CN102095842A - 一种用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法，属烟草技术领域。本发明的方法为：采用人工唾液作为接装纸浸提液；量取一定面积的接装纸，剪成1cm×6cm的条状，置于具有磨口塞的50～250mL锥形瓶中；按照装纸面积/浸提液比例为24～36cm2/mL向锥形瓶中注入浸提液，盖好塞子；将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提5～180min，制备样品原液；以10μL，50μL，250μL，500μL，1000μL的剂量将样品原液掺入平板，分别计数TA 97、TA 98、TA 100、TA 102的回复突变菌落数；再根据鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果评价卷烟接装纸的安全性。本发明的优点在于：能有效模拟接装纸与口腔接触的实际状况制备样品，用于Ames试验的样品原液剂量范围合适，方法实用、简便。
Description
技术领域：
本发明涉及一种用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法，属烟草技术领域。
背景技术：
卷烟接装纸虽不参加燃烧，但是却直接与消费者口腔接触。目前，对卷烟接装纸的关注主要集中于对其物理指标、微生物指标、重金属和品质指标的规范[1～2]。随着减害降焦的不断深入，新型卷烟接装纸不断出现，需要深入开展卷烟接装纸安全性研究，从而为卷烟材料监管提供基础数据和理论支撑。
用于卷烟接装纸生物学评价的样品制备方法，虽然不是安全性评价工作的核心，但却是所有分析检测工作最初的一步。准确模拟实际暴露条件，制备卷烟接装纸在人工唾液中的迁移样品是影响后续安全性评价客观性、准确性及可靠性的关键因素和基本前提。
迄今为止，在国内外未见模拟卷烟接装纸与口腔接触的实际状况，进行接装纸生物学评价的Ames试验方法的公开报道。
参考文献：
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发明内容：
本发明的目的在于提供一种简便、实用的用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法。
本发明的一种用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法，包括样品原液制备及Ames试验，具体步骤如下：
a.采用中华人民共和国国家标准GB/T 16886.15-2003/ISO 10993-15：2000《医疗器械生物学评价第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量》规定的人工唾液作为卷烟接装纸的浸提液；
b.量取一定面积的卷烟接装纸(如：量取卷烟接装纸600cm×6cm，相当于500支卷烟的接装纸用量；量取300cm×6cm，相当于250支卷烟的接装纸用量；量取卷烟接装纸240cm×6cm，相当于200支卷烟的接装纸用量；量取卷烟接装纸120cm×6cm，相当于100支卷烟的接装纸用量；量取60cm×6cm，相当于50支卷烟的接装纸用量)，剪成1cm×6cm的条状，置于具有磨口塞的50～250mL锥形瓶中备用；
c.按照装纸面积/浸提液比例为24～36cm2/mL向锥形瓶中注入浸提液，当卷烟接装纸全部浸入后盖好塞子；
d.模拟实际暴露条件，设置浸提温度为37±1℃；
e.将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提5～180min，得到样品原液；
f.将e步骤得到的样品原液进行鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，即：分别按10μL，50μL，250μL，500μL，1000μL掺入平板，分别计数TA 97、TA 98、TA 100、TA 102四个菌种在剂量下的回复突变菌落数；
g.根据Ames试验结果判别卷烟接装纸材料是否具有致突变作用，用于评价卷烟接装纸的安全性。
本发明的优点在于：能有效模拟抽吸卷烟时接装纸与口腔接触的实际状况制备样品，所选择的用于Ames试验的样品原液剂量范围合适，方法实用、简便。
附图说明：
附图为用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法工艺流程图。
具体实施方式：
下面将结合具体实施例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
实例一 用于HH卷烟接装纸评价
1实验部分
1.1试验材料及其制备
参照中华人民共和国国家标准GB/T 16886.15-2003/ISO 10993-15：2000《医疗器械生物学评价第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量》规定的人工唾液制备方法，配制与口腔接触的卷烟接装纸的浸提液。
量取HH卷烟接装纸600cm×6cm(相当于500支卷烟的接装纸用量)，剪成约1cm×6cm细条状，置于具磨口塞的250mL锥形瓶中。往装有HH卷烟接装纸的锥形瓶中注入配制好的人工唾液100mL，致使接装纸条全部浸入(接装纸面积/浸提液的比例为36cm2/mL，相当于用1mL浸提液浸提5支卷烟的接装纸)，盖好塞子。模拟实际暴露条件，设置浸提温度为37±1℃；根据中华人民共和国烟草行业标准《烟用接装纸原纸》(YC 170-2002)及《烟用接装纸》(YC 171-2002)中规定的褪色浸泡时间，设置浸提时间为2h。将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提2h(震荡速度200r/min)，制备接装纸样品原液。
1.2试验菌株
组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)TA 97、TA 98、TA 100、TA 102由上海市疾病预防控制中心提供。试验前，菌株鉴定符合要求，菌种贮存于-196℃液氮内。
增菌方法：置于37±1℃恒温摇床(100次/min)培养10h备用。
1.3 S-9混合液
大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9混合液根据中华人民共和国国家标准GB15193.4-2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》自制。储存于-196℃液氮内。
1.4对照物
阴性对照：蒸馏水(自发回变)；溶剂对照：人工唾液；阳性对照：2-氨基芴(10μg/0.1mL/皿)，1，8-二羟基蒽醌(50μg/0.1mL/皿)，敌克松(50μg/0.1mL/皿)，叠氮钠(1.5μg/0.1mL/皿)。
1.5试验方法
采用中华人民共和国国家标准GB 15193.4-2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》的平板掺入法对HH接装纸样品原液进行Ames试验，选用TA97、TA98、TA 100、TA 102四个菌种，向融化并保温在45℃的2.0mL顶层培养基试管中依次加入0.1mL增菌液，0.5mL S-9混合液(或不加S-9混合液)和经0.22μm一次性过滤器过滤的HH卷烟接装纸样品原液(原液掺入剂量分别为10μL，50μL，250μL，500μL，1000μL)混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均匀分布，待上层培养基凝固后，将平板翻转，每一浓度每一个菌株3皿，37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。受试样品的回复突变菌落数
增加，超过阴性对照组2倍，有剂量-反应关系；或某一剂量超过阴性对照组2倍以上，呈现能重复并有统计学意义时记为阳性。
2结果
由表1知，无论在-S-9和+S-9的情况下，HH卷烟接装纸样品原液在受试剂量范围(10～1000μL/皿)内未引起测试菌株回变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回变菌落数明显增加，并超过自发回变和溶剂对照的2倍以上，表明HH卷烟接装纸样品原液在试验添加剂量范围内细菌回复突变试验结果为阴性。
表1HH卷烟接装纸样品原液Ames试验检测结果
**超过阴性对照组回变菌落数2倍以上
实例二 用于HD卷烟接装纸评价
基本同实例一。不同之处为：
量取HD卷烟接装纸300cm×6cm(相当于250支卷烟的接装纸用量)，剪成约1cm×6cm细条状，置于具磨口塞的250mL锥形瓶中。往装有卷烟接装纸的锥形瓶中注入配制好的人工唾液150mL，致使接装纸条全部浸入(接装纸面积/浸提液的比例为24cm2/mL，相当于用1mL浸提液浸提3.3支卷烟的接装纸)，盖好塞子。模拟实际暴露条件，设置浸提温度为37±1℃，将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提1h(震荡速度200r/min)，制备HD卷烟接装纸样品原液。
由表2知，无论在-S-9和+S-9的情况下，HD接装纸样品原液在受试剂量范围(10～1000μL/皿)内未引起测试菌株回变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回变菌落数明显增加，并超过自发回变和溶剂对照的2倍以上，表明HD接装纸样品原液在试验添加剂量范围内细菌回复突变试验结果为阴性。
表2HD卷烟接装纸样品原液Ames试验检测结果
**超过阴性对照组回变菌落数2倍以上
实例三 用于YY卷烟接装纸评价
基本同实例一。不同之处为：
量取YY卷烟接装纸120cm×6cm(相当于100支卷烟的接装纸用量)，剪成约1cm×6cm细条状，置于具磨口塞的50mL锥形瓶中。往装有卷烟接装纸的锥形瓶中注入配制好的人工唾液20mL，致使接装纸条全部浸入(接装纸面积/浸提液的比例为36cm2/mL，相当于用1mL浸提液浸提5支卷烟的接装纸)，盖好塞子。模拟实际暴露条件，设置浸提温度为37±1℃；将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提180min(震荡速度200r/min)，制备样品原液。
由表3知，无论在-S-9和+S-9的情况下，YY接装纸样品原液在受试剂量范围(10～1000μL/皿)内未引起测试菌株回变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回变菌落数明显增加，并超过自发回变和溶剂对照的2倍以上，表明YY接装纸样品原液在试验添加剂量范围内细菌回复突变试验结果为阴性。
表3YY卷烟接装纸样品原液Ames试验检测结果
**超过阴性对照组回变菌落数2倍以上
实例四 用于RS卷烟接装纸评价
基本同实例一。不同之处为：
量取RS卷烟接装纸240cm×6cm(相当于200支卷烟的接装纸用量)，剪成约1cm×6cm细条状，置于具磨口塞的100mL锥形瓶中。往装有卷烟接装纸的锥形瓶中注入配制好的人工唾液40mL，致使接装纸条全部浸入(接装纸面积/浸提液的比例为36cm2/mL，相当于用1mL浸提液浸提5支卷烟的接装纸)，盖好塞子。模拟实际暴露条件，设置浸提温度为(37±1)℃；将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提5min(震荡速度200r/min)，制备RS接装纸样品原液。
由表4知，无论在-S-9和+S-9的情况下，RS接装纸样品原液在受试剂量范围(10～1000μL/皿)内未引起测试菌株回变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回变菌落数明显增加，并超过自发回变和溶剂对照的2倍以上，表明RS卷烟接装纸样品原液在试验添加剂量范围内细菌回复突变试验结果为阴性。
表4RS卷烟接装纸样品原液Ames试验检测结果
**超过阴性对照组回变菌落数2倍以上
Claims (1)
1.一种用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法，其特征在于用于卷烟接装纸生物学评价的Ames试验方法的具体步骤如下：
a.采用医疗器械生物学评价研究中常用的人工唾液作为卷烟接装纸的浸提液；
b.量取一定面积的卷烟接装纸，剪成1cm×6cm的条状，置于具有磨口塞的50～250mL锥形瓶中备用；
c.按照接装纸面积/浸提液比例为24～36cm2/mL向装有接装纸的锥形瓶中注入浸提液，接装纸全部浸入后盖好塞子；
d.模拟实际暴露条件，设置浸提温度为37±1℃；
e.将该锥形瓶置于37±1℃的水浴震荡器中震荡浸提5～180min，得到样品原液；
f.将e步骤得到的样品原液进行鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，即：分别按10μL，50μL，250μL，500μL，1000μL掺入平板，分别计数TA 97、TA 98、TA 100、TA 102四个菌种在剂量下的回复突变菌落数；
g.根据Ames试验结果评价卷烟接装纸的安全性。
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