CN102105161A - 菠萝蛋白酶抑制剂及菠萝蛋白酶抑制剂前体的重组制备 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及菠萝蛋白酶，尤其涉及该复杂的蛋白质混合物所含有的活性化合物。本发明提供了重组表达的菠萝蛋白酶中含有的菠萝蛋白酶抑制剂前体和菠萝蛋白酶抑制剂。已经发现，重组表达的抑制剂在治疗疾病和状态上的效果优于来源于植物提取物的菠萝蛋白酶或者它的蛋白组分。

Description

菠萝蛋白酶抑制剂及菠萝蛋白酶抑制剂前体的重组制备
本发明主要涉及菠萝蛋白酶(Bromelain)，尤其涉及包含在该复杂的蛋白质混合物中的活性化合物。本发明提供了重组表达的菠萝蛋白酶中含有的菠萝蛋白酶抑制剂前体和菠萝蛋白酶抑制剂。重组表达的抑制剂被发现在治疗某些疾病或症状时的效果要优于来源于植物提取物的菠萝蛋白酶或其蛋白质组分。
菠萝蛋白酶在生物化学上被定义为菠萝茎的粗提取物，在药学上被定义为半胱氨酸蛋白酶的混合物。其多方面的正面效果至少部分是源自其蛋白分解作用，尤其是纤维蛋白分解作用。据知，菠萝蛋白酶的抗肿瘤效果依赖于其蛋白分解作用之外的活性，但其机制仍然不清楚。在凤梨科植物的组织中，特别是茎和果实中发现的蛋白分解酶统称为菠萝蛋白酶。最常见的菠萝蛋白酶是来源于菠萝植物(ananas comosus)的茎的各种成分的混合物。已知茎菠萝蛋白酶(以下称为菠萝蛋白酶)含有至少五种蛋白分解酶，此外还含有非蛋白分解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化酶；其还可能含有淀粉酶和纤维素酶活性。此外，还存在多种其他成分。
CN1186118中公开了一种菠萝蛋白酶的物理提取工艺。除其他步骤外，该工艺还包括对菠萝植物的预处理步骤，通过冷冻、破碎、挤压得到汁液，过滤得到澄清液体，通过超滤膜和反渗透膜进行浓缩，然后冷冻真空干燥得到海绵状的产品。据报道，通过控制温度、时间和pH值可提高酶活性和产率。
U.S.3658651涉及在对酶进行沉淀之前先对提取自菠萝植物茎部的含有菠萝蛋白酶的汁液进行纯化处理，将汁液通过离子交换的方式进行纯化，离子交换使用带碳酸氢盐形式的阴离子交换剂和含有弱酸性官能团的阳离子交换剂，以及第二种碳酸氢盐形式的阴离子交换剂。
U.S.4,286,064公开了菠萝蛋白酶粗提取物制备等内容。首先用磷酸将菠萝茎汁液的pH值调至3或4，再加入硫氢化钠以防止巯基被氧化。惰性材料用例如丙酮进行沉淀并过滤。澄清的液体用丙酮沉淀，离心收集沉淀物，然后沉淀物再在预先用磷酸酸化的含有硫氢化钠的水中重新溶解并重新沉淀，或者直接在真空箱中干燥。粗提取物可以通过过滤、透析或渗滤来进一步纯化，以除去小分子和蛋白，再将所得的溶液进行浓缩，最后冻干。
为了避免降解和/或其他不期望的化学反应，如氧化反应，有必要选择特定的处理条件，如温度、pH、溶剂和缓冲液、和/或添加剂，例如稳定剂和抗氧剂。
除了以上的不足以外，还可能需要对粗提取物进行进一步的纯化。这样的纯化可以使用例如在U.S.2002/188107中概括的HPLC方法。
因此，迫切需要提供化学稳定且纯的菠萝蛋白酶药物活性成分，这些成分可以使用在药物组合物、皮肤学组合物、和营养组合物中，并且还不存在现有技术中菠萝蛋白酶制剂的不足。
以上问题已经通过提供异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂得到解决，其中该菠萝蛋白酶抑制剂在异源宿主中以可溶形式大量表达。
本发明是基于发现，菠萝蛋白酶所产生的正面效果可能也归功于其单独存在或共同存在的抑制剂。本发明的抑制剂可以获得更高的纯度，特别是可以避免其他蛋白质或者蛋白质片段的存在，从而减少副作用。也已经发现，本发明的菠萝蛋白酶抑制剂即使在水溶液中经过很长一段时间后仍具有高度的储存稳定性。本发明的菠萝蛋白酶抑制剂也可以用来稳定任何含有多肽的药物组合物，例如含有抗生素的口服组合物。
在本发明研究过程中也已经发现，菠萝蛋白酶抑制剂的前体蛋白(菠萝蛋白酶抑制剂前体，BIP)代表菠萝蛋白酶中所含有的半胱氨酸蛋白酶的天然底物。通过异源表达所述前体蛋白可以获得具有足够纯度的可溶形式的所述天然底物，用于说明半胱氨酸蛋白酶的活性和特异性。因为菠萝蛋白酶抑制剂前体蛋白会被菠萝蛋白酶所含的各种半胱氨酸蛋白酶等降解成它实际起效的药物活性成分，也就是被降解成数种菠萝蛋白酶抑制剂，所以所述菠萝蛋白酶抑制剂前体也可以在含有例如源自菠萝蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶的药物中用作活性成分。在菠萝蛋白酶的作用下形成的菠萝蛋白酶抑制剂反过来会抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，如此可以进一步改变菠萝蛋白酶的药物活性和含有半胱氨酸蛋白酶的任何其它种类组合物的药物活性。
图1示出了作为菠萝蛋白酶抑制剂前体(BIP)一部分的菠萝蛋白酶抑制剂III(bi-III)。示出的氨基酸序列对应于具有链间区域的轻链和重链。
图2示出了菠萝蛋白酶抑制剂III的表达构建子。所用载体(Novagen)适用于大肠杆菌(E.coli)。可以通过β-内酰胺酶来进行筛选。可以通过与NusA-标记融合从而明显提高溶解性。
图3示出了在大肠杆菌粗提物中的菠萝蛋白酶抑制剂。具体示出了使用大肠杆菌Rosetta 2作为表达宿主从pET43.1a/BIP获得的粗提物的10％SDS-PAGE电泳结果。箭头表示来自NusA-标记和菠萝蛋白酶抑制剂BI-III的融合蛋白，其分子量将近75kDa。左边的条带指的是大肠杆菌Rosetta 2中表达的对照的pET43.1a。
图4示出了菠萝蛋白酶抑制剂前体的表达。具体示出了用100μl来自毕赤酵母(Pichia pastoris)表达培养物的上清液进行的10％SDS-PAGE电泳结果。左边的条带示出了阳性BIP-克隆4，右边的条带示出了阴性BIP-克隆5。
图5示出了菠萝蛋白酶抑制剂前体的蛋白质序列示意图，其中的多肽通过多肽质量指纹图谱来确定(下划线表示)。
图6示出了信号P之后的ER信号多肽。
图7示出了含有半胱氨酸蛋白酶an1的载体pPICZalpha(Invitrogen)。所述构建子可以在毕赤酵母中进行表达，并可以用来对菠萝蛋白酶抑制剂活性进行定量/定性分析。图8示出了用图7所示的构建子在毕赤酵母中表达重组Ananain。毕赤酵母KM71H的表达培养物的上清液，其中表达的前酶(35kDa箭头)激活得到的Ananain(25kDa箭头)具有很高的产率(45kDa箭头表示分泌的酵母蛋白)。重组Ananain可以用来测试菠萝蛋白酶抑制剂的活性。
图9示出了菠萝蛋白酶抑制剂前体的DNA序列(图9a)和蛋白质序列(图9b)。
图10-14示出了单个菠萝蛋白酶抑制剂bi-I，bi-II，bi-III，bi-VI和bi-VII的DNA序列(图10-14a)和蛋白质序列(图10-14b)。所述DNA序列包括起始密码子、轻链、链间区域、重链和终止密码子。
图15示出了编码抑制剂蛋白bi-III、bi-VI和bi-VII的菠萝蛋白酶抑制剂前体Bromein。所述抑制剂蛋白被结构域间的区域(ID)共享，该区域可能被肽链内切酶切开。抑制剂由以链间区域(IC)连接的轻链和重链组成(分别表示为LC和HC)，链间区域作为菠萝蛋白酶“靶标”，并允许抑制剂的自动调控。
根据本发明的第一个实施方式，本发明提供了异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂(BI)或者菠萝蛋白酶抑制剂前体(BIP)，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂(BI)或者菠萝蛋白酶抑制剂前体(BIP)已经以可溶蛋白的形式被大量异源生产。
本申请中所用的术语异源表达，是指在不同于原始有机体的宿主有机体中进行蛋白表达，在本申请中是指使用非菠萝属的宿主进行表达，即不是菠萝植物。这样的宿主的实例包括毕赤酵母或大肠杆菌等。
本申请中所用的菠萝蛋白酶抑制剂是指菠萝蛋白酶粗提取物的任意组分中所含的单一抑制剂，其在氨基酸序列上区别于菠萝蛋白酶中含有的其他抑制剂。一般而言，抑制剂的活性主要取决于其活性位点以及位于其附近的可影响其反应性能所需的特定三维结构的区域，但是更远一点的氨基酸伸展区域(stretches)例如圈和层，可能影响抑制剂底物的亲和力，在抑制剂表面上的氨基酸区域则可影响对底物的接近和抑制剂的水溶性。
菠萝蛋白酶抑制剂前体是指一种或多种单个菠萝蛋白酶抑制剂的无活性的前体蛋白，该前体需要通过蛋白酶活化的方式来“释放”所述抑制剂。活化可能一方面需要通过半胱氨酸蛋白酶来进行，另一方面还需要通过肽链内切酶来进行。菠萝蛋白酶抑制剂前体可以形成如图15所示结构。
本申请中所用的术语“大量”是指，菠萝蛋白酶抑制剂前体或者活性菠萝蛋白酶抑制剂异源表达量≥1mg/L，优选≥4mg/L、≥8mg/L、≥12mg/L、≥16mg/L、≥20mg/L、≥30mg/L或者≥40mg/L，以及更优选≥50mg/L。
本申请中所用的术语“可溶的”是指，抑制剂或者抑制剂前体，其表现出与相应的天然的野生型抑制剂基本相同的三维结构。这确保了该抑制剂对半胱氨酸蛋白酶表现出理想的活性，并且可避免添加其他物质，例如为了复性的需要而添加其他物质，这一方面确保了服用时耐受度的提高，在另一方面也避免了对多肽进行不需要的修饰。该抑制剂可进一步对其周围环境展现出足够的亲水性氨基酸，也就是与水分子形成氢键，这样该抑制剂可以具有足够的生物利用度从而使其适用于医药用途。术语生物利用度是指活性成分或活性片段从药品中被吸收并且在作用位点可获得的速度和程度。口服摄入的药物的生物利用度由多种因素决定，包括分子的性质、稳定性和给药剂型，以及病人的因素，例如由于急腹痛疾病和肠切除等导致的肠表面积降低、以及是否在进餐时服药等。影响生物利用度的因素可以包括但不限于，胃肠道吸收不佳、肝首过效应以及药物在到达系统循环前的部分降解。本发明的表达系统可使本发明的抑制剂达到意想不到的高产率和意想不到的高溶解度，而且由于减少或避免了被蛋白酶消化的量，因此可产生更高产的活性抑制剂。
本发明的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体可以通过，例如从植物材料中分离RNA来获得，例如，第一步通过使用TRIzol plus RNA纯化系统(Invitrogen)。DNA以及蛋白可以通过TRIzol方法(Invitrogen)分离。由于淀粉会破坏从蛋白中分离出RNA所需的梯度，因此需要先通过使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)从淀粉富集的部位例如茎中分离出更大量的RNA。下一步，可建立cDNA文库。这可以通过技术人员已知的任何方法进行，例如通过使用SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit(Clontech)。cDNA可以引入到适当的质粒或载体，随后再转化到容易处理的宿主有机体中，例如大肠杆菌。这可以使用技术人员已知的任何方法来进行。可以通过标准的DNA测序技术对插入片段进行测序。DNA序列可以连接到适当的表达载体中，在组成型启动子或可诱导的启动子的控制下进行表达。合适的表达系统例如是pPICZalpha(Invitrogen)，该表达系统可通过任何适当的技术例如电穿孔转化到合适的宿主中，例如是酿酒酵母或优选地毕赤酵母。毕赤酵母作为异源表达的宿主具有特别的优势，其糖基化模式基本上与高等真核生物相匹配，这是因为在所述的有机体中不含有α-1，3-甘露糖基转移酶的类似物。其他表达用的宿主可以是白念珠菌或者昆虫细胞系。单个菠萝蛋白酶抑制剂也可以通过提供菠萝蛋白酶抑制剂前体来获得，通过用含有蛋白酶，如菠萝蛋白酶的组分处理，通过本领域技术人员已知的方法例如色谱法分离获得单个抑制剂。
转化和随后的蛋白表达可以根据本技术领域现有的试验方法进行。重组DNA技术所需要的知识可以参阅Maniatis等人；Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，(1989)。表达的抑制剂的活性可以通过使用例如来自菠萝蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶容易地测得。这样的蛋白酶可以使用酪蛋白作为底物并能将其切开/降解成酪蛋白水解产物。这种转化可以进行定性和定量测定。定性测定通过使用含有酪蛋白的固体基质并将蛋白酶加到基质表面上的方式来进行。酪蛋白降解会在蛋白酶周围形成清楚的晕圈现象。定量测定时，可以使用一定浓度的酪蛋白溶液并加入不同量的蛋白酶。酪蛋白到水解产物之间的转化可以通过分光光度计来监测，该分光光度计的工作波长在可见光范围内，例如600nm。可以理解，被测试的化合物，也就是推定的菠萝蛋白酶抑制剂可以包含于样品中，可以通过与只含有蛋白酶和酪蛋白而不含被测试的化合物的样品进行比较，可以测得其效果。因此，可以对用于测试半胱氨酸蛋白酶或者相似的水解酶的其他合适的检测方法进行改进并调适。其他检测方法的实例可以参阅Bornscheuer U.T.，Kazlauskas，R.J.，Hydrolases in OrganicSynthesis，Wiley-VCH，Weinheim(Germany)，1999)。重组DNA技术所需要的知识可以参阅Maniatis等人；Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，(1989)。推定的菠萝蛋白酶抑制剂的抑制效果也可以与已知的特定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行比较，例如E64(Merck)。
已经惊奇地发现，通过移除ER-转移肽，可以在大肠杆菌中表达抑制剂前体和抑制剂。此外，相比于仍然带有ER-转移肽的菠萝蛋白酶抑制剂/抑制剂前体的异源表达，本发明的菠萝蛋白酶抑制剂/抑制剂前体的产率明显提高了2倍，优选3或4倍，更优选5倍或更多。在不受任何理论束缚的前提下，可以假定ER-转移肽促使蛋白粘附到细胞膜上，这阻止了细胞分裂，显示ER-转移肽可能对表达宿主产生毒性作用。除了其他好处外，这还可以使菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体在大肠杆菌中的表达无需使用折叠蛋白/分子伴侣(chaperones)来获得正确的三维结构。
因此，本发明的第一个方面是提供异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中已经去除了编码相应菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体的ER-转移肽的DNA。可以理解，ER-转移肽的DNA序列可以根据本领域技术人员的知识容易地确定。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体。BI或者BIP具有不同于菠萝属表达系统所赋予的翻译后修饰，这取决于所用的表达系统。通过使用非菠萝属的有机体，可以确保不同的翻译后修饰(PTM)。PTM一般是指蛋白在翻译后的化学修饰，在翻译中信使RNA被解码从而生成特定多肽或蛋白。可以根据对翻译后的蛋白质的作用对PTM进行分类。PTM可以添加官能团或其他蛋白/多肽，使得形成蛋白质的氨基酸的化学结构改变从而导致蛋白结构改变。翻译后修饰的一个例子就是糖基化，在这个过程中多糖被添加到蛋白质上。尤其是，不同的糖基化可能导致不同的水溶性，其可以反过来正面影响蛋白质的生物利用度。
本领域技术人员也可以理解，菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体的功能可以通过多种不同氨基酸序列来实现，在本发明的另一个实施方式中，异源表达的BI或者BIP与对应的BI或者BIP具有至少90％的序列一致性。优选地，该序列一致性至少为95％，98％，99％或者99.5％，更优选地至少为99.8％。
与本发明的BI或者BIP之一分别具有上面提到的序列一致性的这样的BI或者BIP，是一种在对活性而言非必需的氨基酸残基处有改变的多肽，即虽然与原始菠萝蛋白酶抑制剂在氨基酸序列上存在差异，但仍然保留其生物功能或活性。例如，氨基酸可以在“非必需”氨基酸残基处被替换。“非必需”氨基酸残基是指一种残基，其可以与野生型序列不同，而不改变其生物功能或折叠结构，但“必需”氨基酸残基对于生物功能则是必要的。相似的功能通常可通过相似结构或化学性质的氨基酸实现，例如，用异亮氨酸替代亮氨酸。较少见地，异构体可以带有“非保守”改变，例如，用色氨酸替换甘氨酸。同样的道理不仅适用于单个氨基酸残基，还适用于整条氨基酸序列，其可以被添加或删除而不改变蛋白质生物功能。因此，相似的小改变也可包括氨基酸删除或插入，或两者均有。较常见地，在相对大得多的多肽中，是由某段短的氨基酸序列主要负责蛋白质的生物活性或功能。
因此，本发明也包括BI或者BIP的同源物。蛋白质序列的同源性或序列相似性或序列一致性可以通过本领域中熟知的技术来容易地确定，例如，通过使用已有的软件或电脑程序，如，基于Altschul，S.F等人做的BLAST(Basic Local Alignment and Search Tool)程序(J.Mol.Biol.；215(1990)403-410和Nucleic Acids Res.；25(1997)3389-3402)提供了一组相似性搜索程序，其设计用于检索所有可使用的序列数据库，不论查询的序列是蛋白还是DNA。BLAST程序的设计考虑到速度，并且最小程度地牺牲对相关性低的序列的敏感度。在BLAST检索中打的分数有明确的统计学解释，使得可以很容易地从随机的背景配对中辨别出真实的配对。BLAST使用了启发式的(heuristic)算法，其寻找局部而不是全局的配对，因此可检测到仅在某些独立区域存在相似性的序列间的关系。所述的程序是基于Smith和Waterman的(J.Mol.Biol；147(1981)195-197)和Sellers的(Bull.Math.Biol.；46(1984)501-514)改进的算法，以寻找在两条序列间相同或相似的最佳区段。当使用序列比对程序例如BLAST，来确定序列同源性、相似性或一致性时，可以使用默认配置，或选用适当的打分矩阵，例如BLOSUM或PAM，用于优化一致性分数、相似性分数或同源性分数。
可以理解，本发明重组生产的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体可以用来阐释其在植物中的生物活性和作用。对于抑制剂的情况，这尤其适用于阐释抑制剂与半胱氨酸蛋白酶之间的相互作用，而且也适用于与其他菠萝蛋白酶抑制剂，而菠萝蛋白酶中含有的那些形成半胱氨酸蛋白酶的天然底物的菠萝蛋白酶抑制剂前体可用于进行，例如活性测试，或者用于其他天然底物或者具有类似的或改进性能的底物的体外和计算机模拟(in-silico)研究。
为了覆盖可能因为多种原因而引入的氨基酸序列的人工修饰，本发明还包括了那些不是同源的但具有至少如上述定义的序列相似性，或如本发明所述的菠萝蛋白酶蛋白的三维结构，或如本发明所述的菠萝蛋白酶蛋白的功能的序列。可以理解，通过特定调换单个氨基酸或通过调换糖基化模式，可以得到不同性质的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体。这种调换的一个作用可能在于，例如，提高生物利用度，例如获得与不含该特定调换的抑制剂或者抑制剂前体相比更高的溶解度。
在本发明的另一个实施方式中，异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂具有SEQ ID.No.1-5(对应于图10-14b所示的蛋白质序列)中的任意序列。异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂前体具有SEQ ID.No.6的序列(对应于图9a所示的蛋白质序列)。
优选地，通过移除ER-转移肽，可以将具有序列SEQ ID.No.1-6的蛋白质的产率提高至上面定义的范围。对应于如SEQ ID.No.1-6表示的蛋白的DNA序列表示为序列SEQ ID.No.7-12(图10-14a示出了DNA序列SEQ ID.No.7-11，图9a示出了DNA序列SEQ ID.No.12)。
根据本发明的一个实施方式，将异源表达的蛋白区别于野生型蛋白的所述翻译后修饰可导致不同的糖基化模式。本领域技术人员知道，用于异源表达多肽的不同有机体可以导致不同的糖基化模式，从而影响多肽的生物利用度等性能。
根据本发明的另一个实施方式，异源表达的BI或者BIP的翻译后修饰通过选自于下组的宿主系统实现：酵母、昆虫细胞、植物细胞和大肠杆菌。对此等表达宿主的选择是在技术人员的知识范围内的，包括初步地调整编码抑制剂或者抑制剂前体的核苷酸序列中密码子的使用，以确保高表达水平。密码子的使用是指不同有机体在编码相同的特定氨基酸的多种密码子中偏好于某一种的现象，密码子也就是指确定多肽中一个氨基酸残基的三个核苷酸。为了适应这样的偏好，可能有必要通过例如化学合成编码蛋白的DNA，其中密码子的使用已经被调整为匹配所选的表达宿主。这在技术人员的知识范围内。BI或者BIP的表达可以根据本领域技术人员公知的实验方法来进行。可以理解，表达的条件包括温度、培养基、容器种类、通风等，都在技术人员的知识范围内，并且可以根据各自的要求作相应的调整。
毕赤酵母已被认可为特别合适的表达宿主。该菌株已被证明不会影响BI或者BIP的表达，也不会影响使用上面提到的半胱氨酸蛋白酶和酪蛋白进行的相关测试。优选的毕赤酵母菌株为KM71或KM71H，其允许基因整合到AOX2-基因位点以及缓慢的甲醇代谢。一般认为，缓慢的甲醇消耗和相应的BI或者BIP的缓慢生成可以促使抑制剂正确地折叠和分泌。在毕赤酵母中使用合适的质粒进行表达，如pPIC9或pPICZalpha(都来自于Invitrogen)，可保证高效率的转录和翻译。此外，菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体保持了可溶性，并且活性多肽的进一步降解得以减少或甚至避免。本发明的BI或者BIP进一步表现出对宿主有机体无明显毒性。使用酵母，如毕赤酵母，作为表达宿主的另一好处在于，可进行缩小规模的生长实验，即，使用带有如24孔或甚至96孔的微量滴定板替代培养瓶。这确保了可高通量地测试蛋白质性能，如抑制半胱氨酸蛋白酶以及其他蛋白酶的性能。可以通过使用一种本发明的菠萝蛋白酶抑制剂来改变所述蛋白酶降解相应底物的能力，例如半胱氨酸蛋白酶切开酪蛋白的能力。所述抑制剂的此等活性反过来可以标示潜在的药用活性，其至少部分对应于菠萝蛋白酶的药用活性。
根据本发明的另一种实施方式，异源表达的BI或者BIP带有允许抑制剂纯化的结构。这些技术手段为技术人员所公知，可以通过例如，生成和表达抑制剂或者抑制剂前体与某特定氨基酸序列的融合多肽来实现，该特定氨基酸序列可以与滤柱材料的基质可逆地结合。该氨基酸序列可以是，例如，与需纯化的多肽的N或C末端融合的聚组氨酸标记序列。蛋白表达后，该标记与其亲和材料结合并通过咪唑梯度的方式释放，从而从其他蛋白和蛋白片段中分离得到该融合蛋白或融合多肽。如果需要的话，该标记可以被除去。这样的技术为技术人员所公知。可以理解，本发明可以使用任何种类的标记。
根据一种优选的实施方式，可以预见药物组合物、皮肤学组合物或营养组合物可以含有一种或多种异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体。可以理解，当使用菠萝蛋白酶抑制剂前体时，所述组合物也需要包含可以将菠萝蛋白酶抑制剂前体消化成活性形式的蛋白酶。蛋白酶可以，例如以菠萝蛋白酶的形式提供或者以半胱氨酸蛋白酶和其他肽链内切酶混合物的形式提供。本领域技术人员可以容易地调整实验方法以确定能将菠萝蛋白酶抑制剂前体转化成其活性形式的蛋白酶混合物。
根据另一种实施方式，本发明的组合物可以配制成任何适于服用的剂型。营养组合物可以在服用前直接制备或者在生产过程中制备。但是，营养组合物优选为可直接使用的形式。活性成分包含在适于口服的可接受的辅料和/或载体中。短语“营养学上或药学上可接受的载体”是指一种营养学或药学用的载体，其可将活性组分输送至作用位点且对人或动物接受者不会产生明显的伤害。但是，该载体的实际形式并不是关键。
本发明的另一个优选实施方式涉及一种或多种本发明的菠萝蛋白酶抑制剂和/或菠萝蛋白酶抑制剂前体在制备药物中的应用，所述药物可以用于预防和/或治疗与半胱氨酸蛋白酶的表达增加有关联的疾病。
菠萝蛋白酶抑制剂产生的正面效果包括降水肿、溶血、纤维蛋白分解、消炎、抗肿瘤转移和肿瘤抑制作用。
因此，另一个实施方式涉及一种或多种本发明的菠萝蛋白酶抑制剂和/或菠萝蛋白酶抑制剂前体用于制备药物的应用，所述药物用于预防和/或治疗癌症、动脉粥样硬化、细菌感染、炎症、血栓和水肿。所述癌症优选自前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和皮肤癌。
可以理解，菠萝蛋白酶抑制剂前体需要通过例如前面提到过的菠萝蛋白酶来进行合适的活化。
根据另一个实施方式，可以预见菠萝蛋白酶抑制剂在任意含有多肽的组合物中作为稳定剂的应用，例如用于口服使用的含有抗生素的药物组合物中。
因为本发明的菠萝蛋白酶抑制剂具有与Bowman-Birk-抑制剂相似的三维结构，因此还可以预见与Bowman-Birk-抑制剂相似的用途。
Bowman-Birk-抑制剂最初是在大豆中发现的，其中所述蛋白含有71个氨基酸。BBI具有潜在的化学预防活性，其含有明显的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制位点。目前还不清楚BBI抑制癌形成的准确机制，但BBI抑制增殖的活性似乎与胰凝乳蛋白酶的抑制区域有关联。
以上机理预示本发明的抑制剂可能在血液凝结和炎症过程中起到一定的作用。此外，还预示本发明的抑制剂可以用来抑制弹性蛋白酶。BBI蛋白可以进一步提高口服药物的稳定性，并且已知可以作为杀虫剂(Qi等人，2005)。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不对本发明构成任何限制。
实施例
除非另有说明，重组DNA技术的进行根据Maniatis等人；MolecularCloning；A Laboratory Manual第二版，(1989)。纯水通过使用PURELABultra(ELGA)获得。
RNA分离
使用Qiazol试剂盒(Invitrogen)分离RNA以及DNA和蛋白质，按照生产商的说明书操作：将1ml Qiazol与50-100mg新鲜重量的植物材料混合。为除去多糖，将混合物在室温下以12,000×g离心10分钟。上清液在30℃下培养5分钟。按照每1ml Qiazol加0.2ml的量加入氯仿，充分混合溶液15秒。混合物在30℃培养分钟。然后混合物在4℃下以2,000×g离心15分钟。提取含有RNA的上层，并按照每1ml Qiazol加0.5ml的量与异丙醇混合。混合物在4℃下以12,000×g离心10分钟并除去上清液。RNA沉淀物按照每1ml Qiazol加1ml的量用75％乙醇(用DEPC水配成)冲洗，充分混合并在4℃下以7500×g下离心5分钟。除去上清液后，用无RNA酶的水重悬沉淀物。
另使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)得到来源于菠萝茎的不含DNA和蛋白质的更大量的RNA。
建立基因组cDNA库
为建立基因组cDNA文库，使用了SMART IVTM cDNA文库构建试剂盒(SMART IVTMcDNA Library Construction Kit(Clontech))。按照生产商的说明书，进行第一条和第二条链的合成，用蛋白酶K消化，用SfiI消化，cDNA按尺寸排斥分级(size exclusion fractionation)，连接SfiI剪切的cDNA和SfiI剪切的去磷酸化的pDNR-LIB载体，将所得的含有插入片段的载体进行转化。
制备PCR产品
菌落PCR的PCR反应包括在94℃下进行5分钟的单步反应，以及30个循环，每个循环为94℃下进行1分钟+54℃下进行1分钟+72℃下进行1分钟，然后是72℃下进行7分钟，和4℃储藏。
为克隆目的进行序列扩增的PCR反应包括，在98℃下进行1分钟的单步反应，以及25个循环，每个循环为98℃下进行8秒钟+59℃下进行20秒钟+72℃下进行25秒钟，然后是72℃下进行5分钟，和4℃储藏。表1列出了所用的引物。BI-for和BI-rev是指用于前体的引物，剩下的引物用于单个菠萝蛋白酶抑制剂/异构体的表达。
表1
Figure BPA00001307150800131
Figure BPA00001307150800132
Figure BPA00001307150800141
为克隆目的进行异构体序列组合的PCR反应，包括在94℃下进行5分钟的单步反应，和25个循环，每个循环为98℃下进行8秒钟+59℃下进行15秒钟+60℃下进行25秒钟，然后是72℃下进行5分钟，和4℃储藏。
PCR反应
按照生产商的说明书进行PCR反应，反应在HF缓冲液中使用高保真的PhusionTM聚合酶进行。
Phusion-聚合酶；NEB
10μl  10x缓冲液HF(NEB)
0,5μl  引物A(100pmol/μl)
0,5μl  引物B(100pmol/μl)
0,5μl  dNTP-混合物(10mM，Fermentas)
xμl双蒸水
0，2μl Phusion(2，0U/μl)(NEB)
x   ng  DNA
                                     
5   0μl  ∑无菌水
使用含有cDNA片段的pDNR-LIB作为模板。按照生产商的说明书，将扩增的序列通过TOPO TA
Figure BPA00001307150800151
Kit(Invitrogen)亚克隆入pCRII。
菌落PCR使用taq聚合酶(Fermentas)进行。因此将所有组分取样，并将细胞材料加入到反应中。
菌落PCR：
5μl10X缓冲液
5μl 25mM MgCl2
1μl 25mM dNTPs
1μl 5′AOX1引物(10pmol/μl)
1μl 3′AOX1引物(10pmol/μl)
27μl无菌水
5μl  细胞材料
                               
45μl总体积
异构体组合：
5μl 10X缓冲溶液
5μl 25mM MgCl2
1μl 25mM dNTPs
1μl 5′引物(10pmol/μl)
1μl 3′引物(10pmol/μl)
37ul无菌水
                           
50μl总体积
PCR反应全部使用无菌PCR反应容器(德国，汉堡，Eppendorf)在Mastercycler Gradient(德国，Eppendorf)中进行，其反应物通过常规的SDS琼脂糖凝胶的方法分离，使用
Figure BPA00001307150800161
Plasmid-DNA Kit(Macherey & Nagel，德国都伦)或用Microspin Columns(AmershamPharmacia)切割和纯化，用于测序。在pTOPO-PCRII(Invitrogen)中克隆产品，通过
Figure BPA00001307150800162
GT或MINI-SUB-
Figure BPA00001307150800163
GT(两者均来自Biorad)，用Mighty Small SE250/SE260(Hoefer)方法制备凝胶。使用Avanti JE冷却离心机(Beckmann Coulter)，Biofuge pico或Biofuge fresco(两者均来自Heraeus)进行离心。
测序
按照生产商的说明书使用毛细管测序仪(MWG)进行DNA测序。
克隆/生长条件
根据生厂商的说明书，不含ER-转移肽的菠萝蛋白酶抑制剂BIP(菠萝蛋白酶抑制剂III)的序列被克隆入pPET43.1a(Novagen)在大肠杆菌Rosetta 2中进行克隆(cf.图3)。通过使用Ni-琼脂糖凝胶的亲和色谱纯化该抑制剂，获得将近40mg/L纯化后的抑制剂。
使用EcoRI和NotI限制位点，将菠萝蛋白酶半胱氨酸蛋白酶an1(Acnr1：CAA05487)和菠萝蛋白酶抑制剂BIP的序列克隆到pPIC9或者pPICZA(均来自Invitrogen)的阅读框中。根据生产商的说明书，使用Genepulser/Pulse Controller(均来自Biorad)进行克隆。
pPICZ/gfp用作对照(其由Glieder，TU Graz友情提供)。所述质粒含有gfp(Shimomura O等人，J.Cell.Comp.Physiol.，59(1962)，223-239；Shimomura O.，J.Microsc.，217(2005)1-15)，使用同样的限制性位点和同样的生长和诱导条件。
测试半胱氨酸蛋白酶抑制
从大肠杆菌培养物中纯化菠萝蛋白酶抑制剂，并用菠萝蛋白酶或者胰蛋白酶预培养2小时。当使用菠萝蛋白酶预培养时，在80℃下处理混合物20分钟以除去蛋白水解活性，当使用胰蛋白酶预培养时，使用丝氨酸蛋白酶抑制剂除去蛋白水解活性。加入来自毕赤酵母的上清液，其含有异源表达的来自菠萝的活性半胱氨酸蛋白酶以及酪蛋白(0.5％)。在室温下培养1小时后用标准微孔板读数仪测定OD600。比较不同样品的结果。使用其他蛋白酶作为抑制活性的底物，例如Bowman Birk抑制剂，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶，Falcipain和菠萝蛋白酶BP。样品与未激活的蛋白酶提取物和适当的合成抑制剂(例如，当为半胱氨酸蛋白酶时用E64)进行比较。
含有pPICZA的毕赤酵母，其中pPICZA带有alpha因子、前肽和Ananain(An1)但不带C末端半胱氨酸蛋白酶序列，将这些毕赤酵母在1L BMM培养基(pH6)中，使用带有3或4个挡板的摇瓶，转速230rpm，28℃，使用Unitron HT摇晃培养箱(Infors)生长48小时，得到12mg/L的活性的AN1(以酪蛋白为底物)。
在不同温度下进行上面所提到的测试(分别在30、40、50、60、70和80℃下培养1小时)，结果显示与室温下(在22和24℃之间)的活性相比，菠萝蛋白酶抑制剂在70℃下的残存活性为室温的82％±8％(结果未示出)，这与BBI蛋白相似并具有BIP的相应用途。
对菠萝蛋白酶蛋白的Maldi-Tof分析
培养3天后取得上清液的样品，用Zip-Tips(Millipore)纯化，然后使用4800TOF/TOF质量分析仪(Applied Biosystems)进行Maldi-Tof分析。
可以推导，分泌信号被正确剪切。用Glykomod工具(www.ExPASy.ch；结果来显示)验证，证明在毕赤酵母中表达的蛋白表现出糖基化。
Figure IPA00001307150200011
Figure IPA00001307150200021
Figure IPA00001307150200031
Figure IPA00001307150200041
Figure IPA00001307150200051
Figure IPA00001307150200061
Figure IPA00001307150200071
Figure IPA00001307150200081
Figure IPA00001307150200091
Figure IPA00001307150200101
Figure IPA00001307150200111

Claims (14)

1.异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体被以可溶形式大量异源表达。
2.根据权利要求1所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中已经除去了编码菠萝蛋白酶抑制剂ER-转移肽的DNA序列。
3.根据前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂具有不同于菠萝属所赋予的翻译后修饰。
4.根据前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体与相应的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体具有至少90％的序列一致性。
5.根据前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID.No.2-6中任一所示的序列，或者所述菠萝蛋白酶抑制剂前体具有如SEQID.No 1？所示的序列。
6.根据前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述翻译后修饰导致了不同的糖基化模式。
7.根据权利要求6所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述翻译后修饰是由宿主有机体所赋予，该宿主有机体选自：酵母、昆虫细胞、植物细胞和大肠杆菌。
8.根据前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体带有允许纯化的结构。
9.含有前述任一项权利要求所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体的药物、皮肤学或营养组合物。
10.根据权利要求9所述的药物、皮肤学或营养组合物，以组合物总重计，所述组合物含有0.1-15％重量百分比范围内的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或者菠萝蛋白酶抑制剂前体。
11.根据权利要求9或10所述的药物、皮肤学或营养组合物，其中所述营养组合物选自：巧克力、牛奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于奶的发酵产品、冰淇淋、发酵的谷物产品、基于奶的粉末、婴儿配方食品或宠物食品，和/或，其中所述皮肤学组合物选自：乳液、洗发水、乳霜、防晒霜、晒后乳霜或抗衰老乳霜，和/或软膏；和/或，其中所述药物组合物选自：片剂、液体混悬剂、干的口服补充剂、湿的口服补充剂、干的管喂食剂或湿的管喂食剂。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的药物组合物，其进一步含有选自以下组的辅料：稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、助流剂、调味剂和着色剂。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或菠萝蛋白酶抑制剂前体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗和/或预防与半胱氨酸蛋白酶表达增加有关联的疾病。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的异源表达的菠萝蛋白酶抑制剂或菠萝蛋白酶抑制剂前体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症、动脉粥样硬化、细菌感染、炎症、血栓和水肿。
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