CN102083966B - 大规模诱导和扩增治疗性同种异体抗原-特异性的人调节性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的调节性T细胞的方法。使用CD40-活化的B细胞，可以从首次用于实验的CD4+CD25"T细胞诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的调节性T细胞。调节性T细胞可以是人T细胞。在一个实施方案中，同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞可以是CD4高CD25±Foxp3+调节性T细胞。
Description
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在国立卫生研究院授权号AI050153的美国政府支持下完成。美国政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年6月30日提交的美国临时申请系列号 61/133,643的优先权利益，其所有内容通过引用并入本文。
背景技术
使用免疫抑制药物的治疗，被广泛接受为提高移植物存活的骨髓和实体器官移植的有效治疗。但是，移植物的慢性排斥仍然对长期结果具有显著影响。此外，许多免疫抑制药物非特异性地靶向免疫应答，导致不希望的副作用，诸如减弱的总免疫系统。因而，移植的目标是，诱导对供体同种异体抗原的特异性耐受的持续状态，使总免疫抑制最小化或彻底消除。
CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是对自身抗原和外来抗原的免疫应答的负调节物，且通过抑制自身免疫病、移植同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)中的病态免疫应答，在维持免疫耐受性方面起关键作用1-3。在啮齿动物中过继转移后，发现Treg会控制实验性自身免疫病4、抑制GVHD5,6、并预防移植同种异体移植物排斥7,8，表明基于Treg的疗法对于人类中的这些疾病具有重大的治疗潜力。
基于Treg的疗法的一个重要障碍是，可得到有限数目的这些细胞，因为仅约1-2%的循环的人CD4+ T细胞是Treg。几个研究组已经开发了在体外扩增大量多克隆CD4+CD25+ Treg的方法，其中使用CD3和CD28 mAb或人工抗原呈递细胞(APC)的重复刺激，通过CD3和CD28进行活化，并使用外源性高剂量的IL-29-11。多克隆Treg可以造成总免疫抑制4,7。另外，由于在多克隆Treg群体中仅存在极少的抗原-特异性的Treg，需要非常大量的非特异性地扩增的Treg来抑制动物模型中的骨髓同种异体移植物排斥12。多克隆Treg的所有这些特征都阻碍的它们的临床应用。
相反，已经证实，抗原-特异性的Treg的过继转移会高效率地预防和治疗T-细胞-介导的炎性疾病。在动物模型中，小量抗原-特异性的Treg可以抑制实验性的自身免疫病13、在骨髓和实体器官移植中预防GVHD和同种异体移植物排斥14,15。重要的是，抗原-特异性的Treg的转移会预防靶抗原-介导的T-细胞应答（诸如GVHD）和同种异体移植物排斥，但是不会损害宿主的一般免疫，包括移植物抗肿瘤活性和抗病毒免疫5,15-17。基于这些研究，抗原-特异性的Treg在人免疫疗法中具有重大前途。
稀少的抗原-特异性的Treg的可靠诱导和扩增在技术上是挑战性的。目前，已经报道了几种诱导和扩增鼠抗原-特异性的Treg的方法，其中在有高剂量IL-2存在下与经过同种异体抗原脉冲的自体树突细胞(DC)一起共培养纯化的CD4+CD25-或CD4+CD25+细胞，或直接与同种异体的DC一起共培养14,18-20。最近，还已经报道了将类似的方法用于生产人抗原-特异性的Treg21。在该方法中，通过与同种异体的单核细胞-衍生的DC一起共培养CD4+CD25- T细胞，可以生产抗原-特异性的CD4+CD25+ Treg。但是，因为DC的某些特性，同种异体抗原-特异性的Treg的大规模体外扩增是困难的。例如，DC在外周血中相对稀少，且通常源自单采血液成分术或骨髓源，包括单核细胞22,23。而且，DC不是同质的，包括具有不同功能性能的多个子集24。最后，迄今为止没有有效的扩增人DC的方法25。另外，目前的体外生产人DC的方法是昂贵且费力的26。
Schultze 等人报道了一种从人外周血单核细胞(PBMC)扩增大量人CD40-活化的B细胞（高达105,6-倍）的简单且低成本的方法27。这些扩增的B细胞可有效地用作APC，且可以有效地诱导抗原-特异性的T细胞和细胞毒性的T 淋巴细胞26,27。
但是，本领域缺少大规模生产人抗原-特异性的Treg的有效手段。因而，本领域需要大规模诱导或生产人抗原-特异性的Treg的方法。
发明内容
本发明提供了新颖的诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的调节性T细胞的方法。有利地，可以大规模地进行调节性T细胞的诱导、扩增和/或生产。本发明另外提供了根据本文所述的方法生产的细胞。
在有些实施方案中，本发明提供了大规模诱导和扩增高效的人同种异体抗原-特异性的Treg的新颖方法，其中与人同种异体的CD40-活化的B细胞一起共培养首次用于实验的CD4+CD25- T细胞，不使用任何外源性细胞因子。诱导的同种异体抗原-特异性的Treg是CD45RO+和CCR7-记忆细胞，并表达共同的Treg标志物(CD25和Foxp3)以及淋巴结归巢受体CD62L (L-选择蛋白)。它们也可通过CD4高表面表型来鉴别。这些CD4高CD25+Foxp3+ 同种异体抗原-特异性的Treg的抑制功能是细胞-细胞接触依赖性的，但是不包含细胞-介导的细胞毒性。
本发明的体外诱导和扩增同种异体抗原-特异性的Treg的方法，将会促进基于Treg的临床免疫疗法的发展。例如，根据本发明，同种异体抗原-特异性的调节性T细胞的过继转移，可以用于抑制同种异体的免疫应答，例如 GVHD，并预防移植同种异体移植物排斥。另外，本发明的方法可以用于生产人同种异体抗原-特异性的Treg，它们可以用于控制自身免疫病。
本发明的方法的独特之处在于，它们使用CD40-活化的B细胞作为APC，而不是同种异体的单核细胞-衍生的DC或PBMC。CD40-活化的B细胞就该目的而言具有一个重要优点，因为它们可以容易地体外扩增至相对大量，相反地，而在体外分化成树突细胞的单核细胞不发生细胞分裂。冷藏保存的CD40-活化的B细胞在解冻后也保留它们的APC功能，且其生产相对节省成本。另外，因为用t-CD40-L细胞或重组的sCD40-L刺激过的B细胞在生产同种异体抗原-特异性的Treg方面同样有效，sCD40-L的使用会显著提高该方法的临床适用性。
附图说明
本专利文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用后，含有彩图的该专利的复制件将由专利和商标局提供。
图1A-C表明，CD40活化可以非常有效地生产大量CD40-活化的B细胞，它们表达高水平的MHC和共刺激分子。(1A) 显示了来自8个不同个体的CD40-活化的B细胞的总扩增。通过与CD40L-转染的NIFI3T3 (t-CD40-L)细胞一起共培养来自5 ml 外周血的PBMC，生产CD40-活化的B细胞。 (1B) 说明sCD40-L可以象t-CD40-L细胞一样有效地扩增培养的人B细胞。借助于t-CD40-L细胞或不同浓度的可溶性六聚体CD4O-L，生产CD40-活化的B细胞。显示的结果是3个独立实验的代表。(1C) 显示了CD80、CD86和MHC I类和II类在培养8天的CD40-活化的B细胞上的表达(实心直方图)。用相关的同种型对照得到填充的直方图。这里显示的数据是从8个不同的健康成年供体得到的B-细胞群体的代表。
图2A-C表明，被CD40-活化的B细胞诱导的人同种异体反应性的CD4高细胞是Treg。(2A) 用同种异体的B细胞刺激5天的CD4+CD25- T细胞中的CD4表达(上图)，和基于CFSE标记和CD45RA表达的缺失的它与细胞增殖的关系。上图代表被CD4门控的T细胞。指示了在每个门中的CD4+ T细胞的百分比。对于下图，空心直方图指示未刺激的对照T细胞的CFSE荧光强度，填充的直方图代表同种异体刺激的T细胞的CFSE荧光强度。每个直方图中的数字代表来自每个细胞子集的已经经历有丝分裂的细胞的百分比。(2B) CD4高细胞表达CD25和Foxp3。左侧的点图显示了同种异体刺激5天后的CD25表达。右侧的空心直方图显示了Foxp3表达，填充的直方图指示同种型对照。显示的结果是4个不同实验的代表。(2C) 从CD4+CD25- T细胞生产的CD4高CD25+ Treg以抗原-非特异性的方式有效地抑制了MLR。与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养新鲜纯化的CD4+CD25- T细胞7天。将分选的CD4高CD25+ (黑色正方形)和CD4中CD25- (空心正方形)细胞加入在材料和方法中所述的MLR培养系统。显示了MLR 3天的增殖(y-轴)。显示的结果是5个不同实验的代表。
图3A-B表明，CD40-活化的同种异体的B细胞从首次用于实验的CD4+CD25- T细胞诱导的人CD4高Treg是同种异体抗原-特异性的Treg。(3A) 从首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞诱导的CD4高Treg的特征。用CFSE标记新鲜纯化的首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞，并与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养7天。显示了来自6个独立实验的CD4和CD25表达(左图)、CFSE稀释度(右上图)和Foxp3表达 (右下图)的代表性数据。空心直方图显示了CD4中CD25-细胞的CFSE荧光强度(右上图)和Foxp3表达 (右下图)。填充的直方图代表CD4高CD25+细胞的CFSE荧光强度(右上图)和Foxp3表达 (右下图)。(3B) 从首次用于实验的CD4+CD25- T细胞生产的CD4高CD25+ Treg以同种异体抗原-特异性的方式有效地抑制了MLR，且从首次用于实验的CD4+CD25- T细胞生产的未分选的CD4+ T细胞在MLR中具有类似的抑制能力。与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养新鲜纯化的CD4+CD45RA+CD25- T细胞7天。将分选的CD4高CD25+ (黑色正方形)和CD4中CD25- (空心正方形)和未分选的CD4+ T细胞 (x)加入在材料和方法中所述的MLR培养系统。显示了MLR 第3天的增殖(y-轴)。显示的结果是8个独立实验的代表。
图4A-B 显示了CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg的特征。与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养新鲜纯化的首次用于实验的CD4+CD25- T细胞指定的时间。如在材料和方法中所述，通过FACS测定和分析细胞表面标志物(4A)和细胞内细胞因子(4B)的表达。指示了在CD4高CD25+和CD4中CD25-子集内每种细胞表面标志物或细胞内细胞因子的阳性细胞的百分比。显示的结果是4个独立实验的代表。
图5A-C表明，CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg不具有细胞毒性能力，且它们的抑制功能依赖于细胞-细胞接触，并部分地依赖于CTLA-4表达。在同种异体刺激7天后，分选CD4高CD25+ Treg或CD4中CD25- T细胞，如图3B所示。(5A) 诱导的CD4高CD25+ Treg的细胞毒性能力。(5B) CD4高CD25+ Treg的同种异体抗原-特异性的抑制功能是细胞-细胞接触依赖性的。(5C) 中和抗-CTLA-4 mAb会部分地逆转由CD4高CD25+ Treg介导同种异体抗原-特异性的抑制，但是中和IL-4、IL-10、TGF-β和GITR的mAb不会逆转该抑制。与或不与分选的CD4高CD25+ Treg或CD4中CD25- T细胞一起，共培养应答者(R) CD4+CD25-和γ-辐照的刺激者PBMC (S)。将人IL-2活化的NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性(A)设定为阳性对照(PC)。将单独的刺激者(S)或应答者(R)细胞设定为对照。对于transwell实验(B)，将相同量的应答者(R)和刺激者(S)细胞涂布在Transwell系统的底孔中。给顶孔插入物接种相同量的分选的CD4高CD25+ Treg。对于封闭实验(C)，将中和mAb (空心条棒)和它们的相关同种型对照(填充的条棒)加入共培养系统。显示了培养物第3天的增殖 (y-轴)。显示了4个不同实验的数据(n=4)。双尾未配对的Student氏t检验用于对比。*指示p<0.01。
图6A-E表明，CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg可以被CD40-活化的B细胞大规模地连续扩增，而不丧失功能，且外源性 IL-2不会增强该细胞扩增。与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养新鲜纯化的首次用于实验的CD4+CD25- T细胞指定的时间。(6A) 培养物中CD4高CD25+和CD4中CD25-细胞的百分比(n=10)。(6B) 来自10 个不同个体的CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg的扩增。标准化CD4高CD25+细胞的扩增，并显示了CD4高CD25+的倍数增加。(6C) 在有或没有IL-2的情况下，与CD40-活化的同种异体的B细胞一起共培养首次用于实验的CD4+CD25-。标准化CD4高CD25+细胞的扩增，并显示了CD4高CD25+的倍数增加(n=4)。(6D) 从1 x 106 个首次用于实验的CD4+CD25- T细胞生产的CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg的绝对数目(n=10)。(6E) 被CD40-活化的B细胞诱导和扩增21天的CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg保留功能。与CD40-活化的同种异体的B细胞 (靶抗原)一起共培养新鲜纯化的首次用于实验的CD4+CD25- T细胞 (应答者)，以诱导和扩增CD4高CD25+ Treg 21天，每7天更换B细胞。将分选的CD4高CD25+和CD4中CD25-细胞加入在材料和方法中所述的MLR培养系统。这里显示的数据是3个独立实验的代表。
具体描述
本发明概括地涉及诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的调节性的“T”细胞 (Treg)的方法。有利地，可以大规模地进行根据本发明的调节性T细胞的诱导、扩增和/或生产。
本发明的方法提供了使用同种异体的CD40-活化的B细胞从首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞大规模地获得同种异体抗原-特异性的CD4高CD25+Foxp3+ Treg的简单、容易、低成本且新颖的方法。在优选的实施方案中，调节性T细胞是人T细胞。
有利地，本发明的同种异体抗原-特异性的Treg可以用于控制自身免疫病和抑制同种异体的免疫应答（诸如GVHD）和移植同种异体移植物排斥。
CD4
高
Treg细胞生产的方法
本发明提供了相对简单且低成本的使用同种异体的CD40-活化的B细胞从首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞大规模地诱导和扩增高效的人同种异体抗原特异性的CD4高CD25+Foxp3+ Treg的方法。这促进了基于Treg的免疫疗法的临床应用，所述免疫疗法使用体外诱导和扩增的同种异体抗原-特异性的Treg来诱导供体-特异性的移植耐受。类似的策略，例如使用抗原脉冲的自体的CD40-活化的B细胞来诱导和扩增自身抗原-特异性的Treg，也可以用于治疗其中已知目标自身抗原的自身免疫病。
在一个实施方案中，本发明的方法包含，使包含首次用于实验的CD4+CD25- T细胞的细胞群体接触包含同种异体的CD40-活化的供体B细胞的细胞群体一段时间，该段时间足以生产供体同种异体抗原-特异性的调节性T细胞。在接触步骤后，可以任选地从细胞群体分离T细胞。在一个实施方案中，所述T细胞是人T细胞。
在另一个实施方案中，使细胞群体接触CD40-活化的B细胞多次。在一个实施方案中，同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞可以包含CD4高CD25+Foxp3+调节性T细胞。在一个实施方案中，同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞是CD4+CD25+ T细胞。在一个实施方案中，本发明的方法另外包含，扩增使用本发明的方法生产的同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞群体。
不同于先前的工作26'27'43，其中将自体的CD40-活化的B细胞用作APC，并与IL-2和IL-7联用来发生效应T-细胞应答，根据本发明，同种异体的Treg 生产不需要添加外源性细胞因子。外源性细胞因子（诸如IL-2和IL-7）的缺乏和使用同种异体的、而不是自体的CD40-活化的B细胞，会导致同种异体的Treg、而不是效应T细胞在CD40-活化的B细胞/首次用于实验的 CD4+ T-细胞共培养系统中分化和显著扩增。
有利地，在本发明的培养系统中，没有必要添加外源性的IL-2来诱导和扩增同种异体抗原-特异性的CD4高CD25+Foxp3+ Treg (图6D)。这样避免对外源性细胞因子的需求，会显著降低同种异体抗原-特异性的Treg的生产成本。
在一个实施方案中，使用同种异体的CD40-活化的-B细胞与总或首次用于实验的CD4+CD25- T细胞的共培养，在培养5-7天后，产生了CD4高CD25*Foxp3+ Treg (图2-3)。从首次用于实验的 CD4 4 CD25- T-细胞前体产生的CD4高CD25+Foxp3+ Treg是同种异体抗原-特异性的(图3)，而源自总CD4+CD25- T细胞（包括首次用于实验的和记忆细胞）的那些不具有抗原特异性(图2)。还发现从记忆CD4+CD25- T细胞产生的Treg不具有抗原特异性，并能抑制目标和第三方抗原刺激的MLR。从总CD4+CD25-和首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞产生的Treg之间的抗原特异性的显著差异的根本原因，可能是由于从在总CD4+CD25- T细胞中存在的抗原-刺激过的记忆细胞产生的Treg。
在一个实施方案中，通过用同种异体的CD40-活化的B细胞重复刺激一段时间，可以从首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞生产约6.4 x 105至约1.6 x 107 个同种异体抗原-特异性的Treg。该段时间可以是，例如，约1天至约30天。在一个实施方案中，该段时间是约21天。
本发明的方法可以用于，例如，从每约1 x 106 个首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞生产约6 x 106至约1.1 x 107 个同种异体抗原-特异性的Treg。通过例如从外周血分离，可以得到首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞。在一个实施方案中，通过从约5毫升(mL)至约8 ml 外周血分离，可以得到首次用于实验的CD4+CD25- T细胞。
有利地，不同于现有的使用单核细胞-衍生的同种异体的树突细胞生产同种异体抗原-特异性的Treg的方法，本发明的方法使大规模扩增同种异体抗原-特异性的Treg成为可能。本发明的方法也使容易地冷藏保存并在将来使用时解冻同种异体抗原-特异性的Treg并且不丧失它们的功能成为可能。另外，在本发明的方法中使用的CD40-活化的-B细胞的生产是低成本的。此外，本发明与现有方法相比进一步降低了成本，因为可以不使用任何外源性重组细胞因子，生产同种异体抗原-特异性的Treg。
有利地，本发明的生产同种异体抗原-特异性的Treg的方法不具有使用树突细胞 (DC)的现有方法的重大缺陷。例如，DC在外周血中相对稀少，且通常源自单采血液成分术或骨髓源（包括单核细胞），DC不是同质的，并代表不同的功能上不同的细胞类型。另外，没有已知的、有效的扩增人DC的方法，现有的体外生产人DC的方法是昂贵且费力的。
CD4
高
Treg细胞
本发明也涉及使用本发明的方法生产的分离的同种异体抗原-特异性的调节性T细胞。在一个实施方案中，所述T细胞是人T细胞。
也观察到，用同种异体的CD40-活化的B细胞同种异体刺激首次用于实验的或总CD4+CD25- T细胞后，T细胞上的CD4分子的明显上调。基于CD4和CD25的表达，可以将同种异体刺激的人CD4+ T细胞分成2个子集: CD4高CD25+和CD4中CD25-细胞 (图2-3)。CD4高CD25+是、但CD4中CD25-细胞不是表达Foxp3且具有高抑制能力的Treg(图2-3)，提高了CD4高在其它背景下成为人Treg的标志物的可能性。
在本系统或本发明中生产的同种异体抗原-特异性的CD4高CD25+Foxp3+ Treg是CD45RO+和CCR7-记忆细胞，并表达高水平的淋巴结归巢受体CD62L (图3)。这些细胞具有可用于迁移至周边淋巴组织引流移植部位以抑制T细胞-介导的同种异体移植物排斥和GVHD的潜力。以前已经证实，离体扩增的Treg可以保留它们的调节活性，并适当迁移进受体的周边淋巴器官，如果它们表达高水平的CD62L12'47。
同种异体抗原-特异性的CD4高CD25+Foxp3+ Treg表达CTLA-4和GITR，但是具有微小的TGF-β或IL-10分泌(图4)。其它人以前报道了其它表面标志物（诸如CD27和CD44）可以区分功能性的Treg和非-Treg36'37。但是，在用B-细胞共培养系统生产的CD4高CD25+Foxp3+ Treg和CD4中CD25-Foxp3- 非-Treg之间的CD27和CD44表达中没有观察到显著差异。
在某些实施方案中，根据本发明的方法生产的同种异体抗原-特异性的Treg的抑制效应可以低至，在约50,000个应答CD4+CD25- T细胞和约50,000个同种异体的外周血单核细胞(PBMC)刺激物的培养物中约718个抑制物 (0.0156:1比)。这些效应比以前关于新分离的或扩增的人多克隆和同种异体抗原-特异性的Treg所报道的那些更有效9-11'21，并且再次支持了由CD40-活化的B细胞生产的Treg在过继免疫疗法中的临床实用性。
临床应用
本发明也提供了治疗移植物排斥、或促进移植物存活、或治疗或预防自身免疫性疾病或病症的方法。
在一个实施方案中，使用本发明的方法，从细胞群体生产供体同种异体抗原-特异性的调节性T细胞，并过继转移或提供给受试者，所述受试者已经接受移植物移植、或将要接受移植物移植、或正在遭受或可能遭受自身免疫性疾病或病症。
所述自身免疫病可以是，例如，I型糖尿病、艾迪生病、狼疮、类风湿性关节炎、格雷夫斯病、多发性硬化或韦格纳肉芽肿病。
在一个实施方案中，受试者是人，且供体同种异体抗原-特异性的调节性T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，同种异体抗原-特异性的调节性T细胞是CD4lugh CD25+ Foxp3+调节性T细胞。
有利地，本发明的诱导的CD4高CD25+Foxp3+ Treg不具有细胞毒性活性(图5)。另外，排除了Th2应答参与MLR的可能性，因为IL-4 的阻断不会限制CD4高CD25+Foxp3+ Treg的抑制 (图5)。
在上文或下文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有附图和表格，都通过引用整体并入，只要它们不与本说明书的明确教导相矛盾。
材料和方法
CD40-活化的B细胞的生产
根据伦理委员会批准，从健康供体获取人外周血。按照以前的报道28,29，通过密度梯度离心分离PBMC。如以前所述27，使用用人CD40 配体转染的NIH3T3细胞(t-CD4O-L细胞)，通过CD40刺激来自PBMC 的B细胞。所述转染的细胞已经稳定表达人CD4OL超过5年，在t-CD4O-L细胞上不表达其它人分子27。以0.4 x 105个细胞/孔的浓度，将致死辐照的(96Gy) t-CD40-L细胞涂布在6-孔平板 (Costar, Cambridge, MA)上的培养基中，所述培养基含有45% DME (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)、45% F12 (Gibco/BRL)、10% FCS、2 mM 谷氨酰胺 (Gibco/BRL)和15 μg/ml庆大霉素(Gibco/BRL)。
在37℃、5% CO2下培养过夜后，t-CD4OL细胞贴壁，并准备好B-细胞培养。在37℃、5% CO2下，在添加了10% 人AB 血清、50 μg/ml 转铁蛋白 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)、5 μg/ml 胰岛素 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)和15μg/ml庆大霉素(Gibco/BRL)的Iscove氏MDM (Gibco/BRL)中，在有IL-4 (2 ng/ml; R&D systems, Minneapolis, MN)和环孢菌素A (CsA, 5.5 x 10-7M)存在下，与t-CD4OL细胞一起共培养2 x 106个细胞/ml的PBMC。
发现这里使用的CsA的浓度仅抑制T-细胞增殖，而不影响B-细胞生长。每隔3-5天，将培养的细胞转移至含有新辐照的t-CD40-L细胞的新平板的孔。一旦培养的PBMC含有75% CD19，以0.75-1.0 x 106个细胞/ml的浓度培养它们。每隔3-5天，通过流式细胞术分析活细胞和CD19+ B细胞的数目。共培养14天后，超过95%的存活的悬浮细胞是CD19阳性的。将B细胞冷藏保存，以备将来使用。关于与CD4+ T细胞的共培养，总是在聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度上离心冷藏保存的CD40-活化的B细胞，并在PBS中洗涤2次，以去除未存活的细胞，包括剩余的t-CD40L细胞。或者，用不同浓度的可溶性六聚体CD40L (sCD40L, Alexis Biochemicals, 瑞士)替换t-CD40L细胞，如上所述扩增B细胞30。
T-细胞分离
通过负选择，从健康供体PBMC分离人CD4+或首次用于实验的CD4+ T细胞，在所述负选择中，使用CD4+ T-细胞分离试剂盒或首次用于实验的CD4+ T-细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec, CA)，它们用于去除表达CD8、CD 14、CD 16、CD 19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ和CD235a (血型糖蛋白A) 的细胞(对于CD4+ T细胞)，或去除CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ、CD235a和CD45RO(对于首次用于实验的CD4+ T细胞)。在双柱去除操作后，通过正选择，进一步去除CD25+细胞，所述正选择利用直接缀合的抗-CD25磁性微珠(Miltenyi Biotec, CA)。双柱去除操作后，通过流式细胞术分析测得，CD4*CD25-或CD4+CD45RA+CD45RO-CD25-细胞通常超过99%纯度。在有些情况下，通过FACSAria分选CD25-细胞，且CD4+CD25-或CD4+CD45RA+CD45RO-CD25-细胞的纯度大于99.9%。
诱导和扩增Treg的同种异体刺激试验
在含有10%热灭活的人AB 血清的RPMI 1640培养基中，以10:1的T细胞/B细胞比，与同种异体的CD40-活化的B细胞一起共培养新鲜纯化的CD4+CD25-或CD4+CD45RA+CD45RO-CD25- T细胞。对于有些实验，如以前报道的18，在与CD40-活化的B细胞共培养之前，用CFSE标记T细胞。在重复的刺激实验中，每培养7天，加入同种异体的CD40-活化的B细胞。在有些实验中，将人重组IL-2 (1000 IU/ml)加入培养基。在指定的培养时间，检查诱导和扩增的T细胞的功能和表型标志。通过计数锥虫蓝-排斥细胞，测定细胞的扩增。
流式细胞术分析
使用FACSAria，分析细胞的表型。使用下述荧光-缀合的mAb。抗-CD4-PE-Cy5、抗-CD45RA-PE、抗-CD45RO-APC购自Caltag Laboratories-Invitrogen (Carlsbad, CA)。抗-CD25-APC、抗-CD62L-APC、抗-CD27-PE、抗-CD44-PE、抗-CCR7-PE、抗-CTLA-4-PE、抗-GITR-PE和它们的具有不相关特异性的同种型-匹配的对照Ab购自BD Biosciences。按照我们以前报道的28'29'31，在细胞固定和透化后，使用Fix和Perm试剂(BD Biosciences)，进行细胞内染色。使用下述mAb: 抗-CTLA-4-PE (BD Biosciences)、抗-GITR-PE (BD Biosciences)、抗-IL-10-PE (R&D)、抗-TGF-fl-PE (IQ-products、Netherlands)和抗-IL-2 (BD Biosciences)。对于Foxp3 染色，如前所述32，使用人Foxp3 染色试剂盒(eBiosciences)。
混合淋巴细胞反应(MLR)试验
按照我们以前所述，做出一些改进23,32，在MLR共培养抑制试验中，研究了在与同种异体的CD40-活化的B细胞的共培养中诱导和扩增的T细胞的抑制能力。与同种异体的CD40-活化的B细胞(目标)一起共培养CD4+CD25-或CD4+CD45RA+CD25' T细胞7或21天，该时间以后，通过FACSAria，分选CD4中CD25-和CD4高CD25+ T细胞。分选的细胞的纯度通常超过99%。滴定称作“抑制物”的分选的CD4高CD25+和CD4中CD25+细胞，并在开始MLR试验时加入，所述MLR试验由来自CD4中/CD4高细胞的相同供体的5 x 104 个应答者CD4+CD25- T细胞和来自同种异体B细胞的相同供体的5 x 104 个γ-辐照的(30Gy)目标PBMC的总和组成。在与第三方刺激者PBMC一起进行的共培养中，检查抗原特异性，所述第三方刺激者PBMC与(目标)同种异体的B细胞全是I和II 类HLA-错配的。如以前所述33,34，通过[3H]-胸苷掺入试验，分析增殖，其中将掺入表示为每种条件4-6个孔的平均±SEM cpm。
通过活/死细胞-介导的细胞毒性试剂盒(Molecular Probes, OR)，检测（detenoin）诱导和扩增的细胞的细胞毒性能力35。进行类似的MLR共培养，但是用3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine (DiO) 标记应答者CD4+CD25- T细胞。MLR 培养2和3天后，在37℃用碘化丙啶 (PI)对细胞染色2h，然后通过流式细胞术进行分析。在绿荧光靶细胞上回门控（Back gating），评价PI-阳性细胞的裂解细胞百分比。
使用24-孔平板，在Transwell实验中，检查了CD4高CD25+ Treg的接触依赖性。简而言之，在孔的下隔室中，共培养2 x 105 个应答者CD4+CD25-细胞和2 x 105 个γ-辐照的刺激者PBMC (目标)。在Transwell插入物(0.4 um孔径; Millicell; Millipore)中，培养2 x 105个CD4高CD25+ Treg。在共培养第3天，将等体积培养物从24-孔平板的下隔室转移至96-孔圆底平板，并如上分析增殖。
在有直接抗CTLA-4 (10 μg/ml, Ancell, USA)、IL-4 (10 μg/ml, R&D)、IL-10 (10 μg/ml, eBiosciences)、GITR (2 μg/ml, R&D)、TGF-β (2 μg/ml, R&D)和它们的相关同种型对照的中和mAb存在下，进行封闭研究。
统计分析
使用用于Windows 的Prism 4.00软件 (GraphPad Software, San Diego, CA)，进行图表和统计分析。0.05或更小的P值视作显著的。
实施例1: 通过与CD40-配体转染的细胞或可溶性六聚体CD40-配体一起温育扩增的CD40-活化的B细胞表达高水平的MHC和共刺激分子
如以前所报道的27，通过用CD40-配体 (CD40-L) 转染的NIH3T3 (t-CD40-L)细胞、IL-4和低浓度的环孢菌素A处理，可以从在PBMC中包含的循环B细胞扩增未转化的CD40-活化的B细胞。在第8天时，CD19+CD3- B细胞的纯度是至少83%，在第12天时超过95%。在培养28-32天时，超过99%的细胞是CD19+CD3- B细胞。为了评价B细胞的扩增速率，我们监测从来自8个未选择的健康成年供体的5.0 ml 外周血生产的CD19+CD3-细胞的绝对数。我们发现，培养32天后，生产了8.1-54.3 x 107 个CD40-活化的B细胞(图1A)。我们接着测定了可溶性六聚体CD40-配体 (sCD40-L)是否可以代替t-CD40-L用于B-细胞活化和扩增，因为t-CD40-L是异种的，且在人的过继免疫方法中是潜在地不希望的污染物。我们发现，sCD40-L以剂量依赖性的方式扩增B细胞(图1B)。在1.0 μg/ml的浓度，它象t-CD40-L一样有效地促进B-细胞扩增(图1B)。使用sCD40-L或tCD40-L生产的CD40-活化的B细胞在第8天表达高水平的MHC I和II类分子和共刺激分子CD80和CD86(图1 C)，且这些分子的表达此后保持稳定。
实施例2: 通过CD40-活化的B细胞诱导的人同种异体反应性的CD4高细胞是Treg
为了确定同种异体的CD40-活化的B细胞是否可以从CD4+CD25- T细胞诱导Treg，用同种异体的CD40-活化的B细胞刺激纯化的循环CD4+CD25- T细胞 (纯度>99%) 7天。令人惊奇地，在同种异体刺激5天后，诱导了具有显著上调水平的CD4 表面表达的新细胞子集，且这些CD4高细胞中的大部分丧失CD45RA表达 (图2A)，并获得CD45RO表达 (数据未显示)。此外，这些CD4高细胞中的大部分也丧失CFSE 染色，而CD4中细胞仍然维持它们的CFSE含量(图2A)，表明诱导的CD4高细胞是增殖的同种异体反应性的细胞。这些推测的同种异体反应性的CD4高细胞表达CD25和Foxp3，而CD4中细胞不表达这两种Treg标志物 (图2B)。这些发现一起表明，CD40-活化的B细胞优先扩增CD4高CD25+Foxp3+ Treg 细胞群体。在该共培养系统中，使用通过FACS分选出的高度纯化的CD4+CD25- T细胞 (纯度>99.9%)，我们也发现了类似的结果(数据未显示)。因而，得到的CD4高CD25+Foxp3+ Treg 不太可能是污染最初培养物的CD4+CD25+ T细胞的扩增的结果。
为了检查从CD4+CD25-细胞诱导的CD4高CD25+Foxp3+ Treg的功能和同种异体抗原特异性，使用了MLR试验。如图2C所示，同种异体刺激7天后，通过FACS分选出CD4高CD25+和CD4中CD25-细胞，然后加入MLR试验。CD4中细胞不抑制最初的目标或第三方同种异体抗原-诱导的增殖，而CD4高CD25+细胞抑制目标-和第三方-抗原诱导的增殖，尽管它们对第三方同种异体抗原-诱导的增殖的抑制效应低于由目标同种异体抗原介导的抑制效应(图2C)。因而，从CD4+CD25-细胞生产的CD4高CD25+ Treg在MLR试验中被有效抑制，但是它们的抑制不是同种异体抗原-特异性的。
实施例3: CD40-活化的B细胞可以从首次用于实验的CD4+CD25-细胞诱导同种异体抗原-特异性的CD4高CD25+ Treg
我们接着测定了，通过与同种异体的CD40-活化的B细胞一起共培养，是否可以从纯化的首次用于实验的CD4+CD25-细胞 (CD4+CD45RA+CD45RO- CD25+)生产同种异体抗原-特异性的Treg。正如未分离的CD4+CD25- T细胞的情况，通过与CD40-活化的B细胞一起共培养扩增的首次用于实验的 CD4±CD25-细胞在培养7天后也获得CD4高、CD25+和Foxp3+ 表型 (图3A)。此外，这些CD4高CD25+Foxp3+ Treg在同种异体刺激7天时经历了7-8次细胞分裂(图3A)。相反，CD4中细胞既不分裂也不表达CD25和Foxp3 (图3A)。
我们进一步检查了从首次用于实验的前体诱导的CD4高CD25+ Treg的抑制能力和同种异体抗原特异性。这些CD4高CD25+ Treg 明显抑制了最初的目标同种异体抗原-诱导的增殖，而CD4中CD25-细胞没有表现出实质的抑制能力(图3B)。重要的是，诱导的CD4高CD25+ Treg不能抑制第三方同种异体抗原-诱导的增殖(图3B)。这些数据证实，通过同种异体的CD40-活化的B细胞从首次用于实验的 CD4+CD25- T细胞诱导的CD4高CD25+ Treg是同种异体抗原-特异性的。
从首次用于实验的前体生产的CD4高CD25+ Treg具有非常高的抑制潜力：即使在1:256的Treg:应答细胞(CD4+CD25-)细胞比，目标同种异体抗原-刺激的增殖被抑制了接近50%。在1:16或更高的Treg:应答细胞比，目标同种异体抗原-刺激的增殖几乎被完全抑制(图3B)。用含有接近80%的CD4高CD25+ T细胞和20%的CD4中CD25- T细胞的未分选的CD4+ T细胞，也观察到了该高度抑制潜力， 表明污染CD4中CD25-细胞不会干扰Treg 活性，因此不需要通过FACS分选去除(图3B)。
实施例4: CD4高CD25+Foxp3+ 同种异体抗原-特异性的Treg的表征
我们进一步表征了诱导的CD4高CD25+Foxp3+ 同种异体抗原-特异性的Treg群体的表型。在培养第3天时，CD25从低基线水平明显上调，且在第3天和第10天时分别有超过90%和95%的CD4高细胞表达CD25，然而，培养多达10天，在CD4中细胞中没有CD25上调(图4A)。记忆T-细胞标志物CD45RO也在CD4高和CD4中细胞中上调，但是同时，在培养10天后，95%的CD4高细胞是CD45RO，且仅约50%的CD4中细胞具有该表面表型。不同于以前的报道，其指示CD27和CD44的表达可以区分人和小鼠中的功能性的CD4+CD25+ Treg36,37，我们没有发现CD4高Treg与CD4中T细胞相比或在CD4高CD25+ Treg群体内的CD27和CD44 表面表达的显著差异(图4A)。大多数诱导的CD4高 Treg在培养6天后丧失了它们的CCR7表达，表明它们具有记忆/效应样表型和向炎症组织迁移的趋向，而不是经历淋巴结和血液之间的再循环38。但是，CD4高Treg仍然维持高水平的CD62L表达，它们可能通过高内皮小静脉赋予有效的淋巴结归巢。
我们接着检查了以前参与Treg的抑制活性的蛋白的表达，包括细胞毒性的T淋巴细胞抗原-4 (CTLA-4或CD 152)、糖皮质激素-诱导的TNF受体(GITR)、IL-10和TGF-β39。图4表明，细胞表面CTLA-4和GITR在第3天时可明显检出且逐渐增加，所以在第6天和第7天之间分别有约30%和45%的CD4高Treg表达表面 CTLA-4和GITR。此后表面表达逐渐下降。总CTLA-4和GITR表达表现出不同的动力学，因为它们从第3天逐渐增加，所以基于细胞内染色，在培养10天后，分别有约60%和30%的CD4高CD25+ Treg表达CTLA-4和GITR (图4B)。相反，CD4中CD25- T细胞在表面上或在细胞内表达微量的或不表达CTLA-4和GITR 分子(图4)。在培养10天期间，CD4中CD25-细胞和CD4高CD25+ Treg表达微量的或不表达可检出的IL-10和TGF-P (图4B)。这些数据一起表明，CTLA-4或GITR是、但1L-10和TGF-β不是CD4高CD25+ Treg抑制活性的潜在介导物。
实施例5: CD4高CD25+ Treg缺乏细胞毒性能力，且通过需要细胞-细胞接触并部分地包含CTLA-4表达的机理进行抑制
为了确定CD4高CD25+ Treg抑制的机理，我们首先测定了CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg是否对应答细胞 (CD4+CD25-)具有细胞毒性活性，如以前的研究所证实的，Treg的抑制依赖于它们的细胞毒性40,41。在MLR的2-3天期间，CD4高CD25+ Treg没有杀死应答细胞或诱导它们的细胞凋亡 (图5A)，表明CD4高CD25+ 同种异体抗原-特异性的Treg的抑制不是由细胞-介导的细胞毒性介导。
我们接着测定了CD4高CD25+抑制是否由从Treg释放的可溶分子单独介导。如图5B所示，当在Transwell培养系统中将应答细胞与诱导的CD4高CD25+ Treg物理地分离时，抑制消失。将IL-10、TGF-β、IL-4或GITR的中和单克隆抗体 (mAb)加入MLR 培养物，对CD4高CD25+ Treg的抑制同种异体抗原-特异性的增殖的能力几乎没有影响或无影响(图5C)。相反，CTLA-4的抗体阻断部分地逆转CD4高CD25+ Treg抑制 (图5C)。这些数据一起表明，CD4高CD25+ Treg-介导的同种异体抗原应答的抑制是细胞-细胞接触依赖性的，且部分地通过CTLA-4介导。
实施例6: 通过CD40-活化的B细胞可以大规模地连续扩增CD4高CD25+ Treg，且不丧失功能，外源性 IL-2不会增强细胞扩增
我们检查了与同种异体的CD40-活化的B细胞一起共培养首次用于实验的CD4+CD25- T细胞3周来生产Treg的能力，其中每周加入新生产的CD40-活化的 B细胞。如图6A所示，CD4高CD25+ Treg逐渐增加，在第21 天时超过92%的培养的T细胞是CD4高CD25+ Treg (图6A)。使用10个健康的随机选择的成年供血者，在培养21天期间，我们能扩增CD4高CD25+ Treg 6.4 x 105至1.6 x 107倍(图6B)。该扩增不需要外源性的IL-2，因为的它的加入没有增加CD4高CD25+ Treg细胞的生产(图6C)。为了更精确地测定扩增速率，我们在培养开始时使用了标准数目的首次用于实验的CD4+CD25- T细胞 (1 x 106个)，并发现，从10个未选择的供体的每1 x 106个首次用于实验的CD4+CD25- T细胞，可以生产约8.3 x 106个 (范围是5.4-11.3 x 106个)的CD4高CD25+ Treg (图6D)。此外，在培养21天时评价的扩增的CD4高CD25+ Treg具有类似的抑制能力和同种异体抗原特异性(图6E)，因为在更短的体外培养时间段内生产了Treg。另外，这些Treg仍然维持它们的高水平的Foxp3表达(数据未显示)。这些结果一起证实，CD40-活化的B细胞可以在可能与临床免疫疗法有关的规模诱导和扩增CD4高CD25+Foxp3+ 同种异体抗原-特异性的Treg。
关于给定特征的任意数字或数字范围，来自一个范围的数字或参数可以与来自相同特征的不同范围的其它数字或参数相组合，以产生数字范围。
除了在操作实施例中以外，或在另有说明的情况下，在说明书和权利要求书中使用的提及成分、反应条件等的量的所有数字、值和/或表述，应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的，根据它们的各种修饰或变化将暗示给本领域技术人员，且被包括在本申请的精神和范围内。
参考文献目录
Claims (8)
1.诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞的方法，其包含：
使同种异体的CD40-活化的B细胞接触首次用于实验的CD4+CD25-T细胞一段时间，该段时间足以诱导、扩增和/或生产同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞；
其中所述同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞是CD4髙CD25+Foxp3+调节性T细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述时间段是21天，且在没有外源性细胞因子的情况下进行同种异体的CD40-活化的B细胞与首次用于实验的CD4+CD25-T细胞的接触。
3.根据权利要求1的方法，另外包含，从外周血获得首次用于实验的CD4+CD25-T细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中对于每1x106个首次用于实验的CD4+CD25-T细胞生产6.4x105至1.6x107个同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞。
5.根据权利要求1的方法，其中对于每1x106个首次用于实验的CD4+CD25-T细胞生产6x106至1.1x107个同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞。
6.根据权利要求1的方法，其中所述同种异体抗原-特异性的人调节性T细胞可以冷藏保存和解冻，而不丧失功能。
7.通过权利要求1的方法生产的细胞。
8.权利要求7的细胞在生产用于治疗GVHD和/或同种异体移植物排斥的药剂中的应用。
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