CN102115477A - 2",2"-二甲基-吡喃-[5",6":7,8]黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕及其他含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的植物中提取纯化化学成分的工艺方法，本发明采用乙醇提取，通过硅藻土柱和硅胶柱分离纯化，最终获得纯度在95％以上的化学单体成分：2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮。该提取方法科学合理，稳定可靠，具有很高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种从含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的植物中提取纯化化学成分的方法，具体涉及2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的提取纯化方法。
背景技术
2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮是一种黄酮类成分，该成分在豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕属于首次发现。在本发明之前没有如何提取纯化该成分的方法收载与文献之中。本发明旨在提供一种科学合理，稳定可靠的2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮提取方法，获得纯度高于98％的2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮，该物质可以用于药物质量控制方法的对照品。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种从含有该成分的植物中提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，获得的2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮，尤其是获得高纯度的2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮。
所述的提取方法包括以下步骤：
1、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4～8倍重量的70％～95％乙醇提取两次，每次1～2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.10～1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1～1∶2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟0.6～2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.05～1.15的清膏a。
2、将清膏a与60～180目柱层析硅胶以1∶1.5～1∶2.5的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5∶1～6∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1∶1～3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10～20重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0.5～0.8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
3、将氯仿液b在10～20℃下放置12～24小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.3～0.7倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24～48小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测， 观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。
4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120-160目的柱层析硅胶以1∶1.5～1∶2.5的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.2～0.6重量份的速度进行洗脱，以5～15重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0.5～0.8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置12～24小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。
5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟0.1～0.3重量份的速度进行洗脱，以2～7重量份为单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0.4～0.6重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用0.4～0.6重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置12～24小时，过滤，收集析出结晶。
6、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含20～40μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
所述制备方法中步骤2～4中薄层鉴别方法为：以体积比3∶1的正己烷∶丙酮为展开剂，其中，2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。
所述提取方法的优选方法包括以下步骤：
1、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的70％～95％乙醇提取两次，每次1.5小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.23。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟1.5重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.1的清膏a。
2、将清膏a与80～120目柱层析硅胶以1∶2的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶柱中。用体积比为5∶1的正己烷∶丙酮，先以每分钟0.7重量份的速度 进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后以每分钟0.7重量份的速度，用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮进行洗脱，收集洗脱液，以15重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0.7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
3、将氯仿液b在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.5倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。
4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120～160目的柱层析硅胶以1∶2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.4重量份的速度进行洗脱，以10重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0.7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。
5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟0.2重量份的速度进行洗脱，以5重量份为单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0.5重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用0.5重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置18小时，过滤，收集析出结晶。
6、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
所述制备方法中步骤2～4中薄层鉴别方法为：以体积比3∶1的正己烷∶丙酮为展开剂，其中，2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。
所述的含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的提取纯化方法适用于同样含有该成分的其他植物。
本发明制备得到的2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮结构式如下：
具体实施方式
实施例1
1、将5000g豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的90％乙醇提取两次，每次1.5小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.23。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟15ml的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.1的清膏a，得到清膏a 51g。
2、将清膏a与80～120目柱层析硅胶以1∶2的重量比拌样，样品干燥后装入直径10cm，高15cm的硅胶柱中。先用体积比为5∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟10ml的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟10ml的速度进行洗脱，收集洗脱液，以150ml为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用5ml的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
3、将氯仿液b在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.5倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，存在两个杂质点。
4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120～160目的柱层析硅胶以1∶2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟4ml的速度进行洗脱，以100ml为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用5ml的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行 薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测还有1个杂质点。
5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟2ml的速度进行洗脱，以50ml单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液浓缩到约5ml为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用5ml的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置18小时，过滤，收集析出结晶。
6、取第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，复核要求，该化学成分提取纯化完毕，制备获得2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮213mg。
实施例2
1、将3000g豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕制成粗粉，用相当于该粗粉4倍重量的80％乙醇提取两次，每次2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.15。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟10ml的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.1的清膏a，得到清膏a 28g。
2、将清膏a与60～120目柱层析硅胶以1∶2的重量比拌样，样品干燥后装入直径10cm，高18cm的硅胶柱中。先用体积比为5∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟3ml的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟4ml的速度进行洗脱，收集洗脱液，以80ml为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用5ml的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
3、将氯仿液b在10～20℃下放置12小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.5倍重量的甲醇，在10～20℃下放置48小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，存在三个杂质点。
4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120～160目的 柱层析硅胶以1∶2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟2ml的速度进行洗脱，以100ml为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用3ml的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置12小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测还有1个杂质点。
5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟1ml的速度进行洗脱，以30ml单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液浓缩到约3ml为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用3ml的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置24小时，过滤，收集析出结晶。
6、取第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，复核要求，该化学成分提取纯化完毕，2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮115mg。
实施例3
1、将5000g豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的70％乙醇提取两次，每次1小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.25。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟15ml的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.1的清膏a，得到清膏a 45g。
2、将清膏a与80～120目柱层析硅胶以1∶2的重量比拌样，样品干燥后装入直径10cm，高20cm的硅胶柱中。先用体积比为5∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟10ml的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟10ml的速度进行洗脱，收集洗脱液，以150ml为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用5ml的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
3、将氯仿液b在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.5倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点， 存在一个杂质点。
4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟2ml的速度进行洗脱，以50ml单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液浓缩到约5ml为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用5ml的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置18小时，过滤，收集析出结晶。
5、取第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，复核要求，该化学成分提取纯化完毕，2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮162mg。
Claims (5)
1.一种从植物中提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4～8倍重量的70％～95％乙醇提取两次，每次1～2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.10～1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1～1∶2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟0.6～2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.05～1.15的清膏a。
(2)、将清膏a与60～180目柱层析硅胶以1∶1.5～1∶2.5的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5∶1～6∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1∶1～3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10～20重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0.5～0.8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
(3)、将氯仿液b在10～20℃下放置12～24小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.3～0.7倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24～48小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，即得到2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮粗结晶。
2.根据权利要求1所述的提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，其特征在于所述制备方法中步骤2中薄层鉴别方法为：以体积比3∶1的正己烷∶丙酮为展开剂，其中2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点。
3.根据权利要求1所述的提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4～8倍重量的70％～95％乙醇提取两次，每次1～2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.10～1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1～1∶2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟0.6～2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.05～1.15的清膏a。
(2)、将清膏a与60～180目柱层析硅胶以1∶1.5～1∶2.5的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5∶1～6∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1∶1～3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.3～1.1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10～20重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0.5～0.8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
(3)、将氯仿液b在10～20℃下放置12～24小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.3～0.7倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24～48小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，即得到2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮粗结晶，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。
(4)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120-160目的柱层析硅胶以1∶1.5～1∶2.5的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.2～0.6重量份的速度进行洗脱，以5～15重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0.5～0.8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置12～24小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。
(5)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟0.1～0.3重量份的速度进行洗脱，以2～7重量份为单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0.4～0.6重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用0.4～0.6重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置12～24小时，过滤，收集析出结晶。
(6)、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含20～40μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
4.根据权利要求3所述的提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的70％～95％乙醇提取两次，每次1.5小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.23。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1∶1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟1.5重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1.1的清膏a。
(2)、将清膏a与80～120目柱层析硅胶以1∶2的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶柱中。用体积比为5∶1的正己烷∶丙酮，先以每分钟0.7重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后以每分钟0.7重量份的速度，用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮进行洗脱，收集洗脱液，以15重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0.7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。
(3)、将氯仿液b在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0.5倍重量的甲醇，在10～20℃下放置24小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。
(4)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120～160目的柱层析硅胶以1∶2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3∶1的正己烷∶丙酮，以每分钟0.4重量份的速度进行洗脱，以10重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0.7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的氯仿液合并，在10～20℃下放置18小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。
(5)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为75∶25的甲醇∶水，以每分钟0.2重量份的速度进行洗脱，以5重量份为单位收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0.5重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容器中，并用0.5重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置18小时，过滤，收集析出结晶。
(6)、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85∶15的甲醇∶水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大于总峰面积98.5％，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
5.根据权利要求3和权利要求4所述的提取纯化2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的方法，其特征在于所述制备方法中步骤2～4中薄层鉴别方法为：以体积比3∶1的正己烷∶丙酮为展开剂，其中，2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″：7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。
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