CN102091065A - 莪术醇的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明公开了莪术醇的新用途即莪术醇在制备治疗HPV感染药物中应用。本发明通过试验研究，在众多导致宫颈癌的因素中，确定了莪术醇对HPV感染导致的宫颈癌具有很好的治疗作用。

Description

莪术醇的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药有效成分的新用途。

本发明所述HPV是指人乳头瘤病毒。

背景技术

中药有效成分是其发挥药效作用的物质基础，有效物质的清晰与系统全面的质量控制是中药现代化的关键和核心，将中药的疗效物质药效研究清楚，从而代替中药有效部位或提取物，才能保障其质量均一、疗效稳定、安全可控，成为标准有效成分，作为原料药制备成药物，因此，对中药有效成分中进行深入的研究，具有深远的意义，有助于中药现代化、有助于中药走向世界，更加有利于人类的身体健康。

莪术醇是中药莪术中有效成分之一，查阅文献(莪术醇的研究进展；邓嵘等；辽宁药物与临床2001年第4卷第1期)记载了莪术醇具有抗肿瘤的作用，特别应用于宫颈癌的治疗。

宫颈癌的致病因素现今未研究清楚，现研究较多的认为其发病机制主要包括人乳头瘤病毒、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(病毒致宫颈癌发病机制的研究进展；杨丽丽、佟秀琴；内蒙古医学杂志Inner Mongolia Med J 2009年第41卷第8期)，衣原体、细菌性感染、滴虫等(生殖道感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的相关性分析；杨洁；中国实用医药2010年9月第5卷第27期)，因此，在众多导致宫颈癌因素中，证明莪术醇对什么原因导致宫颈癌具有治疗作用至关重要，而这种深入的研究，可以很好的确证莪术醇能够很好的治疗宫颈癌这种疾病，为莪术醇药效机理的揭示，为莪术醇在新药研发过程中，提供了确切的、深入的理论基础。

发明内容

基于上述原因，本公司的科研人员通过实验研究，从众多宫颈癌的致病因素中，研究并证明了莪术醇对HPV感染具有很好的治疗作用，说明莪术醇对HPV感染导致的宫颈癌具有很好的预防和治疗作用；特别是含量大于等于50％的莪术醇，与市售莪术油比较，具有更好的药理作用；与含量小于50％莪术醇比较，也具有更好的药理作用。

本发明通过下述技术方案实现的。

莪术醇在制备治疗HPV感染药物中的应用。

莪术醇在制备治疗HPV感染导致的宫颈疾病药物中的应用。

莪术醇在制备治疗HPV感染导致的宫颈癌药物中的应用。

其中莪术醇含量大于等于50％小于100％。

其中HPV感染为高危型人乳头瘤病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

其中HPV类型为16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66、59、68、73和82型中的一种或几种。

其中HPV类型为6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、83和89型一种或几种。

其中莪术醇作用部位包括但不限于HPV中E6和E7蛋白。

其中莪术醇为活性成分的药物制剂。

其中药物制剂为口服制剂、注射制剂、阴道制剂或直肠制剂。

其中口服制剂为片剂、胶囊剂、滴丸剂或口服液；其中注射制剂为注射乳剂或冻干粉针剂；其中阴道制剂为栓剂、软胶囊、泡腾片、凝胶剂、软膏剂、阴道片、膜剂或泡沫剂；其中直肠制剂为栓剂或软胶囊。

本发明所述HPV是指人乳头瘤病毒。

药理学试验

试验1抗人乳头瘤病毒的作用

试验试剂：HPV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(包括DNA提取液1、DNA提取液2、PCR反应液、Taq酶、UNG)。其他试剂均为分析纯。

试验药物：

试验1组：市售莪术油。

试验2组：含量为44.3％莪术醇。

试验3组：含量为90.5％莪术醇。

试验方法：

样品制备：将上述试验1组配置成500μg/ml溶液；试验2组配置成25μg/ml溶液；将试验3配置成200μg/ml溶液；试验3组配置成100μg/ml；试验3组配置成50μg/ml；试验3组配置成25μg/ml；试验3组配置成20μg/ml；

HPV感染标本制备：从医院门诊确诊HPV感染采取的离体标本(HPV类型为16、52混合型)，集中到1只离心管中，称重30mg，用玻璃匀浆器匀浆，再加入5mL生理盐水，配成6mg/mL的离体混悬液，备用。

样品处理的方法：用移液枪吸取25μL样品液和25μL标本混悬液至15mL离心管中，振摇均匀，使样品与标本能充分作用，置37℃水浴箱培养，在样品处理标本1d、3d、5d、7d后，各取1组进行以下试验。

HPV-DNA的提取：从温浴箱中取出经样品处理的标本混悬液，按试剂盒步骤提取DNA：加入50μL生理盐水，混匀后再加入100μLDNA提取液，振摇均匀，1200r/min离心10min，弃去上清液，再加入25μL DNA提取液2，充分混匀，100℃沸水煮10min，1200r/min离心10min，上清液即为HPV-DNA模板。

DNA扩增：取检测试剂盒中的PCR反应液37.6μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，UNG0.03μL于PCR反应管中，再加入HPV-DNA模板2μL，扣严管盖，置于定量PCR仪上循环扩增。HPV-DNA经高温变性、低温退火及延伸进行循环扩增，循环程序设置为：37℃，5min；94℃，1min；95℃，5sec；60℃，30sec，循环40次。

量标准曲线：用荧光探针检测定量，按照检测试剂盒要求，设立4个系列浓度的HPV-DNA定量阳性标准品，依次为5×10⁷/mL，5×10⁶/mL，5×10⁵/mL，5×10⁴/mL，经PCR检测(其检测灵敏度为1×10³/mL，结果小于该浓度者判定为阴性)。以起始拷贝数的自然对数为横坐标，循环阈值为纵坐标，得到的回归直线为标准曲线，据此对样品的扩增倍数进行定量。

试验结果：见表1。

表1不同试验药物对HPV感染的DNA作用结果

注：-代表阴性。

将HPV感染标本换成从医院门诊确诊为HPV感染采取的离体标本(HPV为18型)，按照上述方法进行试验，试验3组(25-200μg/ml)(莪术醇含量为50.3％)培养1天、3天、5天、7天的结果皆为阴性；试验2组(莪术醇含量为19.7％)培养时间5天结果为阴性，培养时间7天结果阴性；试验1组培养7天结果为阴性。

将HPV感染标本换成从医院门诊确诊为HPV感染采取的离体标本(HPV类型为26型)，按照上述方法进行试验，试验3组(25-200μg/ml)(莪术醇含量为87.9％)培养1天、3天、5天、7天的结果皆为阴性；试验2组(莪术醇含量为41.9％)培养时间5天结果为阴性，培养时间7天结果阴性；试验1组培养7天结果为阴性。

将HPV感染标本换成从医院门诊确诊为HPV感染采取的离体标本(HPV类型为11、40、42型)，按照上述方法进行试验，试验3组(25-200μg/ml)(莪术醇含量85.9％)培养1天、3天、5天、7天的结果皆为阴性；试验2组(莪术醇含量为37.3％)培养时间5天结果为阴性，培养时间7天结果阴性；试验1组培养7天结果为阴性。

试验结论：上述试验数据表明试验3组中对不同亚型HPV感染的DNA具有很好的抑制作用。

试验2

对HPV E6、E7基因抑制作用的影响

试验材料：

宫颈癌细胞系：人宫颈癌CaSKi细胞系(HPV16阳性、HPV53阳性、HPV83阳性)；人宫颈鳞状上皮永生化细胞系H8(HPV56阳性、HPV66阳性、HPV42阳性)。

引物：由上海生工生物工程技术服务有限公司，应用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成，纯化方式：PAGE。

培养基和血清：Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基(GIBCOBRL)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)；工具酶：Taq DNA聚合酶(Promega)，逆转录酶(AMV Reverse Transcriptase)(Promega).

试验药物：

试验1组：市售莪术油。

试验2组：含量为42.1％莪术醇。

试验3组：含量为90.2％莪术醇。

实验方法

宫颈癌细胞系的培养：人宫颈癌CaSKi细胞在5％胎牛血清的DMEM培养基中，H8细胞在含2％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度环境下培养。

药物浓度选择：不同试验组药物浓度为150μg/ml。

细胞形态观察：活细胞照相：将对数生长期的细胞接种于6孔板培养板，每孔10×10⁴个细胞，在各实验组的6孔培养板中每孔放置一片盖玻片，形成附有细胞的盖片，第二天细胞贴壁后更换为含药培养基，培养三天后，在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。

四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同药物对CaSKi细胞和H8细胞生长抑制情况：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔3000个细胞，第二天加入不同药液，每个浓度平行5孔，37℃，5％CO2培养24小时后每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)20μl，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl，培养20分钟后酶标仪492nm测定OD值。

细胞周期检测：同前法在六孔培养板中以含不同浓度药物的培养基培养五天，每个药物浓度平行3孔，收集细胞，制备单细胞悬液，PBS清洗2次，预冷70％乙醇固定，4℃保存待检。经0.01％RNA酶处理胞浆RNA、50mg/L碘化丙锭(popidium iodide，PI)DNA染色30min后，经300目筛过滤除去成团细胞，应用COULTER EPICS XL流式细胞仪检测细胞周期中不同时相的细胞调亡率。每份标本测定5000个细胞，根据DNA含量区分细胞所处细胞周期时相。

mDNA表达检测：收集培养第五天的细胞，TRIZOL处理后提取RNA，逆转录为cDNA，扩增HPVE6、E7，同时扩增β-action作为内参照，HPVE6、E7引物(616bp)：

上游5`-TGACTTTGCTTTTCGGGGATT-3`，

下游5`GAGAACAGATGGGGCACAC-3`。

β-action(552bp)引物序列：上游：5`-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3`，下游5`CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3`。

扩增参数为：94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃复性45s，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸加时5min；PCR产物4℃保存；2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，电压40V。应用Scion Image 4.0(NIH)软件进行电泳条带图象灰值的半定量分析。待测基因电泳条带灰度比值＝待测条带灰度值/同一份标本内参照β-action条带灰度值。

应用SPSS 13.0.0统计软件，进行单因素方差分析(ANOVA)、t检验等。

表2对CaSki细胞的生长抑制作用(OD，n＝5)吸光度值(OD)

注：与control组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与试验1组比较^*P＜0.05；与试验2组比较△P＜0.05。

表3对H8细胞的生长抑制作用(OD，n＝5)吸光度值(OD)

注：与control组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与试验1组比较^*P＜0.05；与试验2组比较△P＜0.05。

表4对HPVE6、E7基因表达的影响(CaSKi细胞周期分布和细胞凋亡率)

注：与control组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

表5对HPVE6、E7基因表达的影响(H8细胞周期分布和细胞凋亡率)

注：与control组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

表6RT-PCR产物电泳条带灰度值

注：与control组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

试验结论：上述试验1和试验2证明了莪术醇对HPV感染具有很好抑制作用，对HPV不同亚型感染具有很好的抑制作用，主要作用其E6、E7蛋白；与莪术油比较具有更好的药理作用；与含量低于50％的莪术醇比较具有更好的药理作用。

实施例

实施例1

莪术醇为活性成分制备的片剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量99.8％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例2

莪术醇为活性成分制备的胶囊剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量50.3％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例3

莪术醇为活性成分制备的注射乳剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量74.4％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例4

莪术醇为活性成分制备的冻干粉针剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量66.2％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例5

莪术醇为活性成分制备的阴道栓剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量84.1％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例6

莪术醇为活性成分成为制备的阴道泡沫剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量92.8％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例7

莪术醇为活性成分制备的阴道泡腾片，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量55.7％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例8

莪术醇为活性成分制备的直肠栓剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量90.0％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例9

莪术醇为活性成分制备的阴道凝胶剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量37.4％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例10

莪术醇为活性成分制备的阴道软膏剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量54.3％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例11

莪术醇为活性成分制备的阴道膜剂，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量67.2％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例12

莪术醇为活性成分制备的阴道软胶囊，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量92.2％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

实施例13

莪术醇为活性成分制备的直肠软胶囊，该制剂用于治疗HPV感染导致的疾病，包括但不限于宫颈疾病或宫颈癌。

其中莪术醇含量72.7％。其中HPV感染包括但不限于高危型人乳头病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

上述实施例包括但不限于所述。

Claims (9)

1.莪术醇在制备治疗HPV感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中莪术醇含量大于等于50％小于100％。

3.根据权利要求1所述的应用，其中HPV为高危型人乳头瘤病毒亚型或低危型人乳头瘤病毒亚型。

4.根据权利要求1所述的应用，其中HPV类型为16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66、59、68、73和82型中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的应用，其中HPV类型为6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、83和89型一种或几种。

6.根据权利要求4-5任一项所述的应用，其中莪术醇作用部位包括HPV中E6和E7蛋白。

7.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其中莪术醇为活性成分的药物制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其中药物制剂为口服制剂、注射制剂、阴道制剂或直肠制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其中口服制剂为片剂、胶囊剂、滴丸剂或口服液；其中注射制剂为注射乳剂或冻干粉针剂；其中阴道制剂为栓剂、软胶囊、泡腾片、凝胶剂、软膏剂、阴道片、膜剂或泡沫剂；其中直肠制剂为栓剂或软胶囊。