CN102099479B - 包括一个突变体indehiscent等位基因的芸薹属植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作物植物，这些作物植物的果实开裂特性是经过调制的。更确切地说，本发明涉及用于减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获后而且同时保持这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力，以及用于增加产量的改进的方法和手段。

Description

包括一个突变体INDEHISCENT等位基因的芸薹属植物
发明领域
本发明涉及农业领域，更确切地讲是涉及用来改变裂开性种子植物、具体地是十字花科、特别是芸薹属属种，和/或用来加速培育此类裂开性种子植物的分子生物技术的用途。更确切地讲，本发明涉及用于在植物中如十字花科植物、具体地是在用于种子生产而生长的十字花科植物中减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获后，而同时维持荚果的一种农艺学相关的脱粒能力(treshability)的改进的方法和手段。还提供了用于在一个集合的裂开性种子植物中鉴别与减少或延迟种子落粒相关的分子标记的方法。还提供了用于增加产量、具体地是谷物和种子产量的方法和手段。可以从该减少或延迟种子落粒的表型中分离出产量增加的表型。
发明背景
来自芸薹属植物的长角果或荚果通过一个称为果实开裂的过程释放它们的种子。一个长角果由两个边缘至边缘结合的心皮组成。这些边缘之间的缝形成了一个厚的肋状物，称为胎座框。当荚果接近成熟时，这两个瓣沿着荚果中所指定的弱线渐进地与该胎座框分离，最后导致附连到该胎座框上的种子的落粒。开裂区定义了瓣分离的精确位置。
在作物收获之前或收获过程中由成熟荚果脱落种子(也称作“种子落粒”或“荚果落粒”)对于形成干的裂开性果实的作物是一种普遍的现象。过早的种子落粒导致种子回收率减少，这代表了主要为了种子而生长的作物(如产油的芸薹属植物、具体地是油菜籽油菜)中的一个问题。与过早的种子落粒相关的另一个问题是在随后的作物年度中自然落粒生长的增加。在油菜籽油菜中，与荚果落粒相关的产量损失平均是20％(Child et al.，1998，J Exp Bot 49：829-838)、但是可以达到高达50％，这取决于气候条件(MacLeod，1981，Harvesting in Oilseed Rape，pp.107-120，CambridgeAgricultural Publishing，Cambridge)。
当前的商品化的油菜籽油菜品种对于落粒是非常敏感的。在欧洲油菜的现有的培育程序中对于落粒的耐受性存在很小的变化，但是已经在欧洲油菜(甘蓝和芜青)的二倍体亲本中以及在芸薹属的其他成员(值得注意的是芥菜、埃塞俄比亚芥以及黑芥)中发现了抗性系。Kadkol等人(1986，Aust.J.Botany 34(5)：595-601)报告了在芸薹的某些登记物中对于抗落粒性增加，这与将这些长角果瓣附连到该胎座框的区域中缺少一个分离层相关。Prakash和Chopra(1988，Plant breeding 101：167-168)描述了通过非同源重组将来自芥菜的对落粒的耐受性渗入到欧洲油菜中。Spence等人(1996，J of Microscopy 181：195-203)描述了与欧洲油菜品系相比一些品系的芥菜显示出对于落粒减小的趋势。Morgan等人，1998(Fields CropResearch 58，153-165)描述了在从合成的欧洲油菜所开发的油菜籽油菜的品系之中对于荚果抗落粒性的遗传变异，并且得出结论：需要大量能量来打开它们的荚果的品系似乎在开裂区具有增加的维管化作用并且似乎在开裂区具有减小的细胞壁降解。他们进一步发现了荚果的喙的长度与引起荚果落粒所需要的力之间的一个显著的负相关性。Child和Huttly(1999，Proc10th Int.Rapeseed Congress)描述了在一种辐射诱导的突变体欧洲油菜和它的亲本栽培品种(Jet Neuf)的一个集合中在荚果成熟中的变化，其中该最大耐受性的野生型和突变体植物显示出遍及开裂区的多群细胞的大量的木质化作用并且其中位于邻近该突变体中开裂区的内部边缘处的维管迹线被描述为帮助固定这些瓣。Child等人(2003，J Exp Botany 54(389)：1919-1930)进一步描述了增加的荚果抗落粒性与一个再合成的欧洲油菜品系的荚果中维管结构中的改变之间的联系。然而，在将抗落粒性引入油菜栽培品种中而不干扰其他想要的性状如早开花、早成熟和黑腿病耐受性方面传统的培育方法是不成功的(Prakash and Chopra，1990，GeneticalResearch 56：1-2)。
已经通过突变体分析在拟南芥中鉴定了几个促进或抑制荚果开裂的基因：将突变体结合入SHATTERPROOF1(SHP1；最初称为AGL1)和SHATTERPROOF2(SHP2；最初称为AGL5)两者中导致了不裂开的长角果(即在拟南芥中当成熟时仍然关闭的长角果)(Liljegren et al.，2000，Nature 404，766-770)。类似地，拟南芥(Liljegren et al.，2004，Cell 116：843-853；PCT公开WO 01/79517)中INDEHISCENT基因(称为IND1)中的突变体连同ALCATRAZ(称为ALC；Rajani et al. 2001，CurrentBiology 11，1914-1922)中的突变体干扰了荚果开裂，导致了荚果抗落粒性。拟南芥中FRUITFUL(FUL)(一个SHP和IND的阻抑物)的组成型表达也导致了不裂开的长角果(Ferrandiz et al.，2000，Science，289，436-438)。这些转录因子被认为形成了一种非线性的转录网络，该非线性的转录网络控制了瓣边缘一致性以及荚果落粒。Liljegren等人(2004，Cell 116：843-853)进一步描述了IND(一种非典型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因)指导瓣边缘在拟南芥中分化成分离层以及木质化层。邻近分离层的木质化细胞的层连同内果皮b层(在各瓣中一个单个的木质化细胞层)一起在干燥的果实中产生了一种类似弹簧的张力，该张力对它的打开有影响。该瓣内果皮b层的木质化作用要求IND、SHP、ALC、以及FUL(一个在瓣的所有各处表达的MADS-结构域转录因子)的活性(上述的Liljegren etal.，2004；Mandel and Yanofsky，1995，Plant Cell 7，1763-1771)。已经发现FUL和REPLUMLESS(RPL)(一个在胎座框中表达的同源结构域转录因子)(Roeder et al.，2003，Curr Biol 13，1630-1635)设定了提供瓣边缘一致性的基因的边界(Gu et al.，1998，Development 125，1509-1517；Ferrandiz et al.，2000，Science，289，436-438；上述的Roeder et al.，2003)。最后，鉴定了FILAMENTOUS FLOWER(FIL)以及YABBY3(YAB3)(两个YABBY-家族转录因子)(Sawa et al.，1999，Genes Dev 13，1079-1088；Siegfried et al.，1999，Development 126，4117-4128)、以及JAGGED(JAG)(一个C2H2锌指转录因子)(Dinneny et al.，2004，Development 131，1101-1110；Ohno et al.，2004，Development 131，1111-1122)通过以一种区域特异的方式促进FUL和SHP的表达从而冗余地对正常的瓣和瓣边缘的发育有影响(Dinneny et al.，2005，Development132，4687-4696)。还已经鉴定了对于多种水解酶如内切多聚半乳糖醛酸酶的基因，该内切多聚半乳糖醛酸酶在荚果开裂期间，在程序化地断裂来自芸薹属植物的荚果中的开裂区中起作用)(参见例如WO 97/13865；Petersenet al.，Plant.Mol.Biol.，1996，31：517-527)。
Liljegren等人(2004，Cell 116：843-853)描述了拟南芥属IND的五个突变体等位基因。开裂区中的木质化的细胞在包括这些突变体等位基因的植物中是不存在的或存在的，这取决于突变的严格性(严格的ind突变体在对应于野生型植物中的瓣边缘的内部部分的区域中不包含木质化的细胞)，但是在所有情况下长角果是不裂开的。Wu等人(2006，Planta 224，971-979)描述了拟南芥属IND的一个第六突变体等位基因。包括这个突变体等位基因的植物在瓣边缘与胎座框的联接处没有显示出木质化的细胞，在七层细胞的一个区域中含有更少的细胞，这七层细胞似乎包围了野生型植物中通常已知的开裂区和胎座框边缘，并且在这个层中展示出不完全的细胞质分裂。
US 2005/0120417和US 2007/0006336描述了来自欧洲油菜的两个IND1直向同源物的鉴定和分离。
WO99/00503、WO01/79517以及WO0159122描述了使用基因沉默技术(如反义抑制或共抑制)以及诱变来下调拟南芥属ALC、IND、AGL1以及AGL5基因及其直向同源物的表达。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain June 28-July 2；2002)报告了在油菜籽油菜中在一个CaMV 35S启动子的控制下来自拟南芥的FUL的表达导致了多个荚果抗落粒性转化体。此类荚果抗落粒性品系的荚果不具有开裂区，并且荚果的打开仅能通过使用相当大的压力通过随机断裂这些瓣来实现。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain June 28-July 2；2002)还报告了使用所谓的dsRNA沉默技术在拟南芥中将IND基因进行沉默导致了几乎完全的荚果抗落粒性。百分之九十八的转基因的拟南芥属品系发育成长角果，这些长角果不能沿着瓣缝打开，并且仅能通过向这些瓣施加相当大的压力来打开。
重要的是认识到虽然种子落粒在油菜籽油菜培养中构成了一个重要的问题(这个问题最终可以通过开发荚果落粒抗性品系来解决)，仍然要求从这些荚果中分离这些种子。在正常的农业实践中，这是通过一个联合收割机通过将这些荚果进行脱粒来实现的。通过一个联合收割机将这些荚果进行脱粒必须是完全的并且必须对如此释放的种子造成最小的损害。然而，随着荚果强度增加，将它们脱粒所要求的更严格的动作对种子造成不可接受的水平的损害。因此，荚果抗落粒性十字花科植物的荚果不应如此坚固以致不能将它们在一个联合收割机中进行脱粒(Bruce et al. 2001，J.Agric.Engng Res.80，343-350)。
WO 2004/113542描述了十字花科植物中荚果的开裂区和瓣边缘的发育中所涉及的基因的中等程度的dsRNA基因沉默允许分离具有增加的荚果抗落粒性和减少的种子落粒性的转基因品系，然而这些转基因品系的荚果仍然可能通过施加有限的物理力沿着开裂区被打开。
WO09/068313(要求了欧洲专利申请EP 07023052的优先权)披露了包括至少两个IND基因的芸薹属植物，具体地是欧洲油菜植物，其特征在于它们在其基因组中包括三个完全敲除的突变体IND等位基因并且其中与不包括突变体IND等位基因的植物的荚果抗落粒性相比这些植物的荚果抗落粒性是显著地增加的，但是其中该植物优选地维持了这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力。
在以下不同的实施方案、实例和权利要求中所描述的发明进一步提供了用于调节裂开性种子植物中的开裂特性的改进的方法和手段。更确切地讲，本发明进一步描述了用于在植物中(如十字花科植物、具体地是用于种子生产而生长的十字花科植物)减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获后，而同时维持这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力的改进的方法和手段。具体地，本申请披露了包括至少两个IND基因的芸薹属植物，具体地是欧洲油菜植物，其特征在于它们在其基因组中包括两个部分敲除的突变体IND等位基因或两个部分敲除的突变体IND等位基因和两个完全敲除的突变体IND等位基因并且其中与不包括突变体IND等位基因的植物的荚果抗落粒性相比这些植物的荚果抗落粒性是显著地增加的，但是其中该植物优选地维持了这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力。还提供了用于增加产量、具体地是谷物和种子产量的方法和手段。可以从该减少或延迟种子落粒的表型中分离出产量增加的表型。
发明概述
本发明的诸位发明人发现具有类似于WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中描述的芸薹属植物的一种荚果落粒表型的欧洲油菜植物(即该欧洲油菜植物将增加的荚果抗落粒性与荚果的一种农艺学相关的脱粒能力进行结合)还可以通过将两个部分敲除的突变体IND等位基因与或不与两个完全敲除的突变体IND等位基因进行结合而不是将三个完全敲除的突变体IND等位基因进行结合而得到。
因此，在一个第一方面，本发明提供了一种芸薹属植物，该芸薹属植物包括至少两个IND基因，或其一个细胞、部分、种子或子代，其特征在于它在其基因组中包括至少两个部分敲除的突变体IND等位基因。在一个实施方案中，这些IND基因是IND-A1或IND-C1基因。在另一个实施方案中，这些IND基因包括选自以下群组的一个核酸分子，该群组的组成为：一个核酸分子，该核酸分子包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3从位置46处的核苷酸到位置633处的核苷酸、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：7至少90％序列一致性；以及一个核酸分子，该核酸分子编码一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4从位置16处的氨基酸到位置21处的氨基酸或SEQ ID NO：4至少90％序列一致性。在一个进一步的实施方案中，这些部分敲除的突变体IND等位基因是IND-C1基因的突变体IND等位基因。在又另一个实施方案中，这些部分敲除的突变体IND等位基因是选自以下群组，其组成为：ind-a1-EMS06、ind-a1-EMS09、ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS04、ind-c1-EMS08以及ind-c1-EMS09。在又另一个实施方案中，该植物在其基因组中进一步包括至少一个完全敲除的突变体IND等位基因。在又另一个实施方案中，该完全敲除的突变体IND等位基因是IND-C1基因的一个突变体IND等位基因。在另一个实施方案中，该完全敲除的突变体IND等位基因是选自以下群组，其组成为：ind-a1-EMS01、ind-a1-EMS05、ind-c1-EMS01以及ind-c1-EMS03。在又另一个实施方案中，该植物对于该部分敲除的突变体IND等位基因和/或对于该完全敲除的突变体IND等位基因是纯合的。在又另一个实施方案中，与由一种相应的不包括突变体IND等位基因的植物所产生的功能性IND蛋白的量相比，该植物产生了一个显著减少的量的功能性IND蛋白。在一个进一步的实施方案中，与一种相应的不包括突变体IND等位基因的植物的种子落粒性相比，该植物的种子落粒性是显著地减少或延迟的。在一个甚至进一步的实施方案中，该植物维持了荚果的一种农艺学相关的脱粒能力。在又另一个实施方案中，该植物是来自一种芸薹属作物属种的一种植物、优选地是欧洲油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥、芜青或甘蓝。在又另一个实施方案中，该植物是来自一种芸薹属油籽属种的一种植物、优选地是欧洲油菜、芥菜、或芜青。
在另一个方面，本发明提供了一种植物、或其一个细胞、部分、种子或子代，该植物、或其一个细胞、部分、种子或子代，包括在其基因组中的一个IND基因的至少一个部分敲除的突变体等位基因，其中该IND基因包括选自以下群组的一个核酸分子，该群组的组成为：一个核酸分子，该核酸分子包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3从位置46处的核苷酸到位置633处的核苷酸、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：7至少90％序列一致性；以及一个核酸分子，该核酸分子编码一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4从位置16处的氨基酸到位置21处的氨基酸或SEQ ID NO：4至少90％序列一致性。在一个实施方案中，该部分敲除的突变体IND等位基因是选自以下群组，其组成为：ind-a1-EMS06、ind-a1-EMS09、ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS04、ind-c1-EMS08以及ind-c1-EMS09。在另一个实施方案中，该突变体IND等位基因是从一个芸薹属种的一种植物得到的。在又另一个实施方案中，该植物是来自一个芸薹属种的一种植物。
在一个另外的方面，提供了一种能从本发明的植物得到的种子荚果。
在又另一个方面，提供了一个IND基因的一个部分敲除的突变体等位基因，其中该IND基因包括选自以下群组的一个核酸分子，该群组的组成为：一个核酸分子，该核酸分子包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3从位置46处的核苷酸到位置633处的核苷酸、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：7至少90％序列一致性；以及一个核酸分子，该核酸分子编码一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4从位置16处的氨基酸到位置21处的氨基酸或SEQ ID NO：4至少90％序列一致性。在一个实施方案中，该突变体等位基因是选自以下群组，其组成为：ind-a1-EMS06、ind-a1-EMS09、ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS04、ind-c1-EMS08以及ind-c1-EMS09。在另一个实施方案中，该突变体等位基因是从一种芸薹属种，优选地从一种芸薹属作物属种或一种芸薹属油籽属种的一种植物中得到的。在又另一个方面，提供了一种突变体IND蛋白，该蛋白是由本发明的突变体IND等位基因所编码的。
在甚至另一个方面，根据本发明在一个生物样品中提供了一种用于鉴定一个突变体IND等位基因的方法，该方法包括在该生物样品中存在的一种核酸中确定一个突变体IND特异性区域的存在。在一个实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品经受一个聚合酶链式反应测定，该测定使用一组至少两种引物，所述至少两种引物的组选自以下群组，其组成为：一组引物，其中所述引物中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’侧翼区并且所述引物中的另一种对应地特异地识别该突变体IND等位基因的3’侧翼区；一组引物，其中所述引物中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区并且所述引物中的另一种特异地识别该突变体IND等位基因的突变区；以及一组引物，其中所述引物中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区并且所述引物中的另一种对应地特异地识别位于该突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区。在另一个实施方案中，特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体IND等位基因的突变区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自该突变体IND等位基因的突变序列或选自其互补序列，或特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自跨越位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述17到200个连续核苷酸不是唯一地从该突变序列亦或这些侧翼序列上得到的。在又另一个实施方案中，特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区的引物在其末端3’端处包括一个至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体IND等位基因的突变区的引物在其末端3’端处包括一个至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自该突变体IND等位基因的突变序列或选自其互补序列，或特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的引物在其末端3’端处包括一个至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自跨越位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述位于3’的17个连续核苷酸不是唯一地从该突变序列亦或这些侧翼序列上得到的。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品经受一个杂交测定，该测定使用包括至少一种特异性探针的一组特异性探针，所述特异性探针组选自以下群组，其组成为：一组特异性探针，其中所述探针中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’侧翼区并且所述探针中的另一种特异地识别该突变体IND等位基因的3’侧翼区；一组特异性探针，其中所述探针中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区并且所述探针中的另一种特异地识别该突变体IND等位基因的突变区；一组特异性探针，其中所述探针中的一种特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区并且所述探针中的另一种对应地特异地识别位于该突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区；以及一种特异性探针，该探针特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区。在又另一个实施方案中，特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体IND等位基因的突变区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列选自该突变体IND等位基因的突变序列或选自其互补序列，或特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述13到1000个连续核苷酸不是唯一地从该突变序列亦或这些侧翼序列上得到的。在一个具体实施方案中，特异地识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体IND等位基因的突变区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自该突变体IND等位基因的突变序列或选自其互补序列，或特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述至少13个连续核苷酸不是唯一地从该突变序列亦或这些侧翼序列上得到的。在另一个具体实施方案中，该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至929或931至1622或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸930或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至930或930至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至995或997至1622或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸996或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至996或996至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至1035或1037至1622或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸1036或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至1036或1036至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至902或904至1593或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸903或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至903或903至1593或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQID NO：7从核苷酸1至910或912至1593或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸911或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至911或911至1593或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至919或921至1593或其互补序列的核苷酸序列；所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸920或其互补序列的核苷酸序列；并且所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至920或920至1593或其互补序列的核苷酸序列。在又另一个具体实施方案中，该组探针选自以下群组，其组成为：一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：11的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：12的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：14的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：15的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：17的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：18的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：20的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：21的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：23的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：24的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：26的序列的探针和/或一种包括SEQ ID NO：27的序列的探针。
在又另一个方面，提供了一种根据本发明用于在一种植物、或其一个细胞、部分、种子或子代中确定一个突变体IND等位基因的接合性状态的方法，该方法包括在所述植物、或其一个细胞、部分、种子或子代的基因组DNA中确定一个突变体和/或一个相应的野生型IND特异区的存在。在一个实施方案中，该方法进一步包括使所述植物、或其一个细胞、部分、种子或子代的基因组DNA经受一个聚合酶链式反应测定，该测定使用一组至少两种引物或至少三种引物，其中至少两种所述引物特异地识别该野生型IND等位基因，所述至少两种引物选自以下群组，其组成为：一种第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二引物，该第二引物对应地特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的3’或5’侧翼区；一种第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二引物，该第二引物特异地识别该野生型IND等位基因的突变区；以及一种第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二引物，该第二引物对应地特异地识别位于该野生型IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区，并且其中至少两种所述引物特异地识别该突变体IND等位基因，所述至少两种引物选自以下群组，其组成为：该第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及该第二引物，该第二引物对应地特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的3’或5’侧翼区；该第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第三引物，该第三引物特异地识别该突变体IND等位基因的突变区；该第一引物，该第一引物特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第三引物，该第三引物对应地特异地识别位于该突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区。在一个进一步的实施方案中，特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列；或特异地识别该突变体或该野生型IND等位基因的突变区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体或该野生型IND等位基因的突变序列或选自其互补序列；或特异地识别位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的引物包括一个17到200个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述17到200个连续核苷酸不是唯一地从该突变区序列亦或从这些侧翼序列上得到的。在又另一个实施方案中，特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区的引物在其末端3’端处包括一个17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列；或特异地识别该突变体或该野生型IND等位基因的突变区的引物在其末端3’端处包括一个17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体或该野生型IND等位基因的突变序列或选自其互补序列；或特异地识别位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的引物在其末端3’端处包括一个17个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述位于3’的17个连续核苷酸不是唯一地从该突变位点或区域的序列亦或从这些侧翼序列上得到的。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括使所述植物、或其一个细胞、部分、种子或子代的基因组DNA经受一个杂交测定，该测定使用一组至少两种特异性探针，其中至少一种所述特异性探针特异地识别该野生型IND等位基因，所述至少一种探针选自以下群组，其组成为：一种第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二探针，该第二探针对应地特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的3’和5’侧翼区；一种第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二探针，该第二探针特异地识别该野生型IND等位基因的突变区；一种第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第二探针，该第二探针对应地特异地识别位于该野生型IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区；以及一种探针，该探针特异地识别位于该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区；并且其中至少一种所述特异性探针特异地识别该突变体IND等位基因，所述至少一种探针选自以下群组，其组成为：该第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及该第二探针，该第二探针对应地特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的3’或5’侧翼区；该第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第三探针，该第三探针特异地识别该突变体IND等位基因的突变区；该第一探针，该第一探针特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区，以及一种第三探针，该第三探针特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区；以及一种探针，该探针特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区。在一个具体实施方案中，特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体或该野生型IND等位基因的突变区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体或该野生型IND等位基因的突变区的序列，或特异地识别位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的探针包括一个13到1000个连续核苷酸的核苷酸序列，或一个具有与其至少80％序列一致性的序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列，其中所述13到1000个连续核苷酸不是唯一地从该突变位点或区域的序列亦或从这些侧翼序列上得到的。在另一个具体实施方案中，特异地识别该突变体以及该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼序列或选自其互补序列，或特异地识别该突变体或该野生型IND等位基因的突变区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列选自该突变体或该野生型IND等位基因的突变序列或选自其互补序列，或特异地识别位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的探针包括一个至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列对应地选自跨越位于该突变体或该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列或选自其互补序列，其中所述至少13个连续核苷酸不是唯一地从该突变序列亦或这些侧翼序列上得到的。在一个进一步的具体实施方案中，该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至929或931至1622或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸930或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列a或其互补序列；该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至930或930至1622或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至929随后是a或者a随后是核苷酸序列SEQ ID NO：5从核苷酸931至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至995或997至1622或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸996或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列a或其互补序列；该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至996或996至1622或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至995随后是a或者a随后是核苷酸序列SEQ ID NO：5从核苷酸997至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至1035或1037至1622或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：5的核苷酸1036或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列t或其互补序列；该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至1036或1036至1622或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：5从核苷酸1至1035随后是t或者t随后是核苷酸序列SEQ ID NO：5从核苷酸1037至1622或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至902或904至1593或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸903或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列t或其互补序列；并且该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至903或903至1593或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至902随后是t或者t随后是核苷酸序列SEQ ID NO：7从核苷酸904至1593或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至910或912至1593或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸911或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列a或其互补序列；并且该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至911或911至1593或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至910随后是a或者a随后是核苷酸序列SEQ ID NO：7从核苷酸912至1593或其互补序列的核苷酸序列；或该5’或3’侧翼区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至919或921至1593或其互补序列的核苷酸序列；该野生型IND等位基因的所述突变区具有SEQ ID NO：7的核苷酸920或其互补序列的核苷酸序列；该突变体IND等位基因的所述突变区具有序列t或其互补序列；并且该野生型IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至920或920至1593或其互补序列的核苷酸序列；并且该突变体IND等位基因的所述连接区对应地包括SEQ ID NO：7从核苷酸1至919随后是t或者t随后是核苷酸序列SEQ ID NO：7从核苷酸921至1593或其互补序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，该组的至少三种特异性探针选自以下群组，其组成为：一组探针，该组探针包括一种包括SEQ IDNO：11的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：12的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：13的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：14的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：15的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：16的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：17的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：18的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：19的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：20的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：21的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：22的序列的探针；一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：23的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：24的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：25的序列的探针；以及一组探针，该组探针包括一种包括SEQ ID NO：26的序列的探针、一种包括SEQ ID NO：27的序列的探针、和/或一种包括SEQ ID NO：28的序列的探针。
还提供了根据本发明用于鉴定一个生物样品中的一个突变体IND等位基因的试剂盒、以及根据本发明用于在一种植物、或其一个细胞、部分、种子或子代中确定一个突变体IND等位基因的接合性状态的试剂盒，这些试剂盒包括如上所述的引物或探针，同样提供了根据本发明用于将这些突变体IND等位基因结合到一种植物中的方法、根据本发明用于将这些突变体IND等位基因从一株植物转移到另一株植物上的方法、以及根据本发明用于制造一种(杂交体)植物或种子的方法。
在本发明的另一个实施方案中，使用本发明的突变体IND等位基因来增加从芸薹属植物所收获的种子或谷物的产量。所增加的产量可能是减少或延迟种子落粒的结果，但是还可能不依赖于该减少或延迟种子落粒。具体地，提供了包括至少两个IND基因的芸薹属植物、或其一个细胞、部分、种子或子代，其特征在于这些植物在其基因组中包括两个如在此所述的突变体纯合的IND等位基因。
通用定义
如在此使用的“增加荚果抗落粒性”以及“减少种子落粒性”是指芸薹属植物的减少的种子落粒趋势和/或种子落粒的时间上的延迟，特别是直到收获后，芸薹属植物的果实正常地不是同步地成熟，而是顺序地成熟，从而在收获之前或收获期间一些荚果崩裂开并且使它们的种子落粒。对于荚果落粒的耐受性的水平是正相关于并且可以例如通过确定在“拉伸分离试验”(Davies and Bruce，1997，J Mat Sci 32：5895-5899；Morgan et al.，1998，Fields Crop Research 58，153-165)中破裂荚果所需要的力、在一个“随机冲击试验”中在例如20秒(‘IP20’；Morgan et al.，1998，上述的)、9.7或17秒(Bruce et al.，2002，Biosystems Eng 81(2)：179-184)之后剩余的完整荚果的数目、在一个随机冲击试验中该荚果样品半衰期(以下也称为“LD50”)(即在所测试的荚果样品中引起50％的荚果打开所需要的处理时间)、以及“对于落粒进行大田计分”(Morgan et al.，1998，上述)进行测量。随机冲击试验(RIT)以及用于在此类RIT中定义荚果样品半衰期的算法已经描述于Bruce et al.，2002(上述)、Morgan et al.，1998(上述)以及以下实例中。这两个公开都通过引用结合在此。简言之，将完整的成熟荚果的一个样品与钢球一起放在一个封闭的滚筒中并且然后将该滚筒剧烈摇动持续逐渐增加的一段时间(例如10s、20s、40s、80s)。在各段时间之后，将该滚筒打开并且对破碎和损坏的荚果的数目进行计数。对于每个品系的抗落粒性的水平的最精确的评价是通过对所有可获得的数据进行一个线性x线性曲线的拟合并且估计用于破碎一个样品中一半荚果所花费的时间(“荚果样品半衰期”或“LD50”)来计算的。然而重要的是，荚果主要沿着开裂区打开，并且不是如不裂开的荚果可能发生的简单地粉碎。
如在此使用的，“荚果抗落粒性的农艺学相关的增加”是指一株植物中荚果抗落粒性的增加，该增加导致了大田中(收获之前)荚果落粒相关的产量损失低于对于大田中该植物所正常观察到那些产量损失。对于油菜籽油菜，据报告大田中荚果落粒相关的产量损失对于具有平均良好的生长条件的季节是大约11％并且对于具有平均较差的生长条件的季节是大约25％。在如由Bruce et al.，2002(Biosystems Eng 81(2)：179-184)所描述的随机冲击试验中，发现了对应地在种子损失的这些水平与在9.7s和17s处理时间时的种子损失的水平之间一种正相关性，。可替代地，为了确定一株植物中对荚果落粒的耐受性的水平是否是农艺学相关的，可以将该植物的荚果样品半衰期(“LD50”，参见以上)与一个已知具有平均水平的荚果抗落粒性的植物的荚果样品半衰期进行比较，如对于油菜籽油菜，所有当前可商购的油菜籽油菜品种。
如在此所使用的“荚果或种子落粒”或“果实或荚果开裂”是指在种子成熟后在一个果实中发生的一个过程，由此瓣从中央隔膜分离，释放种子。破裂的区域(即，该“开裂区”)蔓延瓣与胎座框(外隔膜)之间的果实的整个长度。在成熟时，该“开裂区”实质上是瓣中木质化细胞的一个区域与胎座框之间的细胞的一个非木质化层。由于开裂区中细胞壁松弛与由长角果中干燥细胞的不同机械特性而确立的张力的组合发生了落粒。
如在此使用的，一个芸薹属“果实”是指一个芸薹属植物的一个器官，该器官从由融合心皮组成的一个雌蕊发育而来，当该雌蕊受精后，生长成为含有发育的种子的一个“(种子)荚果”或“长角果”。一个芸薹属“(种子)荚果”或“长角果”包括一个果实壁(心皮)，该果实壁由隔膜分成封闭的两个小腔。该“开裂区”在邻近隔膜的心皮边缘处发育并且蔓延该长角果的长度。开裂区的细胞最后开始裂解并且这削弱了心皮壁或瓣与隔膜之间的接触。细胞内聚力的损失被限制在开裂区的细胞中并且由中间薄层断裂(Meakin and Roberts，1990，J Exp Bot 41，995-1011)而形成。
如在此使用的，“开裂区”是指位于植物(特别是芸薹属植物)的两瓣荚果的两侧上的缝中所包含的简单的薄壁细胞的层。这些开裂区位于荚果瓣边缘与含有到茎或花梗的主维管束的一个中央胎座框之间。开裂区中细胞的分离发生在荚果老化期间并且是在荚果达到完全成熟时完成的(Meakin and Roberts，1990，上述)。然后可以发生瓣分离。该开裂区包含维管迹线，这些维管迹线从荚果壁到花梗(茎)和胎座框。荚果落粒的过程仅发生在外力破碎该纤弱的维管线之后，允许瓣分离并且将种子落到地面上。这发生在冠层紊乱期间，例如在收获期间通过与联合收割机进行接触。该维管组织包含增厚的、木质化的细胞，这些细胞形成了在传导细胞附近发现的厚角的细胞集合(Meakin and Roberts，1990，上述)。这向该组织提供了刚性并且推测提供了对于断裂的一些耐受性。
如在此使用的，“一种农艺学相关的脱粒能力”是指当施加物理力(该力允许完全打开荚果同时避免对种子的损害，像例如它们在一个联合收割机中所使用的)时一个荚果(特别是一个油菜籽油菜荚果)对于沿着荚果的开裂区打开(同时释放种子)的耐受性。已经发现在随机冲击试验中一个荚果样品半衰期(‘LD50’)与它们的脱粒能力之间一种正相关性。如按照这些实例中所述进行的一个RIT中所确定的，相应于农艺学相关的脱粒能力的油菜籽油菜荚果样品半衰期不应该超过80秒。对于可商购的油菜籽油菜品种的对照品系的典型的样品半衰期值是大约10秒。因此，具有显著增加的荚果抗落粒性具有农艺学相关的脱粒能力的品系在RIT中具有荚果样品半衰期为约10秒至约80秒之间、约10秒至约70秒之间、约15秒至约70秒之间、约10秒至约60秒之间、约10秒至约50秒之间、约20秒至约60秒之间、约20秒至约50秒之间、约40秒至约60秒之间、约57秒。
“裂开性种子植物”是指生成一种干的裂开性果实的一种植物，该果实具有果实壁，将果实壁打开从而允许包含在其中的种子的释放。裂开性果实通常包含一些种子并且包括已知的果实，例如像豆类、蒴果类以及长角果。
“作物植物”是指作为一种作物进行栽培的植物属种，如欧洲油菜(AACC，2n＝38)、芥菜(AABB，2n＝36)、埃塞俄比亚芥(BBCC，2n＝34)、芜青(同义词芸薹)(AA，2n＝20)、甘蓝(CC，2n＝18)或黑芥(BB，2n＝16)。该定义不包括野草，如拟南芥。
根据本发明术语“核酸序列”(或核酸分子)是指处于单链或双链形式的一个DNA或RNA分子、具体地编码一个蛋白或蛋白片段的一个DNA。一个“内源核酸序列”是指一株植物细胞内的一个核酸序列，例如一个芸薹属细胞的核基因组中存在的一个IND基因的一个内源等位基因。一个“分离的核酸序列”是用于指一个核酸序列，该核酸序列不再在其自然环境中，例如在体外或在一个重组细菌或植物宿主细胞中。
术语“基因”是指一个DNA序列，该序列包括一个区(转录区)，该区在一个细胞中被转录成一个RNA分子(例如转录成一个包括内含子序列的前体-mRNA，然后它被剪接成一个成熟mRNA，或直接转录成不含内含子序列的一个mRNA)，该区可操作地连接到调节区上(例如一个启动子)。因此一个基因可以包括若干可操作地连接的序列，例如一个启动子、一个5’前导序列(包括例如涉及翻译起始的序列)、一个(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)以及一个3’非翻译序列(包括例如转录终止位点)。“内源基因”是用于与一个“外来基因”、“转基因”或“嵌合基因”进行区别，并且是指来自某一植物属、种或品种的一株植物的一个基因，该基因没有通过转化被引入到该植物中(即它不是一个“转基因”)，但是该基因正常地存在于该属、种或品种的植物中，或该基因是通过常规培育技术或通过体细胞杂交(例如通过原生质体融合)从另一株植物属、种或品种的植物(其中该基因正常地是存在的)中引入该植物中的。类似地，一个基因的一个“内源等位基因”不是通过植物转化而引入到一株植物或植物组织中的，却是例如通过植物诱变和/或选择来产生的或是通过筛选植物的天然集合来获得的。
“一个基因的表达”或“基因表达”是指一个过程，其中可操作地连接到适合的调节区(具体地是一个启动子)上的一个DNA区被转录成一个RNA分子。然后在该细胞内将该RNA分子进一步加工(通过后转录过程)，例如通过RNA剪接和翻译起始和翻译成一个氨基酸链(蛋白)，并且通过翻译终止密码子终止翻译。术语“功能性表达”在此用于指生成了一个功能性蛋白；术语“非功能性表达”是指生成了一个具有显著减小的或无功能性(生物学活性)的蛋白或没有生成蛋白(进一步参见以下)。
术语“蛋白”是指一个分子，该分子包括一个氨基酸链，不涉及作用的具体模式、大小、3维空间结构或来源。因此，一个IND蛋白的一个“片段”或“部分”仍可以被称为一个“蛋白”。一个“分离的蛋白”是用于指一个蛋白，该蛋白不再在其自然环境中，例如在体外或在一个重组细菌或植物宿主细胞中。“氨基酸”是蛋白和酶的主要构造单元。当信使RNA由核糖体进行解码时，根据遗传密码，通过转运RNA，将它们结合到蛋白中。在一个蛋白的最终组装期间或之后，氨基酸含量指示了该蛋白或酶的空间的和生物化学的特性。氨基酸主链决定了一个蛋白的一级序列，但是侧链的性质决定了蛋白的特性。如在此使用的，“类似的氨基酸”是指具有类似的氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或实际上中性侧链的氨基酸。如在此使用的“非类似的氨基酸”是指具有不同的氨基酸侧链的氨基酸，例如具有一个极性侧链的一个氨基酸是与具有一个非极性侧链的一个氨基酸非类似的。极性侧链通常趋向于存在于一个蛋白的表面上，在那里它们可以与细胞中发现的水性环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸趋向于驻留在蛋白的中心内，在那里它们可以与类似的非极性邻近物相互作用(“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的实例是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸(全部是亲水性的，除了半胱氨酸之外，它是疏水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的实例是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、以及色氨酸(全部是疏水性的，除了甘氨酸之外，它是中性的)。
术语“转录因子”是用于指一个蛋白，该蛋白包括至少两个不连续的结构域-一个DNA结合域和一个激活或抑制域-它们共同操作以调节从目标基因启动子的转录起始速率(Ptashne，1988，Nature 335，683-689)。术语“碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域转录因子”是用于指一个转录因子，该转录因子除了该bHLH DNA结合域(Heim et al.，2003，Mol Biol Evol 20，735-747；Toledo-Ortiz et al.，2003，Plant Cell 15，1749-1770)之外还包括已知对于基因表达的调节是重要的结构域，它在来自不同种属的相关蛋白中在氨基酸水平上可以是保守的(Quong et al.，1993，Mol Cell Biol 13，792-800)。包括一个bHLH结构域的转录调节子通过碱性区中的残基结合DNA，而该螺旋-环-螺旋结构域促进了二聚作用，允许了家族成员形成异源二聚体或同源二聚体(Murre et al.，1989，Cell 56，777-783)。
术语“IND基因”在此是指编码一个INDEHISCENT(IND)蛋白的一个核酸序列，该蛋白是一种对于种子传播所要求的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域转录因子(Liljegren et al.，2004，Cell 116：843-853)。
如在此使用的，术语“一个或多个等位基因”是指在一个特定基因座处一个基因的一种或多种替代形式的任何一种。在一个生物的一个二倍体(或双二倍体)细胞中，一个给定基因的等位基因位于一个染色体上一个特定的位置或基因座(复数形式基因座(loci))处。一个等位基因存在于同源染色体的对的每个染色体上。
如在此使用的，术语“同源染色体”是指染色体，这些染色体含有用于相同的生物特征的信息，并且这些染色体在相同的基因座处含有相同的基因但可能是这些基因的不同等位基因。同源染色体是在减数分裂期间配对的染色体。代表一个生物的所有生物学特征的“非同源染色体”形成一个组，并且一个细胞中组的数目被称为倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每个同源染色体是从一个不同的亲本遗传的。在一个双二倍体种属中，基本上存在两组二倍体基因组，由此这两个基因组的染色体被称为“部分同源染色体”(并且类似地，这两个基因组的基因座或基因被称为部分同源基因座或基因)。一个二倍体、或双二倍体植物属种在一个特定基因座处可以包括很多不同的等位基因。
如在此使用的，术语“杂合的”是指当两个不同的等位基因位于一个特定的基因座处但是个别地位于细胞中同源染色体的相应的对上时存在的一种遗传条件。反之，如在此使用的，术语“纯合的”是指当两个相同的等位基因位于一个特定的基因座处，但是个别地位于细胞中同源染色体的相应的对上时存在的一种遗传条件。
如在此使用的，术语“基因座”(复数形式基因座(loci))是指一个染色体上的一个具体的位置或多个位置或一个位点，例如在那里发现了一个基因或遗传标记。例如，“IND-A1基因座”是指A基因组的一个染色体上的位置，其中可以发现IND-A1基因(以及两个IND-A1等位基因)，而“IND-C1基因座”是指C基因组的一个染色体上的位置，其中可以发现IND-C1基因(以及两个IND-C1等位基因)。
根据本发明无论何时提及一个“植物”或“多个植物”时，应理解的是除非另外指明，在此还包括植物的部分(细胞、组织或器官、种子荚果、种子、重要的部分如根、叶、花、花粉、等等)、保留了亲本的区别性特征的植物的子代(尤其是果实开裂特性)，如通过自交或杂交得到的种子，例如杂交种子(通过将两个近交亲本品系杂交而得到)，从其得到的杂交植物和植物部分。
一种“分子测定”(或测试)在此是指一种测定，该测定表明(直接地或间接地)在一个或两个IND基因座处(例如在IND-A1或IND-C1基因座的一个或两个处)一个或多个特定的IND等位基因存在或不存在。在一个实施方案中，它允许人们确定在任何单独的植物中的基因座处一个特定的(野生型或突变体)IND等位基因是否是纯合的或杂合的。
如在此使用的，“野生型”(也写作“野生类型”或“野生型的”)是指一个典型形式的一株植物或一个基因，与它最常见地在自然界中存在的一样。一个“野生型植物”是指具有此类植物在自然种群中最常见的表型的一株植物。一个“野生型等位基因”是指对于产生该野生型表型所需的一个基因的一个等位基因。作为对比，一个“突变体植物”是指具有此类植物在自然种群中一种不同的稀有的表型的一株植物、或通过人类干预而生成的一株植物(例如通过诱变)，并且一个“突变体等位基因”是指对于产生该突变体表型所需的一个基因的一个等位基因。
如在此使用的，术语“野生型IND”(例如野生型IND-A1或IND-C1)是指在植物中具体地在十字花科植物中，尤其是芸薹属植物中所发现的一个自然发生的IND等位基因，它编码了一个功能性IND蛋白(例如对应地一个功能性IND-A1或IND-C1)。相比之下，如在此使用的，术语“突变体IND”(例如突变体IND-A1或IND-C1)是指一个IND等位基因，该等位基因不编码一个功能性IND蛋白，即是编码一个非功能性IND蛋白(例如对应地一个非功能性IND-A1或IND-C1)或完全没有编码IND蛋白的一个IND等位基因，如在此使用的，该非功能性IND蛋白是指不具有生物学活性或具有与相应的野生型功能性IND蛋白相比显著减小的生物学活性的一个IND蛋白。如在此使用的，一个“完全敲除”或“无效”突变体IND等位基因是指一个突变体IND等位基因，它编码了与相应的野生型功能性IND蛋白相比不具有生物学活性的一个IND蛋白或它完全没有编码蛋白。这样一个“完全敲除的突变体IND等位基因”是例如一个野生型IND等位基因，该野生型IND等位基因在其核酸序列上包括一个或多个突变，例如一个或多个无义或错义突变。具体地，这样一个完全敲除的突变体IND等位基因是一个野生型IND等位基因，该野生型IND等位基因包括一个突变，该突变优选导致生成一个缺少至少一个功能域(如活化域、DNA结合域和/或二聚化功能域)或缺少至少一个对其功能关键的氨基酸(如对于DNA结合是关键的一个氨基酸，例如SEQ ID NO：2中的位置127处或SEQ ID NO：4中的位置140处等的精氨酸等、或SEQ ID NO：2中的位置122处或SEQ ID NO：4中的位置135处等的谷氨酰胺等)的IND蛋白，从而使得该IND蛋白的生物学活性被完全消除，或由此这一个或多个突变优选地导致没有生成一个IND蛋白。如在此使用的，一个“部分敲除的”突变体IND等位基因是指一个突变体IND等位基因，它编码了与相应的野生型功能性IND蛋白相比具有显著减小的生物学活性的一个IND蛋白。这样一个“部分敲除的突变体IND等位基因”是例如一个野生型IND等位基因，该野生型IND等位基因在其核酸序列上包括一个或多个突变，例如一个或多个错义突变。具体地，这样一个部分敲除的突变体IND等位基因是一个野生型IND等位基因，该野生型IND等位基因包括一个突变，该突变优选地导致生成一个IND蛋白，其中至少一个保守的和/或功能性氨基酸被取代为另一个氨基酸，从而使得该生物学活性被显著减小但是没有完全消除。这样的完全敲除的突变体IND等位基因或部分敲除的突变体IND等位基因还可以编码一个显性阴性IND蛋白，该蛋白能够在相同的细胞内对其他IND蛋白的生物学活性产生不利影响。这样一个显性阴性IND蛋白可以是一个IND蛋白，该蛋白仍然能够与相同的元件(如野生型IND蛋白)相互作用，但是该蛋白限制了其功能的一些方面。显性阴性IND蛋白的实例是IND蛋白，这些蛋白缺少活化域和/或二聚化功能域或对于活化和/或二聚化关键的特定氨基酸残基但是仍然含有DNA结合域，从而使得不仅它们自身的生物学活性被减少或消除，而且它们通过与存在于细胞中的野生型和/或部分敲除的IND蛋白竞争DNA结合位点，进一步减小了细胞中总IND活性。显性阴性IND蛋白的其他实例是IND蛋白，这些蛋白缺少活化域和/或DNA结合域或对于活化和/或DNA结合关键的特定的氨基酸残基但是仍然含有二聚化功能域，从而使得不仅它们自身的生物学活性被减少或消除，而且它们通过生成缺少至少一个功能域的蛋白二聚体进一步减少了细胞中总IND活性。编码IND蛋白的核酸序列的突变体等位基因在此被指定为“ind”(例如对应地ind-a1或ind-c1)。突变体等位基因可以或是“天然突变体”等位基因(它是在自然界中发现的突变体等位基因)(例如在没有人类施加诱导剂下自发生成的)或是“诱导的突变体”等位基因(它是通过人类干预(例如通过诱变)诱导的)。
一个“显著减少量的功能性IND蛋白”(例如功能性IND-A1或IND-C1蛋白)是指与由不包括该突变体IND等位基因的细胞生成的功能性IND蛋白的量相比，由包括一个突变体IND等位基因的细胞生成的一个功能性IND蛋白的量减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即没有功能性IND蛋白由该细胞生成)。该定义包括在体内生成一个不具有生物学活性的“非功能性”IND蛋白(例如截短的IND蛋白)、该功能性IND蛋白的绝对数量的减少(例如由于IND基因中的突变没有制造功能性IND蛋白)、与一个功能性野生型IND的活性相比生成一个具有显著减小的生物学活性的IND蛋白(例如一个IND蛋白，其中如以下所例证的一个或多个对于所编码的IND蛋白的生物学活性关键的氨基酸残基被取代为另一个氨基酸残基)和/或显性阴性IND蛋白对其他功能性和/或部分功能性IND蛋白的不利影响。
如在此使用的，术语“突变体IND蛋白”是指由一个突变体IND核酸序列(“ind等位基因”)所编码的一个IND蛋白，由此与由一个非突变体野生型IND序列(“IND等位基因”)所编码的IND蛋白的活性相比，该突变导致了在体内显著减小的和/或无IND活性。
如在此使用的，“诱变”是指一个过程，其中使植物细胞(例如多个芸薹属种子或其他部分，如花粉等)经受一种技术，该技术诱导了细胞的DNA中的突变，如与一种诱变剂(如一种化学物质(如乙基甲基磺酸酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU)、等))或电离辐射(中子(如在快速中子诱变中、等)、α射线、γ射线(如由一种钴60源提供的)、X射线、紫外线辐射、等)、或这些的两种或更多种的一个组合进行接触。因此，一个或多个IND等位基因的所希望的诱变可以通过使用化学方法(如通过将一个或多个植物组织与乙基甲基磺酸酯(EMS)、乙基亚硝基脲等进行接触)、通过使用物理方法(如x射线等)、或通过γ辐射(如由一种钴60源提供的)来实现。虽然由辐射引起的突变经常是大的缺失或其他总的损伤如易位或复合体重排，由化学诱导剂引起的突变经常是更不连续的损伤如点突变。例如，EMS烷基化鸟嘌呤碱基，它导致了碱基错配：一个烷基化的鸟嘌呤将与一个胸腺嘧啶碱基进行配对，主要地导致了G/C至A/T的转变。在诱变后，使用已知技术从这些处理过的细胞再生出芸薹属植物。例如，根据常规的生长步骤可以将生成的芸薹属种子进行种植并且在自花传粉之后在这些植物上形成种子。可替代地，可以提取出双单倍体小植株从而立即形成纯合植物，例如如由Coventry等人(1988，Manual for Microspore CultureTechnique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OACPublication 0489.Univ.of Guelph，Guelph，Ontario，Canada)所述。可以收获由于在现在世代或一个随后的世代中这种自花传粉而形成的另外的种子并且进行筛选检测突变体IND等位基因的存在。用于筛选特定的突变体等位基因的一些技术是已知的，例如DeleteageneTM(缺失一个基因；Li etal.，2001，Plant J 27：235-242)使用聚合酶链式反应(PCR)测定来筛选由快速中子诱变生成的缺失突变体，TILLING(基因组中靶向的诱导的局部损伤；McCallum et al.，2000，Nat Biotechnol 18：455-457)鉴别了EMS诱导的点突变、等。用于筛选特定的突变体IND等位基因的存在的另外的技术描述于以下实例中。
如在此使用的，术语“非自然发生的”或“培养的”当用于提及一株植物时是指具有已经由人类修饰的一个基因组的一株植物。例如一个转基因植物是含有一个外源核酸分子的一个非自然发生的植物，该外源核酸分子例如包括一个转录区的一个嵌合基因，该转录区当转录时产生了能够降低一个内源基因的表达的一个生物学活性RNA分子，如一个IND基因，并且因此已经由人类进行了遗传上的修饰。此外，由于暴露于一种诱变剂而含有在一个内源基因中的一个突变例如在一个内源IND基因中的一个突变(例如在一个调节元件中或在编码序列中)的一株植物也被认为是一种非天然植物，由于它已经由人类进行了遗传上的修饰。此外，含有在一个内源基因中例如在一个内源IND基因中的一个突变的一个特定属种的一种植物如欧洲油菜(该突变在该特定植物属种中在自然状态下不发生，由于例如与该植物相同或另一个属种的一种植物如芥菜或芜青进行定向培育过程如标记协助的培育和选择或基因渗入)同样被认为是一种非天然发生的植物。相比之下，仅含有自发的或天然发生的突变的一株植物(即没有由人类进行遗传上的修饰的一株植物)不是一个如在此所定义的“非天然发生的植物”，并且因此没有包括在本发明之内。本领域的普通技术人员应理解的是虽然一个非天然发生的植物典型地具有一个与一个天然发生的植物相比改变的核酸序列，一个非天然发生的植物也可以是在没有改变其核酸序列下由人类进行了遗传上的修饰是，例如通过改变其甲基化形式。
术语一个基因或蛋白的“直向同源物”在此是指在另一个属种中发现的同源基因或蛋白，它与该基因或蛋白的功能相同，但是(通常)从当包含这些基因的这些种属偏离时的时间点开始在序列上不同(即这些基因从一个共同的祖先通过物种形成而进化)。因此欧洲油菜IND基因的直向同源物可以在其他植物种属(例如芥菜、等)中基于两个序列比较(例如基于对整个序列或对于特定结构域的百分比序列一致性)和/或功能分析进行鉴定。
在此使用的一个“品种”与UPOV惯例一致并且是指最低已知等级的一个单个的植物学类名之内的一株植物分组，该分组可以通过由一个给定的基因型或基因型的组合造成的特征的表达来定义，可以通过至少一个所述特征的表达而从其他植物分组区分开并且被认为是关于其适合被无变化地(稳定)繁殖的一个单元。
术语“包括”应被解释为指明了所陈述的部分、步骤或组分的存在，但不排除一种或多种另外的部分、步骤或组分的存在。因此包括某一性状的一种植物可以包括另外的性状。
应当理解的是当以单数形式提及一个单词(例如植物或根)时，在此也包括复数形式(例如多个植物、多个根)。因此，通过不定冠词“一个”或“一种”提及一个元素时，不排除多于一种元素存在的可能性，除非上下文清楚地要求了存在一种并且仅有一种该元素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常是指“至少一种”。
出于本发明的目的，两个相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”(表示为一个百分数)是指在这两个最佳比对序列中的具有相同残基的位置的数目(x100)除以所比较的位置的数目。一个缺口(即一个比对中的一个位置，其中一个残基在一个序列中存在但是在另一个序列中不存在)被视为具有不相同残基的一个位置。根据Needleman和Wunsch总体比对运算法则(Needleman and Wunsch，1970，J Mol Biol 48(3)：443-53)在欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS，Rice et al.，2000，Trends in Genetics16(6)：276-277；参见例如http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中使用缺省设置(缺口开放罚分＝10(对于核苷酸)/10(对于蛋白)和缺口延长罚分＝0.5(对于核苷酸)/0.5(对于蛋白))通过将两个序列对整个长度进行比对发现了两个序列的“最佳的比对”。对于核苷酸所使用的缺省记分矩阵是EDNAFULL，并且对于蛋白该缺省记分矩阵是EBLOSUM62。
如在此使用的“基本上一致”或“基本上相似”是指序列，当如以上定义进行最佳的比对时，该序列共享至少某一最小百分比的序列一致性(如以下进一步定义)。
可以使用“严格的杂交条件”来鉴别核苷酸序列，这些核苷酸序列与一个给定的核苷酸序列是基本上一致的。严格的条件是序列依赖的并且在不同情况下将是不同的。总体上，选择严格条件为在一种限定的离子强度和pH下比该特异性序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。Tm是50％的目标序列杂交到一种完全匹配的探针上所处的温度(在限定离子强度及pH下)。典型地，将选择严格的条件，其中盐浓度是pH 7下大约0.02摩尔并且温度是至少60℃。降低盐浓度和/或增加温度增加了严格性。对于RNA-DNA杂交(使用例如100nt的一个探针的RNA印迹法)的严格条件是例如包括在63℃下在0.2X SSC中至少一次洗涤持续20分钟的那些，或等效条件。
可以例如通过在65℃下在一种含有6x SSC(20x SSC含有3.0MNaCl、0.3M柠檬酸钠、pH 7.0)、5x Denhardt′s(100X Denhardt’s含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、以及20μg/ml变性的载体DNA(单链鱼精液DNA，具有120-3000个核苷酸的平均长度)(作为非特异性竞争试剂)的水溶液中杂交而提供“高度严格条件”。杂交后，高度严格性洗涤可以是以若干步骤完成，其中在0.2-0.1×SSC，0.1％SDS中在杂交温度下进行最终洗涤(大约30分钟)。
“中等程度严格条件”是指与在上述溶液中杂交等效的条件但是在大约60℃-62℃下。中等程度严格性洗涤可以在1x SSC，0.1％SDS中在杂交温度下完成。
“低严格性”是指与在上述溶液中在大约50℃-52℃下杂交等效的条件。低严格性洗涤可以在2x SSC，0.1％SDS中在杂交温度下完成。还参见Sambrook et al.(1989)and Sambrook and Russell(2001)。
“增加的收获产量”或“增加的种子或谷物产量”是指根据本发明当与从一个相似数目的不含突变体IND等位基因的同基因植物收获的种子或谷物的量相比时，从各自包括突变体IND等位基因的多个植物收获的更大量的种子或谷物。产量典型地是以每表面单位所收获的种子的体积单位来表示的，如蒲式尔/英亩或kg/ha。产量增加典型地是以百分比来表示的，由此参照或对照植物的产量被指定为100％并且根据本发明的植物的产量表示为相对于该对照植物的产量的％。在根据本发明芸薹属植物中所观察到的产量增加范围是从至少101％到至少124％并且可预期的是更高的产量增加是可能的。产量增加还可以是范围从104％到108％或105％到110％。
详细说明
如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述，以前发现欧洲油菜植物(它们在其两个IND基因(即IND-A1或IND-C1)中仅有一个中对于一个完全敲除的ind等位基因是纯合的)与不包括突变体IND等位基因的欧洲油菜植物相比没有显示出在荚果抗落粒性上的显著增加，而在欧洲油菜植物中(在两个IND基因中对于一个完全敲除的ind等位基因都是纯合的)荚果抗落粒性是显著增加的，但是荚果抗落粒性的水平是过高的从而不能维持一种农艺学相关的脱粒能力。通过对比，在包括两个欧洲油菜IND基因的三个完全敲除的ind等位基因的欧洲油菜植物中，荚果抗落粒性显著增加到一个水平的，从而这些植物维持了一个农艺学相关的荚果脱粒能力。
本发明的诸位发明人出人意料地发现具有类似于WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中描述的芸薹属植物的一种荚果落粒表型的欧洲油菜植物(即该植物将增加的荚果抗落粒性与荚果的一种农艺学相关的脱粒能力进行结合)还可以通过将两个部分敲除的突变体IND等位基因与两个完全敲除的突变体IND等位基因进行结合而不是将三个完全敲除的突变体IND等位基因进行结合而得到。进一步发现的是与IND-A1基因中的突变相比，IND-C1基因中的突变导致了更强的荚果抗落粒性上的增加。例如与当这两个完全敲除的突变体IND等位基因是来自IND-A1基因并且这两个部分敲除的突变体IND等位基因是来自IND-C1基因时相比，当这两个完全敲除的突变体IND等位基因是来自IND-C1基因的完全敲除的突变体IND等位基因并且这两个部分敲除的突变体IND等位基因是来自IND-A1基因的部分敲除的突变体IND等位基因时，观察到在欧洲油菜植物中荚果抗落粒性上更强的增加。出人意料地，将一个增加的荚果抗落粒性与一个农艺学相关的荚果脱粒能力进行结合的欧洲油菜植物还可以通过引入两个部分敲除的突变体IND等位基因、具体是单独的该IND-C1基因来得到。
因此在本发明的一个实施方案中，在此提供了包括至少两个IND基因的一个芸薹属植物、具体是包括一个IND-A1和一个IND-C1基因的一个欧洲油菜植物，其特征在于它在其基因组中包括两个部分敲除的突变体IND等位基因、具体是一个IND-A1和/或一个IND-C1基因、优选地一个IND-C1基因，由此这些ind等位基因导致了一个显著减少量的由这些突变体等位基因的野生型等效物编码的这种类型的功能性IND蛋白，并且因此在这些植物细胞中、确切地在体内在发育的种子荚果中生成了一个总体上显著减少量的功能性IND蛋白。
在另一个实施方案中，该芸薹属植物在其基因组中进一步包括两个完全敲除的突变体IND等位基因、具体地对应地一个IND-C1和/或一个IND-A1基因、优选地一个IND-C1基因，如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的那些，例如ind-a1-ems01、ind-a1-ems05、ind-c1-ems01、或ind-c1-ems03、等。
据认为通过将特定的部分敲除的突变体IND等位基因的足够的拷贝与特定的完全敲除的突变体和/或野生型IND等位基因的足够的拷贝在一株植物、具体是一个芸薹属植物中进行结合，有可能很好地调节所制造的功能性IND蛋白的量和/或类型，这反过来影响了该植物的果实开裂特性。因此可以以这样一种方式调节这些IND蛋白的绝对和相对量从而提供了植物，这些植物产生足够的一种或多种IND蛋白，从而能够具有一个农艺学相关的种子荚果脱粒能力，同时在收获之前或收获过程中降低了种子落粒。
因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了一株植物、具体是一个芸薹属植物，该植物包括至少一个部分敲除的突变体IND等位基因，该基因编码了一个部分功能性IND蛋白，如以下所述的那些，例如ind-a1-ems06、ind-a1-ems09、ind-a1-ems13、ind-c1-ems04、ind-c1-ems08、或ind-c1-ems09、等，而剩下的等位基因可以是部分敲除的、完全敲除的和/或野生型IND等位基因。
在本发明的一个方面，提供了包括至少两个IND基因的一个芸薹属植物、具体是包括该芸薹属植物、具体是欧洲油菜植物中的两个IND基因(IND-A1和/或IND-C1基因，优选IND-C1基因)的两个部分敲除的ind等位基因和n-元组完全敲除的ind等位基因的一个欧洲油菜植物，由此n≤2(例如n＝0、1、或2)，从而至少一个等位基因生成了至少部分功能性IND蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了包括至少两个IND基因的一个芸薹属种(具体是欧洲油菜)的一个纯合的IND单一突变体植物(n＝2，即对于一个IND基因的一个部分敲除的突变体等位基因是纯合的)、和/或一个纯合的IND双突变体植物(n＝4，即对于两个IND基因的一个完全敲除的突变体等位基因和/或一个部分敲除的突变体等位基因是纯合的)，由此这些突变体等位基因是该芸薹属植物中的两个IND基因、具体是IND-A1和/或IND-C1基因的突变体等位基因。根据本发明此类突变体植物可以用于培育的目的。
因此在本发明的一个实施方案中，在此提供了一个纯合的IND单个部分敲除的突变体欧洲油菜植物，其中该植物的基因型可以描述为ind-a1P/in d-a1P、IND-C1/IND-C1、或IND-A1/IND-A1、ind-c1P/ind-c1P。在本发明的另一个实施方案中，在此提供了一个纯合的IND双部分突变体欧洲油菜植物，其中该植物的基因型可以描述为ind-a1P/ind-a1P、ind-c1P/ind-c1P。在本发明的又另一个实施方案中，在此提供了一个纯合的IND双部分突变体欧洲油菜植物和完全突变体欧洲油菜植物，其中该植物的基因型可以描述为或者ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P或者ind-a1P/ind-a1P、in d-c1F/in d-c1F。
在此进一步提供了来自芸薹属种的部分敲除的突变体IND基因/等位基因的新的核酸序列、以及部分敲除突变体IND蛋白。还提供了在芸薹属植物以及在其基因组中包括完全敲除的突变体IND等位基因和部分敲除的突变体IND等位基因的特定组合的芸薹属植物或植物部分中生成并且结合部分敲除的突变体IND等位基因的方法，由此在这些植物中种子落粒被减少了。用于将部分敲除的突变体IND等位基因转移到其他植物中的这些植物的用途也是本发明的一个实施方案，同样的是任何所述植物的植物的产品。此外，提供了用于结合或检测IND基因和/或等位基因的标记辅助选择(MAS)的试剂盒以及方法。在此以下详细描述了本发明的各实施方案。
在此描述的展示出减少的或延迟的种子落粒的芸薹属植物具有所收获的种子产量上的增加。然而，观察到的是当与不包括这些突变体IND等位基因的同基因的芸薹属植物相比时，不仅来自仅包括处于纯合状态的ind-c1-09等位基因的芸薹属植物(它显示出一个可观察的减少的或延迟的种子落粒表型)的所收获的种子产量、而且来自仅包括处于纯化状态的两个突变体IND等位基因的其他芸薹属植物(即其中该植物的基因型可以描述为ind-a1P/ind-a1P、IND-CI/IND-C1、或IND-AI/IND-A1、ind-c1P/ind-c1P)的所收获的种子产量也显著地增加了，尽管在包括这些突变体IND等位基因的芸薹属植物中不存在一个可观察到的减少的或延迟的种子落粒表型。因此，本发明还提供了包括至少两个IND基因的芸薹属植物，其中至少两个等位基因产生了一个功能性IND蛋白，该植物具有更高的种子产量。应当清楚的是处于IND-A基因座或处于IND-C基因座处的这两个突变体等位基因可以是相同的突变体等位基因或不同的突变体等位基因。
根据本发明的核酸序列
提供了来自十字花科、具体来自芸薹属种、尤其来自欧洲油菜、但是还来自其他芸薹属作物属种的IND基因的编码部分功能性IND蛋白(即具有显著减小的生物学活性的IND蛋白)的部分敲除的突变体ind核酸序列，(即包括一个或多个突变的IND核酸序列，这一个或多个突变导致了所编码的IND蛋白的显著减小的生物活性)。例如，根据本发明包括一个A和/或一个C基因组的芸薹属种可以包括IND-A1或IND-C1基因的等位基因，它们与本发明的部分敲除的突变体IND等位基因是基本上类似的并且它们可以在一个单个植物中被鉴定并且结合。此外，可以使用诱变方法以便在野生型IND等位基因中生成突变，由此生成了基本上与本发明的部分敲除的突变体IND等位基因类似的突变体ind等位基因以根据本发明使用。由于特定的IND等位基因可能通过杂交和选择被结合入一株植物中，在一个实施方案中将这些ind核酸序列提供于一株植物中(即内源地)，例如一个芸薹属植物、优选地可以与欧洲油菜杂交的或可以用于制造一个“合成的”欧洲油菜植物的一个芸薹属植物。不同芸薹属种之间的杂交描述于本领域中，例如在Snowdon(2007，Chromosome research 15：85-95)中所提及的。例如可以使用种间杂交将来自例如欧洲油菜中C基因组(AACC)的基因转移到埃塞俄比亚芥中C基因组(BBCC)中、或甚至从例如欧洲油菜中C基因组(AACC)到芥菜中B基因组(AABB)中(通过它们的C与B基因组之间的异常重组的偶尔发生的事件)。“再合成的”或“合成的”欧洲油菜品系可以通过将最初的祖先甘蓝(CC)与芜青(AA)进行杂交来产生。例如通过胚挽救技术或原生质体融合(参见例如以上的Snowdon)可以在芸薹属作物属种和它们的相关物之间的杂交中成功地克服种间的以及还有属间的不相容性障碍。
然而，在此还提供了分离的ind核酸序列(例如通过克隆从植物中分离的或通过DNA合成而合成地制造的)、及其变异体和这些的任何一项的片段，与可以用于确定哪个序列内源地存在于一株植物或植物部分中、该序列是否编码一个功能性的、一个部分功能性的、一个非功能性的蛋白或不编码蛋白(例如通过如以下所述在一个重组宿主细胞中进行表达)以及用于选择并将特定的等位基因从一株植物转移入另一株植物中的那些一样，用于生成具有所希望的部分敲除的突变体IND等位基因和/或完全敲除的突变体IND等位基因的组合的一株植物。
已经从欧洲油菜中分离出野生型IND-A1和IND-C1的新的部分敲除的突变体IND核酸序列。如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的野生型IND序列描述于序列表的SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中，而这些序列以及基本上类似于这些的序列的新的部分敲除的突变体ind序列参照野生型IND序列描述于以下以及实例中。来自欧洲油菜的基因组的编码IND蛋白的DNA不包括任何内含子。
根据本发明“IND-A1核酸序列”或“IND-A1变异体核酸序列”是编码一个氨基酸序列的核酸序列，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列一致性、或具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核酸序列。这些核酸序列还可以称为是与序列表中所提供的IND序列“基本上类似的”或“基本上一致的”。
根据本发明“IND-C1核酸序列”或“IND-C1变异体核酸序列”是编码一个氨基酸序列的核酸序列，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：4(IND-C1-长)或与SEQ ID NO：4从位置16处的氨基酸到位置210处的氨基酸(IND-C1-短)至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列一致性、或具有与SEQ ID NO：3(IND-C1-长)或与SEQ ID NO：3从位置46处的核苷酸到位置633处的核苷酸(IND-C1-短)或与SEQ ID NO：7至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核酸序列。这些核酸序列还可以被称为是与序列表中所提供的IND序列“基本上类似的”或“基本上一致的”。
因此本发明提供了编码野生型、功能性IND-A1和IND-C1蛋白的核酸序列的新的部分敲除的突变体核酸序列，包括其变异体和片段(如以下进一步定义)，由此与该野生型IND蛋白相比，在核酸序列中的突变优选地导致了一个或多个氨基酸被插入、缺失或取代，特别是一个或多个氨基酸被取代，并且由此该IND蛋白的生物学活性显著地降低了。IND蛋白的生物学活性上的显著减少在此是指该IND蛋白的DNA结合活性、二聚作用能力和/或转录调节活性上的减少，从而与一个表达相应的野生型IND蛋白的植物相比，一个表达该突变体IND蛋白的植物的荚果抗落粒性是增加的。
为了确定在植物、具体地在芸薹属植物中一个特定的IND等位基因/蛋白的功能性，这些植物中对荚果落粒的耐受性的水平可以通过在包括该特定的IND等位基因/蛋白的植物和相应的野生型植物的果实和花上进行宏观的、微观的和组织学的测定来确定，类似于如由Liljegren等人(2004，上述)所述的或在以下实例中所述的在拟南芥属果实和花中进行的测定。简言之，荚果抗落粒性上的改变可以例如通过宏观测试来评价和/或测量，如用肉眼检查种子荚果来评价，例如存在或不存在瓣边缘、荚果的喙的长度、等；当轻轻地扭曲荚果时通过评价荚果打开的容易程度用来比较不同突变体IND品系与相应的野生型品系之间的荚果抗落粒性的水平的一个手动冲击试验(MIT)；通过测量这些品系的荚果样品的半衰期用来比较对应地来自不同突变体IND品系与相应的野生型品系的来自植物的种子荚果的脱粒能力的一个随机冲击试验(RIT)；和/或通过显微测试以检查例如瓣边缘处和种子荚果的开裂区处的细胞是否和如何被IND中的突变所影响。一旦鉴定并且表征了该IND蛋白(例如在这种情况下该IND蛋白本身其功能取决于一种同源二聚体的形成，或在这种情况下另一种蛋白其功能取决于一种异源二聚体的形成)的二聚作用配偶体和/或一个或多个基因(该一个或多个基因的转录被该IND蛋白所调节)，一个特定的IND等位基因/蛋白的功能性可以可替代地通过本领域中已知的重组DNA技术来评价，例如通过在一个宿主细胞(例如一个细菌，如大肠杆菌)中共表达该二聚体的两个配偶体并且评价是否二聚体仍然可以形成、是否这些二聚体仍然可以结合到这一个或多个调节的基因的bHLH结合位点上、和/或是否这一个或多个基因的转录仍然由这种结合所调节。
在此提供了内源的和分离的核酸序列两者。根据本发明的另一个方面，还提供了以上定义的这些突变体IND序列和突变体IND变异体核酸序列的片段，用作引物或探针以及用作试剂盒的组分(进一步参见以下)。一个ind核酸序列或其变异体(如所定义的)的一个“片段”可以具有不同的长度，如至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600个相邻的核苷酸的IND或ind序列(或该变异体序列)。
编码功能性IND蛋白的核酸序列
在序列表中描述的核酸序列编码来自欧洲油菜的野生型、功能性IND蛋白。因此，这些序列对于欧洲油菜植物(这些序列是从这些植物中分离出的)是内源的。可以筛选其他芸薹属作物属种、品种、培育品系或野生登记物检测编码相同的IND蛋白或其变异体的其他IND等位基因。例如，可以使用核酸杂交技术(例如DNA印迹分析，使用例如严格杂交条件)或基于PCR的技术来鉴定与其他芸薹属植物、例如不同的欧洲油菜品种、品系或登记物内源的IND等位基因，并且还可以筛选芥菜(尤其是A-基因组上的IND等位基因)、埃塞俄比亚芥(尤其是C-基因组上的IND等位基因)以及芜青(A-基因组)和甘蓝(C-基因组)植物、器官和组织检测其他的野生型IND等位基因。为了筛选这类植物、植物器官或组织检测IND等位基因的存在，可以使用序列表中提供的IND核酸序列、或变异体或这些任何一种的片段。例如，可以使用全部序列或片段作为探针或引物。例如，可以使用特异的或简并的引物来扩增来自该植物、植物器官或组织的基因组DNA的编码IND蛋白的核酸序列。可以使用标准的分子生物学技术来分离和测序这些IND核酸序列。然后可以使用生物信息学分析来表征这一个或多个等位基因，例如为了确定该序列对应于哪个IND等位基因以及哪个IND蛋白或蛋白变异体被该序列编码。
不论一个核酸序列是否编码一个功能性IND蛋白，可以通过本领域中已知的重组DNA技术进行分析，例如通过一个遗传互补测试，使用例如一个拟南芥属植物，分析IND-A1和IND-C1基因两者哪个对于一个完全敲除的ind突变体等位基因是纯合的，或使用一个欧洲油菜植物，分析IND-A1和IND-C1基因两者哪个对于一个完全敲除的ind突变体等位基因是纯合的。。
此外，应当理解的是这些IND核酸序列及其变异体(或这些中任何一项的片段)可以在基于硅的计算机中通过筛选核酸数据库检测基本上类似的序列而进行鉴定。同样，可以用化学方法合成一个核酸序列。根据本发明还提供了核酸分子的片段，这些片段在以下被进一步描述。片段包括仅编码该bHLH结构域的核酸序列、或包括部分该bHLH结构域(如碱性结构域或该HLH结构域、等)的较小的片段。
编码突变体IND蛋白的核酸序列
本发明提供了相对于描述于序列表的SEQ ID NO：1、3、5和7中的野生型IND核酸序列包括一个或多个核苷酸缺失、插入或取代的核酸序列，其中核酸序列中的一个或多个突变导致了所编码的IND蛋白相对于野生型IND蛋白的显著减小的生物活性，即一种部分敲除的生物活性，连同此类突变体核酸分子的片段。此类突变体核酸序列(称为indP序列)可以如以下进一步描述使用不同的已知方法来生成和/或鉴定。此外，此类核酸分子以内源形式以及以分离的形式两者进行提供。
基本上，在野生型IND核酸序列中的任何突变(该突变导致包括相对于野生型IND蛋白至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代的一种IND蛋白)可以导致显著减小的生物活性或无生物活性。然而，应当理解的是IND蛋白中的某些突变更有可能导致该IND蛋白的生物学活性的完全消除，如由此这些功能域的重要部分如DNA结合域(‘b’)、二聚化功能域(‘HLH’)和/或转录调节域缺失的突变，或由此这些结构域之内的某些关键的氨基酸残基如由Heim等人(2003，Mol Biol Evol 20，735-747；分别对应于SEQ IDNO：10中位置123、127和131、以及128和130，参见表1)定义的共有区bHLH结构域序列的位置5、9、和13处的Gln(Q)、Ala(A)以及Arg(R)氨基酸或位置10和12处的碱性氨基酸残基(特别是Arg(R)残基)缺失或被取代，优选地被不相似的或非保守的氨基酸取代，而IND蛋白中其他突变更有可能导致该IND蛋白的生物学活性的显著减小，如导致特定的氨基酸(例如表1中所指示的保守的氨基酸)被取代的突变，导致更小地有效DNA结合、一个更小地有效的二聚作用、和/或一个更小的有效地调节转录，而没有完全消除所编码的IND蛋白的生物学活性。WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)描述了例如完全敲除的突变体IND等位基因，具体是ind-a1-ems01、ind-c1-ems01和ind-c1-ems03，它们包括一种无义突变，该无义突变导致了生成缺少bHLH结构域的截短的IND蛋白，以及完全敲除的突变体IND等位基因，具体是ind-a1-ems05，它编码了一个突变体IND蛋白，其中共有区bHLH结构域的位置10处的保守的Arg被取代为一个芳香族的His，同时本发明描述了部分敲除的突变体IND等位基因，具体是例如ind-c1-ems09，它编码了一个突变体IND蛋白，其中共有区bHLH结构域的位置9处的保守的Ala被取代为一个Thr，以及ind-c1-ems04，它编码了一个突变体IND蛋白，其中共有区bHLH结构域的位置12处的保守的Arg被取代为一个Cys。
这些核酸分子可以包括一个或多个突变，如：
-一个“错义突变”，它是核酸序列上的一个改变，该改变导致了一个氨基酸被取代为另一个氨基酸；
-一个“无义突变”或“STOP密码子突变”，它是核酸序列上的一个改变，该改变导致将一个过早的STOP密码子引入并且因此终止了翻译(导致了一个截短的蛋白)；植物基因含有这些翻译终止密码子“TGA”(在RNA中是UGA)、“TAA”(在RNA中是UAA)以及“TAG”(在RNA中是UAG)；因此导致这些密码子之一出现在正在翻译的成熟的mRNA(在阅读框中)中的任何核苷酸取代、插入或缺失将终止翻译；
-一个或多个氨基酸的一个“插入突变”，由于一个或多个密码子已被加入到该核酸的编码序列中；
-一个或多个氨基酸的一个“缺失突变”，由于一个或多个密码子已在该核酸的编码序列中被缺失；
-一个“移码突变”，导致了将该核酸序列被翻译在该突变下游一个不同的框内。一个移码突变可能具有不同的原因，如一个或多个核苷酸的插入、缺失或复制。
表1对应地指出了SEQ ID NO：10中的拟南芥属IND蛋白、SEQ IDNO：9中的DNA编码的拟南芥属IND、以及SEQ ID NO：2和6以及SEQID NO：4和8中欧洲油菜IND-A1和IND-C1蛋白的长度；该bHLH结构域在欧洲油菜IND-A1和IND-C1蛋白中的位置(基于根据拟南芥属信息资源(TAIR)数据库(http://www.arabidopsis.org/；基因座At4g00120.1，通过引用结合在此；SEQ ID NO：10)拟南芥属IND蛋白的所指出的pfam结构域PF00010、smart结构域SM00353、prosite结构域PS50888以及superfam结构域G3D.4.10.280.10或SSF47459的位置)；bHLH结构域和保守的氨基酸在欧洲油菜IND-A1和IND-C1蛋白中的位置(基于根据Heim等人(2003，Mol Biol Evol 20，735-747)、根据Toledo-Ortiz等人(2003，Plant Cell 15：1749-1770)、以及根据Liljegren等人(2004，Cell，116，843-853)，通过引用结合在此)所指出的bHLH结构域和保守的氨基酸在拟南芥属IND蛋白中的位置)；如进一步在WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所描述，将其通过引用结合在此。
表1IND蛋白-氨基酸(AA)区和位置
Heim等人，H：Heim et al.，2003，Mol Biol Evol 20，735-747；Toledo-Ortiz等人，T：Toledo-Ortiz et al.，2003，Plant Cell 15：1749-1770；Liljegren等人，L：Liljegren et al.，2004，Cell，116，843-853；W：Wu et al，2006，Planta 224，971-979.
拟南芥属核酸IND核酸(SEQ ID NO：9)和具有IND核酸序列的氨基酸(SEQ ID NO：10)序列、特别是芸薹属IND核酸(SEQ ID NO：1和3)和本发明的氨基酸(SEQ ID NO：2和4)序列的最佳比对允许确定这些芸薹属序列中相应的保守的结构域和氨基酸的位置(对于SEQ ID NO：1至4的芸薹属IND序列参见表1)。
因此在一个实施方案中，提供了包括一个或多个上述类型的突变中任何一种的部分敲除的突变体IND核酸序列。在另一个实施方案中，提供了包括一个或多个终止密码子(无义)突变、一个或多个错义突变和/或一个或多个移码突变的部分敲除的ind序列。提供了以上突变体核酸序列中任何一项本身(处于分离的形式)，同样提供了内源地包括此类序列的植物和植物部分。在此以下的表中，描述了最优选的ind等位基因，并且如所指示将包括一个或多个ind等位基因的欧洲油菜种子的种子存储物进行存储。
如在此使用的一个IND等位基因中的一个无义突变是在一个IND等位基因中的一个突变，由此将一个或多个翻译终止密码子引入到相应的野生型IND等位基因的编码DNA以及相应的mRNA序列中。翻译终止密码子是TGA(在mRNA中是UGA)、TAA(UAA)以及TAG(UAG)。因此，导致在编码序列中生成一个框内终止密码子的任何突变(缺失、插入或取代)将导致翻译的终止以及氨基酸链的平截。在一个实施方案中，提供了包括一个无义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，其中将一个框内终止密码子通过一个单个的核苷酸取代(如CAG到TAG、TGG到TAG、TGG到TGA、或CAA到TAA的突变)引入到该IND密码子序列中。在另一个实施方案中，提供了包括一个无义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，其中将一个框内终止密码子通过双核苷酸取代(如CAG到TAA、TGG到TAA、或CGG到TAG或TGA的突变)引入到该IND密码子序列中。在又另一个实施方案中，提供了包括一个无义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，其中将一个框内终止密码子通过三核苷酸取代(如CGG到TAA的突变)引入到该IND密码子序列中。该截短的蛋白缺少由该突变下游的编码DNA编码的氨基酸(即IND蛋白的C端部分)并且维持了由该突变上游的编码DNA编码的氨基酸(即该IND蛋白的N端部分)。在一个实施方案中，提供了包括一个无义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该无义突变存在于该H2结构域的保守的Leu残基之前的任何地方(如由Heim et al.，2003所述，处于共有区bHLH结构域序列的位置56处，参见表1)，从而至少该保守的Leu残基是缺失的。与该野生型IND蛋白相比该突变体IND蛋白愈是截短的，该平截可能愈是更多地导致该IND蛋白的显著减小的活性。据信为了使该突变体IND蛋白保留一些生物活性，应该至少包括DNA结合(b)域。因此在另一个实施方案中，提供了包括一个无义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该无义突变导致了一个截短的蛋白，该蛋白具有小于约170个氨基酸(缺少保守的Leu)、小于约150个氨基酸(缺少H2结构域)、小于约145个氨基酸(缺少L和H2结构域)、或小于约130个氨基酸(缺少HLH结构域)(参见表1)。
在此以下的多个表格描述了在在此提供的欧洲油菜IND序列中的一系列可能的无义突变：
表2a在IND-A1(SEQ ID NO：1)中潜在的STOP密码子突变
表2b在IND-C1(SEQ ID NO：3)中潜在的STOP密码子突变
显而易见地，突变不限于以上表中所示的这些，并且应当理解的是类似的STOP突变可以存在于除了序列中所描述的以及以上的表中所提及的那些等位基因的ind等位基因中。
如在此使用的一个IND等位基因中的一个错义突变是在一个IND等位基因中的任何突变(缺失、插入或取代)，由此一个或多个密码子被改变成相应的野生型IND等位基因的编码DNA和相应的mRNA序列，导致了野生型IND蛋白中的一个或多个氨基酸被取代为突变体IND蛋白中的一个或多个其他氨基酸。在一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：2、或基本上与其类似的一个序列中IND蛋白的位置124处的一个缬氨酸(Val)残基特别地被一个甲硫氨酸(Met)残基所取代，如ind-a1-EMS06等位基因(表3a)。在另一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：2、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置146处的一个甘氨酸(Gly)残基特别地被一个丝氨酸(Ser)残基所取代，如ind-a1-EMS09等位基因(表3a)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：2、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置159处的一个丙氨酸(Ala)残基特别地被一个缬氨酸(Val)残基所取代，如ind-a1-EMS13等位基因(表3a)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中IND蛋白的位置136处的一个苏氨酸(Thr)残基特别地被一个甲硫氨酸(Met)残基所取代，如ind-c1-EMS08等位基因(表3b)。在一个进一步的实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中IND蛋白的位置139处的一个丙氨酸(Ala)残基特别地被一个苏氨酸(Thr)残基所取代，如ind-c1-EMS09等位基因(表3b)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该错义突变导致了SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中IND蛋白的位置142处的一个精氨酸(Arg)残基特别地被一个半胱氨酸(Cys)残基所取代，如ind-c1-EMS04等位基因(表3b)。包括处于纯合状态的ind-a1-EMS06、ind-a1-EMS09、ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS08、ind-c1-EMS09、以及ind-c1-EMS04等位基因的参照种子已对应地在登录号NCIMB 41570、NCIMB 41571、NCIMB41572、NCIMB 41573、NCIMB 41574、以及NCIMB 41575下在2008年7月7日存放在NCIMB Limited(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，Scotland，AB219YA，UK)处。
表3a：IND-A1中的错义突变
表3b：IND-C1中的错义突变
在另一个实施方案中，提供了包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因，该突变体编码一个IND蛋白，其中在以上或表1中所指出的一个或多个保守的氨基酸被取代，如部分敲除的突变体IND等位基因ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS04和ind-c1-EMS09(在表3中用＊指出)。如在Heim等人(2003，Mol Biol Evol 20，735-747)、Toledo-Ortiz等人(2003，Plant Cell 15：1749-1770)、Liljegren等人(2004，Cell，116，843-853)、以及WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述，一些保守的氨基酸比其他氨基酸对该IND蛋白的生物活性更加关键。因此，例如，导致了例如由Heim等人(上述)所定义的共有区bHLH结构域序列的位置5、9(例如ind-c1-EMS09)、和13处或位置10(例如ind-a1-EMS05)和12(例如ind-c1-EMS04)处的氨基酸的取代的错义突变更有可能导致显著减小的活性，这些由于该IND蛋白结合到目标DNA上的能力减小了。类似地，导致了例如由Heim等人(上述)所定义的共有区bHLH结构域序列的螺旋1中的位置16、20、23、27处、或螺旋2中的位置36、39、43、49(例如ind-a1-EMS13)、53和56处的氨基酸的取代的错义突变更有可能导致显著减小的活性，由于该IND蛋白的二聚作用能力减小了。
在又另一个实施方案中，可以根据本发明使用的包括一个错义突变的一个部分敲除的突变体IND等位基因是包括一个错义突变(对应于拟南芥属部分敲除的ind-1(Liljegren et al.，2004，上述)等位基因(参见表1)中的错义突变)的一个IND等位基因。
如在此使用的一个IND等位基因中的一个移码突变是在一个IND等位基因中的一个突变(缺失、插入、复制、等)，该突变导致了该核酸序列被翻译在该突变的下游一个不同的框内。
根据本发明的氨基酸序列
提供了来自十字花科、具体来自芸薹属种、尤其是来自欧洲油菜、但是也来自其他芸薹属作物属种的部分敲除的突变体IND氨基酸序列(即包括一个或多个突变的IND氨基酸序列，这一个或多个突变导致了该IND蛋白的显著减小的生物活性)。例如，包括一个A和/或一个C基因组的芸薹属种可以编码不同的IND-A1或IND-C1氨基酸，这些氨基酸与本发明的新颖的部分敲除的突变体IND蛋白是基本上类似的。此外，可以使用诱变方法来在野生型IND等位基因中产生突变，由此产生了可以编码另外的突变体IND蛋白的突变体等位基因，该突变体IND蛋白与本发明的部分敲除的突变体IND蛋白是基本上类似的。在一个实施方案中，在一个芸薹属植物中(即内源地)提供了该突变体IND氨基酸序列。然而，在此还提供了分离的IND氨基酸序列(例如从植物分离的或合成制备的)、以及其变异体和任何这些的片段。
与本发明的新颖的部分敲除的突变体IND蛋白基本上类似的氨基酸序列可以通过用具有类似特性(如类似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β折叠结构的倾向)的其他氨基酸替代本发明的部分敲除的IND氨基酸序列中的氨基酸来得到。保守的取代表在本领域中是已知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company以及本发明申请书的表4)。
表4：保守的氨基酸取代的实例
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile，Val
Arg Lys Lys Arg，Gln
Asn Gln，His Met Leu，Ile
Asp Glu Phe Met，Leu，Tyr
Gln Asn Ser Thr，Gly
Cys Ser Thr Ser，Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp，Phe
His Asn，Gln Val Ile，Leu
Ile Leu，Val
已经从欧洲油菜中分离了野生型IND-A1和IND-C1蛋白的新颖的部分敲除的突变体IND氨基酸序列。如在WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的野生型IND序列被描述于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中，而这些序列以及基本上类似于这些的序列的新颖的部分敲除的突变体IND序列参照野生型IND序列被描述在此以下以及在实例中。如上所述，欧洲油菜的野生型IND蛋白的长度是大约185-210个氨基酸并且包括多个结构域和功能域。
根据本发明，“IND-A1氨基酸序列”或“IND-A1变异体氨基酸序列”是具有与SEQ ID NO：2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以称为是与在序列表中所提供的IND序列“基本上类似的”或“基本上一致的”。
根据本发明，“IND-C1氨基酸序列”或“IND-C1变异体氨基酸序列”是具有与SEQ ID NO：4(IND-C1-长)或与SEQ ID NO：4从位置16处的氨基酸到位置210处的氨基酸(IND-C1-短)至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以称为是与在序列表中所提供的IND序列“基本上类似的”或“基本上一致的”。
因此，本发明提供了野生型、功能性IND-A1和IND-C1蛋白的氨基酸序列的新颖的部分敲除的突变体序列，包括其变异体或片段(如以下进一步定义)，与相应的野生型IND蛋白的生物活性相比，由此氨基酸序列中的突变优选地导致IND蛋白的生物活性显著减小。IND蛋白的生物活性的显著减少在此是指该IND蛋白的DNA结合活性、二聚作用能力和/或转录调节活性上的减少，从而与一个表达相应的野生型IND蛋白的植物相比，表达该突变体IND蛋白的植物的荚果抗落粒性与一个相应的野生型植物的荚果抗落粒性相比是增加的。
在此提供了内源的和分离的氨基酸序列两者。还提供了以上定义的IND氨基酸序列以及IND变异体氨基酸序列的片段。一个IND氨基酸序列或其变异体的一个“片段”(如所定义的)可以不同的长度，如IND序列(或该变异体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、150、175、180个邻接的氨基酸。
功能性IND蛋白的氨基酸序列
序列表中所描述的氨基酸序列是来自欧洲油菜的野生型、功能性IND蛋白。因此，这些序列对于欧洲油菜植物(这些序列是从该植物中分离出的)是内源的。如上所述，可以筛选其他芸薹属作物种属、品种、培育品系或野生的登记物检测具有相同的氨基酸序列或其变异体的其他功能性IND蛋白。
此外，应当理解的是这些IND氨基酸序列及其变异体(或任何这些的片段)可以在硅芯片计算机中通过筛选氨基酸数据库检测基本上类似的序列进行鉴定。根据本发明还提供了氨基酸分子的片段。这些片段包括该bHLH结构域或更小的片段的氨基酸序列、该更小的片段包括该bHLH结构域的部分(如碱性结构域或该HLH结构域、等)。
突变体IND蛋白的氨基酸序列
本发明提供了相对于描述于序列表的SEQ ID NO：2和4中的野生型IND氨基酸序列包括一个或多个氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中的一个或多个突变导致了所编码的IND蛋白连同此类突变体氨基酸分子的片段相对于野生型蛋白的显著减小的生物活性，即一种部分敲除的生物活性。如上所述可以使用不同的已知方法来生成和/或鉴定此类突变体氨基酸序列。此外，此类氨基酸分子以内源形式以及以分离的形式两者进行提供。
如上所述，基本上，野生型IND氨基酸序列中的任何突变(这导致一种IND蛋白，该蛋白包括相对于野生型IND蛋白至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代)可以导致显著减小的生物活性或无生物活性。然而已经了解到在IND蛋白中的某些突变更有可能导致该IND蛋白的生物活性的完全消除，如导致截短的蛋白的突变，由此这些功能域的重要部分(如DNA结合域(‘b’)、二聚化功能域(‘HLH’)和/或在转录调节中重要的氨基酸(参见表1))缺失了，或由此这些结构域之内的某些关键的氨基酸残基如由Heim等人(上述；分别对应于SEQ ID NO：10中的位置123、127和131、以及128和130，参见表1)所定义的共有区bHLH结构域序列的位置5、9、和13处的Gln(Q)、Ala(A)以及Arg(R)氨基酸或位置10和12处的碱性氨基酸残基(特别是Arg(R)残基)缺失或被取代(优选地被不相似的或非保守的氨基酸取代)的突变，而该蛋白中的其他突变更有可能导致该IND蛋白的生物活性的显著减小，如导致特定的氨基酸的取代的突变，例如表1中所指示的保守的氨基酸导致更低效的DNA结合、更低效的二聚作用、和/或更低效地调节转录，而没有完全消除所编码的IND蛋白的生物活性。
因此在一个实施方案中，提供了包括一个或多个缺失或插入突变的部分敲除的突变体IND蛋白，由此这一个或多个缺失或插入导致了一种突变体蛋白，该突变体蛋白在体内具有显著减小的活性。此类突变体IND蛋白是与野生型IND蛋白相比其中至少1、至少2、3、4、5、10、20、30、50、100、100、150、175、180或更多个氨基酸被缺失或插入的IND蛋白，由此这一个或多个缺失或插入导致了一种突变体蛋白，该突变体蛋白在体内具有显著减小的活性。
在另一个实施方案中，提供了部分敲除的突变体IND蛋白，该部分敲除的突变体IND蛋白是截短的，由此该平截导致了在体内具有显著减小的活性的一种突变体蛋白。此类截短的IND蛋白是缺少相应的野生型IND蛋白的C端部分中的功能域的并且维持了相应的野生型IND蛋白的N端部分的IND蛋白。因此在一个实施方案中，提供了包括相应的野生型IND蛋白的N端部分一直到但是不包括H2结构域的保守的Leu残基(处于由Heim et al.，2003所述的共有区bHLH结构域序列的位置56处，参见以上)的一个部分敲除的突变体IND蛋白。该突变体蛋白与该野生型蛋白相比较愈是截短的，该平截可能愈是更多地导致该IND蛋白的显著减小的活性。所相信的是为了使该突变体IND蛋白保留一些生物活性，应该至少包括该DNA结合(b)域。因此在另一个实施方案中，提供了一个部分敲除的突变体IND蛋白，该部分敲除的突变体IND蛋白包括该相应的野生型IND蛋白的N端部分、缺少部分或全部的第二H结构域、和/或缺少部分或全部的L结构域、和/或缺少部分或全部的第一H结构域(参见表1)。
在又另一个实施方案中，提供了包括一个或多个取代突变的部分敲除的突变体IND蛋白，由此这一个或多个取代导致了一种突变体蛋白，该突变体蛋白在体内具有显著减小的活性。在一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQID NO：2、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置124处的一个缬氨酸(Val)残基特别地被一个甲硫氨酸(Met)残基所取代，如由ind-a1-EMS06等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3a)。在另一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQ ID NO：2、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置146处的一个甘氨酸(Gly)残基特别地被一个丝氨酸(Ser)残基所取代，如由ind-a1-EMS09等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3a)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQ IDNO：2、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置159处的一个丙氨酸(Ala)残基特别地被一个缬氨酸(Val)残基所取代，如由ind-a1-EMS13等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3a)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置136处的一个苏氨酸(Thr)残基特别地被一个甲硫氨酸(Met)残基所取代，如由ind-c1-EMS08等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3b)。在一个进一步的实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置139处的一个丙氨酸(Ala)残基特别地被一个苏氨酸(Thr)残基所取代，如由ind-c1-EMS09等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3b)。在又另一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了在SEQ ID NO：4、或基本上与其类似的一个序列中的IND蛋白的位置142处的一个精氨酸(Arg)残基特别地被一个半胱氨酸(Cys)残基所取代，如由ind-c1-EMS04等位基因所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(表3b)。
在另一个实施方案中，提供了包括一个取代突变的一个部分敲除的突变体IND蛋白，该取代突变导致了如以上或表1中所指出的一个保守的氨基酸残基的取代，如由ind-a1-EMS13、ind-c1-EMS04或ind-c1-EMS09所编码的部分敲除的突变体IND蛋白(在表3中用＊指示)。
根据本发明的方法
在本发明的另一个方面，提供了用于生成并选择含有至少一个部分敲除的ind等位基因和/或至少一个完全敲除的ind等位基因的裂开性种子植物、及其细胞、部分、种子和子代的方法。具体地，提供了用于生成并选择包括至少两个IND基因的芸薹属植物、具体是欧洲油菜植物、及其细胞、部分、种子和子代的方法，该植物及其细胞、部分、种子和子代在该基因组中在至少两个不同的IND基因座中的至少一个处(例如在芸薹属IND-A1和IND-C1基因的至少两个不同的基因座中的至少一个处)含有至少一个部分敲除的ind等位基因和/或至少一个完全敲除的ind等位基因，并且从而在一个裂开性种子植物或植物部分中进行完全敲除的ind等位基因、部分敲除的ind等位基因与野生型IND等位基因的存在之间的区别。因此提供了用于生成和/或鉴定部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因或包括此类ind等位基因的裂开性种子植物或植物部分的方法(如诱变和/或标记辅助选择)、以及用于将一个适合数目的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因和/或不同类型的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因结合入一个单个的裂开性种子植物中以便改变这些植物的果实开裂特性、特别是以便减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获之后，而同时维持一种农艺学相关的荚果脱粒能力的方法。
根据本发明可以使用一系列方法来生成(例如通过诱变进行诱导)和/或鉴定部分敲除的突变体ind等位基因和完全敲除的突变体ind等位基因，这些方法在本领域中是常规的，例如使用基于PCR的方法来扩增部分或全部的ind基因组DNA或cDNA。
在诱变后，使用已知技术将植物从这些处理的种子中生长出来、或从这些处理的细胞中再生出来。例如，可以根据常规的生长步骤将诱变过的种子进行种植并且在自花传粉之后在这些植物上形成种子。可替代地，可以从处理过的小胞子或花粉细胞中提取出双单倍体小植株以立即形成纯合的植物，例如由Coventry等人(1988，Manual for Microspore CultureTechnique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OACPublication 0489.Univ.of Guelph，Guelph，Ontario，Canada)所述。使用本领域中常规的技术(例如基于聚合酶链式反应(PCR)的技术(扩增该ind等位基因)或基于杂交的技术，例如DNA印迹分析、BAC文库筛选、等，和/或ind等位基因的直接测序)可以将由于在当前世代或一个随后的世代中的这种自花传粉而形成的另外的种子进行收获并且筛选检测突变体IND等位基因的存在。为了在突变体IND等位基因中进行筛选检测点突变(所谓的单核苷酸多态性或SNPs)的存在，可以使用本领域中常规的SNP检测方法，例如基于寡连接的技术、基于单个碱基延长的技术或基于限制性酶切位点中的差别的技术，如TILLING。
如上所述，一个特定的野生型IND等位基因的诱变(自发的以及诱导的)导致了在所得到的突变体IND等位基因中存在一个或多个缺失的、插入的、或取代的核苷酸(以下称为“突变区”)。因此该突变体IND等位基因的特征是在野生型IND等位基因中该一个或多个缺失的、插入的、或取代的核苷酸的位置和构型。该一个或多个核苷酸被对应地插入、缺失、或取代的该野生型IND等位基因中的位置在此也称为“突变区或序列”。如在此使用的一个“5’或3’侧翼区或序列”是指在与含有一个或多个缺失的、插入的、或取代的核苷酸的DNA不同的至少20bp、优选地至少50bp、至少750bp、至少1500bp、以及高达5000bp的DNA的突变体(或相应的野生型)IND等位基因中的一个DNA区或序列，优选来自该突变体(或该相应的野生型)IND等位基因的DNA，该IND等位基因位于该突变体IND等位基因(或该相应的野生型IND等位基因)中或者突变区的紧邻上游并且与(5’侧翼区或序列”)邻接或者该突变区的紧邻下游并且与其(3’侧翼区或序列”)邻接。如在此使用的一个“连接区”是指在一个突变体(或相应的野生型)IND等位基因中的一个DNA区，其中该突变区与该5’或3’侧翼区彼此相连。因此，一个“跨越该突变区与该5’或3’侧翼区之间的连接区的序列”包括了一个突变序列以及与其邻接的侧翼序列。
所开发的用来鉴定一个特定的突变体IND等位基因或包括一个特定的突变体IND等位基因的植物或植物材料、或包括植物材料(该植物材料包括一个特定的突变体IND等位基因)的产物的工具是基于与相应的野生型IND等位基因的基因组特征相比该特定的突变体IND等位基因的特定的基因组特征，如包括该突变区的基因组区域的一个特异的限制性酶切图谱、分子标记或侧翼区和/或突变区的序列。
一旦对一个特定的突变体IND等位基因进行了测序，可以通过一种分子生物学技术来开发特异地识别一个样品的核酸(DNA或RNA)中的突变体IND等位基因的5’侧翼、3’侧翼和/或突变区之内的一个序列的引物和探针。例如，可以开发一种PCR方法来鉴定生物样品(例如植物、植物材料或包括植物材料的产物的样品)中的突变体IND等位基因。这样一种PCR是基于至少两个特异性“引物”：一个识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区之内的一个序列，并且另一个对应地识别该突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区之内的一个序列；或一个识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区之内的一个序列，并且另一个识别该突变体IND等位基因的突变区之内的一个序列；或一个识别该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区之内的一个序列，并且另一个对应地识别跨越该特定的突变体IND等位基因(如以下进一步描述)的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列。
这些引物优选具有15与35个核苷酸之间的一个序列，该序列在最佳的PCR条件下“特异地识别”该5’或3’侧翼区之内的一个序列、该突变区之内的一个序列、或跨越该特定的突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列，从而从包括该特定的突变体IND等位基因的一个核酸样品扩增一个特定的片段(“突变体IND特定片段”或识别扩增子)。这意味着在最佳的PCR条件下在植物基因组中仅目标突变体IND等位基因、而没有其他序列被扩增。
适合用于本发明的PCR引物可以是以下各项：
-寡核苷酸，长度范围从17nt到约200nt，包括至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的一个核苷酸序列，这些连续核苷酸选自一个特定的突变体IND等位基因的5’或3′侧翼序列或其互补序列(即例如，本发明的突变体IND等位基因中一个或多个核苷酸被缺失、插入或取代的5’或3′侧翼序列，如以上所述的无义、错义或移码突变的5’或3′侧翼序列或以上表格中所示的STOP密码子突变或以上所示的取代突变的5’或3′侧翼序列或其互补序列)(识别5’侧翼序列的引物)；或
-寡核苷酸，长度范围从17nt到约200nt，包括至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的一个核苷酸序列，这些连续核苷酸选自一个特定的突变体IND等位基因的突变区的序列或其互补序列(即例如，在本发明的IND基因中所插入的或取代的核苷酸的序列或其互补序列)(识别突变序列的引物)。
这些引物当然可以长于所提到的17个连续核苷酸，并且可以例如是18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长的或甚至更长的。这些引物可以完全由选自所提到的侧翼序列和突变序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，在这些引物在其5’端的核苷酸序列(即位于3’的17个连续核苷酸之外)是较不关键的。因此，适当时，这些引物的5’序列可以由选自侧翼序列或突变序列的一个核苷酸序列组成，但是可以含有一些(例如1、2、5、10)错配。这些引物的5’序列甚至可以完全由一个与该侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列组成，例如像表示限制性酶识别位点的一个核苷酸序列。这些不相关的序列或具有错配的侧翼DNA序列应该优选地是不长于100、更优选地不长于50或甚至25个核苷酸。
此外，适合的引物可以包含或包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列跨越了位于侧翼序列与突变序列之间的连接区(即例如，对应地位于一个本发明的突变体IND等位基因中一个或多个核苷酸被缺失、插入或取代的5’或3′侧翼序列与该一个或多个核苷酸被插入或取代的序列，或该一个或多个核苷酸被缺失的3’或5′侧翼序列之间的连接区，如位于上述本发明的IND基因中无义、错义或移码突变的一个5’或3′侧翼序列与该无义、错义或移码突变的序列之间的连接区、或对应地位于如以上表格中所示的一个潜在的STOP密码子突变或以上所示的取代突变的一个5’或3′侧翼序列与该潜在的STOP密码子突变或取代突变的序列之间的连接区)，条件是该核苷酸序列不是唯一地从该突变区亦或这些侧翼区上得到的。
对于熟练的技工还应该马上清楚的是适当地选择的PCR引物对还应当不包括彼此互补的序列。
出于本发明的目的，“以SEQ ID No：X表示的一个核苷酸序列的互补序列”是核苷酸序列，该核苷酸序列可以从所表示的核苷酸序列通过将这些核苷酸用它们的互补核苷酸(根据Chargaff’s法则)进行替代并且将序列以5’至3’方向(即以所表示的核苷酸序列的相反的方向)进行读取而得到。
适合用于识别特定的突变体IND等位基因的引物的实例描述于这些实例中。
如在此所使用的，“SEQ ID No.Z从位置X到位置Y的核苷酸序列”表示包括两个核苷酸端点的核苷酸序列。
优选地，所扩增的片段具有50至1000个核苷酸之间的长度，如50至500个核苷酸之间的长度、或100至350个核苷酸之间的长度。这些特异性引物可以具有与该5’或3’侧翼区之内的一个序列、与该突变区之内的一个序列、或与跨越该特定的突变体IND等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的一个序列80％至100％之间一致性的一个序列，条件是这些错配仍然允许用这些引物在最佳的PCR条件下特异地识别该特定的突变体IND等位基因。然而，可允许的错配的范围可以通过实验方法容易地确定并且对于本领域的普通技术人员是已知的。
可以以不同的方法，例如通过在凝胶或毛细管电泳之后进行大小评估或通过基于荧光的检测方法，进行一个“突变体IND特异片段”的检测和/或鉴别，。还可以将这些突变体IND特异片段直接进行测序。用于检测扩增的DNA片段的其他序列特异性方法在本领域中也是已知的。
标准的PCR科学试验计划描述在本领域中，如在“PCR应用手册”(Roche Molecular Biochemicals，2nd Edition，1999)以及其他参考文献中。对于每个特定的突变体IND等位基因，对于PCR最佳的条件(包括特异性引物的序列)详细说明在一个“PCR鉴别科学试验计划”中。然而应当理解的是可能需要将PCR鉴别科学试验计划中的多个参数调整到特定的实验室条件，并且可能进行轻微修改以获得类似的结果。例如，使用一种用于制备DNA的不同方法可能要求调整例如引物、聚合酶、MgCl2浓度或所使用的退火条件的量。类似地，选择其他引物可能要求用于该PCR鉴别科学试验计划的其他最佳条件。然而，这些调整对于本领域的普通技术人员应该是清楚的、并且进一步详细描述于现在的PCR应用手册(如以上所举例的这个)中。
用来鉴别特定的突变体IND等位基因的PCR鉴别科学试验计划的实例描述于这些实例中。
可替代地，可以使用特异性引物来扩增一个突变体IND特异片段，该片段可以被用作一个用于鉴别生物样品中的一个特定的突变体IND等位基因的“特异性探针”。将一个生物样品的核酸与该探针在允许该探针与该核酸中其相应的片段杂交的条件下进行接触，导致形成一个核酸/探针杂交体。可以检测这种杂交体的形成(例如标记该核酸或探针)，由此这种杂交体的形成表明了该特定的突变体IND等位基因的存在。基于用一个特异性探针进行杂交的这类鉴定方法(或者在一个固相载体上或者在溶液中)已经描述于本领域中。该特异性探针优选地是一个序列，该序列在最佳条件下特异地杂交到该特定的突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区之内的和/或突变区(在下文中称为“突变体IND特异区”)之内的一个区域上。优选地，该特异性探针包括10至1000bp之间、50至600bp之间、100至500bp之间、150至350bp之间的一个序列，该序列与一个特异区的核苷酸序列是至少80％、优选地80％至85％之间、更优选地85％至90％之间、尤其优选地90％至95％之间、最优选地95％至100％之间一致的(或互补的)。优选地，该特异性探针将包括与该特定的突变体IND等位基因的一个特异区大约13个至大约100个连续核苷酸一致的(或互补的)一个序列。
适合用于本发明的特异性探针可以是以下各项：
-寡核苷酸，长度范围从13nt到约1000nt，包括至少13个连续核苷酸的一个核苷酸序列，这些连续核苷酸选自一个特定的突变体IND等位基因的5’或3′侧翼序列或其互补序列(即例如，本发明的突变体IND等位基因中一个或多个核苷酸缺失的、插入的或取代的的5’或3′侧翼序列，如以上所述的无义、错义或移码突变的5’或3′侧翼序列或以上表格中所示潜在的STOP密码子突变或以上所示取代突变的5’或3′侧翼序列)，或具有与其至少80％序列一致性的一个序列(识别5’侧翼序列的探针)；或
-寡核苷酸，长度范围从13nt到约1000nt，包括至少13个连续核苷酸的一个核苷酸序列，这些连续核苷酸选自一个特定的突变体IND等位基因的突变序列或其互补序列(即例如，在本发明的IND基因中核苷酸被插入或被取代的序列，或其互补序列)，或具有与其至少80％序列一致性的一个序列(识别突变序列的探针)。
这些探针可以完全由选自所提到的侧翼序列和突变序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，这些探针的核苷酸序列在其5’或3′端是较不关键的。因此，适当时，这些探针的5’或3′序列可以由选自该侧翼序列或突变序列的一个核苷酸序列组成，但是可以由与该侧翼序列或突变序列不相关的一个核苷酸序列组成。这类不相关的序列应该优选地不长于50、更优选地不长于25或甚至不长于20或15个核苷酸。
此外，适合的探针可以包含或包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列跨越了位于侧翼序列与突变序列之间的连接区(即例如，对应地，位于本发明的突变体IND等位基因中一个或多个核苷酸被缺失、插入或取代的一个5’或3′侧翼序列与该一个或多个核苷酸被插入或取代的序列，或该一个或多个核苷酸被缺失的3’或5′侧翼序列之间的连接区，如位于以上所述的本发明的IND基因中无义、错义或移码突变的一个5’或3′侧翼序列与该无义、错义或移码突变的序列之间的连接区、或对应地位于如以上表格中所示的一个潜在的STOP密码子突变或以上所示的取代突变的一个5’或3′侧翼序列与该潜在的STOP密码子或取代突变的序列之间的连接区)，条件是所提到的核苷酸序列不是唯一地从该突变区亦或这些侧翼区上得到的。
适合用于识别特定的突变体IND等位基因的特异性探针的实例描述于这些实例中。
例如通过在凝胶电泳之后进行大小评估或通过基于荧光的检测方法可以以不同的方法进行杂交到一个特异性探针上的一个“突变体IND特异区”的检测和/或鉴别。用于杂交到一个特异性探针上的一个“突变体IND特异区”的检测的其他序列特异性方法在本领域中也是已知的。
可替代地，可以使用其他方法，如“缺失-一个-基因TM”方法(该方法使用PCR进行筛选检测通过快速中子诱变(由Li和Zhang，2002，FunctIntegr Genomics 2：254-258所进行的回顾)生成的缺失突变体)，通过TILLING(基因组中靶向诱导的局部损伤)方法(该方法使用变性高效液相色谱法(DHPLC)来检测碱基对改变通过异源双链体分析(McCallum etal.，2000，Nat Biotech 18：455，以及McCallum et al.2000，Plant Physiol.123，439-442)鉴定了EMS-诱导的点突变)，等，生成和鉴定包括一个或多个突变体ind等位基因的植物或植物部位。如所提到的，TILLING使用高通量筛选突变体(例如使用Cel 1切割突变体-野生型DNA异源双链体并且使用一个测序凝胶系统进行检测)。因此，在此包括了用于鉴定包括一个或多个突变体ind等位基因的植物或植物部分的TILLING的用途、以及用于生成并鉴定此类植物、植物器官、组织或种子的方法。因此在一个实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：将植物种子进行诱变(例如EMS诱变)、将植物个体或DNA进行合并、将感兴趣的一个区域进行PCR扩增、形成异源双链体并且进行高通量检测、鉴定突变体植物、对该突变体PCR产物进行测序。应当理解的是可以相同地使用其他诱变和选择方法来生成此类突变体植物。
除了在IND等位基因中诱导突变，可以通过本领域中已知的方法鉴定天然的(自发的)突变体等位基因。例如可以使用ECOTILLING(Henikoffet al.2004，Plant Physiology 135(2)：630-6)来筛选多个植物或植物部分检测天然突变体ind等位基因的存在。关于以上的诱变技术，优选地对包括一个A和/或一个C基因组的芸薹属种属进行筛选，从而可以随后通过杂交(种间或种内杂交)和选择将所鉴定的ind等位基因引入其他芸薹属种、如欧洲油菜中。在ECOTILLING中，通过上述的TILLING方法对培育品系或相关属种中的天然多态性进行筛选，其中使用植物的个体或集合来PCR扩增该ind目标物、形成异源双链体并且进行高通量分析。在其之后可以选择具有所要求的突变的单个的植物，该植物可以随后用于培育计划中来合并所希望的突变体等位基因。
然后可以对所鉴定的突变体等位基因进行测序并且可以将该序列与野生型等位基因进行对比以鉴定这一个或多个突变。可任选地，可以如以上所示来测试功能性。使用这种方法，可以鉴定多个突变体ind等位基因(以及包括一个或多个这些等位基因的芸薹属植物)。然后可以将所希望的突变体等位基因与所希望的野生型等位基因通过如以下进一步描述的杂交和选择方法进行合并。最后，生成了包括所希望数目的突变体ind和所希望数目的野生型IND等位基因的一个单个植物。
还可以使用适合作为PCR引物或用于检测一个特定的突变体IND等位基因的特异性探针的寡核苷酸来开发用于确定该特定的突变体IND等位基因的接合性状态的方法。
为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以开发一种基于PCR的测定来确定一个突变体和/或相应的野生型IND特异性等位基因的存在。
为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计特异地识别该野生型IND等位基因的两个引物，即它们指向彼此，并且具有位于这些引物之间的突变区。这些引物可以是对应地特异地识别该5’和3’侧翼序列的引物。这组引物允许同时诊断性PCR扩增该突变体、以及相应的野生型IND等位基因。
可替代地，为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计特异地识别该野生型IND等位基因的两个引物，即它们指向彼此，并且它们中的一个特异地识别该突变区。这些引物可以是对应地特异地识别该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区和突变区的序列的引物。这组引物与一个第三引物(该第三引物特异地识别了该突变体IND等位基因中的突变区的序列)一起允许同时诊断性PCR扩增该突变体IND基因、以及该野生型IND基因。
可替代地，为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计特异地识别该野生型IND等位基因的两个引物，即它们指向彼此，并且它们中的一个特异地识别位于该5’或3’侧翼区与突该变区之间的连接区。这些引物可以对应地是特异地识别该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼序列和位于突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区的引物。这组引物与一个第三引物(该第三引物对应地特异地识别了位于该突变体IND等位基因的突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区)一起允许同时诊断性PCR扩增该突变体IND基因、以及该野生型IND基因。
可替代地，可以通过使用替代的引物组来确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，该替代的引物组特异地识别了突变体和野生型IND等位基因。
如果该植物对于该突变体IND基因或相应的野生型IND基因是纯合的，以上所述的诊断性PCR测定将生成一种单个的PCR产物，该产物对于该突变体或野生型IND等位基因是典型的、优选在长度上是典型的。如果该植物对于该突变体IND基因是杂合的，将会出现两种特异性PCR产物，反映突变体和野生型IND等位基因两者的扩增。
可以例如通过在凝胶或毛细管电泳之后进行大小估计(例如对于包括多个插入的或缺失的核苷酸的突变体IND等位基因，(这些插入的或缺失的核苷酸导致了从野生型和突变体IND等位基因所扩增出的片段之间大小不同，从而所述片段可以在一个凝胶上被可见地分离))；通过在凝胶或毛细管电泳之后估计两个不同的片段的存在或不存在，由此任选地该突变体IND等位基因的诊断性PCR扩增可以与该野生型IND等位基因的诊断性PCR扩增分开地进行；通过将所扩增的片段直接进行测序；或通过基于荧光的检测方法，进行该野生型和突变体IND特异性PCR产物的鉴定。
适合用于确定特定的突变体IND等位基因的接合性的引物的实例描述于这些实例中。
可替代地，为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以开发一种基于杂交的测定来确定一个突变体和/或相应的野生型IND特异等位基因的存在：
为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计识别该野生型IND等位基因的两个特异性探针，即每个探针特异地识别该IND野生型等位基因之内的一个序列并且该突变区位于由这些探针所识别的序列之间。这些探针可以是对应地特异地识别该5’和3’侧翼序列的探针。优选地，使用这些探针中的一个或两个允许同时诊断性杂交该突变体、以及相应的野生型IND等位基因。
可替代地，为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计识别该野生型IND等位基因的两个特异性探针，即它们中的一个特异地识别该IND野生型等位基因之内的一个序列(野生型等位基因位于该该突变区上游或下游、优选地位于该突变区的上游)，并且它们中的一个特异地识别该突变区。这些探针可以是对应地特异地识别该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)和突变区的序列的探针。优选地这些探针中的一个或两个任选地与一个第三探针(该第三探针特异地识别该突变体IND等位基因中的突变区的序列)一起使用允许诊断性杂交该突变体以及该野生型IND基因。
可替代地，为了确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，可以以这样一种方式设计识别该野生型IND等位基因的一个特异性探针，即该探针特异地识别位于该野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区。可任选地，该探针与一个第二探针(该第二探针特异地识别位于该突变体IND等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区)一起允许诊断性杂交该突变体以及该野生型IND基因。
可替代地，可以通过使用替代组的探针来确定一个特定的突变体IND等位基因的接合性状态，该替代组的探针特异地识别突变体和野生型IND等位基因。
如果该植物对于该突变体IND基因或相应的野生型IND基因是纯合的，以上所述的诊断性杂交测定将生成一种单个的特定的杂交产物(如一个或多个杂交DNA(限制性)片段)，该产物对于该突变体或野生型IND等位基因其中一项是典型的、优选在长度上是典型的。如果该植物对于该突变体IND基因是杂合的，将会出现两种特定的杂交产物，反映该突变体和野生型IND等位基因的两个杂交。
可以例如通过在凝胶或毛细管电泳之后对大小进行估计(例如对于包括多个插入的或缺失的核苷酸的突变体IND等位基因(这些插入的或缺失的核苷酸导致了来自野生型和突变体IND等位基因的杂交DNA(限制性)片段之间大小不同，从而所述片段可以在一个凝胶上被可见地分离))；通过在凝胶或毛细管电泳之后估计两个不同的特异性杂交产物的存在或不存在，由此任选地该突变体IND等位基因的诊断性杂交可以与该野生型IND等位基因的诊断性杂交分开地进行；通过将杂交DNA(限制性)片段直接进行测序；或通过基于荧光的检测方法，进行该野生型和突变体IND特异性杂交产物的鉴定。
适合用于确定特定的突变体IND等位基因的接合性的探针的实例描述于这些实例中。
此外，还可以使用在此提供的特定的突变体IND等位基因特异性序列信息来开发对于一个特定的突变体IND等位基因特异性的检测方法，该方法不同于基于PCR或基于杂交的扩增方法。这些替代的检测方法包括：基于侵入性酶切特定的核酸结构的线性信号扩增检测方法，也称为InvaderTM技术(如例如美国专利5,985,557“Invasive Cleavage of Nucleic Acids”、6,001,567“Detection of Nucleic Acid sequences by Invader DirectedCleavage”中所描述，通过引用结合在此)，基于RT-PCR的检测方法，如Taqman，或其他检测方法，如SNPlex、单个碱基延长(SBE)，等。简言之，在InvaderTM技术中，例如可以将目标突变序列与一个标记的第一核酸寡核苷酸(该寡核苷酸包括该突变序列或跨越位于该5′侧翼区与该突变区之间的连接区的一个序列的核苷酸序列)进行杂交并且与一个第二核酸寡核苷酸(该寡核苷酸包括在该突变序列的紧邻下游并且邻近该突变序列的3′侧翼序列)进行杂交，其中该第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过这种杂交生成的双链体或三链体结构允许用一种酶进行选择性探针切割，留下目标序列保持完整。潜在地通过一个中间步骤随后检测所切割的标记的探针，导致了进一步的信号扩增。
如在此使用的，一个“试剂盒”是指用于实现本发明的方法的目的(更具体地，鉴定生物样品中的一个特定的突变体IND等位基因或确定包括一个特定的突变体IND等位基因的植物材料的接合性状态)的一组试剂。更具体地，如上所述，本发明的试剂盒的一个优选实施方案包括用于鉴定一个特定的突变体IND等位基因的至少两个特异性引物或用于确定接合性状态的至少两个或三个特异性引物。可任选地，该试剂盒可以进一步包括在此所述的PCR鉴别科学试验计划中的任何其他试剂。可替代地，根据本发明的另一个实施方案，如以上所述，该试剂盒可以包括用于鉴定一个特定的突变体IND等位基因的至少一个特异性探针(该探针特异地与生物样品的核酸进行杂交以鉴定其中的一个特定突变体IND等位基因的存在)或用于确定接合性状态的至少两个或三个特异性探针。可任选地，该试剂盒可以进一步包括使用该特异性探针用于来鉴定生物样品中的一个特定的突变体IND等位基因的任何其他试剂(例如但不限于杂交缓冲剂、标记)。
出于质量控制(例如种子批次的纯度)、检测一个特定的突变体IND等位基因在植物材料或包括或得自植物材料的材料(例如但不限于食物或饲料产品)中存在或不存在的目的，可以使用本发明的试剂盒，并且其组分可以被特异性地调节。
如在此使用的术语“引物”包括能够在一个依赖模板的过程(如PCR)中启动一个新的核酸的合成的任何核酸。典型地，引物是从10到30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以采用更长的序列。引物可以以双链股形式提供，虽然单链形式是优选的。探针可以被用作引物，但是探针被设计用来结合到目标DNA或RNA上并且不需要用在一个扩增过程中。
当提及特异性引物时，如在此使用的术语“识别”是指以下事实，即这些特异性探针在方法中列出的条件(如PCR鉴别科学试验计划的条件)下特异地杂交到一个特定的突变体IND等位基因中的一个核酸序列上，由此通过阳性和阴性对照的存在来确定该特异性。
当提及特异性探针时，如在此使用的术语“杂交”是指以下事实，即该探针在标准的严格条件下结合到一个特定的突变体IND等位基因的核酸序列中的一个特定区域上。如在此使用的标准的严格条件是指在此所述的用于杂交的条件或是指如由Sambrook et al.，1989(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，NY)所述的常规的杂交条件，例如它可以包括以下步骤：1)将植物基因组DNA片段或BAC文库DNA固定到一个滤纸上，2)将该滤纸在65℃下在6X SSC、5X Denhardt’s试剂、0.5％SDS和20μg/ml变性的载体DNA中预杂交1到2小时，3)加入已经被标记的杂交探针，4)孵化16到24小时，5)将该滤纸在68℃下在6X SSC、0.1％SDS中洗涤一次持续30分钟，6)将滤纸在68℃下在2X SSC、0.1％SDS中洗涤三次(两次在30ml中持续30分钟并且一次在500ml中持续10分钟)，并且7)将该滤纸在-70℃下暴露于X射线4到48小时。
如在此使用的，一个“生物样品”是一株植物、植物材料或包括植物材料的产品的一个样品。术语“植物”旨在包括植物组织(处于任何成熟度阶段)、以及从任何此类植物取得或得到的任何细胞、组织、或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如在此使用的“植物材料”是指从一株植物获得或得到的材料。包括植物材料的产品涉及食品、饲料、或使用植物材料生产的或可以被植物材料污染的其他产品。应当理解的是在本发明的上下文中对此类生物样品进行测试检测对于一个特定的突变体IND等位基因特异性的核酸的存在，意味着样品中核酸的存在。因此，在此提及的用于鉴定生物样品中一个特定的突变体IND等位基因的这些方法涉及在生物样品中鉴定核酸，该核酸包括该特定的突变体IND等位基因。
本发明还涉及了将多个特定的IND等位基因结合入一株植物中、涉及将一个或多个特定的突变体IND等位基因从一株植物转移到另一株植物中、涉及包括一个或多个特定的突变体IND等位基因的植物、从这些植物得到的子代、并且涉及从这些植物得到的植物细胞、植物部分、以及植物种子。
在一个实施方案中，提供了用于将一个适合的数目的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因和/或不同类型的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因结合入一个单个的裂开性种子植物中从而改变该植物的果实开裂特性、特别是从而减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获之后，而同时维持一个农艺学相关的荚果脱粒能力的一种方法。
在一个方面，提供了用于改变包括至少两个IND基因的一个芸薹属植物的果实开裂特性、特别是用于减少种子落粒、或将种子落粒延迟到收获之后，而同时维持一个农艺学相关的荚果脱粒能力的一种方法，该方法包括以下步骤：
-如上所述，生成和/或选择包括至少两个IND基因的一个芸薹属植物，其中该至少两个IND基因的至少两个等位基因是部分敲除的ind等位基因，
-选择具有改变的果实开裂特性的一株植物，特别是其中将种子落粒减少或延迟到收获之后而荚果同时维持一种农艺学相关的脱粒能力的一株植物。
在这个方面的一个实施方案中，包括至少两个IND基因的芸薹属植物是包括一个IND-A1和一个IND-C1基因的一个欧洲油菜植物。在这个实施方案的一个具体方面，该至少两个部分敲除的ind等位基因是IND-C1基因的部分敲除的ind等位基因。
在另一个方面，如上所述，该方法进一步包括生成和/或选择包括至少两个IND基因的一个芸薹属植物的步骤，其中该至少两个IND基因的至少两个另外的等位基因是完全敲除的ind等位基因。在一个实施方案中，包括至少两个IND基因的芸薹属植物是包括一个IND-A1和一个IND-C1基因的一个欧洲油菜植物。在这个实施方案的一个具体方面，该至少两个部分敲除的ind等位基因是IND-A1基因的部分敲除的ind等位基因并且该至少两个完全敲除的ind等位基因是IND-C1基因的完全敲除的ind等位基因。
在本发明的另一个实施方案中，用于制造包括至少两个IND基因的一种杂交体芸薹属作物植物或种子、特别是一个杂交体欧洲油菜植物或种子的一种方法，其中该植物或从该种子生长的植物的果实开裂特性被改变，特别是其中将种子落粒减少或延迟到收获之后而荚果同时维持一种农艺学相关的脱粒能力，该方法包括以下步骤：
-如上所述，生成和/或鉴定包括处于纯合状态的一个第一部分敲除的ind等位基因的一个第一植物以及包括处于纯合状态的一个第二部分敲除突的ind等位基因的一个第二植物，
-将该第一与该第二植物进行杂交并且从包括该至少两个IND基因的两个部分敲除的ind等位基因的杂交物中收集F1杂交种子。
在本发明的一个进一步的实施方案中，如上所述，该第一植物额外地包括处于纯合状态的一个第一完全敲除的ind等位基因并且该第二植物额外地包括处于纯合状态的一个第二完全敲除的ind等位基因，并且收集了包括该至少两个IND基因的两个部分敲除的ind等位基因和两个完全敲除的ind等位基因的F1杂交种子。
使用包括处于纯合状态的一个部分敲除的ind等位基因和/或一个完全敲除的ind等位基因的亲本植物来生成杂交种子(从该种子可以生长出植物，这些植物显示出减小的或延迟的种子落粒而同时维持一个农艺学相关的荚果脱粒能力)的可能性提供了超过使用包括处于纯合状态的两个完全敲除的ind等位基因的一个亲本植物以及包括一个完全敲除的ind等位基因状态的一个亲本植物(如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述)的优点，因为这两个亲本植物都生成了显示一种农艺学相关的脱粒能力的荚果，而包括处于纯合状态的两个完全敲除的ind等位基因的亲本植物的荚果生成了管样的荚果，从这种荚果中难以收获种子。
在本发明的一个方面，该第一和第二部分敲除的ind等位基因是相同的，从而这些F1杂交种子对于一个部分敲除的ind等位基因是纯合的。在本发明的另一个方面，该第一和第二完全敲除的ind等位基因是相同的，从而这些F1杂交种子对于一个完全敲除的ind等位基因是纯合的。
根据标准培育技术可以根据本发明将完全敲除ind等位基因(即其功能性表达被完全消除的IND等位基因)(如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的那些)、和/或部分敲除的ind等位基因(即其功能性表达被部分消除的IND等位基因)进行组合。
例如通过以下各项可以将部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因结合入一个单个的裂开性种子植物中：
(a)生成和/或鉴定两个或多个植物，它们各自包括一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因(对于部分敲除的ind等位基因如以上所述，并且对于完全敲除的ind等位基因如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述)，
(b)如以上所述，将包括一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个第一植物与包括一个或多个其他选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个第二植物进行杂交，从这些杂交物中收集F1种子，并且任选地鉴定包括来自该第一植物的一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因与来自该第二植物的一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个F1植物，
(c)可任选地，重复步骤(b)直到获得包括所有选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个F1植物，
(d)可任选地，
-通过确定这些突变体IND等位基因的接合性状态鉴定一个F1植物，该F1植物对于一个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的或杂合的(对于部分敲除的ind等位基因如以上所述，并且对于完全敲除的ind等位基因如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP07023052的优先权)中所述)，或
-通过执行以下步骤中的一项，生成对于一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的植物：
-如以上所述，从包括该一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的F1植物的处理过的小胞子或花粉细胞中提取双单倍体植物，
-如以上所述，将包括该一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的F1植物自交一个或多个世代(y)，从这些自交物中收集F1Sy种子，并且鉴定这些F1Sy植物，这些F1Sy植物对于该一个或多个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的。
可以例如通过以下各项将部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因从一个裂开性种子植物转移到另一个裂开性种子植物中：
(a)如以上所述，生成和/或鉴定包括一个或多个所选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个第一植物，或如以上所述(其中该第一植物对于该一个或多个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的或杂合的)，通过将一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因结合入一株植物中来生成该第一植物，
(b)将包括该一个或多个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的该第一植物与不包括该一个或多个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个第二植物进行杂交，从该杂交物中收集F1种子(其中如果该第一植物对于该部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的，这些种子对于一个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是杂合的，并且其中如果该第一植物对于该部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是杂合的，对于一个部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因，一半种子是杂合的并且一半种子是不成对的(即不包括))，并且如以上所述任选地鉴定包括一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的一个F1植物，
(c)将包括一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的F1植物与不包括该一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的该第二植物回交一个或多个世代(x)，从这些杂交物中收集BCx种子，并且如以上所述在每个世代中鉴定包括该一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的BCx植物，
(d)可任选地，通过执行以下步骤中的一项生成对于该一个或多个选择的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的BCx植物：
-如以上所述，从包括该一个或多个所希望的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的BCx植物的处理过的小胞子或花粉细胞中提取双单倍体植物，
-如以上所述，将包括该一个或多个所希望的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因的BCx植物自交一个或多个世代(y)，从这些自交物中收集BCx Sy种子，并且鉴定这些BCx Sy植物，这些BCxSy植物对于该一个或多个所希望的部分敲除的ind等位基因和/或完全敲除的ind等位基因是纯合的。
该第一和第二裂开性种子植物可以是十字花科植物、特别是芸薹属植物、尤其是欧洲油菜植物或来自另一个芸薹属作物种属的植物。可替代地，该第一植物可以是一个十字花科植物、特别是一个芸薹属植物、尤其是一个欧洲油菜植物或来自另一个芸薹属作物种属的一株植物，并且该第二植物可以是来自一个十字花科培育品系、特别是来自一个芸薹属培育品系、尤其是来自一个欧洲油菜培育品系或来自另一个芸薹属作物种属的一个培育品系的一株植物。如在此使用的“育种品系”优选是通过一个优选的基因型和/或表型而区别于其他植物品系的一个纯合的植物品系，使用该选的基因型和/或表型产生杂交后代。
序列
SEQ ID NO：1：IND-A1基因的编码DNA，该基因编码来自欧洲油菜的一个野生型IND-A1蛋白。
SEQ ID NO：2：由SEQ ID NO：1编码的野生型IND-A1蛋白。
SEQ ID NO：3：IND-C1基因的编码DNA，该基因编码来自欧洲油菜的一个野生型IND-C1蛋白。
SEQ ID NO：4：由SEQ ID NO：3编码的野生型IND-C1蛋白。
SEQ ID NO：5：IND-A1基因的基因组DNA，该基因编码来自欧洲油菜的一个野生型IND-A1蛋白。
SEQ ID NO：6：由SEQ ID NO：5编码的野生型IND-A1蛋白。
SEQ ID NO：7：IND-C1基因的基因组DNA，该基因编码来自欧洲油菜的一个野生型IND-C1蛋白。
SEQ ID NO：8：由SEQ ID NO：7编码的野生型IND-C1蛋白。
SEQ ID NO：9：拟南芥属IND1基因的编码DNA。
SEQ ID NO：10：由SEQ ID NO：9编码的拟南芥属IND1蛋白。
SEQ ID NO：11：用于检测IND-A1-EMS06和IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：12：用于检测IND-A1-EMS06的寡核苷酸
SEQ ID NO：13：用于检测IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：14：用于检测IND-A1-EMS09和IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：15：用于检测IND-A1-EMS09的寡核苷酸
SEQ ID NO：16：用于检测IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：17：用于检测IND-A1-EMS13和IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：18：用于检测IND-A1-EMS13的寡核苷酸
SEQ ID NO：19：用于检测IND-A1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：20：用于检测IND-C1-EMS04和IND-C1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：21：用于检测IND-C1-EMS04的寡核苷酸
SEQ ID NO：22：用于检测IND-C1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：23：用于检测IND-C1-EMS08和IND-C1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：24：用于检测IND-C1-EMS08的寡核苷酸
SEQ ID NO：25：用于检测IND-C1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：26：用于检测IND-C1-EMS09和IND-C1-WT的寡核苷酸
SEQ ID NO：27：用于检测IND-C1-EMS09的寡核苷酸
SEQ ID NO：28：用于检测IND-C1-WT的寡核苷酸
除非在实例中另外说明，所有重组DNA技术是按照如Sambrook andRussell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，in Volumes 1and 2of Ausubelet al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USAand in Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)中所描述的标准分子生物学技术来实现的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于Plant MolecularBiologyLabfax(1993)by R.D.D.Croy，jointly published by BIOS ScientificPublications Ltd(UK)and Blackwell Scientific Publications，UK中。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中，以及在McPherson at al.(2000)PCR-Basics：From Backgroun d toBench，First Edition，Springer Verlag，Germany中找到。用于AFLP分析的标准程序描述于Vos等人(1995，NAR 23：4407-4414)中以及公开的EP专利申请EP 534858中。
实例
实例1-部分敲除的突变体IND等位基因(ind)的生成和分离
如下生成并且鉴定序列表中SEQ IN NO：1或3以及5或7中所述的IND基因中的多个突变：
-将来自一个原种春油菜籽油菜育种品系(M0种子)的30,000粒种子在湿滤纸上在去离子水或者蒸馏水中预先吸收水分两小时。将这些种子的一半暴露于0.8％EMS中并且将另一半暴露于1％EMS(Sigma：M0880)中并且孵化4小时。
-将这些诱变的种子(M1种子)冲洗3次并且在一个通风橱中干燥过夜。将30,000个M1植物生长于土壤中并且进行自交从而生成M2种子。对于每个单独的M1植物收获M2种子。
-将从不同的M1植物得到的两倍的4800个M2植物进行生长并且根据CTAB方法(Doyle and Doyle，1987，Phytochemistry Bulletin 19：11-15)从每个单独的M2植物的叶子样品进行DNA样品制备。
-通过使用标准测序技术(Agowa)直接测序并且使用NovoSNP软件(VIB Antwerp)分析这些序列检测点突变的存在，对这些DNA样品进行筛选检测这些IND基因中点突变的存在，这些点突变是由于取代了这些IND蛋白中的氨基酸，具体地这些IND蛋白的bHLH结构域中的氨基酸所引起的。
-因此鉴定了以上表3a以及b中所指示的部分敲除的突变体IND等位基因(ind)。
总之，以上的实例显示了部分敲除的突变体IND等位基因可以如何被生成并且分离。并且，如以下实例中所述，可以使用包括这类突变体等位基因的植物材料来将选定的突变体IND等位基因结合入一株植物中。
实例2-包括一个部分敲除的突变体芸薹属IND等位基因的一种芸薹属植物的鉴定
如下鉴定实例1中所鉴定的IND基因中包括多个突变的芸薹属植物：
-对于在一个M2植物的DNA样品中所鉴定的每个突变体IND基因，将从与包括该IND突变M2植物相同的M1植物得到的至少50株M2植物进行生长并且从每个单独的M2植物的叶子样品进行DNA样品制备。
-如以上实例1中所述，对这些DNA样品进行筛选检测所鉴定的IND点突变的存在。
-将包括相同突变的杂合的以及纯合的(基于电泳图进行确定)M2植物进行自交并且收获M3种子。
实例3-包括一个部分敲除的突变体芸薹属IND基因和/或完全敲除 的突变体芸薹属IND基因的芸薹属植物的果实开裂特性的分析
为了确定芸薹属植物中部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因的存在与这些芸薹属植物的果实开裂特性之间的相关性，如下述在温室中以及在大田中对单独地以纯合体形式包括一个部分敲除的突变体IND基因或者以纯合体形式包括一个部分敲除的突变体IND基因和一个完全敲除的突变体IND基因两者的欧洲油菜植物的果实开裂特性进行分析并且与如WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的包括2至4个完全敲除的ind油菜籽油菜等位基因的欧洲油菜植物的果实开裂特性进行比较。
-为了检查瓣边缘和种子荚果开裂特性是否以及如何受部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因的存在的影响，使用如下宏观试验将ind果实与野生型果实进行比较。
(a)用肉眼从总体上检查种子荚果和植物以确定由不同的部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因的存在所引起的这些荚果和植物的表型上的差异。确定这些荚果的表型：当荚果完全生长并且被填满时，正好在黄化之前，在两个瓣不再接触(在荚果的远端)的区域上对5个随机的荚果(来自不同的植物，如果一个品系多株植物可供使用)的描绘瓣以及喙的区域的锐度进行评估并且给予一个从0至10或者从1至5的分数。对应地，0或1表示一个清晰的凹陷以及分隔瓣和喙的非常尖锐的区域；对应地，1至3或2表示一些凹陷以及尽管更模糊，但将瓣从喙中分隔出来的清晰的区域；对应地，4至6或3表示仍然可以当做两个不同的组织被很好地观察到瓣和喙，但是它们之间有一个非常平滑的过渡；对应地，7至9或4表示几乎不能当做两个不同的组织被观察到瓣和喙；对应地，10或5表示瓣和喙之间一个完全地平滑的过渡，两种组织类型之间没有任何清晰的区别，即在这些荚果的远端处瓣和喙之间的凹陷越小，分数越高。对应地，分数0或1(瓣和喙之间急剧的凹陷)相应于这些荚果的野生型表型，更确切地说是这些荚果的一种荚果落粒敏感型表型；对应地，分数1至9或2至4(瓣和喙之间更平缓的过渡)相应于这些荚果的一种荚果抗落粒性表型，其中种子落粒被显著地减少或延迟，而这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力被维持，从而这些荚果仍然可以通过施加有限的物理力沿着开裂区被打开；并且对应地，分数10或5(瓣和喙之间没有凹陷)相应于这些荚果的一种荚果抗落粒性表型，其中种子落粒被减少或延迟到一个不再允许这些荚果的一种农艺学相关的脱粒能力的程度，从而这些荚果不能通过施加有限的物理力沿着开裂区被打开。
(b)用于确定由不同的部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因的存在所引起的荚果抗落粒性增加的手动冲击试验(MIT)。在这些荚果上通过手动施加扭力通过确定打开封闭的成熟的荚果所需要的物理力以半定量的方式将以单独地纯合体形态包括一个部分敲除的突变体IND基因或者以纯合体形态包括一个部分敲除的突变体IND基因和一个完全敲除的突变体IND基因两者的欧洲油菜品系的荚果抗落粒性的水平与包括相应的野生型IND等位基因的芸薹属品系的荚果抗落粒性的水平进行比较。这些荚果的荚果抗落粒性根据这个物理力被给予一个从1至5的分数：1表示在最轻微的扭力下沿开裂区完全打开的荚果，2至4表示仅在开裂区的底部打开并且需要更强的扭力来完全打开的荚果，并且5表示只能被压碎并且沿开裂区不能打开的荚果。
(c)用于确定由不同的部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因的存在所引起的荚果抗落粒性增加的随机冲击试验(RIT)。根据Bruce et al.(2002，上述)所述通过确定来自两个品系的荚果样品的半衰期以定量的方式将以纯合体形态单独地包括一个部分敲除的突变体IND基因或者以纯合体形态包括一个部分敲除的突变体IND基因和一个完全敲除的突变体IND基因两者的欧洲油菜品系的荚果抗落粒性的水平与包括相应的野生型IND等位基因的芸薹属品系的荚果抗落粒性的水平进行比较。更确切地说，将来自各品系的20个完整的成熟的荚果的两个重复样品进行一个RIT。将20个荚果和12.5mm直径的六个钢球一起置于一个轴线垂直的直径20cm的圆柱形容器中。然后将该容器进行频率为4.98Hz的简谐运动以及水平面上冲程51mm的简谐运动。将这些荚果(测试前检查过坚固性)进行震动持续累积时间为10、20、40以及80秒(如果多于50％的荚果仍然完整)。每个周期之后将滚筒打开并且对封闭的荚果的数量进行计数。如果两个瓣的开裂区仍然是封闭的，对这些荚果进行检查并且归类为“封闭的”。因此，如果这些瓣的一个或两个是分离的，将这些荚果归类为“打开的”，从而将种子释放。如果这些荚果的大多数被破碎或者损坏但是没有打开开裂区，该样品被标记为“不可数的”(在表5b中用＊标示)。为了给每个点相等的权重，通过加1和取log10将数据均匀间隔于独立变量、时间中。打开的荚果的百分比p通过对数转换进行转换，即logit p＝loge(p/100-p)。然后对转换的时间以及百分比数据拟合一个线性的模型并且使用它来估计该半衰期。
(d)用于确定植物中荚果抗落粒性、脱粒能力以及产量与某些突变体IND等位基因的存在之间的关系的大田试验。以半定量的方式通过确定并且比较种子落粒(SHAT)的水平、联合收割机收获能力(CHA1)以及脱粒能力(CHA2)以及以定量的方式通过确定并且比较联合收割后每块地的种子产量(YLDP)以及种植ind植物的地块与种植野生型植物的地块之间的大田中秸秆脱粒后的种子产量(YLDS)，将包括突变体IND等位基因的芸薹属品系的荚果抗落粒性的水平、脱粒能力以及产量与包括相应的野生型IND等位基因的芸薹属品系的荚果抗落粒性的水平、落粒能力以及产量进行比较。这些地块被给予一个1至9的分数用于表示收获之前这块地上种子落粒的水平：从分数1(表示实际上这块地上的所有植物在收获前都落粒)到分数9(表示实际上这块地上没有植物在收获前落粒)。这些地块被给予一个1至5的分数用于表示这块地上联合收割机收获能力的水平：分数1、到3或者到5对应地用于表示用联合收割机收获这块地是困难的、到可行的、或者到容易的。这些地块被给予一个1至5的分数用于表示这块地的脱粒能力的水平分数1、到3或者到5对应地表示在联合收割机收获后手工收获秸秆中剩余的种子是困难的、到可行的、或者到容易的。通过用联合收割机收获每块地的种子并且将这些种子称重来确定联合收割后每块地的种子产量(YLDP；用每块地克数表达)，并且通过手工收获用联合收割机收获种子后在秸秆中剩余的种子来确定秸秆脱粒后的种子产量(YLDS；用秸秆的重量％表达)。
-为了更严密地检查种子荚果的瓣边缘处的细胞是否以及如何受部分敲除的突变体IND基因和/或完全敲除的突变体IND基因存在的影响，通过微观评估种子荚果将ind果实的切片与野生型果实的切片进行比较：
-外植体：从生长在温室中的植物(每个基因型三个荚果)收获从相似发育阶段(在开花后大约35天(DAA)，一个发育阶段，该发育阶段紧密地相应于可见的果皮黄化的发生)以及相似大小的荚果的中心以及远端取得的大约3mm的外植体。从荚果上切开开裂区。
-固定：在含有10％福尔马林和0.25％戊二醛，pH7的100mM磷酸钾缓冲液中持续共4小时进行固定。1和2小时后进行真空渗入持续15分钟。每次真空渗入后将固定剂进行更新。
-脱水：用100mM磷酸钾缓冲液pH7将该样品冲洗2次每次30分钟。用工业乙醇(用0.85％NaCl水溶液稀释进行稀释)进行脱水：室温下50％乙醇中60分钟，70％乙醇中90分钟，80％乙醇中90分钟，90％乙醇中90分钟，95％乙醇中90分钟，100％乙醇中90分钟
-包埋：使用Leica 7022-31731Historesin或者Kulzer Histo-Technik7100(Heraeus)包埋试剂盒进行包埋，这些试剂盒是三种组分树脂(一种碱性树脂，一种活化剂以及一种硬化剂)试剂盒。如下以生产厂家所建议的比例使用这三种组分：将样品在50％乙醇/50％碱性树脂中孵化4小时，在30％乙醇/70％碱性树脂中过夜(任选：4℃)，在100％碱性树脂中2至4小时，更新碱性树脂后在100％碱性树脂中一天并且真空渗入20分钟(任选：4℃)后，在渗透介质中真空渗入20分钟后在碱性树脂+活化剂(1％)(“渗透介质”)中持续一天。用碱性树脂+活化剂(1％)+硬化剂(1ml，15ml中)(“包埋介质”)洗涤样品。在平的包埋模子(具有大约300μl腔体的AGAR平的包埋模子G3531：14mm长×6mm宽×4mm深)中进行包埋加入100至125μl包埋介质/腔体，将包埋介质在55℃下聚合大约一小时，将组织置于该聚合的包埋介质上(1个外植体/腔体)，用包埋介质装满这些腔体，将包埋介质在55℃下聚合3至5小时，将模子冷却下来，从模子中取出塑胶块并且在室温下保存在密封的容器(例如eppendorf管)中。
-切片：将这些塑胶块用其平的侧面粘在一个1cm3的perpex块上并且环绕该样品进行方方正正地裁剪。在切片机上用ralph玻璃刀(在Reichert-Jung的组织制刀机的-1位置上用6mm厚的玻璃棒在大约6的切角下进行制备)切成4μm切片(每个基因型3至4个外植体，每个外植体大约25个切片)。将这些切片附连在玻璃载玻片上，这些载玻片已用Vectabond(Vector实验室)处理过。
-木质素的证明：使用装备有荧光(带有Zeiss滤片组02)的显微镜检查固定在Eukitt中的未染色的切片。木质素发清晰的浅蓝色荧光。
-组织学评估：通过使用DIC-Normaski或者自身荧光(带有Zeiss滤片组18-激发BP390-420；发射LP450)可以看见未染色的切片。
植物材料：
一种植物品系的子代，包括IND-A1基因中一个完全敲除的突变(表示为ind-a1F)，特别地是WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的ind-a1-EMS01等位基因(在表5中表示为ind-a1-01)，以及IND-C1基因中一个部分敲除的突变(表示为ind-c1P)，特别地是表3b中所表示的ind-c1-EMS04、ind-c1-EMS08以及ind-c1-EMS09等位基因(在表5中表示为ind-c1-04、ind-c1-08以及ind-c1-09)，具有基因型ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P(即纯合的双突变体植物)，IND-A1/IND-A1、ind-c1P/ind-c1P(即纯合的单突变体植物)，以及IND-A1/IND-A1、IND-C1/IND-C1(即野生型植物)。
一种植物品系的子代，包括IND-A1基因中一个部分敲除的突变(表示为ind-a1P)，特别地是表3a中所表示的ind-a1-EMS06、ind-a1-EMS09以及ind-a1-EMS13等位基因(在表5中表示为ind-a1-06、ind-a1-09以及ind-a1-13)，以及IND-C1基因中一个完全敲除的突变(表示为ind-c1F)，特别地是WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的ind-c1-EMS01等位基因以及ind-c1-EMS03等位基因(在表5中表示为ind-c1-01以及ind-c1-03)，具有基因型ind-a1P/ind-a1P、ind-c1F/ind-c1F(即纯合的双突变体植物)，IND-A1/IND-A1、ind-c1F/ind-c1F(即纯合的单突变体植物)，以及IND-A1/IND-A1、IND-C1/IND-C1(即野生型植物)。
宏观评估：
a)用肉眼检查种子荚果和植物。
-来自具有基因型ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P或者ind-a1P/ind-a1P、ind-c1F/ind-c1F的纯合的双突变体IND亲缘性植物的荚果表现出一种类似于来自某些植物的荚果的表型，这些植物包括WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的处于纯合态的一个完全敲除的ind等位基因以及处于杂合态的一个完全敲除的ind等位基因(基因型为：ind-a1F/ind-a1F、IND-C1/ind-c1F或者IND-A1/ind-a1F、ind-c1F/ind-c1F，其中ind-a1F是一个完全敲除的ind-a1等位基因，特别地是WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的ind-a1-EMS01或者ind-a1-EMS05等位基因，并且其中ind-c1F是一个完全敲除的ind-c1等位基因，特别地是WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的ind-c1-EMS01或者ind-c1-EMS03等位基因。更确切地说，总体上这些突变体IND亲缘性植物的荚果的瓣边缘比在WO09/068313(要求欧洲专利申请EP 07023052的优先权)中所述的纯合的双完全敲除的突变体IND亲缘性植物中更轮廓分明(与来自野生型IND亲缘性植物的荚果相比，后者表现出合适的瓣边缘轮廓的缺失，在果实的近端和远端这两端特别明显)，但是在野生型亲缘性植物中这些荚果的远端处瓣与喙之间急剧的凹陷在这些突变体植物中仍然像在这些纯合的双完全敲除的ind亲缘性植物中一样是大量地缺少的，后者也表现出瓣和喙组织之间一个更平缓的过渡(也参见表5a中对温室生长的植物以及表5b中对大田生长的植物的视觉评分)。
-来自纯合的单突变体IND亲缘性植物的荚果(基因型：IND-A1/IND-A1、in d-c1P/in d-c1P或者in d-a1P/in d-a1P、IND-C1/IND-C1)表现出与来自野生型IND亲缘性植物的荚果相似的一种荚果形态，除了来自具有基因型IND-A1-EMS01/IND-A1-EMS01、ind-c1-EMS09/ind-c1-EMS09的纯合的单突变体IND亲缘性植物的荚果，它们表现出与来自具有基因型ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P或者ind-a1P/ind-a1P、ind-c1F/ind-c1F的纯合的双突变体IND亲缘性植物的荚果相似的一种改变的荚果形态(也参见表5a中对温室生长的植见，以及表5b中对大田生长的植物的视觉评分)。进一步观察到植物(基因型：IND-A1/IND-A1、IND-C1/ind-c1-EMS09)中处于杂合态的ind-c1-EMS09等位基因的存在足以引起与来自具有基因型ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P或者ind-a1P/ind-a1P、ind-c1F/ind-c1F的纯合的双突变体IND亲缘性植物的荚果相似的一种改变的荚果形态。据认为包括碱性DNA结合域的一个保守氨基酸中的一个取代突变的ind-c1-EMS09等位基因可以产生一个显性阴性IND蛋白，该蛋白仍然能够形成二聚物，但是不能结合到该一个或多个调节基因的bHLH结合位点上。
b)随机冲击试验：
-表5显示了总体上来自包括处于纯合态的一个完全敲除的ind-c1等位基因以及处于纯合态的一个部分敲除的ind-a1等位基因的植物的荚果的LD50值大于来自包括处于纯合态的一个完全敲除的ind-a1等位基因以及处于纯合态的一个部分敲除的ind-c1等位基因的植物的荚果的LD50值，表明IND-C1等位基因中的突变可能比IND-A1等位基因中的突变在荚果抗落粒性方面具有更强的影响。
表5a
表5b
＊：不可数的
c)田间试验
表5c显示了如所示的如上所述对于种植ind植物以及野生型植物的田间地块所确定的种子落粒(SHAT)、联合收割机收获能力(CHA1)、脱粒能力(CHA2)、联合收割后每块地的种子产量(YLDP)以及秸秆脱粒后的种子产量(YLDS)的水平。YieldWTSeg％值以一个分离群体中野生型分离子的百分比表示YLDP。
表5c
微观评估：
-生长在温室条件下的来自具有基因型ind-a1F/ind-a1F、ind-c1P/ind-c1P或者ind-a1P/ind-a1P、ind-c1F/ind-c1F的纯合的双突变体IND亲缘性植物的荚果以及来自具有基因型IND-A1-EMS01/IND-A1-EMS01、ind-c1-EMS09/ind-c1-EMS09的纯合的单突变体IND亲缘性植物的荚果在其远端表现出遍及全部开裂区的木质化以及属于该开裂区的细胞与邻近的细胞类型的较差的区别，例如维管组织细胞以及通常在内荚果壁处发现的细胞的木质化层(即末端细胞)。在荚果的中心，木质化没有遍及全部开裂区发生，但是这些荚果反而在内荚果壁附连到隔膜处展示出仅仅一些额外的木质化细胞的层。
-来自具有基因型ind-a1-EMS01/ind-aA1-EMS01、ind-c1-EMS09/ind-c1-EMS09的纯合的双突变体IND亲缘性植物的荚果在其远端处以及这些荚果的中心处两者显示了遍及全部开裂区的木质化以及属于开裂区的细胞与邻近的细胞类型较差的区别，例如维管组织细胞以及通常在内荚果壁处发现的细胞的木质化层(即末端细胞)。
实例4-突变体IND基因的检测和/或将它们转入(原种)芸薹属品 系中
通过以下方法将突变体IND基因转入(原种)芸薹属培养品系中：将包括一个突变体IND基因的一株植物(供体植物)与一株(原种)芸薹属品系(原种亲本/轮回亲本)或者缺少该突变体IND基因的品种进行杂交。使用如下的渗入方案(突变体IND基因被缩写为ind而野生型被描述为IND)：
初始杂交：ind/ind(供体植物)×IND/IND(原种亲本)
F1植物：IND/ind
BC1杂交：IND/ind×IND/IND(轮回亲本)
BC1植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用对于突变体IND等位基因(ind)的分子标记(例如AFLP、PCR、InvaderTM等；也参见下文)选择该50％IND/ind。
回交2杂交：IND/ind(BC1植物)×IND/IND(轮回亲本)
BC2植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用对于突变体IND等位基因(ind)的分子标记选择该50％IND/ind。
重复回交直到BC3至BC6
BC3至BC6植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用对于突变体IND等位基因(ind)的分子标记选择该50％IND/ind。为了减少回交的数量(例如直到BC3，而不是BC6)，可以使用对原种亲本遗传背景特异性的分子标记。
BC3至BC6S1杂交：IND/ind×IND/ind
BC3至BC6S1植物：25％IND/IND和50％IND/ind和25％ind/ind
使用对于突变体IND等位基因(ind)的分子标记选择包括ind的植物。使用对于突变体以及野生型IND等位基因的分子标记选择对于该突变体IND等位基因(ind/ind)是纯合的单独的BC3至BC6S1植物。然后使用这些植物进行种子生产。
为了选择一个IND等位基因中包括一个点突变的植物，可以使用本领域已知的标准的测序技术进行直接测序(例如实例1中所述的那些)。
可替代地，可以开发PCR测定来将IND等位基因中包括一个特异的点突变的植物与不包括该特异的点突变的植物区别开。因此可以开发如下的差别PCR测定来检测实例1中所鉴定的突变体等位基因的存在或者缺失以及接合性状态(参见表3a以及3b)。
-模板DNA：
-从纯合的或者杂合的突变体芸薹属植物(包括一个突变体IND等位基因，在下文中被称为“IND-Xx-EMSXX”)的叶子材料中分离的基因组DNA。
-野生型DNA对照物：从野生型芸薹属植物(包括突变体IND等位基因的野生型等效物，在下文中被称为“IND-Xx-WT”)的叶子材料中分离的基因组DNA。
-阳性DNA对照物：从已知包括IND-Xx-EMSXX的纯合的突变体芸薹属植物的叶子材料中分离的基因组DNA。
-总体上说，每个引物组包括一个对突变体和野生型目标基因两者特异的引物(例如对于IND-A1-EMS06以及IND-A1-WT两者特异的引物)以及一个对核苷酸差异特异的引物(例如对于IND-A1-EMS06等位基因或者IND-A1-WT等位基因其中一项特异的引物)。通常地，后一个引物的最后一个核苷酸与核苷酸差异相配，但是可以增加一个(或者多个)额外的目标特异性核苷酸用于改善该引物与其目标序列之间的退火。
-PCR混合物：2.5μl10x PCR缓冲液(15mM MgCl2)，0.25μldNTP’s(20mM)，1μl正向引物(10μM)，1μl反向引物(10μM)，0.25μlTaq聚合酶(5U/μl)，19.5μlMilli-Q水，0.5μlDNA(20-50ng/μl)＝总共体积25μl；
-热循环曲线：95℃4分钟；30x[95℃1分钟(变性)以及退火温度下1分钟以及72℃(伸长)2分钟]；72℃5分钟；冷却到4℃。通过温度梯度PCR可以确定最佳退火温度，其中例如在MJ Research热循环仪PTC-200(Biozym)上，该退火温度可以在57℃至70℃之间变化。对于野生型IND特异性引物的最佳退火温度是这样的温度，在该温度下对于来自野生型芸薹属植物的DNA样品、并且不是对于来自突变体芸薹属植物的DNA样品的可以检测到一个预期大小的清晰的PCR片段(如下所述)。对于突变体IND特异性引物的最佳退火温度是这样的温度，在该温度下对于来自该突变体芸薹属植物的DNA样品、并且不是对于来自该野生型芸薹属植物的DNA样品可以检测到一个预期大小的清晰的PCR片段(如下所述)。
-扩增之后，将5μl上样染料(橙色染料)加入15μl PCR样品中并且将样品加载到一块1.5％琼脂糖凝胶上。
-如下对突变体芸薹属植物的基因组DNA扩增后得到的带型进行评估：
-在一个单个的PCR运行以及一个单个的PCR混合物中从这些突变体芸薹属植物的叶子材料中分离的DNA样品的数据不应当被接受，除非：
-对于IND-Xx-WT特异性PCR测定该野生型DNA对照物显示了预期大小的PCR片段并且对于IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定不显示预期大小的PCR片段。
-对于IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定阳性DNA对照物显示预期大小的PCR片段并且对于IND-Xx-WT特异性PCR测定不显示预期大小的PCR片段。
-对于IND-Xx-WT特异性PCR测定泳道不显示预期大小的PCR产物并且对于IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定显示预期大小的PCR片段，表明从中制备基因组模板DNA的相应的植物对于IND-Xx-EMSXX是一个纯合的突变体。
-对于IND-Xx-WT特异性PCR测定以及IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定泳道显示预期大小的PCR片段，表明从其中制备基因组模板DNA的相应的植物对于IND-Xx-EMSXX是一个杂合的突变体。
-对于IND-Xx-WT特异性PCR测定泳道显示预期大小的PCR片段并且对于IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定不显示预期大小的PCR产物，表明从其中制备基因组模板DNA的相应的植物是一个野生型植物。
可替代地，可以使用InvaderTM技术(Third Wave Agbio)来将IND等位基因中包括一个特异的点突变的植物与不包括该特异的点突变的植物区别开。因此开发了以下的差别InvaderTM探针来检测实例4中所鉴定的突变体等位基因的存在或者缺失以及接合性状态(参见表6：
-表6中指示了对于突变体或者相应的野生型目标IND基因特异性(对应地表示为“5’flap1-x”以及“5’flap2-x”)探针以及可以与它们结合使用的“入侵”探针。总体上说，每个探针组包括一个对于该突变体或者该野生型目标基因特异性的探针(所谓的“初级探针”；例如具有SEQ ID NO：12的探针对于IND-A1-EMS06是特异性的并且具有SEQ ID NO：13的探针对于IND-A1-WT是特异性的)，该目标基因5’flap序列后面的第一个核苷酸与核苷酸差异(表6中加下划线的核苷酸)相匹配，以及一个对于该核苷酸差异的上游的核苷酸特异性的探针(所谓的“寡聚物”；例如具有SEQ ID NO：11的探针对于IND-A1-EMS06与IND-A1-WT之间的核苷酸差异的上游的核苷酸是特异性的)。后一个引物的最后一个核苷酸可以与突变体(表6中通过粗体核苷酸指示)中的核苷酸差异相匹配，但是其他核苷酸也可以被用做这个最后一个核苷酸，只要当与目标DNA杂交从而生成被酶(Third Wave Agbio)所识别的特异的入侵结构时初级探针和寡聚物仍然能够形成一个单个碱基重叠。
-按生产厂家(Third Wave Agbio)所规定的进行InvaderTM测定过程以及数据的解释。简言之，表6中表示为“flap1”和“flap2”的核苷酸序列代表5′“flaps”的序列，这些序列是在InvaderTM测定的初级阶段从初级探针中切割下来的并且这些序列对应地与FRETTM盒1和2中的序列互补，并且不与目标突变体或者野生型序列互补。如果这些初级探针在初级阶段被切割并且在第二阶段中flapl探针和/或flap2探针对应地与FRETTM盒1和2杂交，产生一个信号，对应地表明样品中存在该突变体或者相应的野生型目标IND基因。
表6

Claims (23)

1.IND基因的部分敲除的突变体等位基因，其为编码下述氨基酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8组成，其中在第139位的丙氨酸被苏氨酸取代。
2.权利要求1的突变体等位基因，其选自
(a)由SEQ ID NO:3的序列组成的核酸分子，其中在415位的g被a取代；和
(b)由SEQ ID NO:7的序列组成的核酸分子，其中在911位的g被a取代。
3.根据权利要求1或2所述的突变体等位基因，其来自欧洲油菜。
4.突变体IND蛋白，该突变体IND蛋白是由根据权利要求1-3中任一项所述的突变体等位基因编码的。
5.用于在生物样品中鉴定权利要求1-3中任一项的突变体IND等位基因的方法，该方法包括确定在该生物样品中存在的核酸中突变体IND特异性区域的存在，其包括使生物样品进行杂交测定，该测定使用特异性探针组，所述探针组包含由SEQ ID NO:26的序列组成的一种探针，和由SEQID NO:27的序列组成的一种探针。
6.用于确定在植物、或其细胞、植物组织或器官、种子或子代中权利要求1-3中任一项的突变体IND等位基因的接合性状态的方法，该方法包括确定在所述植物、或其细胞、植物组织或器官、种子或子代的基因组DNA中突变体和/或相应的野生型IND特异区的存在，其包括使所述植物，或其细胞、植物组织或器官、种子或子代的基因组DNA进行杂交测定，所述测定使用探针组，所述探针组包含由SEQ ID NO:26的序列组成的一种探针，由SEQ ID NO:27的序列组成的一种探针，和由SEQ ID NO:28的序列组成的一种探针。
7.用于鉴定生物样品中的权利要求1-3中任一项所述的突变体IND等位基因的试剂盒，该试剂盒包含探针组，所述探针组包含由SEQ ID NO:26的序列组成的一种探针，和由SEQ ID NO:27的序列组成的一种探针。
8.用于在植物、或其细胞、植物组织或器官、种子或子代中确定权利要求1-3中任一项的突变体IND等位基因的接合性状态的试剂盒，该试剂盒包含探针组，其中至少一种所述探针特异地识别野生型IND等位基因并且其中至少一种所述探针特异地识别突变体IND等位基因，所述探针组包含由SEQ ID NO:26的序列组成的一种探针，由SEQ ID NO:27的序列组成的一种探针，和由SEQ ID NO:28的序列组成的一种探针。
9.用于将至少两个拷贝的权利要求1-3中任一项所述的部分敲除的突变体IND等位基因组合入一株植物中的方法，该方法包括以下步骤：
(a)根据权利要求5的方法来鉴定至少两株植物，这些植物各自包含至少一个拷贝的部分敲除的突变体IND等位基因，
(b)将该至少两株植物进行杂交并且从该至少一种杂交物中收集F1杂交体种子，
(c)任选地，根据权利要求5的方法来鉴定F1植物，该F1植物包含至少两个拷贝的部分敲除的突变体IND等位基因。
10.根据权利要求9所述的方法，该方法进一步包括通过根据权利要求6的方法，确定该选择的突变体IND等位基因的接合性状态来鉴定F1植物的步骤，该F1植物对于部分敲除的突变体IND等位基因是纯合的。
11.用于将权利要求1-3中任一项的部分敲除的突变体IND等位基因从一株植物转移到另一株植物上的方法，该方法包括以下步骤：
(a)根据权利要求5的方法来鉴定包含部分敲除的突变体IND等位基因的第一植物或根据权利要求9的方法生成包含至少两个拷贝的部分敲除的突变体IND等位基因的第一植物，
(b)将该第一植物与不包含该部分敲除的突变体IND等位基因的第二植物进行杂交并且从该杂交物中收集F1种子，
(c)任选地，根据权利要求5的方法来鉴定F1植物，该F1植物包含该部分敲除的突变体IND等位基因，
(d)将包含该部分敲除的突变体IND等位基因的F1植物与不包含该部分敲除的突变体IND等位基因的该第二植物回交至少一代(x)并且从这些杂交物中收集BCx种子，
(e)根据权利要求5的方法在每一个世代中鉴定BCx植物，该BCx植物包含该部分敲除的突变体IND等位基因。
12.根据权利要求11所述的方法，该方法进一步包括通过根据权利要求6的方法确定该部分敲除的突变体IND等位基因的接合性状态来鉴定BCx植物的步骤，该BCx植物对于部分敲除的突变体IND等位基因是纯合的或杂合的。
13.用于制备包含至少一个拷贝的根据权利要求1-3中任一项所述的突变体等位基因的植物的方法，该方法包括根据权利要求9至12中任何一项的方法将根据权利要求1-3中任一项所述的突变体IND等位基因组合至一种芸薹属植物之中和/或转移至一种芸薹属植物。
14.根据权利要求13的方法，其包括组合两个拷贝的根据权利要求1-3中任一项所述的突变体等位基因。
15.根据权利要求14所述的方法，该方法进一步包括将根据权利要求1-3中任一项所述的部分敲除的突变体IND等位基因组合和/或转移在一种具有完全敲除的突变体IND等位基因的植物中和/或到一种包含完全敲除的突变体IND等位基因的植物，其中所述完全敲除的突变体IND等位基因选自
(a)由SEQ ID NO:1的序列组成的核酸分子，其中在364位的C被T取代；和
(b)由SEQ ID NO:1的序列组成的核酸分子，其中在307和380位的G被A取代。
16.用于制备包含根据权利要求1-3中任一项所述的突变体等位基因的杂交体芸薹属种子或植物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)根据权利要求6的方法来鉴定包含处于纯合状态的根据权利要求1-3中任一项所述的部分敲除的突变体IND等位基因的第一植物以及包含处于纯合状态的根据权利要求1-3中任一项所述的部分敲除的突变体IND等位基因的第二植物，
(b)将该第一和第二植物进行杂交并且从该杂交物中收集F1杂交体种子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中该第一植物额外地包含处于纯合状态的第一完全敲除的突变体IND等位基因并且该第二植物包含处于纯合状态的第二完全敲除的突变体IND等位基因，其中所述第一和第二完全敲除的突变体IND等位基因选自
(a)由SEQ ID NO:1的序列组成的核酸分子，其中在364位的C被T取代；和
(b)由SEQ ID NO:1的序列组成的核酸分子，其中在307和380位的G被A取代。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该第一和第二完全敲除的突变体IND等位基因是相同的。
19.从包含根据权利要求3的突变体等位基因的种子得到的芸薹属植物的用途，其用于培育目的，其中所述种子已经以登录号NCIMB41574保藏在NCIMB中。
20.从包含根据权利要求3所述的突变体等位基因的种子得到的芸薹属植物的用途，其用于将根据权利要求3所述的突变体等位基因转移到其他植物，其中所述种子已经以登录号NCIMB41574保藏在NCIMB中。
21.用于增加包含至少两个IND基因的欧洲油菜植物的产量的方法，该方法包括将两个拷贝的根据权利要求1-3中任一项所述的突变体IND等位基因引入其基因组中。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体IND等位基因的用途，其用于增加芸薹属植物中种子产量。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体IND等位基因用于增加欧洲油菜植物中荚果的抗落粒性的用途。
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