX_(n)含有二元位点RR和在2R之间的切口位点的-4位的碱性氨基酸。所述QRFSR肽在激素原转变酶的作用后产生。

本发明的肽还包括包含或由序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物组成的肽的衍生物。

“肽衍生物”是指具有相对于参照肽包含一或多个突变(取代、插入或者缺失)的氨基酸序列的肽。优选地，所述肽仅包含取代类型的突变。所述取代可以是保守或者非保守的。优选地，所述肽相对于参照肽包含最多1、2、3、4或5个突变或取代。“肽衍生物”还指包含或由序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物组成的肽的拟肽(peptidomimetics)(参见例如Abell，1997，Advances in Amino AcidMimetics and Peptidomimetics，London：JAI Press；Gante，1994，Peptidmimetica，massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew.Chem.106：1780-1802；and Olson et al.，1993，J.Med.Chem.36：3039-3049)。本发明优选的拟肽包括2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/042922及2009年4月7日提交的国际申请PCT/EP2009/054171中描述的那些。

在优选的实施方案中，本发明的肽与参照序列的不同仅在于存在保守取代。保守取代是相同类别氨基酸的取代，如氨基酸不带电侧链上的取代(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)，氨基酸碱性侧链上的取代(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、氨基酸酸性侧链上的取代(如天冬氨酸和谷氨酸)、氨基酸非极性侧链上的取代(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)。

优选地，本发明的肽是分离的肽。“分离的”肽此处是指从人体或从非人哺乳动物的生物体分离的肽，优选是纯化的形式。但是，所述分离的肽可以例如存在于药物组合物中或试剂盒中。优选地，所述肽存在于下述药物组合物之一中。

本发明的肽发挥精神刺激活性。“发挥精神刺激活性的肽”是指这样的肽：

-其在行为绝望测试(behavioral despair test)(例如大鼠中的强迫游泳测试)中发挥针对顺从(resignation)的保护作用；和/或

-其抑制金属外肽酶如NEP(中性溶酶；中性内肽酶；EC3.4.24.11)和/或APN(氨肽酶N；EC 3.4.11.2)的活性。优选地，所述肽抑制NEP和APN活性。不受特定理论限制，本发明人相信本发明的肽通过抑制脑啡肽被这两个金属外肽酶的降解而强化它们在作用幅度和作用时间方面的生理学作用，并由此激活阿片样物质途径，更具体是脑啡肽依赖性μ-和δ-阿片样物质受体(opiod receptor)。

针对顺从的保护作用可以通过在大鼠中的强迫游泳测试确定。在这个测试中，当肽发挥针对顺从的保护作用时，施用所述肽的大鼠的不动时间(immobility time)相对于对照大鼠的不动时间降低了。这个测试包括如下测试：

-测试前时段，在此期间将大鼠置于水中一段确定的时间(10-20分钟之间，例如15分钟)，然后将它们从水中取出，干燥并放回其笼子。

-若干小时后(20-25小时后，例如24小时后)，测试时段，期间将大鼠再次置于水中一段确定时间(5-8分钟之间，例如5分钟)，然后从水中取出，干燥并放回其笼子。

在测试前时段之后及测试之前施用待测试的肽。在测试前期间和测试期间记录大鼠不动时间5分钟。将施用肽的大鼠不动时间与对照大鼠的不动时间以及与相同大鼠在测试前时段中的不动时间相比较。实施例3更详细描述了大鼠中强迫游泳测试的方案。

金属外肽酶如NEP和/或APN的活性的抑制可以通过本领域技术人员公知的任何技术测量。可以例如使用欧洲专利申请EP 1 577 320的实施例2所描述的一种方法。例如，可以通过测量LNCaP细胞的膜制备物中P物质的降解的抑制来测量NEP的抑制活性。此方案在Rougeot et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003；100(14)：8549-54)中及在2009年1月19日提交的国际申请PCT/EP2009/050567中有详细描述。

在特定实施方案中，本发明的肽包含或由序列SEQ ID NO：5的片段组成，或者包含或由衍生自序列SEQ ID NO：5的所述片段的肽组成。

优选地，本发明的肽包含或由序列X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ IDNO：1)组成，其中：

-X₁代表氢原子、酪氨酸或半胱氨酸；

-当X₁是氢原子时，X₂代表谷氨酰胺或焦谷氨酸；

-当X₁是酪氨酸或半胱氨酸时，X₂代表谷氨酰胺；及

-所述序列X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端。

优选地，本发明的肽由序列X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO：1)组成。本发明的肽可以例如由QRFSR序列(SEQ ID NO：2)、YQRFSR(SEQ ID NO：3)或CQRFSR(SEQ ID NO：4)组成。或者，本发明的肽可以因保守取代与序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4不同。

在另一个特定实施方案中，本发明的肽包含或由序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的等位基因变体的成熟产生组成。

为清楚起见，规定序列SEQ ID NO：6的sialorphin排除在本发明的肽之外。

本发明的肽可以进一步包括一或多种改善其稳定性和/或其生物利用率的化学修饰。此修饰可以例如是目的在于获得比初始肽更稳定和更亲脂的肽。包括一或多种改善其稳定性和/或其生物利用率的化学修饰的所述肽是本发明的肽的一部分。

这种化学或酶修饰是本领域技术人员公知的。以非限制性的方式，可提及例如下述修饰：

-所述肽的C末端或N末端的修饰，如N末端脱氨或酰化(优选乙酰化)，或者如C末端酰胺化或酯化；

-两个氨基酸之间酰胺键的修饰，如酰化(优选乙酰化)或者在α氮或碳的烷基化；

-手性变化，如用相应D-对映异构体取代天然氨基酸(L对映异构体)。这种修饰可以伴随侧链的反转(inversion)(从C末端到N末端)；

-改变为重氮肽(azapeptides)，其中一或多个α碳由氮原子替换；和/或

-改变为β肽(betapeptides)，其中一或多个碳被加到主链的N-α侧或者C-α侧。

由此，肽的一或多个氨基酸，丝氨酸(Ser)和/或苏氨酸(Thr)，可以被修饰，特别是通过在丝氨酸和/或苏氨酸的侧链的OH基团引入酯基、醚基或者C₈辛酰基。可以用羧酸、酐、经桥连(bridge)等进行简单的操作酯化，以形成例如乙酸酯或苯甲酸酯。提供更稳定化合物的醚化，可以用醇、卤化物等进行，以形成例如甲醚或O-糖苷。

另外，肽的一或多个氨基酸赖氨酸(Lys)可以也同时或者另外被修饰，特别是通过：

-酰胺化：此修饰易于完成，赖氨酸的正电荷被疏水性基团(例如乙酰基或苯乙酰基)取代；

-氨基化：通过从伯胺R＝(CH₂)₄-NH₃ ⁺形成仲酰胺，例如通过形成N-甲基、N-烯丙基或者N-苄基基团；及

-通过形成N-氧化物、N-亚硝基、N-二烷基磷酰基、N-亚氧硫基或N-糖苷基团。

另外，一或多个氨基酸谷氨酰胺(Gln)可以也同时或者另外被修饰，例如通过酰胺化，通过形成仲胺或叔胺，特别是用官能化(functionalized)或未官能化的甲基、乙基类型的基团。

另外，一或多个氨基酸谷氨酸(Glu)和/或天冬氨酸(Asp)可以也同时或者另外被修饰，例如：

-通过酯化，以形成取代或未取代的甲酯、乙酯、苄基酯、硫醇(活化的酯)；及

-通过酰胺化，特别是为了形成N，N-二甲基、硝基酰苯胺、吡咯烷基团。

另一方面，优选不修饰脯氨酸，其参与所述肽的二级结构，另外注意氨基酸Gly、Ala和Met通常不提供修饰可能性，其显然是感兴趣的。

包括一或多个化学修饰以改善其稳定性和/或其生物利用率的这种肽的例子在2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/042922和2009年4月7日提交的国际申请PCT/EP2009/054171中有描述。这些包括下式(I)的肽：

ζ-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-OH (I)，

其中：

-ζ是氢原子、酪氨酸、Y-[接头]-或者Zn螯合基团，如半胱氨酸、C-[接头]-、N-乙酰-半胱氨酸、N-巯基乙酰基(HS-CH₂-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选取代的羟基喹啉，

-AA₁是Q或Glp，

-AA₂是K、R或H，优选R，

-AA₃是Y、G、N、F或F(X)，优选F或F(X)，

-AA₄是P、S或S(OAlk)，优选S或S(OAlk)，

-AA₅是K或R，优选R，

-C-[接头]-是指Cys-[NH-(CH₂)n-CO]-，其中n是1-20之间的整数，

-Y-[接头]-是指Tyr-[NH-(CH₂)_n’-CO]-，其中n’是1-20之间的整数，

-F(X)是指苯丙氨酸，其苯基由一或多个卤原子取代，

-S(OAlk)是指丝氨酸，其羟基由具有1-20个碳原子的线性或分支烷基取代，

-所述AA₁，AA₂，AA₃，AA₄和AA₅可以独立地为L-构型或D-构型，并且AA₁，AA₂，AA₃，AA₄和AA₅之任一个可以任选地是b氨基酸、重氮氨基酸或者b-重氮氨基酸；

其中如果肽衍生物包含半胱氨酸，则所述肽衍生物任选是二聚体，条件是该肽不是QRFSR，QHNPR，QRGPR，YQRFSR或GlpRFSR。

在式(I)的肽中，优选的肽包括那些抑制NEP和APN的肽。这种肽可具有下式(IV)：

ζ^m-Q-R-AA^m ₃-AA^m ₄-R-OH (IV)，

其中：

-ζ^m是氢原子、或Zn螯合基团，如半胱氨酸、C-[接头]-、N-乙酰-半胱氨酸、N-巯基乙酰基(HS-CH₂-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选取代的羟基喹啉，

-AAⁿ ₃是F或F(X)，优选F(X)，

-AA^m ₄是S或S(OAlk)，优选S或S(OAlk)，

-C-[接头]-、F(X)和S(OAlk)如上述对式(I)肽的定义，

-所述Q、R、AA₃、AA₄和R可以独立地是L-构型或D-构型，并且Q、R、AA₃、AA₄和R之任一个可以任选地是β氨基酸、重氮氨基酸、或者β-重氮氨基酸；

其中如果肽衍生物包含半胱氨酸，则所述肽衍生物任选是二聚体，条件是该肽不是QRFSR或YQRFSR。

式(I)和/或式(IV)的这种肽的具体例子包括：

-QRFSR-NH₂；

-QR-F[4Br]-SR，其中-F[4Br]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由溴原子取代；

-QRFPR；

-(乙酰)-QRFSR；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR；

-生物素(biotine)-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR；

-dR-dS-dF-dR-dQ；

-Y-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR；

-Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR；

-QRF-S(O-辛酰基)-R；

-CQRFSR；

-CQRF-S(O-辛酰基)-R；

-CQRF-S(O-十二酰基)-R；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR；

-C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；

-[Cβ2]QRF-S(O-辛酰基)-R；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[β3R]；

-C-[dQ]-RF-S(O-辛酰基)-[dR]；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR]；

-[dC]-QRF-S(O-辛酰基)-[dR]；

-[Cβ2]-QRF-S(O-辛酰基)-[β3R]；

-[CQRFSR]₂；

-QRYSR；

-QR-F[4F]-SR，其中-F[4F]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由氟原子取代；

-QKFSR；

-QRFSK；

-C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR；

-C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；

-C(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)QRF-S(O-辛酰基)-R；

-C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR；

-C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-β3R；

-C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)β3R；

其中：

-Cβ2是H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-CO-；

-β3R是-NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH；

--S(-O-辛酰基)是指丝氨酸，其羟基由辛酰基取代，

--S(-O-十二酰基)是指丝氨酸，其羟基由十二酰基取代。

在2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/042922和2009年4月7日提交的国际申请PCT/EP2009/054171中描述的包括一或多个化学修饰以改善其稳定性和/或其生物利用率的肽进一步包括：

-NH2-QRFSR-CONH2；

-NH2-QRGPR-COOH；

-NH2-QHNPR-COOH；

-NH2-QR(4溴基F)SR-COOH；

-NH2-QRFPR-COOH；

-N-(乙酰)QRFSR-COOH；

-N-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；

-N-(生物素-C6)QRFSR-COOH；

-NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(D-对映异构体逆反转(retroinversion))；

-NH2-YQRFSR-COOH；

-NH2-Y-(C6-聚乙烯)QRFSR-COOH；

-NH2-Y-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH；

-NH2-QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；

-NH2-CQRFSR-COOH；

-NH2-CQRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；

-NH2-CQRF[S-O-C12-聚乙烯]R-COOH；

-NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；

-NH2-C-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH；

-NH2-C-(C8-聚乙烯)QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；

-NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；

-NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[β3R]-COOH；

-NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH；

-NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[dR]；

-NH2-[dC]QRF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH；

-NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯][β3R]-COOH；和

-[CQRFSR]2，即N-端半胱氨酸和胱氨酸键(二硫键)的SH基团的氧化后形成的二肽；

其中：

-Cβ2用包含与该半胱氨酸的羰基旁边的碳相邻的甲基残基的半胱氨酸-β2来替换天然半胱氨酸残基；

-β3R用包含与该精氨酸的胺基团旁边的碳相邻的甲基残基的精氨酸-β3来替换天然精氨酸；

-[S-O-C8-聚乙烯]是[S-O-辛酰基]；及

-C6、C8或C12聚乙烯相应于由6、8或12个碳的乙烯链组成的间隔区基团。

当肽含有但是不是由序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物组成时，或者含有但是不是由所述成熟产物的衍生物组成时，所述肽在其N末端或C末端含有额外的氨基酸。这些额外的氨基酸可以例如相应于BPLP序列的一部分，或者改善其稳定性和/或其生物利用率的氨基酸序列。但是，该肽的大小应优选不超过30-40个氨基酸。

本发明的肽可以通过本领域技术人员公知的任何方法合成。这种方法特别包括常规的化学合成(以固相或者同质液相)、从组成性氨基酸或其衍生物进行酶合成、以及通过重组宿主细胞的生物学产生方法。经化学途径的合成是特别有利的，这是由于纯度、抗原特异性、不存在不希望的次生物的原因以及由于生产的简易。经化学途径的合成在其它方法之外包括Merrifield型合成以及在Fmoc固相中的肽合成方法学(参见例如“Fmoc solid phase peptide synthesis，a practical approach”，publishedby W.C.Chan and P.D.White，Oxford University Press，2000)。

本发明多肽的治疗用途

已示出opiorphin在大鼠中行为绝望分析的模型中发挥抗抑郁作用及精神刺激作用。另外，已示出opiorphin的抗抑郁作用及精神刺激作用依赖于内源μ-和δ-阿片样物质受体的活化，但是不依赖于内源κ-阿片样物质受体的活化。

因此，本发明涉及上段中描述的本发明的肽，用作精神刺激剂。本发明的这种肽可以用于激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能的(opioidergic)途径。另外，本发明的肽不激活依赖于κ-阿片样物质受体的阿片样物质能的途径。

这些肽特别可以用于治疗或预防发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷(在成人中和在儿童中)、活动过度(在成人中和在儿童中)，注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)，强迫性障碍(OCD)和心境障碍如抑郁状况(depressive conditions)和抑郁(“重度抑郁症(Major DepressiveDisorder)”)，后者包括原发性(primary)抑郁(“重度抑郁症，单次发作”)和抵抗性抑郁(“重度抑郁症，复发”)，双极疾病(I型和/或II型的)，情绪恶劣障碍(dysthymic disorder)和循环型情感障碍。

在治疗这些疾病之一的范围内，本发明的肽优选施用给需要精神刺激剂和/或需要依赖于μ-或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径活化的患者亚群。

本发明的肽还可以与为了治疗或预防相同疾病的第二种活性成分联合(即同时或相继施用)。此第二种活性成分也可以具有精神刺激作用或者抗抑郁作用，或者甚至具有抗焦虑作用。所述肽可以例如与选自如下的至少一种第二种活性成分联合使用：

-抗抑郁剂如imao(异丙烟肼(iproniazide)，吗氯贝胺等)、米帕明(imipraminic)抗抑郁剂(米帕明、氯米帕明、阿米替林、阿莫沙平、度硫平、多塞平、马普替林、曲米帕明等)，5-羟色胺的重俘获的选择性抑制性抗抑郁剂(西酞普兰、氟伏沙明、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、依地普仑等)或5-羟色胺及肾上腺素的重俘获的抑制性抗抑郁剂(米那普仑、文拉法辛、米氮平等)；

-抗焦虑剂如苯并二氮(阿普唑仑、氯巴占、安定、劳拉西泮、普拉西泮等)、甲丙氨酯、羟嗪、丁螺环酮、卡普托胺或依替福嗪；及

-精神刺激剂如吗啡、莫达非尼、哌甲酯、地阿诺衍生物(acti5、乙谷氨乙醇(cleregil)，debrumyl等)、酮戊二酸(ketoglutarate)、阿屈非尼或舒布硫胺。

大多数这些已知活性成分在有效剂量具有显著副作用。与已知的活性成分不同，本发明的肽作用于生理调节系统而非直接作用于转移系统或受体。因此本发明的肽的作用不偏离调节系统范围，并且不会使所述系统饱和。因此，它们没有或仅有非常小的副作用。

本发明的肽通过强化第二种活性成分的作用使得可以以低于第二种活性成分单独施用时的有效剂量的浓度来施用。因此，本发明的优选实施方案涉及本发明的肽与至少一种第二种活性成分联合使用，所述第二种活性成分的以低于有效剂量的浓度进行施用，特别是在副作用被限制、降低、最小化或消除的剂量。

本发明的肽及第二种活性成分可以存在于相同药物组合物中或者在两个分离的药物组合物中。在第二种情况中，所述药物组合物可以基本上同时或者相继施用于患者。

此处所提及的疾病可以在任何疾病阶段进行治疗。“治疗”是指治愈性的治疗(curative treatment)(意在至少缓解、减缓或者终止病理的进程)。“预防”是指预防性治疗(意在降低病理发生的风险)。

“精神刺激剂”(“psychostimulant”和“psychostimulant agent”)是指引起多巴胺能和去甲肾上腺素能神经传递增加的化合物。更具体地，精神刺激剂刺激负责控制注意力、动机、警觉和集中(concentration)的神经递质。多巴胺和肾上腺素是负责控制注意力、动机、警觉和集中的两种主要神经递质。

术语“依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径”是本领域技术人员公知的。这些途径特别包括Henriksen和Willoch(2008Brain.131(Pt 5)：1171-96)描述的那些。本领域技术人员具有一些测试可用于评价化合物是否激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径，如实施例2所述的那些。例如，可以在存在和不存在μ-和/或δ-阿片样物质受体的特定阿片样物质拮抗剂的条件下比较化合物的作用。在所述拮抗剂存在时该化合物作用的消除表明所述化合物激活所研究的阿片样物质能途径。

本发明涉及本发明的肽用于激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径的体外用途和体内用途。

本发明还涉及本发明的肽用于制备如下物质的用途：

-精神刺激剂；

-能激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径的药物；和/或

-用于预防或治疗选自如下的疾病的药物：发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、成人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、强迫性障碍(OCD)，和心境障碍如抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍。另外，本发明涉及用于如下的方法：

-治疗或预防选自由如下所组成的组的疾病：发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、成人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、强迫性障碍(OCD)、和心境障碍如抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍；和/或

-激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径；其包括将本发明的肽施用于个体的步骤。优选地，所述个体是需要其的个体和/或患者。优选地，使用有效量的所述肽。所述个体和/或患者优选需要精神刺激剂和/或需要激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径。

药物组合物和剂量

本发明的肽优先用作药物组合物，其包含至少一种本发明的肽作为活性成分，及一或多种药物学可接受的赋形剂。

“赋形剂”或“药物学可接受载体”是指任何溶剂、分散介质、吸收延迟剂(absorption-delaying agent)等，其在人或动物中不产生任何副作用例如变态反应。

本发明的肽可以相应于上述任何肽。

例如，本发明的药物组合物每药物组合物单位剂量包含3-100、5-50或者10-25mg的本发明的肽。药物组合物可以伴有涉及治疗应用(例如上述那些)和剂量(例如符合前面段落所提及的剂量)的说明书。

剂量特别依赖于相关活性成分、施用模式、治疗适应症、患者的年龄、体重、和状况。

初始剂量一般经选择以尽可能的低(最低有效剂量)。如有必要，根据患者反应逐渐增加剂量。鉴于在活性成分作用发生之前可能有延迟，优选在增加剂量之前必需等待若干天至几周。

在本发明的肽的情况中，成人的初始剂量可以例如是小于或等于75mg/天，分三次施用。如有必要，此剂量可以逐渐增加至150mg每天。不推荐高于每天200mg的剂量。但是，当患者状况严重被送到医院时，剂量可以达到每天250或300mg。在老年患者中，初始剂量是例如小于或等于每天30mg，并且优选不应超过每天100mg。在儿童中，初始剂量可以是例如小于或等于每天10-25mg，优选不应超过每天75mg。

本发明的药物组合物可进一步含有至少一种选自精神刺激剂、抗抑郁剂和/或抗焦虑剂的第二种活性成分。

本发明的药物组合物可以进行配制以便经单一途径或经不同途径施用于患者。

药物组合物可以例如经口服、舌下、经鼻、含服、经皮、静脉内、皮下、肌肉内和/或经直肠途径来施用。

在经口服或舌下途径施用的情况中，本发明的组合物例如是作为明胶胶囊、泡腾片剂、无包衣或有包衣片剂、囊剂(sachet)、“锭剂(dragées)”、可饮用安瓿或溶液、微粒或延长释放的形式。

在经鼻或含服途径施用的情况中，本发明的组合物以例如喷雾剂的形式存在。

在经皮途径施用的情况中，本发明的组合物以例如贴剂的形式存在。

当打算经肠胃外途径施用时，更特别是经注射施用时，包含活性成分的本发明的组合物以包装在安瓿或瓶中用于缓慢灌注的可注射溶液和悬浮液存在。注射可特别经皮下、肌肉内或静脉内途径进行。用于肠胃外施用的形式通过将活性成分与缓冲液、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂混合而常规获得。根据已知技术，这些混合物然后被灭菌(例如经过滤)，并随后包装成静脉内注射剂。

作为缓冲液，本领域技术人员可以使用基于有机磷酸盐来源的缓冲液。

悬浮剂的例子包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯胶和羧甲基纤维素钠。

另外，本发明有用的稳定剂是亚硫酸钠和焦亚硫酸钠，而作为防腐剂可提及的有对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚或者氯甲酚。为制备口服溶液或悬液，将活性成分溶于或者悬浮于具有分散剂、湿润剂、悬浮剂(例如聚乙烯比咯烷酮)、防腐剂(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、调味剂(taste-correcting agent)或着色剂的合适载体液(vehicle)中。

为制备微囊，将活性成分与合适的稀释剂、合适的稳定剂、促进活性物质延长释放的物质或者其它任何添加剂作何以形成中央核心(central core)，然后用合适聚合物(例如水溶性树脂或水不溶性树脂)包衣。本领域技术人员已知的技术将用于此目的。

由此获得的微囊然后任选地配制在合适的剂量单位中。

尽管有不同的含义，但是术语“包含”、“含有”、“包括”和“由...组成”在本发明描述中可互换使用，它们可以互相代替。

下述实施例和附图说明本发明，但不限制其范围。

附图描述

图1说明opiorphin在强迫游泳测试中的精神刺激和抗抑郁作用，这通过在测试前(n＝40)和测试期间(干燥，n＝8大鼠/组)测量不动持续时间(平均值±SEM)。Man-Whitney检验(vs.载体液)的结果如下：^Tp＜0.10；^*p＜0.05；^***p＜0.001。在测试期间，施用了opiorphin的大鼠不顺从(resign)，不像施用了载体液的大鼠那样。这证实opiorphin具有抗抑郁作用。另外，在测试期间，施用了opiorphin的大鼠不动时间比在测试前期间相同大鼠的不动时间短。这证实opiorphin具有精神刺激作用。

图2示出在甩尾疼痛(tail-flick pain)模型中opiorphin发挥止痛活性。在施用人Opiorphin或吗啡后以时间针对有害热刺激的函数来评价疼痛应答。在4个不同时间点评估甩尾潜伏期：参照吗啡在施用Opiorphin或载体液后5、15、25和60分钟。在注射Opiorphin、吗啡或载体液之前进行30秒间隔分隔的两个连续测量，以评估基线甩尾潜伏期。与载体液(空心圆)和吗啡(空心三角；1mg/kg i.v.)相比的Opiorphin(黑色圆；2mg/kg i.v.)对甩尾潜伏期的作用。结果表示为6只大鼠的均值±SEM。星号表示通过Mann-Whitney U检验的^**P＜0.01vs载体液。

图3示出人Opiorphin在甩尾疼痛模型中显示止痛作用。在急性和慢性施用人Opiorphin或吗啡后以针对有害热刺激的函数来评价疼痛应答。在急性(第1天)或在7天期间每天(第7天)i.v.施用Opiorphin、载体液或吗啡后评估甩尾潜伏期。在注射Opiorphin、吗啡或载体液之前进行30秒间隔分隔的两个连续测量，以评估基线甩尾潜伏期。与载体液(空心圆)和吗啡(空心方块；1mg/kg i.v.)相比的Opiorphin(空心三角；2mg/kg i.v.)对甩尾潜伏期的作用。结果以6只大鼠的均值±SEM表示。星号表示通过Mann-Whitney U检验的^*P＜0.05，^**P＜0.01vs载体液。

序列表序列的描述

SEQ ID NO：1，2，3和4相应于本发明的肽。更特别地，SEQ ID NO：2相应于opiorphin。

SEQ ID NO：5相应于人碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的序列。

SEQ ID NO：6相应于sialorphin。

实施例

实施例1：由Génosphère Biotechnologies(F)& Almac Sciences(UK) 合成opiorphin(即QRFSR肽)

Opiorphin批次由Génosphère Biotechnologies(F)& Almac Sciences(UK)合成。经确认这些合成批次以剂量依赖方式在体外保护：

-P物质(NEP的生理学底物)及合成的荧光底物[Abz]-dRGL-[EDDnp]、[Abz]-RGFK-[DnpOH](Thermo-Fisher Scientific)免于由重组人NEP的内切蛋白酶解(endoproteolysis)(QRFSR肽的抑制浓度，包含5-50μM)；及

-Ala-AMC的合成底物免于由重组人APN的氨基蛋白酶解(aminoproteolysis)。

实施例2：opiorphin对伤害感受传递(nociceptive transmission)途径的作用

在雄性大鼠的急性疼痛行为应答分析模型中，即Rougeot et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100(14)：8549-54)所述的“Pin Pain Test”(机械刺激)，已示出opiorphin以1mg/kg i.v.发挥强抗伤害感受(antinociceptive)的活性(p＝0.0002，Mann-Whitney U-检验，n＝8-12只大鼠/组)，等价于以6mg/kg i.p.的吗啡的该活性(Rougeot and Messaoudi，Med.Sci.(Paris).2007；23(1)：37-9)。

以引人注目地方式，在主要副作用中，吗啡的抗蠕动作用(与对照大鼠相比在用吗啡治疗的大鼠中蠕动80-90％抑制)在用opiorphin治疗的大鼠中未观察到。

然后在与皮下慢性炎症(在后爪的化学刺激)相关的慢性疼痛行为应答分析模型中研究了opiorphin的止痛作用，即Rougeot et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100(14)：8549-54)所述的“福尔马林测试(formalin test)”。参照物质是吗啡，剂量为2mg/kg。

在所谓的“福尔马林”疼痛测试中的两个最重要变量舔爪持续时间和痉挛数的基础上，opiorphin显示出延长的止痛特性(analgesic profile)(记录并在动力学中分析行为应答60分钟)，其具有显著剂量依赖作用(p≤0.002，Kruskal-Wallis方差分析，n＝8只大鼠/组)及以1-2mg/kg i.v.的最大抗伤害感受能力(Mann-Whitney检验p＝0.036-0.003vs.载体液)。

下个步骤是解释opiorphin的抗伤害感受作用机制的特异性及特别是内源阿片样物质受体的牵连。分析了下述配体的拮抗作用：广谱阿片样物质拮抗剂(纳洛酮，3mg/kg)，和阿片样物质μ-受体(CTOP，0.8mg/kg)、δ-受体(Naltrindole，10mg/kg)和κ-受体(Nor-Binaltorphimine，5mg/kg)的选择性拮抗剂。

表1

已显示出在“福尔马林测试”中opiorphin的止痛作用在纳洛酮或CTPA，μ-阿片样物质受体的特异性拮抗剂，的存在下被消除(上表1)。这个结果证实opiorphin的抗伤害感受性作用由内源阿片样物质途径介导，所述途径依赖于阿片样物质受体并需要μ-阿片样物质亚型的受体的特异性活化。这些受体参与生理学信号的传递，所述信号参与疼痛传递的阴性逆控制(retrocontrol)(脑啡肽、β-内啡肽和内吗啡(endomorphins))及参与吗啡作用。

因此，在大鼠疼痛行为应答的两个分析模型即“Pin pain测试”(急性机械疼痛)和“福尔马林测试(慢性化学炎性疼痛)中，已证实opiorphin以1mg/kg通过激活内源阿片样物质能途径而发挥强抗伤害感受活性。在另一方面，1mg/kg i.v.的opiorphin在这两个测试中均能诱导由吗啡2-6mg/kg i.p.所诱导的最大止痛作用，吗啡是治疗人类严重及慢性疼痛最具活性的止痛分子。

另外，用大鼠的结肠炎症模型(colic inflammation mode)观察到1mg/kg i.v.的opiorphin不保护结肠壁免于由直肠内施用TNBS所诱导的炎症，与布洛芬不一样。因此，opiorphin在这个测试中不发挥任何显著的肠道抗炎作用。在“福尔马林测试”中1mg/kg的opiorphin的抗疼痛作用因此看起来并不与所述肽的抗炎活性相关。

实施例3：opiorphin对控制情绪的途径的作用：抗抑郁潜力

●行为绝望测试(强迫游泳测试)

在成年雄性大鼠中研究了opiorphin对绝望或顺从行为的作用。该测试包括15分钟的测试前时段和24小时后的5分钟的测试时段。在测试前时段，在开始的5分钟内记录大鼠行为。在测试前的结尾，将大鼠从水中取出，小心干燥，处理，然后放回其居住的笼子。在测试期间，再次将该大鼠置于水中并记录其行为5分钟。

在测试前时段后立即经静脉内途径(i.v.)施用Opiorphin，并在测试时段前300和15分钟施用三剂(0.5、1或2mg/kg)。参照物质是8-OH-DOAT(0.5mg/kg)，其是5-HT1a激动剂，或者丙米嗪(20mg/kg)，其是5-羟色胺重摄取的抑制剂。

表2

Kruskal-Wallis方差分析已示出在测试前不同组的大鼠的不动时间无显著不同，而这些组在处理后观察到显著异质性(上表2)。

Mann-Whitney检验示出用1和2mg/kg opiorphin和8-OH-DPAT处理的大鼠不动时间显著低于对照组大鼠不动时间，而用0.5mg/kg opiorphin处理组的大鼠的不动时间趋向于低于对照组大鼠的不动时间(图1)。

Wilcoxon检验示出对照大鼠的水中不动时间在测试vs.测试前时段之间显著增加。事实上，该对照大鼠在测试期间顺从，因为它们记住(retain)它们很快被从水中取出。与对照大鼠不一样，用1和2mg/kgopiorphin和8-OH-DPAT处理组的大鼠的不动时间在测试前和测试之间显著降低。这表明用opiorphin处理的大鼠不顺从，因此opiorphin具有抗顺从(antiresignation)(抗抑郁)作用。另外，相对于对照组，用1和2mg/kg opiorphin和8-OH-DPAT处理组的大鼠的不动时间显著降低。这表明opiorphin不仅发挥抗顺从作用，也发挥精神刺激作用。

作为结论，静脉内施用的opiorphin诱导抗顺从的保护性剂量依赖性作用，并因此在成年雄性大鼠的行为绝望测试中以1mg/kg发挥最大抗抑郁能力。

为了排除opiorphin可能的遗忘症或活动过度作用，所述作用也可解释经处理的大鼠中顺从的缺失，进行了两个额外行为测试以验证opiorphin的抗抑郁作用的特异性。

●被动回避测试(Passive Avoidance Test)

使用大鼠的被动回避测试，可以评估在应用其不能逃避的厌恶性刺激(aversive stimulus)期间动物的记忆程度。装置由两个室组成，两个室由开放间隔隔开，允许大鼠从一个室到另一个室。在测试开始时放置大鼠的第一个室是照明的，并通过拉门(sash door)与暗室相通，其地面包括通电格栅。该被动回避测试包括测试前时段，其中当动物进入暗室时接受电击(2mA，2s)，以及24小时后的3分钟测试时段，在此针对其学习任务的长期记忆保持而分析动物行为(在该测试中暗室格栅不再通电)。在测试前时段之后立即施用opiorphin(1mg/kg i.v.)。用此测试可以评估opiorphin的健忘作用。下表示出进入暗室的潜伏期时间(laencytime)(平均值±SEM，n＝8只大鼠/组)。

表3

Mann-Whitney检验示出在该两个测试前和测试时段两组大鼠即对照组和opiorphin组进入暗室的潜伏期时间没有显著差异。Wilcoxon检验示出测试时段两组中每一组的大鼠的潜伏期时间显著高于(x 6-7)在测试前时段所获得的时间。这表明动物长期保持了学习任务的记忆。

剂量为1mg/kg i.v的opiorphin因此在被动回避测试中不显示任何遗忘作用。

●运动活性测试(locomotor activity test)

装置由两个室组成，两个室由开放间隔隔开，允许大鼠从一个室到另一个室。所测量的变量是在3分钟期间直立站立动作(垂直活性)的次数和在两个室通过的次数(水平活性)。参照分子是丙米嗪(20mg/kg)。

表4

在大鼠的运动活性测试中，与对照组相比，剂量为1mg/kg i.v.的opiorphin既不诱导任何镇静作用，这与丙米嗪(20mg/kg i.p.)不一样，也不诱导任何显著活动过度作用。

因此，在行为绝望的分析模型中已表明，在雄性大鼠中，opiorphin以1mg/kg i.v.在精神刺激作用之外还发挥特异性抗抑郁作用。

接下来的步骤是测试其作用机制的特异性，特别是内源阿片样物质受体在强迫游泳测试中的牵连。下表示出在强迫游泳测试中处理的作用，这是通过测量测试前和测试时段的不动时间(s，n＝8/组；平均值±SEM)而显示。

表5

在大鼠的行为绝望模型中的此第二系列测试证实了1mg/kg i.v.的opiorphin在精神刺激作用之外还诱导抗抑郁作用。这种作用与20mg/kgi.p.的参照物质丙米嗪所发挥的作用相当。在δ-阿片样物质受体的特异性拮抗剂Naltrindole存在时opiorphin的作用被消除(上表5)。这表明opiorphin的抗抑郁和精神刺激类的作用由内源阿片样物质途径介导并需要δ亚型阿片样物质受体的特异性活化。

实施例4：opiorphin对控制情绪的途径的作用：抗焦虑潜力

●条件防御性掩埋测试(The conditioned defensive burying test)

以剂量1mg/kg静脉内施用的opiorphin的抗焦虑作用在Wistar雄性大鼠的条件防御性掩埋测试中进行评估。

为了避免假阳性，鉴于opiorphin发挥止痛作用，所述测试进行两各时段：选择焦虑大鼠的时段，随后是受处理的测试时段。用于选择实验大鼠的条件防御性掩埋测试在黑暗期的最初几个小时发生，其是大鼠最活跃的时期。将每个大鼠被放置在实验装置中与探针相对的一侧，当其首次将前爪放到探头上时给动物单次低强度电击(2mA)，然后观察其行为3分钟。在每个大鼠通过之前更换锯屑并调整至统一的5cm高度。选择已表现出埋藏探头至少25秒的16只大鼠。

第二天，将所述大鼠在测试前处理15分钟，兵放置于实验装置中与探头相对的部分。在这个时段，该大鼠不接受电击，单看到探头就引发大鼠焦虑。记录该大鼠行为5分钟。分析的变量是探头的掩埋时间、在探头方向伸展(stretching)的次数、面对探头接近的次数(number ofapproaches facing the probe)、逃离探头的次数。这些不同变量用于计算每只大鼠的总体焦虑评分。下表示出在条件掩埋测试中关于opiorphin(1mg/kg，i.v.)对总体焦虑评分的作用所获得的结果。

表6

基于总体焦虑评分，在Wistar雄性大鼠的条件掩埋测试中剂量为1mg/kg i.v.的opiorphin相对于对照不显示任何抗焦虑活性。对于直立站立动作，用opiorphin处理的大鼠显示出表现少于对照大鼠的直立站立动作的倾向(p＝0.11vs.载体液，n＝8只大鼠/组)。

实施例5：opiorphin在药物依赖性行为中的作用：成瘾性类型的潜力

●条件地点偏爱测试(Conditioned place preference test)

装置由两个室组成，两个室在习惯化期间和测试期间由开放拉门隔开，允许大鼠自由地从一个室穿行到另一个室。一个室是照明的且地面包括金属格栅。该室是非偏爱的厌恶室，花在该室的时间是测量的变量。在10天的条件作用期间(45分钟，关闭拉门)，将厌恶室与待测产品(对照和药物)的施用相关联，而偏爱室(黑暗，垫层材料)与对照(载体液)相关联。测试三个阶段进行：习惯化或测试前阶段，条件处理阶段和最终教导阶段。以止痛有效剂量1mg/kg i.v.施用opiorphin，而吗啡作为参照物质以2mg/kg i.v.剂量施用。

基于分别在第1阶段(第0天的测试前)期间和第3阶段(在第11天测试)期间在非偏爱室中花费的时间所应用的Kruskal-Wallis方差分析表明，所述三组在第0天习惯化阶段之后无显著不同(H(2df)＝1.21；p＝0.55)，而这些相同的组在条件处理阶段后第11天测试期间有显著不同(H(2df)＝7.91；p＝0.02)。在后一种情况中，Mann-Whitney检验示出用吗啡处理的大鼠和用载体液处理的大鼠之间的显著差异(U＝1；p＝0.001)。另一方面，在用opiorphin条件处理的大鼠及用载体液条件处理的对照之间无显著差异(U＝31；p＝0.92)。

在用止痛剂量的opiorphin慢性处理后，大鼠未发展出对于最初建立为非偏爱室的显著偏爱。事实上，这些大鼠花费在非偏爱室中的时间与在最初测试前阶段期间一样多(Wilcoxon检验：z＝1.54；p＝0.12)。另一方面，在用止痛剂量的吗啡慢性处理后，大鼠发展了对于最初在测试前建立为非偏爱室的显著偏爱位置(z＝2.52；p＝0.012)。

因此，在“福尔马林测试”中的有效止痛剂量，opiorphin不导致显著药物依赖性，这与吗啡不一样。在条件性地点偏爱测试中，重复施用剂量为1mg/kg的opiorphin未诱导显著的成瘾性类型的副作用。

实施例6：在甩尾测试中未发生opirophin抗伤害感受的耐受

●材料和方法

在实验开始时重250-280g的雄性Wistar大鼠(Harlan，France)用于本研究。在7天驯化期之后，将它们称重并根据处理组随机安置到具有12小时交替光/暗周期(21:00p.m./9:00a.m.)及控制温度(21±1℃)和湿度(50±5％)的房间中。无限制(ad libidum)供应食物和水。它们在实验上仅测试一次。研究动物的行为测试、照顾和安乐死符合EuropeanCommunities Directive 86/609/EEC的指引及ASAB Ethical Committee forthe use of laboratory animals in behavioral research 71：245-53。

将Opiorphin(Genosphere Laboratory，France)溶解于载体液溶液(55％的PBS 100mM-45％的乙酸0.01N)中并在行为测试前5-15分钟以0.5-2mg/kg体重范围的剂量全身注射。将购自Francopia(France)的吗啡HCl溶解于盐水(蒸馏水中的0.9％氯化钠)并在行为测试前15分钟以1-2mg/kg的剂量经静脉内途径注射。纳洛酮(在中枢和周围作用的阿片样物质拮抗剂)购自Sigma Chemical(France)，将其溶解于盐水并在施用Opiorphin前15分钟以3mg/kg皮下(s.c.)施用。Naltrindole(δ-阿片样物质拮抗剂)、Nor-Binaltorphimine(κ-阿片样物质拮抗剂)和CTAP(μ-阿片样物质拮抗剂)均购自Sigma Chemical(France)，将其溶解在盐水中并分别在测试前20分钟以10mg/kg i.p.、在测试前3小时以5mg/kg i.p.及在测试前25分钟以0.8mg/kg施用。所有药物均以1ml/kg体重的体积施用。

对应答急性热刺激所需时间进行评价的甩尾测试优先反映感受伤害的脊髓反射(nociceptive spinal reflex)。使用具有连接至自动化甩尾止痛计(analgesymeter)的辐射热源的标准甩尾装置(Harvard Apparatus LTD，Edenbridge，England)。在测试前一天，使大鼠经两个2分钟时段而习惯于争夺的情形(situation of contention)。在实验日，用手轻轻地限制它们，从而使辐射热源集中于尾巴的末端背侧表面。将先前经调节的热刺激强度设定为30％以获得基础甩尾潜伏期≤2-3秒。在这些实验条件下以及参照吗啡，建立5秒的截断时间以防止组织损伤。对于每种行为测试，大鼠用作其自己的对照，并在注射Opiorphin、吗啡或载体液之前进行由30秒的间隔分开的2个连续测量以评估基线甩尾潜伏期。在测试日，大鼠接受静脉内施用的如下新鲜制备溶液之一：载体液溶液，1mg/kg吗啡或者2mg/kg Opiorphin。为诱导耐受，大鼠在连续7天期间每天接受静脉内施用新鲜制备的溶液。结果表示为n＝6只大鼠的甩尾潜伏期均值±SEM。

结果表示为均值±SEM。组之间差异的显著性用Kruskal-Wallis通过等级对方差的单向分析(Kruskal-Wallis one-way analysis of variance byranks)(KWT，非参数方法)进行评估以对经过实验条件的几个独立变量进行比较。当获得了处理间的显著性差异时，使用Mann-Whitney因果推理(post hoc)检验(MWT)以通过将每个处理组和对照组(载体液或基线值)比较来确定哪一组导致这些差异。使用非参数Wilcoxon匹配对(matchedpairs)检验(WT)以比较每个处理组中具有重复测量的两个配对变量。对于所有的统计学评价，将显著性水平设定为P＜0.05。所有统计学分析用计算机软件Stat5统计学软件包(SAS，Institute，Inc.，USA)进行。

●人Opiorphin在甩尾测试中显示抗伤害感受的作用(antinociceptive effect)

甩尾测试测量应答疼痛性辐射热刺激所需的时间。缩尾潜伏期(Tail withdrawal latency)决定热伤害感受的阈值，其功能地与对有害刺激的疼痛应答性相关。药物诱导的甩尾应答的衰减提供了对于疼痛抗伤害感受的初步证据，其优先整合于脊髓水平。本研究的目的是使用大鼠甩尾测试评估与吗啡相比的Opiorphin止痛作用的能力和持续时间。

对于此研究，选择2mg/kg Opiorphin的全身剂量以在大鼠甩尾测试中研究作用持续时间方面的最大应答。此剂量的评估是根据初步数据，其显示Opiorphin诱导显著的剂量依赖性抗伤害感受应答，最大作用在2mg/kg。甩尾潜伏期在4个不同时间点评估：与吗啡(1mg/kg，i.v.)相比在Opiorphin或载体液施用后5、15、25和60分钟。

图2为在Opiorphin或吗啡或载体液处理条件下(n＝6只大鼠/组)以时间的函数显示出平均甩尾潜伏期。注射前基线值在3组之间无显著差异(P＝0.54，通过Kruskal-Wallis检验)。类似地，在注射后5分钟3组的平均甩尾潜伏期之间无显著差异(P＝0.34)。另一面，单向Kruskal-Wallis分析揭示在注射15、25和60分钟后处理的显著作用(分别为P＝0.005，P＝0.005和P＝0.02)。随后Opiorphin或吗啡处理的大鼠与用载体液处理的对照大鼠之间甩尾潜伏期的个体均值比较表明，在施用Opiorphin和吗啡15和25分钟后，时间潜伏期显著增加：从对于载体液的2.57±0.10和2.51±0.06秒至对于吗啡的3.56±0.32秒和3.29±0.15秒，分别P＝0.01和P＝0.008vs载体液；以及至对于Opiorphin的3.12±0.07秒和3.19±0.07秒，分别P＝0.005和P＝0.004vs载体液，经Mann-Whitney检验(MWT)。对于吗啡，在60分钟后仍是显著的(P＝0.01vs载体液)，而对于Opiorphin则趋于更高(P＝0.08vs载体液)。在处理后15、25和60分钟，经Opiorphin处理的大鼠在应答潜伏期中与经吗啡处理的无显著不同(经MWT，分别为P＝0.20，P＝0.34和P＝0.26vs吗啡)。

另外，与各自注射前基线值的比较显示出在用吗啡处理后5、15和25分钟，甩尾潜伏期显著增加(分别为P＝0.05，P＝0.03和P＝0.05，经Wilcoxon检验WT)。另一方面，用Opiorphin处理在注射后15和25分钟时间点诱导应答潜伏期显著增加(分别P＝0.03和P＝0.03，经WT)。令人感兴趣地是，与对照组的相应基线应答的比较揭示在重复暴露于测试后对热疼痛阈值的显著时间效应，即缩尾时间潜伏期进行性降低。对重复刺激的疼痛阈值的降低可反映出疼痛致敏作用或者对刺激的学习导致促进这些动物中的伤害感受应答。在重复测量后增强的对热刺激的伤害感受应答在用Opiorphin处理的大鼠中类似吗啡那样完全逆转(reverse)，证实其对热急性疼痛的强止痛能力。

在大鼠甩尾范例中，Opiorphin(2mg/kg i.v.)的最大止痛作用发生在静脉内施用之后15-25分钟，并且在作用幅度和持续时间方面与吗啡(1mg/kg i.v.)在相同量度范围。这证实Opiorphin抑制热损伤诱发的急性疼痛行为，其由脊髓脑啡肽能途径控制。

●甩尾测试中人Opiorphin和吗啡慢性处理之间抗伤害感受性耐受发生的比较

该实验目的是使用甩尾测试研究Opiorphin诱导的抗伤害感受性耐受的潜在显现。对于耐受诱导，在连续7天期间大鼠每天接受静脉内施用的Opiorphin(2mg/kg)、吗啡(1mg/kg)或者载体液。然后在峰值作用时间即攻击剂量后15分钟和25分钟测量甩尾潜伏期。

比较注射前基线值，3组的平均甩尾潜伏期之间未观察到显著差异(第1天P＝0.54及第7天P＝0.14，经KWT，n＝6只大鼠/组)。但是，Kruskal-Wallis分析揭示3组之间甩尾潜伏期中的显著处理作用(分别在注射后15和25分钟时间点，第1天P＝0.005；第7天P＝0.003)。当比较第7天和第1天之间的时间-应答谱时，在每天的重复处理之后，载体液处理组甩尾潜伏期保持稳定(P≥0.99，经Wilcoxon检验，WT)，吗啡处理组趋向于降低(P＝0.06)，以及Opiorphin处理组趋向于增加(P＝0.06，经WT)(图3)。

与载体液处理组相比，在第1天单次急性施用吗啡或Opiorphin后观察到应答潜伏期显著增加(在注射后15和25分钟时间点经MWT因果推理比较分别为P＝0.01或P＝0.01)。在连续7天慢性处理后，与载体液慢性处理相比，吗啡和Opiorphin在注射后15和25分钟仍能够诱导甩尾应答的显著增加(分别为P＝0.02和P＝0.004)。但是，吗啡诱导的增加趋向于低于Opiorphin诱导的应答(在注射后15分钟时间点，P＝0.08，经MWT)。

另一方面，与各自的注射前基线值的比较显示在7天慢性处理后，甩尾潜伏期在吗啡攻击剂量后15分钟保持稳定而在给药后(post-dose)25分钟显著降低(P＝0.69和P＝0.03，经WT)，反映出在慢性处理后吗啡抗伤害感受能力的缺失。在相同实验条件下，opiorphin攻击剂量在注射后15分钟显著增加甩尾应答(P＝0.03，经WT)，而看起来在注射后25分钟没有显著作用(P＝0.67)。因此，Opiorphin的止痛强度在慢性处理后未改变，而似乎出现了抗伤害感受应答持续时间的降低。

结论是，与吗啡不一样，每天一次共7天的慢性全身施用Opiorphin(2mg/kg，i.v.)在大鼠的甩尾测试中不诱导产生对最大抗伤害感受作用的耐受。

实施例7：结论

上述实验数据因此证实opiorphin在1mg/kg i.v.通过激活依赖于内源μ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径而发挥强力和强劲的(tonic)抗伤害感受活性。此结果在大鼠中急性行为应答的三种分析模型中得到确认，即“Pin pain Test”(急性机械疼痛)、“福尔马林测试”(慢性化学炎性疼痛)和“甩尾测试”(急性热疼痛)。在这些测试中Opiorphin能诱导吗啡(2-6mg/kg i.p.)所诱导的最大止痛作用，而不诱导吗啡的任何主要副作用，即抗蠕动作用、药物依赖性作用及耐受作用(Rougeot C，Proceedings of the 4th International Peptide Symposium；J.Wilce(Editor)onbehalf of the Australian Peptide Society，2007)。另外，在慢性化学疼痛测试中opiorphin特异的(非抗炎性)和显著的止痛作用有利于在严重神经病性疼痛中opiorphin潜在的抗伤害感受作用。

另外，在雄性大鼠的行为绝望分析模型中，本发明人示出opiorphin在1mg/kg i.v.除了发挥精神刺激作用之外还通过激活依赖于内源δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径而发挥特异性抗抑郁作用。在此测试中opiorphin的作用是特异性的，因为用相同剂量处理的大鼠在各种合适的行为测试中不产生任何遗忘、镇静或活动过度类型的应答。

opiorphin的抗疼痛、抗抑郁和精神刺激作用依赖于内源μ-和δ-阿片样物质受体的活化，所述受体传递应答刺激(疼痛、紧张、情感……)所释放的内源脑啡肽的作用。

另外，以1mg/kg i.v.剂量的opiorphin在雄性大鼠的条件防御性掩埋测试期间未显示任何抗焦虑活性。

最后，在条件性地点偏爱测试中，以及在福尔马林测试中的有效止痛剂量下，opiorphin不引起任何显著的药物依赖性。重复施用1mg/kgopiorphin不诱导任何显著的成瘾性和/或耐受型副作用，这与吗啡不一样。

Claims

1.用作精神刺激剂的肽，其中所述肽：

一包含序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产物的衍生物；和

-发挥精神刺激活性。

2.激活依赖于μ-和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能(opioidergic)途径的肽，其中所述肽：

-包含序列SEQ ID NO：5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产物的衍生物；和

-发挥精神刺激活性。

3.权利要求1或2的肽，其中所述肽包含序列X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO：1)，其中：

-X₁代表氢原子、酪氨酸或半胱氨酸；

-当X₁是氢原子时，X₂代表谷氨酰胺或焦谷氨酸；

-当X₁是酪氨酸或半胱氨酸时，X₂代表谷氨酰胺；和

-所述肽的C端最末端序列由X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg组成。

4.权利要求3的肽，其中所述肽由序列X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg组成。

5.权利要求1-4任一项的肽，其中所述肽由选自序列QRFSR(SEQID NO：2)、YQRFSR(SEQ ID NO：3)和CQRFSR(SEQ ID NO：4)的序列组成。

6.权利要求1-4任一项的肽，其序列由于保守取代而与选自序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列不同。

7.权利要求1-6任一项的肽，其中所述肽包括改善其稳定性和/或生物利用率的化学修饰。

8.权利要求1-7任一项的肽，用于治疗或预防选自由强迫性障碍(OCD)、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、在成人中和在儿童中的注意缺陷和/或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感精神障碍组成的组的疾病。

9.权利要求8的肽，其中所述疾病选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、儿童中的注意缺陷和/或活动过度、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍组成的组。

10.权利要求9的肽，其中所述疾病选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度和警觉下降组成的组。

11.权利要求1-10任一项的肽，以小于或等于75mg/天的剂量施用于成人。

12.权利要求1-10任一项的肽，以小于或等于25mg每天的剂量施用于儿童。

13.权利要求11或12的肽，每天施用三次。

14.权利要求1-13任一项的肽，经选自口服、经皮、经鼻、舌下和静脉内途径的途径来施用。

15.权利要求1-14任一项的肽，与选自由精神刺激剂、抗抑郁剂和抗焦虑剂组成的组的第二种活性成分联合施用。

16.治疗或预防选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动过度障碍、在成人中和在儿童中的注意缺陷和/或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍组成的组的疾病的方法，包括将有效量的权利要求1-15任一项的肽施用于需要其的个体的步骤。