KR20110020857A

KR20110020857A - 정신 자극제로 사용되는 오피오르핀

Info

Publication number: KR20110020857A
Application number: KR1020107028778A
Authority: KR
Inventors: 카트린 루조
Original assignee: 엥스띠뛰 파스퇴르
Priority date: 2008-05-26
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2011-03-03
Also published as: US20150329608A1; EP4218786A3; EP4218786A2; RU2010153244A; CN102123725A; JP2011521002A; WO2009150040A2; CA2725243A1; US20110178021A1; JP2015131810A; FR2931362A1; EP2307039A2; IL209462A0; MX2010012856A; FR2931362B1; EP3804744A1; WO2009150040A3; EP3009142A1; RU2526819C2; CA2725243C

Abstract

본 발명은 정신 자극제로서 사용되는 인간 BPLP(Basic Proline-rich Lacrimal Protein)로부터 유도되는 펩티드, 특히 오피오르핀에 관한 것이다. 이 펩티드는 강박장애(OCD), 기면증, 과면증, 불면증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 성인 및 아동의 주의력 결핍 및/또는 과잉 행동, 우울증, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애와 같은 질병을 치료 또는 예방하는데 유용하다.

Description

정신 자극제로 사용되는 오피오르핀{OPIORPHIN FOR USE AS A PSYCHOSTIMULANT AGENT}

본 발명은 정신 자극제로 사용되는 Prol1 유전자로 코드되는 인간 BPLP(Basic Proline-rich Lacrimal Protein)로부터 유도되는 펩티드, 특히 오피오르핀에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 정신 자극제를 제조하기 위한 이러한 펩티드의 사용에 관한 것이다.

정신 자극제는 신경계의 활동을 가속하고 동기 부여 및 웰빙(well-being)을 자극하는 정신 자극제로서 간주되는 향정신성 물질이다. Delay 및 Deniker가 확립한 향정신성 약물의 분류에 따라, 정신 자극제는 특히 카트(khat) 및 카페인과 같은 각종 각성제 이외에 각성제(암페타민(amphetamine)), 항우울제 thymoanaleptics과 같은 nooanaleptics을 포함한다.

정신 자극제는 신경 전달을 자극함으로써 작용한다. 그들은 불면증, 기면증, 비만, 아동의 주의력 결핍 및/또는 과잉 행동, 강박 장애(OCD), 우울증, 조병 및 조울증을 포함하는 각종 증상을 치료하는데 유용하다.

그러나, 정신 자극제는 급작스러운 금단 및 불안 후 종종 의존성, 내성, 우울증과 같은 역효과가 동반된다. 따라서, 역효과를 한정하고 또는 최소화하는 정신 자극제의 필요성이 있다.

성숙한 쥐의 턱밑샘(submandibular gland) 및 전립선(prostate)에서 주로 나타나는 안드로겐으로 규정되는 유전자는 1988년에 확인되었다(Rosinski-Chupin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85(22):8553-7; EP　0　394　424). 이 유전자는 전구체, SMR1(submandibular rat₁ protein)로 코드된다. 이 전구체는 생체내에서 다염기부로 쪼개져 3개의 구조적으로 닫힌 펩티드를 발생시킨다(Rougeot et al., Eur. J. Biochem. 1994; 219(3):765-73).

시알로르핀(sialorphin)이라고 불리는 시퀀스(sequence) QHNPR(SEQ ID NO:6)의 SMR1로부터 유도되는 펩티드는 세포간 연락의 호르몬 전달자인 것이 확립되었다. 따라서, 시알로르핀은 외분비 및 내분비 호르몬 펩티드이고, 이 표현은 안드로겐 및 아드레날린 작용 신호에 의해 매개되는 환경적 스트레스 하에서 야기되는 분비물에 의해 규정된다(Rougeot et al., Am. J. Physiol. 1997; 273(4 Pt2):R1309-20).

시알로르핀이 성숙한 수컷 쥐의 환경적 스트레스에 대응하는 분비물이라는 사실은 이 펩티드가 재생산과 관련된 생리적 및 행동적 신호의 통합으로 이루어질 수 있다는 가설을 이끌어낸다. 성행동에 있어서의 시알로르핀에 의한 역할이 평가되고, 실험 데이터는 시알로르핀이 환경적 배경에 따라 수컷 쥐의 성행동을 조절할 수 있다는 것을 나타냈다. 국제 특허 출원 WO　01/00221은 성 장애를 포함하여 정신 및/또는 행동 장애를 치료하는 SMR1의 성숙 물질(maturation product)의 사용이 기재되어 있다.

또한, SMR1 성숙 물질은 기관에서 특이 위치를 인식하고, 상기 위치는 미네랄의 농도와 관련되는 것을 발견했다. 국제 특허 출원 WO　98/37100은 미네랄의 불균형과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 SMR1 성숙 물질의 치료적 활용에 기재되어 있다.

Rougeot et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 2003; 100(14):8549-54는 생체내에서 시알로르핀이 결합하는 표면 리셉터(surface receptor)는 NEP 엔도펩티다아제(Neprilysin; EC 3.4.24.11)인 것이 설명되어 있다. 또한, 시알로르핀이 리간드 및 NEP 활동의 생리적 길항제인 것이 입증되었다. 따라서, 시알로르핀은 포유류에서 확인되어온 NEP 엔케팔리나제(enkephalinase)의 제 1 생리적 억제제이고(유럽 특허 출원 EP　1　216　707), 쥐의 통증 모델에 강력한 진통 효과를 보여주는 것이다.

유럽 특허 출원 EP 1　577　320은 시알로르핀의 인간 기능성 동질체가 기재되어 있다. 시퀀스 SEQ ID NO:2의 펩티드는 오피오르핀이라고 한다. 인실리코 게놈 분석은 SEQ ID NO:5의 BPLP 프로테인의 성숙 물질 프래그먼트(fragment)에 대응하는 것임이 밝혀졌다. BPLP 프로테인은 "Basic Proline-rich Lacrimal Protein", "Proline-rich protein 1" 또는 "PRL1"로도 불리고, 인간 유전자 Prol1로 코드된다. 오피오르핀은 생리학적 NEP 및 APN 기질(substrate), 즉 기질 P 및 메티오닌 엔케팔린의 열화를 억제한다. 유럽 특허 출원 EP 1 577 320은 오피오르핀이 통증 완화 특성을 갖고, 특히 통증을 치료하거나 예방할 수 있다는 것을 나타낸다.

오피오르핀의 진통 효과는 Rougeot 및 Messaoudi(Med. Sci. (Paris) 2007; 23(1):37-9)에 의해 충분히 확인되었다. 이 진통 효과는 현재까지 사용되는 가장 강력한 진통제인 모르핀에 발생되는 것과는 다르게 항연동 효과가 동반되지 않는다(Rougeot C, Proceedings of the 4^th International Peptide Symposium; J. Wilce (편집자) the Australian Peptide Society의 대표자, 2007).

본 발명자는 놀랍게도 오피오르핀이 진통 특성뿐만 아니라 정신 자극 효과를 가지고 있음을 발견했다. 또한, 이 정신 자극 효과는 기억 상실, 진정, 과잉 행동 또는 중독 형태의 역효과를 동반하지 않는다. 결국, 오피오르핀의 진통 효력은 모르핀과 같이 강력하고, 정신 자극 효력은 이미프라민(imipramine)과 같이 강력하다는 것을 발견했다.

따라서, 오피오르핀 및 유도된 펩티드는 기면증, 과면증, 불면증, 성인과 아동의 주의력 결핍, 성인과 아동의 과잉 행동, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 강박 장애(OCD), 및 우울증, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애와 같은 기분성 장애과 같은 질병을 치료하고 또는 예방하는 정신 자극제로서 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드

본 발명은 성숙 물질의 참조 펩티드 또는 시퀀스 또는 유도체라고도 하는 SEQ IN NO:5의 BPLP의 시퀀스 성숙 물질을 포함하거나 구성되는 펩티드의 치료적 용도(therapeutic applications)에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 본 출원의 명세서에 "본 발명에 따른 펩티드"로 지정되어 있다.

본 발명의 범위내에서, "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 결합되어 있는 아미노산의 직쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이 쇄는 환상, 즉 아미노산의 직선의 펩티드 또는 측기(side group)가 화학적 결합에 의해 결합되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 100 이하의 아미노산을 갖는다. 바람직하게는 펩티드는 4-40, 4-35, 4-30, 4-20, 4-10, 5-40, 5-35, 5-30, 5-20, 5-10, 5-8 또는 5-6 아미노산으로 이루어진다.

"성숙 물질"은 성숙 콘센서스(consensus) 부위에 프로호르몬 변환 요소(prohormone convertase)에 의해 전구체 프로테인(precursor protein)의 선택적 프로테인 분해에 의해 얻어지는 펩티드를 의미한다. 프로호르몬 변환 요소는 비활성 전구체를 활성 펩티드로 변환하고, 예컨대 푸린, PC 변환 요소 또는 PACE4를 들 수 있다. 성숙 콘센서스 부위의 시퀀스는 이하 콘센서스를 뒤따르는 것이 바람직하다: [H/R/K]-X₃-[R/K]-[R/K](여기서, [H/R/K]는 아미노산이 H, R 또는 K인 것을 의미하고, X₃이 3개 아미노산의 쇄를 나타내고, 또한 [R/K]는 아미노산이 R 또는 K인 것을 의미한다). 프로호르몬 변환 요소는 2염기성 잔기 [R/K]-[R/K] 사이의 콘센서스를 분해한다. 프로호르몬 변환 요소는 당업자에게 잘 알려져 있고, 특히 Scamuffa et al .(2006 FASEB J. 20(12):1954-63)에 의해 기재되어 있다.

SEQ ID NO:5의 BPLP의 시퀀스 성숙 물질 중 하나는 QRFSR 펩티드의 시퀀스 SEQ IN NO:2이다. 프리-프로-프로테인(pre-pro-protein) BPLP의 시퀀스는 신호 펩티드의 닉 콘센서스 부위(nick consensus site)를 함유하고, 이것의 분해는 프로 프로테인 QRFSRRX_(n)을 생성한다. 이 프로 프로테인 QRFSRRX_(n)는 2Rs 사이에 닉 부위의 -4 위치에 염기성 아미노산 및 2염기성 부위 RR을 포함한다. QRFSR 펩티드는 프로호르몬 변환 요소의 작용 후에 발생한다.

또한, 본 발명에 따른 펩티드는 SEQ ID NO:5의 BPLP의 시퀀스 성숙 물질로 이루어진 펩티드의 유도체를 포함하거나 구성된다.

"펩티드 유도체"는 참조 펩티드에 대해 하나 이상의 변이(치환, 삽입 또는 결실)를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는 상기 펩티드는 치환 형태의 변이만을 포함한다. 상기 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 바람직하게는 상기 펩티드는 참조 펩티드에 대해 많아야 1, 2, 3, 4 또는 5 변이 또는 치환을 포함한다. 또한, "펩티드 유도체"는 시퀀스 SEQ ID NO:5의 BPLP의 성숙 물질을 포함하는 펩티드의 펩티드 유사체를 의미한다(예컨대, Abell, 1997, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press; Gante, 1994, Peptidmimetica, massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106: 1780-1802　; and Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36: 3039-3049 참조). 본 발명에 따른 바람직한 펩티드 유사체는 2008년 4월 7일에 출원된 미국 지역 출원 US　61/042922 및 2009년 4월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/EP2009/054171에 기재된 것을 포함한다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드는 보존적 치환의 존재에 의해서만 참조 시퀀스와 다르다. 보존적 치환은 하전되지 않은 측쇄 상에 아미노산의 치환체(예컨대, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 시스테인, 티로신), 염기성 측쇄 상에 아미노산의 치환체(예컨대, 리신, 알기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄 상에 아미노산의 치환체(예컨대, 아스파르트산 및 글루타메이트), 무극성 측쇄 상에 아미노산의 치환체(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판)와 같은 동일 클래스의 아미노산의 치환체이다.

바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드는 고립 펩티드이다. "고립" 펩티드는 인간의 신체 또는 인간이 아닌 포유류의 기관으로부터 고립된 펩티드를 의미하고, 정제화된 형태가 바람직하다. 그러나, 고립 펩티드는, 예컨대 의약 조성물 또는 키트내에 제공될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 이하에 기재된 의약 조성물 중 어느 하나에 제공된다.

본 발명에 따른 펩티드는 정신 자극 활동을 가한다. "정신 자극 활동을 가하는 펩티드"는

- 절망 행동 시험(behavioral despair test)(예컨대, 쥐의 강제 수영 부하 시험(forced swimming test))에 감수(resignation)에 대한 보호 효과를 가하는 펩티드; 및/또는

- NEP(네프릴라이신(neprilysin); 중성 엔도펩티다아제; EC 3.4.24.11) 및/또는 APN(아미노펩티다아제 N; EC 3.4.11.2)와 같은 메탈로-엑토펩티다아제의 활성을 억제하는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는 상기 펩티드는 NEP 및 APN 활성을 억제한다. 특정 이론에 한정되지 않고, 본 발명자들은 메탈로-엑토펩티다아제(metallo ectopeptidases)에 의한 엔케팔린의 열화를 억제함으로써 본 발명에 따른 펩티드는 활동의 진폭 및 활동의 기간의 관점에서 생리 작용을 가능하게 하여 오피오이드 경로, 더욱 특히 엔케팔린 의존성 μ- 및 δ-오피오이드 리셉터의 경로를 활성화시키는 것을 믿는다.

감수에 대한 보호 효과는 쥐의 강제 수영 부하 시험에 의해 측정된다. 이 시험에 있어서, 펩티드는 감수에 대한 보호 효과를 가하는 경우에는 상기 팹티드가 투여된 쥐의 부동 시간(determined time)은 통제 쥐의 부동 시간에 대해 감소되었다. 이 시험은 이하 시험을 포함한다:

- 쥐를 소정 시간(10~20분, 예컨대 15분) 동안 물에 넣은 후 물에서 꺼내 건조하고 우리에 다시 넣는 예비 시험 세션;

- 몇 시간 후(20~25시간 후, 예컨대 24시간 후) 쥐를 소정시간(5~8분, 예컨대 5분) 다시 물에 넣은 후 물에서 꺼내 건조하고 우리에 다시 넣는 시험 세션.

시험할 펩티드는 예비 시험 후, 시험 전에 투여한다. 쥐의 부동 시간은 예비 시험 및 시험시 5분 동안 기록된다. 펩티드가 투여된 쥐의 부동 시간은 통제된 쥐와 예비 시험 세션 동안 동일한 쥐와 비교된다. 실시예 3은 쥐의 강제 수영 부하 시험의 프로토콜의 상세에 대해 설명한다.

NEP 및/또는 APN과 같은 메탈로-엑토펩티다아제의 활성 억제는 당업자에게 잘 알려진 어느 기술에 의해 측정될 수 있다. 유럽 특허 출원 EP 1 577 320의 실시예 2에 기재된 방법 중 하나는 예로 사용될 수 있다. 예컨대, LNCaP 셀의 멤브레인의 제조시 물질 P의 열화를 억제하는 것을 측정함으로써 NEP의 억제된 활동을 측정할 수 있다. 이 프로토콜은 Rougeot et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100(14): 8549-54) 및 2009년 1월 19일에 출원된 국제 출원 PCT/EP2009/050567에 상세히 기재되어 있다.

특정 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드는 시퀀스 SEQ ID NO:5의 프래그먼트를 포함하거나 시퀀스 SEQ ID NO:5의 상기 프래그먼트로부터 유래된 펩티드를 포함한다.

바람직하게는 본 발명의 펩티드는 시퀀스 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO:1)을 포함하고, 여기서:

- X₁은 수소원자, 티로신 또는 시스테인을 나타내고;

- X₁이 수소원자인 경우에는 X₂는 글루타민 또는 피로글루타메이트를 나타내고;

- X₁이 티로신 또는 시스테인인 경우에는 X₂는 글루타민을 나타내고; 또한

- 상기 펩티드의 C-터미널 말단의 시퀀스는 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg로 이루어진다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 시퀀스 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO:1)로 이루어진다. 본 발명에 따른 펩티드는 예컨대 QRFSR 시퀀스(SEQ ID NO:2), YQRFSR(SEQ ID NO:3) 또는 CQRFSR(SEQ ID NO:4)로 이루어진다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는 보존적 치환에 의해 시퀀스 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4와 다를 수 있다.

다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드는 시퀀스 SEQ ID NO:5의 BPLP의 대립 유전자 변형체의 성숙 물질을 포함한다.

명확성을 위해, 시퀀스 SEQ ID NO:6의 시알로르핀은 본 발명에 따른 펩티드로부터 배제된 것이 구체화되었다.

본 발명에 따른 펩티드는 안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 하나 이상의 화학적 변형을 더 포함해도 좋다. 이러한 변형은, 예컨대 본래 펩티드보다 더 안정하고 친유성 펩티드를 얻는 것을 목적으로 할 수 있다. 안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 펩티드는 본 발명에 따른 펩티드의 일부이다.

이러한 화학적 또는 효소 변형은 당업자에게 잘 알려져 있다. 한정되지 않은 방법에 있어서, 이하 변형으로 이루어진 예를 언급할 수 있다:

- N-터미널 탈아미노화 또는 아실화(바람직하게는 아세틸화)와 같은 또는 C-터미털 아미드화 또는 에스테르화와 같은 펩티드의 C-터미널 또는 N-터미널의 변형;

- 알파 질소 또는 탄소에서 아실화(바람직하게는 아세틸화) 또는 알킬화와 같은 2개의 아미노산 사이에서 아미드 결합의 변형;

- D-에난티오머에 대응하는 천연 아미노산(L-에난티오머)의 치환과 같은 키랄성(chirality)의 변형. 이 변형은 측쇄의 전환를 동반할 수 있다(C-터미널 말단부터 N터미널 말단까지);

- 하나 이상의 알파 탄소가 질소원자로 대체되는 아자펩티드로의 변형; 및/또는

- 하나 이상의 탄소가 주쇄의 N-알파측 또는 C-알파측 상에 부가되는 베타펩티드로의 변형.

이와 같은 펩티드의 하나 이상의 아미노산, 세린(Ser) 및/또는 트레오닌(Thr)은 특히 측쇄의 OH기에 세린 및/또는 트레오닌, 에스테르기, 에테르기 또는 C₈ 옥타노일기를 도입함으로써 변형될 수 있다. 에스테르화, 간단한 조작은 브릿지 등에 의해 카르복실산, 무수물로 행할 수 있다. 더욱 안정한 화합물을 생성하는 에테르화는 예컨대 메틸에테르 또는 O-글리코사이드를 형성하기 위해 알콜, 할라이드 등으로 행할 수 있다.

또한, 펩티드의 하나 이상의 아미노산, 리신(Lys)은 특히

- 아미드화(이 변형은 간단히 수행되고, 리신의 양전하는 소수성기(예컨대, 아세틸 또는 페닐아세틸)로 치환됨);

- 아미노화(1차 아민 R=(CH₂)₄-NH₃ ⁺로부터 2차 아미드를 형성함으로써, 예컨대 N-메틸, N-알릴 또는 N-벤질기를 형성함으로써; 및

- N-옥시드, N-니트로소, N-디알킬 포스포릴, N-술페닐 또는 N-글리코사이드기를 형성함으로써 변형될 수 있다.

또한, 하나 이상의 아미노산, 글루타민(Gln)은, 예컨대 아미드화에 의해, 특히 메틸, 에틸형, 관능화되거나 되지 않은 기를 갖는 2차 또는 3차 아민을 형성함으로써 변형될 수 있다.

또한, 하나 이상의 아미노산, 글루타메이트(Glu) 및/또는 아스파르트산(Asp)은, 예컨대

- 치환되거나 되지 않은 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 벤질 에스테르, 티올(활성 에스테르)를 형성하기 위한 에스테르화; 및

- 특히 N,N-디메틸, 니트로아닐리드, 피롤리디닐기를 형성하기 위한 아미노화에 의해 변형될 수 있다.

한편, 펩티드의 2차 구조에 참여되는 프롤린 아미노산을 변형시키지 않는 것이 바람직하고, 아미노산, Gly, Ala 및 Met은 일반적으로 명백히 유리한 변형 가능성을 제공하지 못한다.

안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 이러한 펩티드의 예는 2008년 4월 7일에 출원된 미국 지역 출원 US61/042922 및 2009년 4월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/EP2009/054171에 기재되어 있다. 이것은 하기 일반식(1)의 펩티드를 포함한다.

ζ-AA₁-AAAA₂- AA₃-AA₄-AA₅-OH (I)

여기서:

- ζ은 수소원자, 티로신, Y-[연결기]- 또는 Zn 킬레이트기, 예컨대 시스테인, C-[연결기]-, N-아세틸-시스테인, N-메르갑토아세틸 (HS-CH₂-CO-), 히드록삼산(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환되는 히드록시퀴놀린이고,

- AA₁는 Q 또는 Glp이고,

- AA₂는 K, R 또는 H, 바람직하게는 R이고,

- AA₃은 Y, G, N, F 또는 F(X), 바람직하게는 F 또는 F(X)이고,

- AA₄는 P, S 또는 S(OAlk), 바람직하게는 S 또는 S(OAlk)이고,

- AA₅는 K 또는 R, 바람직하게는 R이고,

- C-[연결기]-는 Cys-[NH-(CH₂)n-CO]-를 의미하고, 여기서 n은 1~20의 정수이고,

- Y-[연결기]-는 Tyr-[NH-(CH₂)_n'CO]-를 의미하고, 여기서 n'는 1~20의 정수이고,

- F(X)는 페닐알라닌을 의미하고, 페닐알리닌의 페닐기는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되고,

- S(OAlk)는 세린기를 의미하고, 세린기의 히드록실기는 탄소원자수 1~20개의 직쇄상 또는 분기상 알킬기로 치환되고,

- 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 독립적으로 L-배열 또는 D-배열이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 선택적으로 b 아미노산, 아자-아미노산 또는 b-아자-아미노산이어도 좋다;

여기서, 펩티드 유도체가 시스테인인 경우에는 상기 펩티드 유도체는 펩티드가 QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR 또는 GlpRFSR이 아니라는 단서를 갖는 선택적인 이량체이다.

일반식(I)의 펩티드 중에서, 바람직한 펩티드는 NEP와 APN 모두를 억제하는 것을 포함한다. 이러한 펩티드는 이하 일반식(IV)를 가져도 좋다.

ζ^m- Q-R-AA^m ₃-AA^m ₄-R-OH (IV),

여기서:

- ζ^m은 수소원자 또는 Zn 킬레이트기, 예컨대 시스테인, C-[연결기]-, N-아세틸-시스테인, N-메르캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 히드로아믹산 (HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환되는 히드록시퀴놀린이고,

- AAⁿ ₃는 F 또는 F(X), 바람직하게는 F(X)이고,

- AA^m ₄는 S 또는 S(OAlk), 바람직하게는 S 또는 S(OAlk)이고,

- C-[연결기]-, F(X) 및 S(OAlk)는 일반식(I)의 펩티드로 상기에 설명된 바와 같고,

- 상기 Q, R, AA₃, AA₄ 및 R은 독립적으로 L-배열 또는 D-배열이어도 좋고, 또한 Q, R, AA₃, AA₄ 중 어느 하나와 R은 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산이어도 좋고;

펩티드 유도체가 시스테인을 포함하는 경우에는 상기 펩티드 유도체는 펩티드가 QRFSR 또는 YQRFSR이 아니라는 단서를 갖는 선택적인 이량체이다.

일반식(I) 및/또는 (IV)의 이러한 펩티드의 구체적인 예로는

- QRFSR-NH₂;

- QR-F[4Br]-SR, 여기서 -F[4Br]-는 페닐알라닌, 파라 위치가 브로모 원자로 치환되는 페닐기;

- QRFPR;

- (아세틸)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

- 비오틴-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

- dR-dS-dF-dR-dQ;

- Y-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

- Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

- QRF-S(O-옥타노일)-R;

- CQRFSR;

- CQRF-S(O-옥타노일)-R;

- CQRF-S(O-도데카노일)-R;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;

- [Cβ2]QRF-S(O-옥타노일)-R;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[β3R];

- C-[dQ]-RF-S(O-옥타노일)-[dR];

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];

- [dC]-QRF-S(O-옥타노일)-[dR];

- [Cβ2]-QRF-S(O-옥타노일)-[β3R];

- [CQRFSR]₂;

- QRYSR;

- QR-F[4F]-SR, 여기서 -F[4Br]-는 페닐알라닌, 파라 위치가 플루오로 원자로 치환되는 페닐기;

- QKFSR;

- QRFSK;

- C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;

- C(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)QRF-S(O-옥타노일)-R;

- C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR;

- C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-β3R;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)β3R를 들 수 있다.

여기서:

- Cβ2는 H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-CO-;

- β3R은 -NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH;

- -S(-O-옥타노일)은 세린, 옥타노일기로 치환된 히드록실기를 의미하고,

- -S(-O-도데카노일)은 세린, 도데카노일기로 치환된 히드록실기를 의미한다.

안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 펩티드는 2008년 4월 7일에 출원된 미국 지역 출원 US　61/042922에 기재되어 있고, 2009년 4월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/EP2009/054171에는

-　NH2-QRFSR-CONH2;

-　NH2-QRGPR-COOH;

-　NH2-QHNPR-COOH;

-　NH2-QR(4브로모F)SR-COOH;

-　NH2-QRFPR-COOH;

-　N-(아세틸)QRFSR-COOH;

-　N-(C8-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

-　N-(비오틴-C6)QRFSR-COOH;

-　NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(D-이넨티오머 리트로인버전(enantiomer　retroinversion));

-　NH2-YQRFSR-COOH;

-　NH2-Y-(C6-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

-　NH2-Y-(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

-　NH2-QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

-　NH2-CQRFSR-COOH;

-　NH2-CQRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

-　NH2-CQRF[S-O-C12-폴리에틸렌]R-COOH;

-　NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

-　NH2-C-(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

-　NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

-　NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

-　NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[β3R]-COOH;

-　NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH;

-　NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[dR];

-　NH2-[dC]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH;

-　NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][β3R]-COOH; 및

-　[CQRFSR]2, 즉, N-터미널 시스테인 및 시스테인 결합의 SH기의 산화 후 형성되는 디펩티드(디술파이드 브릿지(disulfide bridge))를 더 포함한다;

여기서:

- Cβ2는 시스테인의 카르보닐기 옆에 탄소에 근접한 메틸 잔기를 포함하는 시스테인-β2를 갖는 천연 시스테인 잔기로 대체되고;

- β3R은 알기닌의 아민기 옆에 탄소에 근접한 메틸 잔기를 포함하는 알기닌-β3를 갖는 천연 알기닌 잔기로 대체되고;

- [S-O-C8-폴리에틸렌]는 [S-O-옥타노일]; 및

- 에틸렌쇄의 6, 8 또는 12 탄소로 구성되는 스페이서기(spacer group)에 상응하는 C6, C8 또는 C12 폴리에틸렌.

펩티드가 시퀀스 SEQ ID NO:5의 BPLP의 성숙 물질을 함유하지만 구성되지 않거나 또는 상기 성숙 물질의 유도체를 함유하지만 구성되지 않는 경우에는 펩티드는 N- 또는 C-터미널 말단에 부가적인 아미노산을 함유한다. 이들 부가적인 아미노산은, 예컨대 안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 BPLP 시퀀스의 부분 또는 아미노산의 시퀀스와 상응해도 좋다. 그러나, 상기 펩티드의 크기는 30-40 아미노산을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 펩티드는 당업자에 잘 알려진 어떠한 방법으로 합성되어도 좋다. 이러한 방법은 특히 재조합형(recombinant) 호스트 셀에 의한 생물학적인 제조방법뿐만 아니라 종래의 화학적 합성(고체상 또는 균질한 액체상), 아미노산 또는 그 유도체로 구성하는 효소적 합성도 포함된다. 화학적 루트를 통한 합성은 특히 순도, 항원 특이성(antigenic specificity), 바람직하지 않은 2차 물질의 부재, 제조 용이성의 이유로 유리하다. 화학적 루트를 통한 합성은 다른 방법들, 메리필드형 합성(Merrifield type synthesis) 및 Fmoc 고체상으로 펩티드 합성하는 방법론(예컨대, Oxford University Press, W.C. Chan and P.D. White가 출판한(2000) "Fmoc Solid phase peptide synthesis, a practical approach" 참조) 사이에 포함된다.

본 발명에 따른 펩티드의 치료적 활용

오피오르핀은 쥐의 절망 행동 분석 모델에 항우울 효과 및 정신 자극 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, 오피오르핀의 항우울 효과 및 정신 자극 효과는 내인성(endogenous) κ-오피오이드 리셉터의 활동이 아니라 내인성 μ- 및 δ-오피오이드 리셉터의 활동에 의존한다.

따라서, 본 발명은 정신 자극제의 사용에 대해 상기 단락에 기재된 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이러한 펩티드는 μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성하는데 사용되어도 좋다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는 κ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성하지 않는다.

이들 펩티드는 특히 기면증, 과면증, 불면증, 주의력 결핍(성인 및 아동), 과잉 행동(성인 및 아동), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 강박장애(OCD) 및 우울한 상태 및 우울증("주요 우울 장애(Major Depressive Disorder)"), 프라이머리 우울증(Primary depression)("주요 우울 장애, 단일 삽화(single episode)") 및 레지스턴트 우울증(resistant depression)("주요 우울 장애, 재발(recurrent)"), 조울증(타입 I 및/또는 타입 II), 기분 부전 장애 및 순환성 장애와 같은 기분성 장애를 치료 또는 예방하는데 사용되어도 좋다.

이들 질병의 치료 범위내에서, 본 발명에 따른 펩티드는 μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로의 활성 및/또는 정신 자극을 필요로 하는 환자의 하부군(sub group)에 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 펩티드는 동일한 질병을 치료 또는 예방하기 위해 제 2 유효 성분과 조합하여 사용해도 좋다(즉, 동시 또는 순차적 투여). 이 제 2 유효 성분은 정신 자극 효과 또는 항우울 효과도 갖고, 또는 불안 완화 효과마저 갖는다. 상기 펩티드는, 예컨대

- 이마오(이프로니아지드(iproniazide), 모클로베미드(moclobemide) 등), 이미프라민성 항우울제(이미프라민, 클로미프라민(clomipramine), 아미트리프탈린(amitriptyline), 아목사핀(amoxapine), 도수레핀(dosulepin), 도세핀(doxepin), 마프로틸린(maprotiline), 트리미프라민(trimipramine) 등), 세로토닌을 리캡처하는 선택적인 저해 항우울제(selective inhibitory antidepressant)(시탈로프람(citalopram), 플루복사민(fluvoxamine), 플루옥세틴(fluoxetine), 파록세틴(paroxetine), 서트랄린(sertraline), 에스시탈로프람(escitalopram) 등) 또는 세로토닌 및 아드레날린을 리캡처하는 저해 항우울제(inhibitory antidepressant)와 같은 항우울제;

- 벤조디아제핀(benzodiazepine)(알프라졸람(alprazolam), 클로바잠(clobazam), 디아제팜(diazepam), 로라제팜(lorazepam), 프라제팜(prazepam) 등), 메프로바메이트(meprobamate), 히드록시진(hydroxyzine), 부스피론(buspirone), 캡토디암(captodiame) 또는 에티폭신(etifoxine)과 같은 불안 완화제; 및

- 모르핀(morphine), 모다피닐(modafinil), 메틸페니데이트(methylphenidate), 데놀(deanol) 유도체(acti 5, 클레레길(cleregil), 데브루밀(debrumyl) 등), 케토글루타레이트(ketoglutarate), 아드라피닐(adrafinil) 또는 설부티아민(sulbutiamine)과 같은 정신 자극제로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 유효 성분와의 조합으로 사용되어도 좋다.

이러한 공지의 유효 성분의 대부분은 유효량(effective dose)에 상당한 역효과가 있다. 공지의 유효 성분와 다르게, 본 발명에 따른 펩티드는 트랜스퍼 시스템 또는 리셉터 상에 직접적으로가 아니라 생리적인 조절 시스템에 작용한다. 본 발명에 따른 펩티드의 활동은 따라서 조절 시스템의 범위에서 분리되지 않고, 시스템에 포화될 수 없다. 따라서, 역효과를 갖지 않거나 거의 없다.

제 2 유효 성분의 효과를 포텐셜화함으로써 본 발명에 따른 펩티드는 제 2 유효 성분이 홀로 투여된 경우에 유효량 미만의 농도로 투여된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태는 적어도 하나의 제 2 유효 성분과 조합된 본 발명의 펩티드의 사용에 관한 것이고, 상기 제 2 유효 성분은 유효량 미만의 농도, 특히 역효과가 제한되고, 제거되고, 축소되거나 폐지되는 복용량으로 투여된다.

본 발명에 따른 펩티드 및 제 2 유효 성분은 동일한 의약 조성물 또는 2개의 분리된 의약 조성물내에 존재해도 좋다. 두번째 경우에, 의약 조성물은 필수적으로 동시에 또는 순차적으로 환자에게 투여해도 좋다.

여기에 기재된 질병은 질병의 어느 단계에서 치료되어도 좋다. "치료"란 요법(curative treatment)(병리학적 진행을 적어도 완화하고, 늦추거나 멈추는 것을 나타냄)을 의미한다. "예방"이란 예방적 치료(prophylactic treatment)(병리학적 발생의 위험을 감소시키는 것을 나타냄)를 의미한다.

"정신 자극제(psychostimulant 및 psychostimulant agent)"란 도파민으로 활성화되는(dopaminergic) 노르아드레날린에 의해 활성화되는(noradrenergic) 신경 전달의 증가를 야기하는 화합물을 의미한다. 더욱 특히, 정신 자극제는 주의, 동기 부여, 민첩성 및 집중을 통제하는 역할을 하는 신경 전달 물질을 자극한다. 도파민 및 아드레날린은 주의, 동기 부여, 민첩성, 집중을 통제하는 역할을 하는 2개의 주요 신경 전달 물질이다.

"μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로"란 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 경로는 특히 Henriksen 및 Willoch에 의해 기재된 것(2008 Brain. 131(Pt 5):1171-96)을 들 수 있다. 당업자는 화합물이 μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성하는지가 평가되는 것이 가능한 실시예 2에 기재된 바와 같은 몇가지 시험을 했다. 예컨대, μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터의 구체적인 오피오이드 길항제의 존재 및 부재의 효과를 비교할 수 있는 것이다. 길항제의 존재시 화합물의 효과 폐지는 상기 화합물이 조사된 오피오이드 경로를 활성한다는 것을 타나낸다.

본 발명은 μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성하는 본 발명에 따른 펩티드의 생체 외에서(in vitro )의 사용과 생체 내에서( in vivo )의 사용 모두에 관한 것이다.

본 발명은

- 정신 자극제;

- μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성할 수 있는 약물; 및/또는

- 기면증, 과면증, 불면증, 성인 및 아동의 주의력 결핍, 성인 및 아동의 과잉 행동, 주의력 결핍/과잉 행동(ADHD), 강박 장애(OCD) 및 우울증, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애와 같은 기분성 장애로부터 선택되는 질병을 예방 또는 치료하는 약물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 펩티드의 사용도 다룬다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 개인에게 투여하는 단계를 포함하는

- 기면증, 과면증, 불면증, 성인 및 아동의 주의력 결핍, 성인 및 아동의 과잉 행동, 주의력 결핍/과잉 행동(ADHD), 강박 장애(OCD) 및 우울증, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애와 같은 기분성 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법; 및/또는

- μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성하는 방법을 다룬다. 바람직하게는 개인은 그것을 필요로 하는 개인 및/또는 환자이다. 바람직하게는 상기 펩티드의 유효량이 투여된다. 개인 및/또는 환자는 바람직하게는 정신 자극제 및/또는 μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로의 활성을 필요로 한다.

의약 조성물 및 복용량

본 발명에 따른 펩티드는 유효 성분, 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드와 하나 이상의 의약적으로 수용 가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipients)를 포함하는 의약 조성물로서 바람직하게 사용된다.

"부형제" 또는 "의약적으로 수용 가능한 캐리어"란 어떠한 역효과, 예컨대 인간 또는 동물의 알러지 반응을 발생시키지 않는 어느 용매, 분산매(dispersion medium), 흡수 지연제(absorption-delaying agent) 등을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 펩티드는 상기 기재된 어느 펩티드와 일치해도 좋다.

예컨대, 본 발명에 따른 의약 조성물은 의약 조성물 유닛 복용량 당 본 발명의 따른 펩티드를 3~100, 5~50, 10~25㎎ 포함한다. 의약 조성물은 치료적 용도(예컨대, 상기에 기재된 것) 및 복용량(dosage)(예컨대, 상기 문단에 기재된 복용량에 따름)에 관한 지시를 동반해도 좋다.

상기 복용량은 특히 적절한 유효 성분, 처방 형태, 치료적 지시, 나이, 체중 및 환자의 상태에 의존한다.

최초의 복용량은 일반적으로 가능한 한 낮도록 선택된다(최소 유효량). 필요하다면 상기 복용량은 환자의 반응에 의존하여 점진적으로 증가시킨다. 유효 성분의 효과 발생 전에 지연된다는 점을 고려해볼 때 바람직하게는 복용량을 증가시키기 전 며칠에서 몇주 동안 기다릴 필요가 있다.

본 발명에 따른 펩티드의 경우에는 성인의 최초 복용량은 예컨대 하루에 3번 75㎎ 이하로 3번 투여되어도 좋다. 이 복용량은 필요에 따라 하루에 150㎎까지 점진적으로 증가시켜도 좋다. 하루에 200㎎ 이상의 복용량은 권장하지 않는다. 그러나, 환자가 심각한 상태로 병원에 수송되었을 경우, 복용량을 하루에 250 또는 300㎎까지 증가시켜도 좋다. 노인 환자에 있어서, 최초의 복용량은, 예컨대 하루에 30㎎ 이하이고, 바람직하게는 하루에 100㎎을 초과하지 않는다. 아동에 있어서, 최초의 복용량은, 예컨대 하루에 10~25㎎ 이하이고, 바람직하게는 하루에 75㎎을 초과하지 않는다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 정신 자극제, 항우울제 및/또는 불안 완화제로부터 선택되는 적어도 하나의 제 2 유효 성분을 더 포함해도 좋다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 단일 루트를 통해 또는 다른 루트를 통해 환자에 투여되도록 제형되어도 좋다.

상기 의약 조성물은, 예컨대 경구(oral), 설하(sublingual), 비강(nasal), 구강(buccal), 경피(transdermal), 정맥(intravenous), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular) 및/또는 직장(rectal) 루트를 통해 투여되어도 좋다.

경구 또는 설하 루트를 통해 투여하는 경우에는, 본 발명의 조성물은, 예컨대 젤라틴 캡슐, 발포정(effervescent tablets), 박리되거나 코팅된 알약, 봉지(sachets), "드라제(dragees)", 마실 수 있는 앰플(drinkable ampoules) 또는 용액, 미세 과립(microgranules) 또는 서방성 형태(prolonged release forms)이다.

비강 또는 구강 루트를 통해 투여하는 경우에는, 본 발명의 조성물은, 예컨대 스프레이로 존재한다.

경피 루트를 통해 투여하는 경우에는, 본 발명의 조성물은, 예컨대 패치로 존재한다.

비경구적인 루트를 통해 투여가 완료되는, 특히 주사의 경우에는 유효 성분을 포함하는 본 발명의 조성물은 앰플 또는 느린 관류용 플라스트 내에 패키징되는 주입가능한 용액 및 서스펜션으로 존재한다. 상기 주사는 특히 피하, 근육 또는 정맥 루트를 통해 행해져도 좋다. 비경구적인 투여의 형태는 완충제(buffer), 안정제(stabilizer), 보존제(preservative), 가용화제(solubilizer), 등장화제(isotonic agents) 및 서스펜션제를 혼합함으로써 종래에 얻어졌다. 공지의 기술에 따라, 이러한 혼합물은 살균된(예컨대, 여과에 의함) 후 정맥 주사로 패키징되었다.

완충제로서, 당업자는 유기 포스페이트 소스에 따른 완충액을 사용해도 좋다.

서스펜션제의 예로는 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 아카시아(acacia) 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스를 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 유용한 안정화제는 소듐 설파이트 및 소듐 메타술파이트이고, 상기 언급된 것은 보존화제로서 소듐 p-히드록시벤조에이트, 소르브산, 크레졸 또는 클로로크레졸로 제조된 것이다. 경구 용액 또는 서스펜션의 제조에 대해서, 유효 성분은 유처리제(dispersant), 보습제(humectant), 서스펜션제(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 보존제(예컨데 메틸파라벤 또는 프로필파라벤), 입맛 교정제(taste-correcting agent) 또는 착색제에 적합한 운반체 내에 용해되거나 서스펜션된다.

미세 과립을 제조하기 위해서, 유효 성분은 적합한 희석제, 적합한 안정화제, 활성 물질의 서방성을 향상시키는 제 또는 적합한 폴리머(예컨대 수가용성 수지 또는 수불가용성 수지)와 코팅되는 중핵을 형성하는 어떤 다른 형태의 첨가제와 조합되어도 좋다. 당업자에 알려진 상기 기술은 이 목적으로 사용될 것이다.

이렇게 하여 얻어진 미세 과립은 적합한 복용량 단위로 선택적으로 제형된다.

분명한 의미를 갖고 있지만, "comprising", "containing", "including" 및 "consisting in"은 본 발명의 설명에서 상호 교환하여 사용되고, 서로 대체되어도 좋다.

하기 실시예 및 도면은 범위에 한정되지 않고 본 발명을 설명한다.

도 1은 예비 시험(n=40) 및 시험(건조, n=8 쥐/군)(평균±SEM)시 부동성을 측정함으로써 강제 수영 부하 시험에 오피오르핀의 정신 자극 및 항우울 효과를 나타낸다. 맨 위트니 시험(vs. 운반체)은 이하와 같다: ^Tp<0.10; * p<0.05; *** p<0.001. 시험시 오피오르핀이 투여된 쥐는 운반체가 투여된 쥐와 다르게 스스로 감수하지 못한다. 이것은 오피오르핀이 항우울 효과가 있다는 것을 설명한다. 또한, 시험시 오피오르핀이 투여된 쥐의 부동 시간이 예비 시험시 동일한 쥐의 부동 시간 보다 짧다. 이것은 오피오르핀이 정신 자극 효과가 있다는 것을 설명한다.
도 2는 오피오르핀이 꼬리 회피 통증 모델(tail-flick pain model)에서 진통성 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 통증 반응은 인간 오피오르핀 또는 모르핀 투여 후 유해한 온도 자극(noxious thermal stimuli)에 대한 시간의 기능을 평가한다. 꼬리 회피 잠재(Tail-flick latencies)는 4번의 다른 시점에서 평가된다: 모르핀에 관련하여 오피오르핀 또는 운반체 투여 후 5, 15, 25 및 60분. 30초 인터벌로 분리된 2번의 연속 측정은 오피오르핀, 모르핀 또는 운반체 투여 전에 행해져 꼬리 회피 잠재의 기준치를 결정한다. 오피오르핀(블랙 서클; 2 mg/kg i.v.)의 효과는 꼬리 회피 잠재에 대한 운반체(오픈 서클) 및 모르핀(오픈 트라이앵글; 1 mg/kg i.v)과 비교한다. 결과는 6마리 쥐의 평균±SEM으로 표시된다. 별표는 맨-위트니 U 시험에 의해 운반체에 대해 ** P<0.01을 나타낸다.
도 3은 인간 오피오르핀은 꼬리 회피 통증 모델에 진통 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 통증 반응은 인간 오피오르핀 또는 모르핀의 급성 및 만성적 투여 후 유해한 온도 자극의 기능을 평가한다. 꼬리 회피 잠재는 오피오르핀, 운반체 또는 모르핀을 급성(1일) 또는 7일 동안 매일 i.v. 투여(7일)한 후 평가된다. 30초 인터벌로 분리된 2번의 연속 측정은 꼬리 회피 잠재의 기준점을 평가하기 위해 오피오르핀, 모르핀 또는 운반체 주사 전에 행해진다. 오피오르핀(오픈 트라이앵글; 2 mg/kg i.v.)의 효과를 꼬리 회피 잠재에 대해서 운반체(오픈 서클) 및 모르핀(오픈 스퀘어; 1 mg/kg i.v)과 비교했다. 결과는 6마리 쥐의 평균±SEM으로 표시된다. 별표는 맨-위트니 U 시험에 의해 운반체에 대해 *P<0.05, ** P<0.01을 나타낸다.
(서열 목록의 서열 설명)
SEQ ID NOs: 1, 2, 3 및 4는 본 발명에 따른 펩티드와 상응한다. 더욱 특히 SEQ ID NO:2는 오피오르핀에 상응한다.
SEQ ID NO:5는 인간 BPLP(Basic Proline-rich Lacrimal Protein)의 시퀀스에 상응한다.
SEQ ID NO:6은 시알로르핀에 상응한다.

실시예 1: Genosphere Biotechnologies(F) & Almac Sciences (UK)에 의한 오피오르핀의 합성(즉, QRFSR 펩티드)

오피오르핀 배치를 Genosphere Biotechnologies(F) & Almac Sciences (UK)에 의해 합성했다. 이러한 합성 배치는 복용량-의존 방법으로 생체 외에서

- 재조합된 인간 NEP(QRFSR 펩티드의 저해 농도는 5~50μM를 포함함)에 의한 세포내 프로테인 분해(endoproteolysis)로 부터의 물질 P(NEP의 생리적 기질) 및 합성 형광 기질 [Abz]-dRGL-[EDDnp], [Abz]-RGFK-[DnpOH] (Thermo-Fisher Scientific),

- 재조합된 인간 APN에 의한 아미노 프로테인 분해(aminoproteolysis)로부터의 Ala-AMC의 합성 기질을 보호한다는 것을 확인했다.

실시예 2: 침해 수용 전달 경로(nociceptive transmission pathway)에 대한 오피오르핀의 효과

수컷 쥐의 급성 통증 행동 반응의 분석적인 모델, Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(14):8549-54)이 기재한 "핀 통증 시험"(기계적인 자극)에 있어서, 모르핀 6 mg/kg i.p.(Rougeot and Messaoudi, Med. Sci. (Paris). 2007; 23(1):37-9)에서와 동등하게 오피오르핀은 1mg/kg i.v.(p=　0.0002, 맨-위트니 U-시험, n=8-12 쥐/군)으로 강력한 통증 완화 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.

현저한 방법에 있어서, 주요 역효과 중에서 모르핀의 항연동 효과(통제쥐와 비교하여 모르핀으로 치료되는 쥐의 peristaltism을 80~90% 억제)는 오피오르핀으로 치료되는 쥐에서 관찰되지 않았다.

오피오르핀의 진통 활동은 피하의 만성적인 염증에 관한 만성적인 통증 행동 반응의 분석 모델, Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(14):8549-54)이 기재한 "포르말린 시험"으로 조사되었다. 참조 물질은 복용량 2㎎/㎏인 모르핀이다.

소위 "포르말린" 통증 시험에 2개의 가장 중요한 변수, 발을 핥는 기간 및 경련수에 근거하여 오피오르핀은 상당한 복용량 의존 효과(p≤0.002, 크루스칼-왈리스 분산 분석, n=8쥐/군) 및 최대 통증 완화력 1-2 mg/kg i.v. (맨-위트니 시험 p = 0.036-0.003 vs. 운반체)을 갖는 지연된 통증 프로파일(행동 반응은 60분 동안 동력학으로 기록되고 분석됨)을 보여준다.

하기 단계는 오피오르핀의 통증 완화 활동 메카니즘 및 특히 내생의 오피오이드 리셉터의 영향의 상세를 정의한 것이다. 하기 리간드의 길항 효과를 분석하였다: 넓은 스펙트럼(나록손(Naloxone), 3 mg/kg)의 오피오이드 길항제 및 각각 μ-리셉터(CTOP, 0.8 mg/kg), δ-리셉터(날트린돌(Naltrindole), 10 mg/kg), κ-리셉터(노르바이날토르피민(Nor-Binaltorphimine), 5 mg/kg) 의 선택적인 길항제.

"포르말린 시험"에서 오피오르핀의 진통 효과는 나록손 또는 CTPA, μ-오피오이드 리셉터의 특정 길항제의 존재하에 폐지된다는 것을 보여준다(상기 표 1). 이 결과는 오피오르핀의 통증 완화 활동이 오피오이드 리셉터에 의존하고, μ-오피오이드 아형(subtype)의 리셉터의 특정 활성을 필요로 하는 내생의 오피오이드 경로에 의해 중재되는 것을 설명한다. 이러한 리셉터는 통증 전달의 네가티브 리트로컨트롤(retrocontrol)(엔케팔린, δ-엔돌핀 및 엔도모르핀) 및 모르핀 활동에 관한 정신적인 신호 전달과 관련된다.

따라서, 오피오르핀은 쥐의 행동 반응의 2개의 분석적 모델, "핀 통증 시험"(급성 기계적 통증) 및 "포르말린 시험"(만성적인 화학적 염증 통증)으로 내생의 오피오이드 경로의 활성을 통해 1 mg/kg에서 강력한 통증 완화 활성을 나타낸다. 한편, 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀은 이들 시험 모두에서 2-6 mg/kg i.p.의 모르핀, 인간에게 심하고 만성적인 통증 치료에 가장 활성인 진통 분자에 의해 유도되는 최대 진통 효과를 유도할 수 있다.

또한, 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀은 이부프로펜(ibuprofen)과 달리 TNBS의 직장내 투여에 의해 유도되는 염증으로부터 결장벽(colic wall)을 보호하지 못하는 쥐의 결장 염증 모델(colic inflammation model)을 나타낸다. 오피오르핀은, 따라서 이 시험에서 어떠한 상당한 장내의 항염증 효과를 나타내지 않는다. "포르말린 시험"에서 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀의 항통증 효과는 따라서 펩티드의 항염증 활성과 관계 없는 것으로 보인다.

실시예 3: 감정을 통제하는 통로에 대한 오피오르핀의 효과: 항우울 가능성

· 절망 행동 시험(강제 수영 부하 시험)

절망 또는 감수 행동에 대한 오피오르핀의 효과는 성숙한 수컷 쥐로 조사했다. 이 시험은 15분의 예비 시험 세션 및 24시간 후 5분의 시험 세션을 포함한다. 예비 시험 세션시 쥐의 행동은 처음 5분간 기록된다. 예비 시험의 마지막에 쥐를 물에서 꺼내 바로 말리고, 치료한 후 우리에 다시 넣는다. 시험시 쥐를 다시 물에 넣고 쥐의 행동을 5분간 기록한다.

오피오르핀을 예비 시험 세션 직후, 시험 세션 300분 전, 15분 전에 정맥 루트(i.v.)를 통해 3개의 복용량으로 투여하였다(0.5, 2 또는 2mg/kg). 참조 물질은 세로토닌 재흡수 억제제인 5-HT1a 작용 물질(agonist) 또는 임프라민(20mg/kg)인 8-OH-DOAT (0.5　mg/kg)이다.

크루스칼-왈리스 분산 분석은 치료 후 동일한 군에서 상당한 이질성이 발견된 반면에 예비 시험시 다른 군의 쥐의 부동 시간이 실질적으로 다르지 않다는 것을 보여준다(상기 표 2).

맨-위트니 시험은 0.5 mg/kg의 오피오르핀으로 치료한 군의 쥐의 부동 시간이 통제군의 쥐의 부동 시간 미만이 되는 경향이 있는 반면에 1 및 2 mg/kg의 오피오르핀 및 8-OH-DPAT로 치료된 쥐의 부동 시간은 통제군의 쥐의 부동 시간에 상당히 미만인 것을 보여준다(도 1).

윌콕슨 시험은 시험과 예비 시험 사이에 통제 쥐의 수중 부동 시간이 상당히 증가한 것을 보여준다. 그들이 물에서 곧 꺼내진다는 것이 유지되어 온 이래로 통제 쥐는 시험시 스스로 감수한다. 통제 쥐와 달리 1 및 2 mg/kg의 오피오르핀 및 8-OH-DPAT로 치료된 군의 쥐의 부동 시간은 예비 시험과 시험 사이에 상당히 감소했다. 이것은 오피오르핀으로 치료된 쥐가 스스로 감수하지 않으므로 오피오르핀이 항감수(항우울) 효과가 있다는 것을 나타낸다. 또한, 1 및 2 mg/kg의 오피오르핀 및 8-OH-DPAT로 치료된 군의 쥐의 부동 시간은 통제군의 부동 시간에 대하여 상당히 감소했다. 이것은 오피오르핀이 항감수 효과뿐만 아니라 정신 자극 효과도 가한다는 것을 나타낸다.

결과적으로, 정맥으로 투여된 오피오르핀은 감수에 대한 보호 복용량-의존 효과를 유도하므로 성숙한 수컷 쥐에 절망 행동 시험에서 1 mg/kg에서 최대 항우울 효력을 나타낸다.

치료된 쥐의 감수의 부재를 설명해도 좋은 오피오르핀의 기억 상실 또는 과잉 행동 효과를 배제하기 위해서, 2개의 추가적인 행동 시험은 오피오르핀의 항우울 효과의 구체성을 다양화하기 위해 행해져도 좋다.

·수동 회피 시험(Passive Avoidance Test)

쥐의 수동 회피 시험으로 탈출할 수 없어 발생하는 회피 자극의 적용시 동물의 기억의 정도를 평가할 수 있다. 상기 장치는 쥐가 구획에서 다른 구획으로 이동할 수 있는 열린 파티션으로 분리된 2개의 구획으로 이루어진다. 시험 시작시 쥐가 놓여지는 제 1 구획은 밝고 어두운 구획과 섀시 도어를 통해 연결되어 있고, 복도는 전기가 통하는 격자를 포함한다. 수동 회피 시험은 동물이 어두운 구획으로 들어갈 때 전기적 쇼크(2 mA, 2s)를 받는 예비 시험 세션 및 동물의 행동이 학습된 일의 장기적 지연으로 분석되는(시험에서 어두운 구획의 격자는 더 이상 전기가 통하지 않음) 24시간 후 3분의 시험 세션을 포함한다. 오피오르핀은 예비 시험 세션 직후에 투여된다(1　mg/kg i.v.). 이 시험으로 오피오르핀의 기억 상실 효과를 평가할 수 있다. 이하 표는 어두운 구획에 들어가는 지연 시간을 나타낸다(평균±SEM, n=8쥐/군).

맨-위트니 시험은 2번의 예비 시험 및 시험 세션시 어두운 구획으로 들어가는 모든 군, 통제 및 오피오르핀군으로부터 쥐의 지연 시간이 상당히 다르다는 것을 보여준다. 윌콕슨 시험은 시험시 두군 각각에 대한 쥐의 지연 시간이 예비 시험시 얻어진 것보다 상당히 높다(x 6-7)는 것을 보여준다. 이것은 동물은 장기적으로 학습된 일을 유지한다는 것을 나타낸다.

복용량 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀은 따라서 수동 회피 시험에 어떤 기억 상실 효과도 나타내지 않는다.

·운동 활성 시험(locomotor activity test)

상기 장치는 쥐가 구획에서 다른 구획으로 이동할 수 있는 열린 파티션으로 분리된 2개의 구획으로 이루어진다. 측정된 변수는 3분 동안 일어서는 동작(직립 활동)의 수 및 두 구획을 통과하는(수평 활동) 수이다. 참조 분자는 이미프라민(20 mg/kg)이다.

통제군과 비교함으로써, 복용량 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀은 운동 활성 시험에서 이미프라민(20 mg/kg i.p.)과 달리 진정 효과(sedative effect)를 유도하거나 어떠한 상당한 과잉 행동 효과를 유도하지 않는다.

따라서, 절망 행동의 분석적 모델에서, 수컷 쥐에게 오피오르핀은 정신 자극 효과 이외에 1 mg/kg i.v.에서 특정 항우울 효과를 나타낸다는 것을 보여준다.

하기 단계는 활동 메카니즘의 특이성, 특히 강제 수영 부하 시험에 내생의 오피오이드 리셉터의 영향을 시험하는 것이다. 이하 표는 예비 시험 및 시험 세션시 부동 시간을 측정함으로써 강제 수영 부하 시험에 치료의 효과를 나타낸다(s, n=8/군; 평균±SEM)

쥐의 절망 행동 모델에서 시험의 제 2 시리즈는 1 mg/kg i.v.의 오피오르핀은 정신 자극 효과 이외에 항우울 효과를 유도한다는 것이 확인되었다. 이 효과는 20 mg/kg i.p의 참조 물질 이미프라민에 의해 나타난 것과 비교할 수 있다. 오피오르핀의 효과는 δ-오피오이드 리셉터의 특정 길항제인 날트린돌의 존재하에 폐지된다(상기 표 5). 이것은 항우울 및 정신 자극 형태의 오피오르핀 활동이 내생의 오피오이드 경로에 의해 중재되고 δ 아형(subtype) 오피오이드 리셉터의 특정 활성이 요구된다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 감정을 통제하는 경로에 대한 오피오르핀의 효과: 불안 완화 가능성

·조건적 방어 매장 시험(The conditioned defensive burying test)

복용량 1 mg/kg으로 정맥으로 투여된 오피오르핀의 불안 완화 효과는 위스타 수컷 쥐의 조건적 방어 매장 시험으로 평가했다.

오피오르핀이 진통 효과를 나타낸다는 점에서 위양성(false positives)을 피하기 위해서, 시험은 2개의 세션으로 행해진다: 불안한 쥐를 선택하는 세션 후 치료 중인 시험 세션. 실험 쥐를 선택하는 조건적 방어 매장 시험을 쥐가 가장 활동적인 어두운 단계(phase)에서 처음 한 시간 행했다. 각 쥐를 프로브(probe)의 각 반대쪽 실험 장치에 놓고, 프로브에 처음 앞발을 내딛는 순간에 동물에게 한번의 저강도(2 mA)의 전기적 쇼크를 준 후 3분 동안 행동을 관찰했다. 톱밥을 각 쥐가 통과하기 전에 교체하고 5㎝의 균일한 높이로 맞추었다. 프로브에 적어도 25초 매장된 것이 표출된 16마리의 쥐를 선택하였다.

다음날, 쥐를 시험 전에 15분 치료하고 프로브 반대 부분의 실험 장치에 놓았다. 이 세션에서, 쥐는 전기적 쇼크를 받지 않았고, 프로브를 한번 보는 것은 쥐의 불안을 촉발시켰다. 쥐의 행동은 5분 동안 기록되었다. 분석된 변수는 프로브에 매장되는 시간, 프로브의 방향으로 스트레칭하는 수, 프로브에 접근하는 수, 및 프로브에 관한 회피수이다. 이러한 다양한 변수는 각 쥐의 전체 불안 점수를 계산하는데 사용되었다. 이하 표는 조건적 매장 시험의 전체 불안 점수에 대한 오피오르핀(1　mg/kg, i.v.)의 효과에 관해 얻어진 결과를 나타낸다.

전체 불안 점수에 근거하여, 복용량 1　mg/kg i.v.의 오피오르핀은 위스타 수컷 쥐의 조건적 매장 시험에서 통제된 것에 대해 어떤 불안 활동을 나타내지 않았다. 직립 활동에 관해서, 오피오르핀으로 치료된 쥐는 통제 쥐보다 직립 활동을 덜 표출하는 경향을 보였다(p=0.11 vs. 운반체, n=8 쥐/군).

실시예 5: 약리 의존성 행동에 대한 오피오르핀의 효과: 중독 형태 가능성

·조건적 위치 선호도 시험(Conditioned place preference test)

장치는 습관화 단계 및 시험시 쥐가 하나의 구획에서 다른 곳으로 자유롭게 통과할 수 있도록 열린 섀시 문으로 분리된 2개의 구획으로 이루어진다. 하나의 구획은 밝고, 복도는 금속 격자를 포함한다. 이 구획은 비선호 혐오 구획이고, 이 구획에서 보내는 시간은 변수로 측정된다. 10일의 조건 기간(45분, 닫힌 섀시 문)동안, 선호 구획(어둡고, 깔개 물질(bedding material))이 통제(운반체)와 관련된 반면에 비선호 구획은 시험될(통제 및 약물) 물질의 투여와 관련된다. 상기 시험은 3개의 단계가 일어난다: 습관화 또는 예비 시험 단계, 조건적 단계 및 최종 훈련 단계. 오피오르핀을 진통 효과의 복용량 1　mg/kg i.v.을 투여하였고, 모르핀을 복용량 2　mg/kg i.v.로 투여하는 참조 물질로 사용했다.

크루스칼-왈리스 변수 분석은 비선호 구획에서 각각 단계 1(0일 예비 시험) 및 단계 3(11일 시험)에서 경시에 따라 행하였고, 3개의 군은 0일 습관화 단계 후 상당히 다르지 않았지만(H(2df)=1.21; p=0.55), 이들 동일한 군은 조건적 처리 단계 후 11일 시험시 상당히 다르다(H(2df)=7.91; p=0.02)는 것이 나타났다. 이후의 경우에, 맨-위트니 시험은 모르핀으로 치료된 쥐와 운반체로 치료된 쥐가 상당히 다르다는 것을 나타낸다(U=1; p=0.001). 한편, 오피오르핀으로 조건화된 쥐와 운반체로 조건화된 통제 쥐는 상당히 다르지 않았다(U=31; p=0.92).

오피오르핀의 진통 복용량으로 만성적으로 치료된 후, 쥐는 최초로 비선호로서 설립된 구획에 상당한 선호가 발전하지 않았다. 이들 쥐는 최초 예비 시험 단계(윌콕슨 시험: z=1.54; p=0.12)시 비선호 구획에서 많은 시간을 보냈다. 한편, 모르핀의 진통 복용량으로 만성적으로 치료된 후, 쥐는 예비 시험시 최초로 비선호로서 설립된 구획의 지역에 상당한 선호가 발전되었다(z=2.52; p=0.012).

"포르말린 시험"에서 효과적인 진통 복용량의 오피오르핀은 모르핀과 달리 상당한 약리 의존성을 야기하지 않았다. 복용량 1　mg/kg의 오피오르핀의 반복 투여는 조건적 위치 선호 시험에 중독 형태의 상당한 역효과를 유도하지 않았다.

실시예 6: 꼬리 회피 시험에서의 오피오르핀 통증 완화성 내성(antinociceptive tolerance)의 비발생

·물질 및 방법

실험 시작시 250 내지 280g으로 칭량된 수컷 위스타 쥐(Harlan, 프랑스)가 연구에 사용되었다. 7일 순화 기간 후, 12시간 교차 명/암 사이클(21:00 p.m./9:00 a.m.) 및 통제된 온도(21±1℃) 및 습도 측정(50±5%)된 방에서 치료된 군에 따라 쥐들을 임의로 수용(housed)하고, 칭량하였다. 음식과 물은 ad libidum을 사용했다. 쥐들을 실험적으로 단 한번 시험했다. 연구 동물의 행동 시험, 케어 및 안락사는 European Communities Directive 86/609/EEC 및 ASAB Ethical Committee for the use of laboratory animals in behavioral research 71:245-53에 따랐다.

오피오르핀(Genosphere Laboratory, 프랑스)을 운반체 용액(PBS 100mM의 55%-아세트산 0.01N의 45%)에 용해하여 복용량 0.5 내지 2 mg/kg 체중의 범위내로 행동 시험 전 5 내지 15분 침투적으로 주입했다. 모르핀은 Francopia (프랑스)로부터 구매하여 염분(증류수 중 0.9% 염화 나트륨)에 용해하고 1-2 mg/kg 복용량으로 행동 시험 전 15분 i.v. 루트를 통해 주입했다. 날록손(중앙 및 주변 활동의 오피오이드 길항제)을 Sigma Chemical (프랑스)로부터 구매하여 염분에 용해하고 오피오르핀 투여 전 15분 3 mg/kg 피하(s.c.) 투여했다. 날트린돌(δ-오피오이드 길항제), 노르비날토르피민(κ-오피오이드 길항제) 및 CTAP(μ-오피오이드 길항제)를 Sigma Chemical (프랑스)로부터 구매하여 염분에 용해하고, 시험 전 25분 각각 10 mg/kg i.p., 20 min; 5 mg/kg i.p., 3h and 0.8 mg/kg i.v.으로 투여했다. 모든 약물은 1 ml/kg 체중의 체적이 투여되었다.

급성 열 자극에 반응하는데 필요한 시간을 평가하는 꼬리 회피 시험은 침해수용성 척수 반사에 우선적으로 반사된다. 자동 꼬리 회피 analgesymeter에 연결된 복사열원의 표준화된 꼬리 회피 장치(Harvard Apparatus LTD, Edenbridge, 영국)가 사용된다. 쥐는 시험 하루 전에 2개의 2분 세션 동안 경합되는 상황에 익숙하다. 실험 당일, 그들은 손에 의해 절제되어 복사열원이 꼬리의 말초 외측면에 초점을 맞추었다. 미리 조정된 열 자극 강도는 30%로 설정되어 기초 꼬리 회피 잠재≤2-3초가 얻어졌다. 모르핀과 관련되고 이들 실험 조건하에서, 5초 컷오프(cut-off) 시간은 티슈 손상을 방지하기 위해 생겼다. 각 행동 시험 쥐는 스스로 통제됨으로써 사용되고, 30초 인터벌로 분리된 2 연속 측정은 오피오르핀, 모르핀 또는 운반체 주사 전에 행해져 꼬리 회피 잠재 기준치를 평가했다. 시험 당일, 쥐는 신선하게 준비된 이하 용액 중 하나를 정맥 투여 받았다: 운반체 용액, 1 mg/kg 모르핀 또는 2 mg/kg 오피오르핀. 내성 유도 쥐는 7일 연속 신선하게 준비된 용액을 매일 정맥으로 투여 받았다. 결과를 n=6 쥐의 꼬리 회피 잠재±SEM으로 표시했다.

결과를 평균±SEM으로 표시했다. 군들 사이의 명백한 차를 실험 조건을 통해 각종 독립된 변수들 사이의 비교를 위해 랭크된 변수의 크루스칼-왈리스 단방향 분석(KWT, 비모수적 방법(a non-parametric method))을 사용하여 평가했다. 치료 사이의 명백한 차이가 얻어진 경우에는 맨-위트니 포스트 혹 시험(Mann-Whitney post hoc test (MWT))을 사용하여 각 치료된 군과 통제군(운반체 또는 기준치 값)을 비교함으로써 이들 차이에 기여하는 군을 확인했다. 비모수적 윌콕슨 대응쌍 시험(Wilcoxon matched pairs test (WT))은 각 처리군으로 반복 측정된 2쌍의 변수를 비교하는데 사용되었다. 모든 통계적 평가를 위해 중요성 레벨은 P<0.05로 설정되었다. 모든 통계적 분석은 컴퓨터 소프트웨어 StarView®5 통계적 패키지(SAS, Institute, Inc., USA)를 사용하여 행해졌다.

·인간 오피오르핀은 꼬리 회피 시험으로 통증 완화 효과를 나타낸다.

꼬리 회피 시험은 고통스러운 복사열 자극에 반응하는데 필요한 시간을 측정한다. 꼬리 철수 잠재는 유해한 자극에의 통증 반응에 기능적으로 관련되는 열 침해 수용 한계를 결정한다. 꼬리 회피 반응의 약물 유인 완화는 척추 레벨로 우선적으로 통합된 통증 완화용 예비 증거를 제공한다. 상기 연구의 목적은 쥐꼬리 회피 시험 t를 사용하여 모르핀에 대한 오피오르핀 분석적 효과 기간 및 강도를 평가하는 것이다.

이 연구를 위해, 오피오르핀의 침투성 복용량 2 mg/kg은 쥐꼬리 회피 시험에서 활동 기간의 관점에서 최고의 반응을 조사하기 위해 선택된다. 이 복용량은 오피오르핀이 2 mg/kg에서 최대 효과로 상당한 복용량-의존 통증 완화 반응을 유도한다는 것을 보여주는 예비 데이터에 관해 평가한다. 꼬리 회피 잠재는 4개의 다른 시점에서 평가된다: 모르핀(1 mg/kg, i.v.)과 비교하여 오피오르핀 또는 운반체 투여 후 5, 15, 25 및 60초.

도 2는 오피오르핀 또는 모르핀 또는 운반체 치료 조건(군 당 n=6 쥐) 하에서 시간의 기능에 대한 평균 꼬리 회피 잠재를 나타낸다. 예비 주사 기준치 값은 3군 사이에 상당한 차이는 없었다(크루스칼=왈리스 시험 P=0.54). 마찬가지로, 5분 후 주사시(P=0.34) 3군의 평균 꼬리 회피 잠재 사이에 상당한 차이를 나타내지 않는다. 한편, 단방향 크루스칼-왈리스 분석은 15, 25 및 60분 후 주사(각각 P=0.005, P=0.005 및 P=0.02) 치료의 상당한 효과를 나타낸다. 이후의 개체는 오피오르핀- 또는 모르핀-치료된 쥐와 시간 잠재가 오피오르핀과 모르핀 투여 후 15 및 25분 상당히 증가하는 운반체로 치료된 통제 쥐 사이에 꼬리 회피 잠재의 비교를 의미한다: 운반체의 2.57±0.10 및 2.51±0.06초~3.56±0.32초 및 3.29±0.15초, 운반체에 대해 P=0.01 및 P=0.008, 각각 모르핀; 3.12±0.07초 및 3.19±0.07초, 운반체에 대해 P=0.005 및 P=0.004, 각각 맨-위트니 시험(MWT)에 의한 오피오르핀. 오피오르핀(운반체에 대해 P=0.08)의 경우에 높아지는 경향이 있는 반면에 모르핀(운반체에 대해 P=0.01)의 경우에 60분 후 여전히 상당했다. 오피오르핀 치료된 쥐는 치료 후 15, 25 및 60분 모르핀 치료된 쥐보다 반응 잠재가 상당이 다르지 않았다(MWT에 의한 모르핀에 대해, 각각 P=0.20, P=0.34 및 P=0.26).

또한, 각각의 예비 주사 기준치 값의 비교는 꼬리 회피 잠재는 모르핀으로 치료된 후 5, 15 및 25분 상당히 증가한다는 것을 보여준다(윌콕슨 시험 WT에 의해, 각각 P=0.05, P=O.03 및 P=0.05). 한편, 오피오르핀으로의 치료는 후 주사 시점 15 및 25분에서 반응 잠재에서 상당한 증가를 유도한다(WT에 의해, 각각 P=0.03 및 P=0.03). 흥미롭게도, 통제 군에 대해 상응하는 기준치 반응 비교는 시험에 반복 노출된 후 열 통증 한계에 영향받는 상당한 시간, 즉 꼬리 철수의 시간 잠재의 점진적 감소를 나타낸다. 반복 자극에 대한 통증 한계의 감소는 통증의 증감 또는 자극을 학습하여 이들 동물에 있어서 통증 완화 반응을 용이하게 하도록 반영되어도 좋다. 반복 측정에 후 열 자극에 대한 향상된 통증 완화 반응은 열 급성 통증에 대해서 강력한 진통력이 확인되는 모르핀과 유사한 오피오르핀으로 치료된 쥐에서 완전히 반대가 된다.

쥐꼬리 회피 패러다임에서, 오피오르핀(2 mg/kg i.v.)의 최대 진통 효과는 i.v. 투여 후 15 내지 25분 발생하고, 활동의 진폭 및 기간의 관점에서 모르핀의 최대 진통 효과보다 규모의 범위가 동일하다. 이것은 오피오르핀이 스피날 엔케팔린 경로에 의해 통제된 열 유발성 상처 급성 통증 행동을 억제한다는 것을 설명한다.

·꼬리 회피 시험에 있어서 인간 오피오르핀과 모르핀 만성적 치료 사이의 통증 완화 내성의 발생 비교

실험의 목적은 꼬리 회피 시험을 사용하여 오피오르핀 유도된 통증 완화 내성의 잠재적 위험을 조사했다. 내성 유도 쥐에 대해서 연속 7일간 매일 오피오르핀(2 mg/kg), 모르핀(1 mg/kg) 또는 운반체를 정맥 투여하였다. 꼬리 회피 잠재는 피크 유효 시간, 즉 도전적 복용 후 15분 25분에 측정하였다.

예비 주사 기준치 값과 비교하여, 3분의 평균 꼬리 회피 잠재 사이에 상당한 차이가 관측되지 않았다(KWT에 의해 1일 P=0.54 및 7일 P=0.14, n=6쥐 /군). 크루스칼-왈리스 분석은 3군 사이에서 꼬리 회피 잠재에 상당한 치료 효과가 나타났다(15 및 25분 후 주사 시점 , 각각 1일 P=0.005; 7일 P=0.003). 7일과 1일 사이에 시간 반응 프로파일을 비교한 경우, 꼬리 회피 잠재는 매일 반복 치료 후 운반체 처리군에 안정하게 유지되고(윌콕슨 시험, WT에 의해 P=0.99), 모르핀 처리군에 감소되는 경향(P=0.06)이 있고, 오피오르핀 처리군에 증가하는 경향(WT에 의해 P=0.06)이 있다(도 3).

운반체 처리군과 비교하여 반응 잠재의 상당한 증가는 첫날 모르핀 또는 오피오르핀의 단일 급성 투여 후 관찰되었다(각각 MWT post-hoc 비교에 의해 15와 25분 후 주사 시점에서 P=0.01 or P=0.01). 만성적 치료 연속 7일 후, 모르핀과 오피오르핀은 운반체 만성적 치료와 비교하는 경우에 15 및 25분 후 주사 꼬리 회피 반응에 상당한 증가를 유도할 수 있다(각각 P=0.02 및 P=0.004). 그러나, 모르핀 유도된 증가는 오피오르핀에 의해 유도된 반응보다 낮은 경향이 있다(MWT에 의해 후주사 시점 15분에서 P=0.08).

한편, 만성적 치료 후 모르핀 통증 완화력의 부재를 반영하는 각각의 예비 주사 기준치 값과 비교는 7일의 만성적 치료 후 꼬리 회피 잠재는 모르핀의 도전적 복용 후 15분 안정하게 유지되고, 후 복용 25분에 상당히 감소한다는 것을 보여준다(WT에 의해 P=0.69 및 P=0.03). 동일한 실험 조건에서, 오피오르핀의 도전적 복용은 25분 후 주사에 상당한 효과가 없는 것으로 보여지는 반면에(P=0.67), 15분 후 주사에 꼬리 회피 반응을 증가시킨다(WT에 의해 P=0.03). 따라서, 진통 완화 반응 기간의 감소가 나타나는 것으로 보이는 반면에 오피오르핀의 진통 강도는 만성적인 치료 후에 변화되지 않는다.

결과적으로, 모르핀과 달리 7일간 하루에 한번 투여된 오피오르핀의 만성적 침투성 투여는 쥐의 고리 회피 시험에 최대 진통 완화 효과에 내성의 발전을 유도하지 않는다.

실시예 7: 결론

상기 실험 데이터는 1　mg/kg i.v.의 오피오르핀이 내생의 μ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로의 활성을 통해 강력하고 강장의 진통 완화를 활성화하는 것을 설명한다. 이 결과는 쥐의 급성의 행동 반응의 3가지 분석 모델, "핀 통증 시험"(급성 기계적 통증), "포르말린 시험"(만성적 화학적 염증 통증) 및 "꼬리 회피 시험(금성 열 통증)으로 확인했다. 오피오르핀은 모르핀의 어떤 주요 역효과, 즉 항연동 효과, 약리 의존 효과 및 내성 효과(Rougeot C, Proceedings of the 4^th International Peptide Symposium; J. Wilce (편집자) Australian Peptide Society의 대표자, 2007)를 유도하지 않고 이들 시험에 모르핀(2-6 mg/kg i.p.)에 의해 유도되는 최대 진통 효과를 유도할 수 있다. 또한, 만성적 화학적 통증 시험에 있어서 오피오르핀의 구체적인(미항염증성(non-anti-inflammatory)) 및 단호한 진통 효과는 심한 신경병적 통증에 오피오르핀의 진통 완화 활동을 위한 것이다.

또한, 수컷 쥐의 절망 행동의 분석 모델에 있어서, 본 발명자들은 1　mg/kg i.v.의 오피오르핀이 내생의 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로의 활성을 통해 정신 자극 효과 이외에 특징적인 항우울 효과를 가한다는 것을 설명했다. 시험에 있어서 오피오르핀의 효과는 동일한 복용량으로 치료된 쥐가 각종 적합한 행동 시험에 기억 상실, 진정 또는 과잉 행동 형태의 어느 반응을 발전시키지 않으므로 특징적이다.

오피오르핀의 항통증, 항우울 및 정신 자극 효과는 자극(통증, 스트레스, 감정..)에 반응하도록 방출된 내생의 엔케팔린의 활동을 전달하는 내생의 μ- 및 δ-오피오이드 리셉터의 활성에 의존한다.

또한, 복용량 1　mg/kg i.v.의 오피오르핀은 수컷 쥐의 조건적 방어 매장 시험시 어떠한 불안 완화 활동을 보이지 않는다.

마지막으로, 조건적 위치 선호 시험 및 포르말린 시험에서의 유효 진통 복용량에 있어서, 오피오르핀은 어떠한 상당한 약리 의존성을 야기하지 않는다. 오피오르핀 1　mg/kg의 반복 투여는 모르핀과 달리 중독성 및/또는 내성형의 상당한 역효과를 유도하지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR <120> OPIORPHINE FOR USE AS A PSYCHOSTIMULANT AGENT <130> BET 09P0757 <150> FR 08 53400 2008-05-26 <160> 6 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Xaa Xaa Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 3 Tyr Gln Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 4 Cys Gln Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 201 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Lys Leu Thr Phe Phe Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ile Ser Cys Phe 1 5 10 15 Thr Pro Ser Glu Ser Gln Arg Phe Ser Arg Arg Pro Tyr Leu Pro Gly 20 25 30 Gln Leu Pro Pro Pro Pro Leu Tyr Arg Pro Arg Trp Val Pro Pro Ser 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Tyr Asp Ser Arg Leu Asn Ser Pro Leu Ser Leu Pro 50 55 60 Phe Val Pro Gly Arg Val Pro Pro Ser Ser Phe Ser Arg Phe Ser Gln 65 70 75 80 Ala Val Ile Leu Ser Gln Leu Phe Pro Leu Glu Ser Ile Arg Gln Pro 85 90 95 Arg Leu Phe Pro Gly Tyr Pro Asn Leu His Phe Pro Leu Arg Pro Tyr 100 105 110 Tyr Val Gly Pro Ile Arg Ile Leu Lys Pro Pro Phe Pro Pro Ile Pro 115 120 125 Phe Phe Leu Ala Ile Tyr Leu Pro Ile Ser Asn Pro Glu Pro Gln Ile 130 135 140 Asn Ile Thr Thr Ala Asp Thr Thr Ile Thr Thr Asn Pro Pro Thr Thr 145 150 155 160 Ala Thr Ala Thr Thr Arg His Phe His Lys Thr His Asn Asp Asp Gln 165 170 175 Leu Leu Asn Ser Thr Tyr Leu Phe Asn Thr Arg Ala Cys His Leu His 180 185 190 Ile Ser Ser Asn Pro Arg Ser Ile Tyr 195 200 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Gln His Asn Pro Arg 1 5 - 1 -

Claims

정신 자극제로 사용되는 펩티드로서:
상기 펩티드는 시퀀스 SEQ ID NO:5의 BPLP(Basic Proline-rich Lacrimal Protein)의 성숙 물질 또는 상기 성숙 물질의 유도체를 포함하고; 또한
정신 자극제 활성을 나타내는 펩티드.
μ- 및/또는 δ-오피오이드 리셉터에 의존하는 오피오이드 경로를 활성화하는 펩티드로서:
상기 펩티드는 시퀀스 SEQ ID NO:5의 BPLP의 성숙 물질 또는 상기 성숙 물질의 유도체를 포함하고; 또한
정신 자극제 활성을 나타내는 펩티드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 펩티드는 시퀀스 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO:1)를 포함하는 펩티드.
[여기서, X₁은 수소원자, 티로신 또는 시스테인을 나타내고;
X₁이 수소원자인 경우에는 X₂는 글루타민 또는 피로글루타메이트를 나타내고;
X₁이 티로신 또는 시스테인인 경우에는 X₂는 글루타민을 나타내고; 또한
상기 펩티드의 C-터미널 말단의 시퀀스는 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg로 이루어진다.]
제 3 항에 있어서,
상기 펩티드는 시퀀스 X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg로 이루어진 펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드는 시퀀스 QRFSR(SEQ ID NO:2), YQRFSR(SEQ ID NO: 3) 및 CQRFSR(SEQ ID NO: 4)로부터 선택된 시퀀스로 이루어진 펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드의 시퀀스는 보존적 치환에 의해 시퀀스 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로부터 선택된 시퀀스로부터 구별되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드는 안정성 및/또는 생체 이용률을 향상시키는 화학적 변형을 포함하는 펩티드.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
강박장애(OCD)(obsessive-compulsive disorder), 기면증(narcolepsy), 과면증(hypersomnia), 불면증(vigilance drop), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD)(attention-deficit/hyperactivity disorder), 성인 및 아동의 주의력 결핍 및/또는 과잉 행동, 우울증(depression), 조울증(bipolar disease), 기분 부전 장애(dysthymic disorder) 및 순환성 장애(cyclothymic disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 펩티드.
제 8 항에 있어서,
상기 질병은 강박장애, 기면증, 과면증, 불면증, 아동의 주의력 결핍 및/또는 과잉 행동, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드.
제 9 항에 있어서,
상기 질병은 강박장애, 기면증, 과면증 및 불면증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
성인에게 하루 75㎎ 이하의 복용량으로 투여되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
아동에게 하루 25㎎ 이하의 복용량으로 투여되는 펩티드.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
하루에 3번 투여되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
경구, 경피, 비강, 설하 및 정맥 루트로부터 선택되는 루트를 통해 투여되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
정신 자극제, 항우울제 및 불안 완화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 2 유효 성분(second active ingredient)과의 조합으로 투여되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 유효량(effective amount)을 투여하는 단계를 포함하는, 강박장애(OCD), 기면증, 과면증, 불면증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 성인 및 아동의 주의력 결핍 및/또는 과잉 행동, 우울증, 조울증, 기분 부전 장애 및 순환성 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.