CN102083848B - 检测探针 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以检测核酸的核苷酸探针，其由包含三个片段的标记的核苷酸链组成：-具有第一闭合序列的第一片段，-第二片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列，-具有第二闭合序列的第三片段，以及-至少两个标记，所述检测探针的链的末端之一无任何标记，其中，当两个闭合序列杂交在一起时，检测探针具有完整的环状形状，所述闭合序列因此将所述探针保持于在不存在所述靶核酸的条件下不能被检测的构象。本发明还涉及应用所述探针进行检测的方法和试剂盒。本发明优选用于诊断领域中。

Description

检测探针
本发明涉及通过核苷酸探针检测核酸。本发明用于诊断领域中。
目前，发现靶核苷酸序列是许多实验室的主要目标，特别是在医药和食品加工领域。在这些领域中，发现靶序列有助于例如检测病原生物、发现在食品加工链中的污染细菌或者诊断与遗传性疾病或者癌症相关的突变。这些方法中的主要难题涉及使用的检验方法的特异性、灵敏性、速度以及结果再现性。这对于提供精确结果、特别是在诊断领域是绝对必要的。
在文献中描述了不同类型的方法。这些方法通常基于核酸核酸互补链的配对性质，通常称作“核酸的杂交”，或者简单称作“杂交”。
通常地，在确定必须分析的生物体或者疾病的特定序列之后，需要从样品中提取核酸，并任选扩增和检测感兴趣的序列。已经开发了许多扩增方法，如PCR、LCR、NASBA、TMA、SDA。也有许多检测技术。由Tyagi和Kramer(Nature Biotech,1996,14:303-308)描述的这些技术之一使用特殊探针，通常称作“分子信标”。这些探针具有发夹结构，包含单链的“环”部分和双链的“茎”部分。所述“环”部分含有靶核酸序列的互补序列，“茎”部分由彼此互补的两个序列形成。“茎”部分的互补序列之一的游离末端用荧光团标记，而“茎”部分的另一链的另一游离末端与荧光猝灭剂结合。在不存在互补靶序列的条件下，检测探针是发夹形状，且所述探针不产生荧光，荧光团的能量被直接转移至荧光猝灭剂。当这个探针与靶序列杂交时，其丧失其构型，5'和3'末端远离，荧光猝灭剂与荧光团互相分离。发射的荧光反映出探针与靶的杂交，这在扩增期间被检测并任选量化。这被称作实时同相检测。然而，这些分子信标探针可展示出在存在某些污染物的条件下“茎”部分的不希望地提前打开。事实上已经观测到分子信标探针通过未知机制与反应混合物中存在的酶相互作用，如NASBA扩增中使用的酶。这些相互作用即使在不存在任何生物靶的条件下也发生，且使得非特异性荧光信号增加。
分子信标探针的合成受到很大的制约，必需针对茎序列非常特别地设 计。事实上，它们可以非特异性杂交待检测的靶，当所述靶含有丰富的GC碱基时特别明显，诱导假阳性或者相当多的背景噪音，影响检测的灵敏性。此外，需要导入两个互补序列以形成茎；所述发夹探针的完整序列包含至少30个核苷酸，而仅20个核苷酸通常为分子识别所需。因此，这些发夹探针的合成产量特别受限。这些探针的另一缺点是难以设计发夹结构，因为“茎-环”结构促进所述环自身折叠以及内部的“环-环”相互作用。因此，在发现具有所需热动力学特性的序列之前通常需要一些设计和合成。
已经提出许多解决方案尝试克服茎的非特异性杂交的问题。因此，Crey-Desbiolles等(Nucleic Acids Res.,May 2005；33:e77)提出用修饰的核苷酸置换所述茎的天然核苷酸，所述修饰的核苷酸互相杂交形成所述茎，但是不能与靶的天然核苷酸杂交。这种方法的主要缺点是需要在识别序列的每个末端导入至少四个或者五个单位的这种修饰的核苷酸，但是其不可商购，使得发夹探针的合成更为复杂。此外，这种方法未解决完整序列的大量核苷酸或者设计发夹结构的难度的问题。
由Browne(J.Am.Chem.Soc.,2005,127,1989–1994)提出的另一解决方案包括在茎的两个序列中插入反向核苷酸。在这个实施方案中，茎的序列不能直接同与杂交于环的序列相毗邻的靶序列杂交，因为其方向与靶是平行的。这种技术的缺点是茎的序列可以与靶的其它更远距离的序列相互作用，所述序列可以折叠且变得易受这种相互作用的影响。此外，通过这种方法未解决完整序列的大量核苷酸数目以及发夹结构不稳定性的问题。
由Tsourkas等(Nucleic Acids Res.,Oct 2002；30:4208-4215)提出的另一解决方案包括设计发夹探针，由此形成茎的序列之一也形成识别序列的一部分。这个解决方案使得可以缩短探针的完整序列。然而，已经观测到与这种设计相关的特异性丧失。此外，对于一些相同的识别序列，这种类型的设计具有较短的环，这限制其灵活性及增强环-环相互作用，使得探针的热动力学特性不太可测。
因此需要新的探针形式，使得可以克服现有技术领域中的缺点。
因此，本发明涉及检测靶核酸的探针，其由包含三个片段的标记的核苷酸链组成：
-具有第一闭合序列的第一片段，
-第二片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列，
-具有第二闭合序列的第三片段，以及
-至少两个标记，所述检测探针的链的末端之一无任何标记，
其中，当两个闭合序列杂交在一起时，检测探针具有完整的环状形状，所述闭合序列因此将所述探针保持于在不存在所述靶核酸的条件下不能被检测的构象。“完整环状”是指所述探针的构象，其中两个闭合序列互相杂交形成双链体，所述闭合序列之一的末端之一与另一闭合序列的相对末端通过识别序列连接，一起形成如图1和2所示的圆。与发夹结构相反，这种构象使得可以保持环序列线性排列，在所述茎的两端之间拉伸，这样防止环序列中的内部相互作用，也能够促进互补的靶与其接近。
在本发明的一个实施方案中，所述检测探针特征在于第一标记由第一片段的一核苷酸携带，第二标记由第二片段或者第三片段的一核苷酸携带，当这两个闭合序列杂交时所述两个核苷酸相邻。
根据本发明的一个优选实施方案，所述检测探针特征在于两个闭合序列的全部或者一部分平行杂交。有利地，所述闭合序列之一是由α-异头核苷酸组成的序列。
根据本发明的另一优选实施方案，所述检测探针特征在于两个闭合序列的全部或者一部分反平行杂交。有利地，两个闭合序列之一通过5′-5′或者3′-3′反向键(inverted bond)结合于所述识别序列。
有利地，至少一个标记是荧光团，至少另一标记是荧光猝灭剂。因此，当两个闭合序列杂交在一起时，携带标记的核苷酸相邻，由此发射后的荧光团的能量的全部或者大部分被转移至荧光猝灭剂。优选地，两个标记由彼此位置相对的核苷酸携带，这两个核苷酸通过氢键结合在一起，形成碱基对，或者间隔1-5个核苷酸。
有利地，第一或者第二闭合序列的全部或者一部分可以与靶序列杂交。这种构象有助于更好地控制荧光团与荧光猝灭剂之间的缺口；因为所述闭合序列之一固定在靶上，如果这两个闭合序列均是柔性单链构象则不能彼此接近。这种构象也具有减少可以非特异性反应的游离核苷酸数目以及减少完整序列的核苷酸数目的优势。有利地，所述探针的长度在25-40个核苷酸之间。
根据先前的实施方案，一旦与靶序列杂交，探针具有参与杂交的闭合序列，而另一闭合序列由于其相反方向或者存在α核苷酸而不能杂交。这种构象使得可以限制非特异性杂交。此外，在探针的设计期间，给探针添加修饰的(α或者反向的)闭合序列不影响识别序列的设计。因此，设计限于确定与检测条件相关的靶序列的合适互补序列，以及随后在其末端之一加入与能与靶序列杂交的另一闭合序列互补的修饰的(α或者反向)闭合序列，不需要证实与靶的可能的相互作用或者像发夹探针情况中那样在每个末端加入序列。这样因此便于探针的设计。
也有利的是所述闭合序列的长度在6-30个核苷酸之间，优选6-15个核苷酸。
在一个具体的实施方案中，一核苷酸序列附着于所述检测探针。优选地，其附着于天然闭合序列的末端，所述天然闭合序列是既非反向也非由α核苷酸组成的序列。因此，本发明的检测探针可以适合于专利申请WO-A-07/114986所谓的“触手探针(tentacle probe)”的探针设计。
本发明的检测探针可以用于其中核苷酸探针用于检测靶核酸的任何检测中。因此，本发明的另一目的涉及检测样品中可能存在的靶序列的方法，所述方法包括如下步骤：
-将样品与本发明的检测探针接触，
-检测所述检测探针与靶序列之间杂交体的形成，杂交体的形成表示所述样品中存在所述靶序列。
在本发明优选的实施方案中，检测是与靶序列的扩增反应一起进行的；即所谓的实时检测。在另一优选的实施方案中，在靶序列的扩增反应之后进行检测；即所谓的“终点”检测。所述扩增反应可基于任何扩增方法，线性或者指数扩增，如PCR、LCR、NASBA、TMA、SDA、RCA。优选地，所述扩增方法是产生单链DNA或者RNA核酸的扩增方法，如NASBA、TMA或者不对称PCR。
本发明另一目的涉及检测靶序列的包含本发明至少一种检测探针的试剂盒。所述试剂盒任选含有进行扩增反应必需的试剂和引物序列。例如，适于NASBA扩增的本发明的试剂盒可含有核苷酸和扩增酶，如逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶。
提供如下定义以更好地理解本发明。
术语“核酸”或者“核苷酸序列”是指至少两个脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的链，任选包含至少一个修饰的核苷酸，例如具有修饰的核酸碱基的至少一个核苷酸，如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者允许杂交的任何其它修饰的碱基。这个多核苷酸也可以在核苷酸间键水平修饰，例如硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯；在主链水平修饰，如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或者PNA(M.Egholm et al.，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或者2′-O-烷基核糖以及LNA(BW，Sun et al.，Biochemistry，4160-4169，43，2004)。所述核酸可以是天然或者合成的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA、通过酶扩增技术获得的核酸，所述扩增技术如：
·PCR(聚合酶链反应)，在专利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中描述，及其衍生的RT-PCR(逆转录PCR)，显然是单一步骤(single-stage)形式，如在专利EP-B-0,569,272中描述；
·LCR(连接酶链反应)，在专利申请EP-A-0,201,184中揭示；
·RCR(修复链反应)，在专利申请WO-A-90/01069中描述；
·3SR(自主序列复制)，见专利申请WO-A-90/06995所述；
·NASBA(基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO-A-91/02818所述；
·TMA(转录介导的扩增)，见专利US-A-5,399,491所述；以及
·RCA(滚环扩增)，见专利US-6,576,448所述。
在本发明中，“靶”或者“靶核酸”是指这样的核苷酸序列，其中至少一部分核苷酸单位链是特异于且互补于所用检测探针的核苷酸序列。所述靶可以是天然的，或者得自体外酶扩增反应，如NASBA(基于核酸序列的扩增)、PCR(聚合酶链反应)或者本领域技术人员已知的任何其它技术。当靶序列得自体外扩增反应时，通过这种扩增产生的序列被称作“扩增子”。
“检测探针”是指10-100个核苷酸单位的核酸序列，特别是10-50个核苷酸单位，优选25-40个核苷酸。这种探针包含称作第二片段的核苷酸片段，至少一部分核苷酸单位链特异于且互补于靶核苷酸序列。这种探针还包含称作第一个和第三片段的两个其它片段，每个片段均具有其长度在6-30个核苷酸之间的闭合序列，优选在6-15个核苷酸之间。
“第一片段”是指这样的核苷酸序列，当存在第三片段时，其可以与第三片段互补以及极性适于所述第三片段。
“第二片段”是指极性适于靶序列的互补核苷酸序列。
“第三片段”是指极性适于第一片段的互补核苷酸序列。
“标记”是指由核苷酸携带的分子。所述标记与核苷酸之间的键合可以由本领域技术人员通过各种方式实现。人工结合是通过使用携带活性基团的标记进行，典型为羧基或者巯基(thiol)基团，其与携带相应反应基团(例如胺或者巯基)的修饰的内部核苷酸结合，或者与用这些相同反应基团修饰的核苷酸链的一个末端结合。自动结合是通过使用携带标记的亚磷酰胺(phosphoroamidites)，然后在核苷酸链的自动合成期间与链的一个末端或者在内部位置发生结合而实现，根据所用亚磷酰胺的类型而定。
“荧光团”是指当由合适波长的光激发时发射荧光信号的分子。所述荧光团可以是若丹明或者衍生物如德克萨斯红，荧光素或者衍生物，Alexa家族荧光团如Alexa532和Alexa647、Alexa 405、Alexa 700、Alexa 680，或者任何其它合适的荧光团，根据使用的测量仪器而定。适于检测探针的荧光团各不相同，这些为本领域技术人员已知。
在本发明中，“荧光素”是指芳香族化学分子，当由波长为大约495nm的光激发时，其发射荧光信号，在大约530nm处的发射最大。
“荧光猝灭剂”或者“猝灭剂”是指干扰由荧光团发射的荧光的分子。这种猝灭剂可以选自非荧光芳香族分子，以避免寄生发射。优选地，所述猝灭剂是Dabsyl或者Dabcyl或者Black hole quencherTM″，其是非荧光芳香族分子，当其与荧光团物理上相邻近时防止荧光团发射荧光。也可以使用荧光能量共振转移(FRET)技术，如在Fluorescent Energy Transfer NucleicAcid Probes，p.4，Ed.V.V.Didenko，Humana Press 2006，ISSN 1064-3745中描述。所述猝灭剂也可以选自荧光分子，例如TAMRA(羧基四甲基若丹明)。
“极性”是指核苷酸序列相对于其互补序列的方向，5′-3′或者3′-5′。因此，节段可以是如此方向：
·反平行：在这种情况中，寡核苷酸以相反方向与互补序列杂交。在本发明中，一个实施方案是具有这样的一个闭合序列，其由反向核苷酸组成，由此当所述闭合序列与另一闭合序列杂交时，检测探针是环状的。
·平行：在这种情况中，寡核苷酸以相同方向与互补序列杂交。在本 发明中，一个实施方案是具有这样的一个闭合序列，其由α核苷酸组成，由此当所述闭合序列与另一闭合序列杂交时，检测探针是环状的。
“杂交”是指这样的过程，即在合适条件下，具有完全或者部分互补序列的两个单链核苷酸片段可以形成由核酸碱基之间的氢键稳定的双链或者“双链体”。所述杂交条件由操作条件的严格性和低盐度决定。当在更严格条件下进行时，杂交是更特异性的。严格性是根据探针/靶双链体的碱基成分以及两个核酸之间的错配程度而定义。严格性也与反应变量相关，如杂交溶液中存在的离子浓度和类型、变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。其中杂交反应必须进行的条件的严格性主要依赖于使用的杂交探针。所有这些数据均为本领域技术人员熟知，且技术人员可以确定适当的条件。
“α核苷酸”或者“α异头核苷酸”是指具有非天然α-异头构型的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸，其中由脱氧核糖的异头碳携带的含氮碱基位于平面下方，而不是在β核苷酸情况中的位于平面上方。α核苷酸的含氮碱基可以是修饰的核酸碱基，如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者允许杂交的任何其它修饰的碱基。α核苷酸也可以在核苷酸间键水平修饰，例如硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯；或者在主链水平修饰，如2′-O-烷基核糖、PNA和LNA。优选地，所述α核苷酸是在专利申请WO-A-88/04301中描述的那些核苷酸。
“反向核苷酸”是指与含有其的序列相反方向的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸。传统上以3′-5′方向合成，反向核苷酸以5′-3′方向被导入核苷酸链其他部分之后或者之前。反向核苷酸和链的其他部分通过5′-5′或者3′-3′键连接在一起。参见Koga M.et al.，J.Org.Chem.，1991，56，3757。反向核苷酸可任选包含至少一个修饰的核苷酸，例如具有修饰的核酸碱基的至少一个核苷酸，如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者允许杂交的任何其它修饰的碱基。反向的核苷酸也可以在主链水平修饰，例如PNA、2′-O-烷基核糖和LNA。
“末端”是指寡核苷酸合成的起始点和终点，通常由第一个或者最后一个核苷即3′或者5′携带的游离羟基数目限定。应理解适当选择延长单位(α或者β核苷的亚磷酰胺，反向或者非反向)，可以合成3′-5′方向或者相反方向的寡核苷酸，或者在合成期间甚至可以交替延长方向。这样导致寡核苷 酸携带3′-5′、5′-3′、3′-3′或者5′-5′末端。
在本发明中，“生物样品”是指可含有核酸的任何样品。所述核酸可以从组织、血液、血清、唾液、患者循环细胞中提取，或者可以从食品、加工食品中提取，或者可以来自环境。提取是通过本领域技术人员已知的任何方案进行，例如根据专利EP-B-0,369,063所述分离方法进行。
提供附图是为了举例说明实施例，而无限制之意。通过附图可以更易于理解本发明。
图1：本发明的探针的完整环状构象的实例。
T：dT-FAM，荧光团
小写字母核苷酸：α核苷酸
Q：荧光猝灭剂。
图2：本发明的探针的完整环状构象实例。
T：dT-FAM，荧光团
Q：荧光猝灭剂
小写字母核苷酸：反向核苷酸。
图3：α型B型流感病毒模型的本发明的探针的热变性实验，如实施例1所述(任意单位(RFU，相对荧光单位)的荧光发射与测量的温度(摄氏度(℃))相关)。
图3a：存在其合成的靶的条件下的探针。
图3b：没有靶的单独的探针。
图4：α型HIV模型的本发明的探针的热变性实验，如实施例1所述(任意单位(RFU)的荧光发射与温度(℃)相关)。
图4a：存在其合成的靶的条件下的探针。
图4b：没有靶的单独的探针。
图5：反向型B型流感病毒模型的本发明的探针的热变性实验，如实施例2所述(任意单位(RFU)的荧光发射与温度(℃)相关)。
图5a：存在其合成的靶的条件下的探针。
图5b：没有靶的单独的探针。
图6：反向型HIV模型的本发明的探针的热变性实验，如实施例2所述(任意单位(RFU)的荧光发射与温度(℃)相关)。
图6a：存在其合成的靶的条件下的探针。
图6b：没有靶的单独的探针。
图7：研究本发明的α型探针对B型流感病毒靶模型的杂交特异性的实验。纵坐标示出测量的以摄氏度表示的解链点数值(Tm表示解链温度)，其与分子信标CpinfB(方形符号)的“茎”部分的一条链或者本发明的探针Opa6d(圆形符号)的闭合序列之一的互补核苷酸的数目(横坐标)相关。
图8：研究本发明的α型探针对HIV-1A靶模型的杂交特异性的实验。纵坐标示出测量的以摄氏度表示的解链点数值(Tm)，其与分子信标HIV-1A(方形符号)的“茎”部分的一条链或者本发明的探针Hoa8(圆形符号)的闭合序列之一的互补核苷酸的数目(横坐标)相关。
图9：研究本发明的反向型探针对B型流感病毒靶模型的杂交特异性的实验。纵坐标示出测量的以摄氏度表示的解链点数值(Tm)，其与分子信标CpinfB(方形符号)的“茎”部分的一条链或者本发明的探针Opi6d(圆形符号)的闭合序列之一的互补核苷酸的数目(横坐标)相关。
图10：研究本发明的反向探针对HIV-1A模型的杂交特异性的实验。纵坐标示出测量的以摄氏度表示的解链点数值(Tm)，其与分子信标HIV-1A(方形符号)的“茎”部分的一条链或者本发明的探针Hoi8(圆形符号)的闭合序列之一的互补核苷酸的数目(横坐标)相关。
图11：在反应混合物中存在污染物的条件下对分子信标探针和本发明的探针的不希望的提前开放的研究。
图11a：在存在T7 RNA聚合酶的条件下测量探针的荧光信号(任意单位，通过将每个数值除以与时间(以分钟表示)相关的最小初始数值标准化荧光)。
图11b：在不存在T7 RNA聚合酶的条件下测量探针的荧光信号(任意单位，通过将每个数值除以与时间(以分钟表示)相关的最小初始数值标准化荧光)。
图12：在本发明的探针中使用的各种结构的示意图。
图12a：使用的不同核苷酸的结构：核苷酸1＝β-异头核苷酸，核苷酸2＝α-异头核苷酸，核苷酸3＝反向核苷酸。
图12b：本发明的探针的闭合序列的杂交实例，当其中一条链由α核苷酸组成时，其中：T是dT-FAM，即这个分子的荧光团；Q相应于荧光猝灭 剂；小写字母的核苷酸是这个图右手侧的α核苷酸，而用虚线画出的圆示出在这个图左手侧的这些相同的α-异头核苷酸；最后，在这个图右手侧的大写字母的核苷酸是β核苷酸，其在左手侧含有非环形的碱基B。
图12c：本发明的探针的闭合序列的杂交实例，当其中一条链由反向核苷酸组成时，其中：T是dT-FAM荧光团；Q是荧光猝灭剂；小写字母核苷酸是反向核苷酸；用虚线画出的圆示出5′-5′键。
在下文提供的所有实施例中使用的本发明的探针、分子信标探针和靶核酸是通过本领域技术人员已知的亚磷酰胺(phosphoroamidites)合成方法合成的。亚磷酰胺合成方法由Beaucage和Lyer(Tetrahedron，48，223-2311，1992)描述。试剂和亚磷酰胺可商购，主要购自Eurogentec S.A.(Seraing，Belgium)和Glen Research(Sterling，Virginia，USA)。用于导入修饰的α核苷酸的α亚磷酰胺购自Chemgenes(Wilmington，MA，USA，catalog No.ANP-1651，ANP-1652，ANP-1653，ANP-1654)。用于导入反向核苷酸的反向亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，Virginia，USA，catalog No.10-0001，10-0101，10-0201，10-0301)。寡核苷酸通过HPLC纯化。其纯度也通过HPLC分析监测，其相同性通过Maldi-TOF质谱分析监测。
本发明的探针和分子信标中使用的标记是：
-Dabsyl荧光猝灭剂(Glen Research，Cat.No.20-5912)，称作Da，
-FAM(荧光素-胺)荧光团，Molecular Probes，Cat.No.C-2210，
-FAM(荧光素-胺)荧光团，附着于脱氧胸腺嘧啶核苷酸(Glen Research，Cat.No.10-1056)，称作dT-FAM。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针在存在互补靶序列的条件下能通过杂交产生荧光信号。
实验设计
使用的探针如下所示：
B型流感病毒模型-Opa6d探针(SEQ ID No.1)：
5′-gaccgtctg(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAC-3′Da 
HIV模型-HOa8探针(SEQ ID No.2)：
5′-accctatctc(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-
3′Da
下划线处的核苷酸序列相应于本发明探针的闭合序列。
探针中小写字母的核苷酸相应于α型核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
B型流感病毒模型，靶cC(SEQ ID No.3)：
5′-TTTAGTTTTTGGACGTCTTCTCCTTT-3′
HIV模型，靶cH4(SEQ ID No.4)：
5′-TTTACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATTTT-3′
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，0.1μM浓度，
-合成的靶序列，1.25μM浓度。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样可以观测单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，TheNetherlands)中加热至65℃，并冷却5小时。在冷却期间测量在520nm的每个溶液的荧光。
结果
获得的结果示于图3和4。
探针Opa6和Hoa8在存在其各自合成的靶序列的条件下(图3a和4a)呈现出预期的荧光图：在低温度下，探针与其靶序列杂交，荧光团与猝灭剂距离最大。荧光最大。在高温度下，探针/靶双螺旋不稳定，探针变成单链，荧光团与猝灭剂之间的距离降低，导致荧光降低。探针/靶双螺旋的热稳定性由“Tm-靶”数值示出。Tm相应于曲线荧光转折点＝f(温度)。Tm-靶以曲线的一阶导数(first derivative)的最小值计算。探针Opa6和Hoa8具有的Tm-靶(见表1)使其在NASBA扩增反应的温度41℃下保持与其靶序 列杂交，且因此在存在其靶序列条件下产生最大荧光信号。
单独的Opa6d和Hoa8探针(图3b和4b)呈现出预期的荧光图：在低温度下，探针是环状结构，荧光团与猝灭剂非常接近。发射的荧光微不足道。在高温度下，二级结构解离，荧光团远离猝灭剂，发射的荧光逐渐增加，当二级结构完全变性时达到稳定期(plateau)。探针的二级结构的热稳定性以“Tm-探针”数值表示，其相应于曲线荧光转折点＝f(温度)。Tm-探针以曲线的一阶导数的最大值计算。探针Opa6和Hoa8具有的Tm-探针(见表1)使其在NASBA扩增反应的温度41℃下保持闭合，且因此在不存在其靶序列条件下产生最小的残余荧光信号。
“开放/闭合比率”，也称作“O/C比率”，使得可以测量在存在其靶序列的条件下在41℃由探针产生的信号水平。以探针在存在其靶序列的条件下产生的信号与由单独的探针产生的残余信号的比率计算。
表1示出了在这个实施例中描述的使用探针获得的Tm-探针、Tm-靶和O/C比率的数值。
表1：Tm-探针、Tm-靶和O/C比率的数值
结论
B型流感病毒和HIV模型的α型本发明的探针单独在溶液中形成在41℃稳定的二级结构，由于荧光团与猝灭剂邻近而导致荧光信号消除。
当其在存在其靶序列条件下在溶液中时，其与其合成的靶序列杂交，产生可测量的荧光信号。
目的
这个实验的目的是证实根据本发明修饰的探针通过在存在互补靶序列的条件下能通过杂交产生荧光信号。
实验设计
使用的探针如下所示：
B型流感病毒模型-探针Opi6d(SEQ ID No.5)：
5′-Da-GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGA-3′-(dT-FAM)-3′- -
5′
HIV模型-探针HOi8d(SEQ ID No.6)：
5′-Da-CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-3′-(dT-FAM)-3′- -5′
下划线处序列相应于本发明探针的闭合序列。
小写字母和粗体所示核苷酸相应于反向核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
B型流感病毒模型，靶cC(SEQ ID No.3)：
5′-TTTAGTTTTTGGACGTCTTCTCCTTT-3′
HIV模型，靶cH4(SEQ ID No.4)：
5′-TTTACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATTTT-3′
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，The Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μM，
-合成的靶序列，浓度为1.25μM。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样可以观测单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，TheNetherlands)中加热至65℃，并冷却5小时。在冷却期间测量在520nm的每个溶液的荧光。结果以温度对荧光图形式表示。
结果
获得的结果示于图5和6。
探针Opi6和Hoi8d在存在其各自合成的靶序列的条件下(图5a和6a)呈现出预期的荧光图：在低温度下，探针与其靶序列杂交，形成足以使荧光团远离猝灭剂的双链体。在这个双链体中，这两个分子距离最大。发射的荧光最大。
在高温度下，探针/靶双螺旋解离，探针变成单链。在这种情况中，即使这个探针内的二级结构解离，由于变性探针的柔性而导致荧光团与猝灭剂之间的距离仍低于在探针/靶双链体中的距离。这样导致荧光降低。探针/靶双螺旋的热稳定性由“Tm-靶”数值示出，其相应于曲线荧光转折点＝f(温度)。Tm-靶以曲线的一阶导数(first derivative)的最小值计算。探针Opi6和Hoi8d具有的Tm-靶(见表2)使其在NASBA扩增反应的温度41℃下保持与其靶序列杂交，且因此在存在其靶序列条件下产生最大荧光信号。
单独的Opi6d和Hoi8d探针(图5b和6b)呈现出预期的荧光图：在低温度下，探针是环状结构，荧光团与猝灭剂非常接近。发射的荧光微不足道。在高温度下，二级结构解离，荧光团远离猝灭剂，发射的荧光逐渐增加，当二级结构完全变性时达到稳定期(plateau)。探针的二级结构的热稳定性以“Tm-探针”数值表示，其相应于曲线的转折点。Tm-探针以曲线荧光＝f(温度)的一阶导数的最大值计算。探针Opi6d和Hoi8d具有的Tm-探针(见表2)使其在NASBA扩增反应的温度41℃下保持闭合，且因此在不存在其靶序列条件下产生最小的残余荧光信号。
“开放/闭合比率”，也称作“O/C比率”，使得可以测量在存在其靶序列的条件下在41℃由探针产生的信号水平。以探针在存在其靶序列的条件下产生的信号与由单独的探针产生的残余信号的比率计算。
表2示出了在这个实施例中描述的使用探针获得的Tm-探针、Tm-靶和O/C比率的数值。
表2：Tm-探针、Tm-靶和O/C比率的数值
结论
B型流感病毒和HIV模型的反向型本发明的探针单独在溶液中形成在41℃稳定的二级结构，由于荧光团与猝灭剂邻近而导致荧光信号消除。
当其在存在其靶序列条件下在溶液中时，其与其合成的靶序列杂交，产生可测量的荧光信号。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针在NASBA扩增期间能检测其靶序列。
实验设计
扩增的靶序列是长度为212个核苷酸的RNA，通过从质粒中转录合成，根据本领域技术人员已知的体外转录技术进行。这个RNA的序列相应于B型流感病毒基因组序列。
使用的引物和探针如下所示：
引物：
P1(SEQ ID No.7)：
5′- GAGCTCTGCTTTAGCACTTCCA-3′
P2(SEQ ID No.8)：
5′-GAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTA-3′
Opa6d探针(SEQ ID No.1)：
5′-gaccgtctg(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAC-3′Da 
引物P1中斜体字表示的节段相应于由T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，为NASBA体外酶扩增所必需。
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列。
Opa6d探针中小写字母所示核苷酸相应于α型核苷酸。
引物P1的3′节段与靶RNA序列互补。引物P2的序列与位于引物P1的互补序列的5′末端的靶RNA序列相同。NASBA扩增反应产生大量RNA序列拷贝，称作“扩增子”，其序列相应于靶RNA的互补序列，在引物P1的杂交序列与等于引物P2序列的序列之间。本发明的探针包含识别序列，其与通过NASBA扩增反应产生的扩增子杂交。因此，由探针产生的信号只有在靶RNA序列存在于反应混合物中且用选择的引物通过NASBA扩增时才被检测。
NASBA扩增反应是通过使用“NASBA基本试剂盒”试剂(bioMérieuxB.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.60079136 & 60085192)及在厂商指定条件下进行。每个扩增试管含有终体积20μl，其由如下材料组成：
·8.64μl的由厂商指定比例的“基本试剂盒”试剂，
·0.4μl的引物P1，10μM，
·0.4μl的引物P2，10μM，
·0.16μl的Opa6d探针，10μM，
·5μl的RNA靶，浓度足以获得终浓度为5、50、500或者5000拷贝/反应试管。
在所有情况中，均制备阴性对照，其含有“无DNase/RNase”水(catalogNo.32739，ACROS)。所有实验均一式两份进行。
在65℃变性5分钟及在41℃保温2分钟之后，将5μl的“酶混合物”试剂(1μl“酶”accusphere 60085111加入45μl的“酶”稀释液60085192，“NASBA基本试剂盒”的一部分)加入反应混合物中。然后将该反应混合物导入荧光检测仪中，其温度设定为41℃，利用荧光检测仪的Director 2.0软件监测反应(EasyQ reader，bioMérieux B.V，Boxtel，the Netherlands)，在520nm读取90分钟由FAM荧光团发射的荧光。
在反应结束时，获得每个试管的检测图，带有“Alpha3”和“MSR”的数值。数值“Alpha3”是“引物耗竭时间”，如Weusten et al.(Nucleic AcidsResearch 2002，vol.30，No.6，e26)所述。这个数值相应于开始可以检测的荧光信号增加的时间。扩增越快及因此越有效，则Alpha3数值越短。
数值“MSR”是“最大信号比率”。这个数值相应于在扩增反应结束时读取的荧光值与理论上的最终荧光值的比率，所述理论上的最终荧光值是从在信号开始增加之前的初始数值中推断的。这个数值是探针获得的信号水平，对于认为是阳性的信号必须高于1。这两个数值由EasyQ读器的软件针对每个样品自动计算和显示。
结果
NASBA实时检测结果未示出，但是如果需要可以获得。可以看出检测限度是5个拷贝靶转录体。阳性样品产生可检测的信号，最佳“MSR”为4.47，“Alpha3”数值在23-31分钟之间。
结论
本发明的Opa6d探针在溶液中存在其靶序列的条件下能发射可检测的荧光信号，特征在于最佳信号水平为4.47(MSR)。表示信号开始变得可检测的时间的“Alpha3”数值在23-31分钟之间。“Alpha3”与存在的靶序列 的量成正比，其赋予基于这个数值量化靶序列的可能性。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针在NASBA扩增期间能检测其靶序列。
实验设计
扩增的靶序列是长度为212个核苷酸的RNA，通过从质粒中转录合成，根据本领域技术人员已知的体外转录技术进行。这个RNA的序列相应于B型流感病毒基因组序列。
使用的引物和探针如下所示：
引物：
P1(SEQ ID No.7)：
5′- GAGCTCTGCTTTAGCACTTCCA-3′
P2(SEQ ID No.8)：
5′-GAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTA-3′
Opi6d探针(SEQ ID No.5)：
5′-Da-GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGA-(dT-FAM)-3′-3′- -5′
下划线处节段相应于本发明的探针的闭合序列。
P1引物中斜体字所示节段相应于由T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，其为NASBA体外酶扩增所必需。
Opi6d探针中小写字母和粗体字所示核苷酸相应于反向核苷酸。
引物P1的3′节段与靶RNA序列互补。引物P2的序列与位于引物P1的互补序列的5′末端的靶RNA序列相同。NASBA扩增反应产生大量RNA序列拷贝，称作“扩增子”，其序列相应于靶RNA的互补序列，在引物P1的杂交序列与等于引物P2序列的序列之间。本发明的探针包含识别序列，其与通过NASBA扩增反应产生的扩增子杂交。因此，由探针产生的信号只有在靶RNA序列存在于反应混合物中且用选择的引物通过NASBA扩增时才被检测。
NASBA扩增反应是通过使用“NASBA基本试剂盒”试剂(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.60079136 & 60085192)及在厂商指定条件下进行。每个扩增试管含有终体积20μl，其由如下材料组成：
·8.64μl的由厂商指定比例的“基本试剂盒”试剂，
·0.4μl的引物P1，10μM，
·0.4μl的引物P2，10μM，
·0.16μl的Opi6d探针，10μM，
·5μl的RNA靶，浓度足以获得终浓度为5、50、500或者5000拷贝/反应试管。
在所有情况中，均制备阴性对照，其含有“无DNase/RNase”水(catalogNo.32739，ACROS)。
在65℃变性5分钟及在41℃保温2分钟之后，将5μl的“酶混合物”试剂(1μl“酶”accusphere ref.60085111加入45μl的“酶”稀释液ref.60085192，“NASBA基本试剂盒”的一部分)加入反应混合物中。然后将该反应混合物导入荧光检测仪中，其温度设定为41℃，利用荧光检测仪的Director 2.0软件监测反应(EasyQ reader，bioMérieux B.V，Boxtel，theNetherlands)，在520nm读取90分钟由FAM荧光团发射的荧光。
在反应结束时，获得每个试管的检测图，带有“Alpha3”和“MSR”的数值。
结果
NASBA实时检测结果未示出，但是如果需要可以获得。可以看出检测限度是5个拷贝靶转录体。阳性样品产生可检测的信号，最佳“MSR”为3.88，“Alpha3”数值在18-26分钟之间。
结论
本发明的Opi6d探针在溶液中存在其靶序列的条件下能发射可检测的荧光信号，特征在于最佳信号水平为3.88(MSR)。表示信号变得可检测的时间的“Alpha3”数值在18-26分钟之间。“Alpha3”与存在的靶序列的量成正比，其赋予基于这个数值量化靶序列的可能性。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针在NASBA扩增期间能实时检测其靶序列。
实验设计
扩增的靶序列是长度为212个核苷酸的RNA，通过从质粒中转录合成，根据本领域技术人员已知的体外转录技术进行。这个RNA的序列相应于“HIV”人免疫缺陷病毒基因组序列。 
使用的引物和探针如下所示：
引物：
P3(SEQ ID No.9)：
5′- TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCA-3′
P4(SEQ ID No.10)：
5′-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3′
Hoa6探针(SEQ ID No.11)：
5′-accctatcc-(dT-FAM)-ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGG-3′-Da
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列。
引物P3中斜体字所示节段相应于由T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，其为NASBA体外酶扩增所必需。
探针Hoa6中小写字母所示核苷酸相应于α核苷酸。
引物P3的3′节段与靶RNA序列互补。引物P4的序列与位于引物P3的互补序列的5′末端的靶RNA序列相同。NASBA扩增反应产生大量RNA序列拷贝，称作“扩增子”，其序列相应于靶RNA的互补序列，在引物P3的杂交序列与等于引物P4序列的序列之间。本发明的探针包含识别序列，其与通过NASBA扩增反应产生的扩增子杂交。因此，由探针产生的信号只有在靶RNA序列存在于反应混合物中且用选择的引物通过NASBA扩增时才被检测。
NASBA扩增反应是通过使用“NASBA基本试剂盒”试剂(bioMérieuxB.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.60079136 & 60085192)及在厂商指定条件下进行。每个扩增试管含有终体积20μl，其由如下材料组成：
·8.64μl的由厂商指定比例的“基本试剂盒”试剂，
·0.4μl的引物P3，l0μM，
·0.4μl的引物P4，10μM，
·0.16μl的探针Hoa6，10μM，
·5μl的靶RNA，浓度足以获得终浓度为5、50、500或者5000拷贝/反应试管。
在所有情况中，均制备阴性对照，其含有“无DNase/RNase”水(catalogNo.32739，ACROS)。
在65℃变性5分钟及在41℃保温2分钟之后，将5μl的“酶混合物”试剂(1μl“酶”accusphere ref.60085111加入45μl的“酶”稀释液ref.60085192，“NASBA基本试剂盒”的一部分)加入反应混合物中。然后将该反应混合物导入荧光检测仪中，其温度设定为41℃，利用荧光检测仪的Director 2.0软件监测反应(EasyQ reader，bioMérieux B.V，Boxtel，theNetherlands)，在520nm读取90分钟由FAM荧光团发射的荧光。
在反应结束时，获得每个试管的检测图，带有“Alpha3”和“MSR”的数值。
结果
NASBA实时检测结果未示出，但是如果需要可以获得。可以看出检测限度等于或者少于5个拷贝靶转录体。阳性样品产生可检测的信号，最佳“MSR”为2.53，“Alpha3”数值在14-22分钟之间。
结论
本发明的Hoa6探针在溶液中存在其靶序列的条件下能发射可检测的荧光信号，特征在于最佳信号水平为2.53(MSR)。表示信号变得可检测的时间的“Alpha3”数值在14-22分钟之间。“Alpha3”与存在的靶序列的量成正比，其赋予基于这个数值量化靶序列的可能性。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针在NASBA扩增期间能实时检测其靶序列。
实验设计
扩增的靶序列是长度为212个核苷酸的RNA，通过从质粒中转录合成，根据本领域技术人员已知的体外转录技术进行。这个RNA的序列相应于“HIV”人免疫缺陷病毒基因组序列。 
使用的引物和探针如下所示。
引物：
P3(SEQ ID No.9)：
5′- TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCA-3′
P4(SEQ ID No.10)：
5′-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3′
Hoi6d探针(SEQ ID No.12)：
5′-Da-CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGG-3′-(dT-FAM)3′-  5′
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列。
探针中小写字母和粗体所示核苷酸相应于反向核苷酸。
引物P3的斜体字所示节段相应于由T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，为NASBA体外酶扩增所必需。
Hoi6d探针中小写字母和粗体字所示核苷酸相应于反向核苷酸。
引物P3的3′节段与靶RNA序列互补。引物P4的序列与位于引物P3的互补序列的5′末端的靶RNA序列相同。NASBA扩增反应产生大量RNA序列拷贝，称作“扩增子”，其序列相应于靶RNA的互补序列，在引物P3的杂交序列与等于引物P4序列的序列之间。本发明的探针包含识别序列，其与通过NASBA扩增反应产生的扩增子杂交。因此，由探针产生的信号只有在靶RNA序列存在于反应混合物中且用选择的引物通过NASBA扩增时才被检测。
NASBA扩增反应是通过使用“NASBA基本试剂盒”试剂(bioMérieuxB.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.60079136 & 60085192)及在厂商指定条件下进行。每个扩增试管含有终体积20μl，其由如下材料组成：
·8.64μl的由厂商指定比例的“基本试剂盒”试剂，
·0.4μl的引物P3，10μM，
·0.4μl的引物P4，10μM，
·0.16μl的探针Hoi6d，10μM，
·5μl的靶RNA，浓度足以获得终浓度为5、50、500或者5000拷贝/反应试管。
在所有情况中，均制备阴性对照，其含有“无DNase/RNase”水(catalogNo.32739，ACROS)。
在65℃变性5分钟及在41℃保温2分钟之后，将5μl的“酶混合物”试剂(1μl“酶”accusphere ref.60085111加入45μl的“酶”稀释液ref.60085192，“NASBA基本试剂盒”的一部分)加入反应混合物中。然后将该反应混合物导入荧光检测仪中，其温度设定为41℃，利用荧光检测仪的Director 2.0软件监测反应(EasyQ reader，bioMérieux B.V，Boxtel，theNetherlands)，在520nm读取90分钟由FAM荧光团发射的荧光。
在反应结束时，获得每个试管的检测图，带有“Alpha3”和“MSR”的数值。
结果
NASBA实时检测结果未示出，但是如果需要可以获得。可以看出检测限度等于或者少于5个拷贝靶转录体。阳性样品产生可检测的信号，最佳“MSR”为2.03，“Alpha3”数值在15-21分钟之间。
结论
本发明的Hoi6d探针在溶液中存在其靶序列的条件下能发射可检测的荧光信号，特征在于最佳信号水平为2.03(MSR)。表示信号变得可检测的时间的“Alpha3”数值在15-21分钟之间。“Alpha3”与存在的靶序列的量成正比，其赋予基于这个数值量化靶序列的可能性。
目的
探针的特异性是其仅识别其靶的能力，及因此将其与包含例如错配或者缺失的靶区分。分子信标目前是最特异性的分子探针，因为其可以区分仅一个核苷酸不同的两个靶。这个实验的目的是示出与含有相同识别序列的分子信标探针相比，本发明探针的特异性水平。
实验设计
使用的探针如下所示：
分子信标CP InfB(SEQ ID No.13)：
5′-(FAM)-CGATCGGGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCG-3′Da 
Opa6探针(SEQ ID No.14)：
5′-gagcgtagc(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTCGCATCG-3′Da 
Opa5探针(SEQ ID No.15)：
5′-gagctagc(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCG-3′Da 
Opi4探针(SEQ ID No.16)：
3′- -5′-5′-(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCG-3′Da 
Opi3探针(SEQ ID No.17)：
3′- -5′-5′-(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCGG-3′Da 
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列，以及相应于形成所述分子信标的“茎”部分的链的序列。
探针中以小写字母表示的核苷酸相应于α型核苷酸。
探针中以小写字母和粗体表示的核苷酸相应于反向核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶cC(SEQ ID No.3)：
5′-TTTAGTTTTTGGACGTCTTCTCCTTT-3′
靶cG(SEQ ID No.18)：
5′-TTTAGTTTTTGGAGGTCTTCTCCTTT-3′
靶cA(SEQ ID No.19)：
5′-TTTAGTTTTTGGAAGTCTTCTCCTTT-3′
靶cT(SEQ ID No.20)：
5′-TTTAGTTTTTGGATGTCTTCTCCTTT-3′
合成的靶序列“cC”与探针的一部分序列完全互补。所述合成的靶序列“cG”、“cA”和“cT”相对于探针中的互补序列含有错配，由下划线的相应字母表示。
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至65℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。结果以温度(℃)对荧光(RFU)的图形式表示。
结果
在针对B型流感病毒模型检测的探针中，OPa6是显示完整的靶(cC)与具有错配的靶(cG、cA或者cT)之间Tm-靶最大差异的探针。
表3：B型流感病毒模型的探针的Tm分析(左侧前两列)以及完整的靶(cC)与具有错配的靶(cG和ΔTmcG；cA和ΔTm cA；cT和ΔTm cT)之间获得的Tm靶差异
这个表结合了从获得图中测量的Tm值。图9示出这些图的两个实例。在图上清晰可见具有其完整靶序列的探针的Tm-靶与具有错配的靶序列的探针的Tm-靶之间的差异，对于探针OPi4和OPa6可达到10℃。由于具有错配的靶序列的探针的Tm-靶与探针的Tm-茎非常接近，后者在与其靶序列杂交之前自身闭合。
结论
本发明的探针是指定靶的特异性探针，在这方面其性能与参考的分子信标相似。主要感兴趣的是检测相应于指定基因中单核苷酸变异的SNP或者单核苷酸多态性。
目的
探针的特异性是其仅识别其靶的能力，及因此将其与包含例如错配或 者缺失的靶区分。分子信标目前是最特异性的分子探针，因为其可以区分仅一个核苷酸不同的两个靶。这个实验的目的是示出与含有相同识别序列的分子信标探针相比，本发明探针的特异性水平。
实验设计
使用的探针如下所示：
分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)：
5′(FAM)-CTATCCCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG-3′Da 
Hoa6探针(SEQ ID No.11)：
5′-accctatcc(dT-FAM)ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGG-3′Da 
Hoa7(SEQ ID No.22)：
5′-ttaccctatc(dT-FAM)ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG-3′Da 
Hoa8探针(SEQ ID No.2)：
5′-accctatctc(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-
3′Da
Hoi6d探针(SEQ ID No.12)：
5′-Da-CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGG-3′-(dT-FAM)-3′-  5′
Hoi7d探针(SEQ ID No.23)：
5′-Da-CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGG-3′-(dT-FAM)-3′-  5′
Hoi8d探针(SEQ ID No.6)：
5′-Da-CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-3′-(dT-FAM)-3′- 5′
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列，以及相应于形成所述分子信标的“茎”部分的链的序列。本发明探针中以小写字母表示的核苷酸相应于α型核苷酸。
本发明探针中以小写字母和粗体表示的核苷酸相应于反向核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶cH5(SEQ ID No.24)：
5′-TTTCATTCTGCAGCTTCCTCATTT-3′
靶cGH5(SEQ ID No.25)：
5′-TTTCATTCTGCAGGTTCCTCATTT-3′
靶cAH5(SEQ ID No.26)：
5′-TTTCATTCTGCAGATTCCTCATTT-3′
靶cTH5(SEQ ID No.27)：
5′-TTTCATTCTGCAGTTTCCTCATTT-3′
合成的靶序列“c H5”与探针的一部分序列完全互补。所述合成的靶序列“cGH5”、“cAH5”和“cTH5”相对于探针中的互补序列含有错配，由下划线的相应字母表示。
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至65℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。结果以温度对荧光的图形式表示。
结果
结果在下表和图10中示出。
表4：所述分子信标与具有完整靶cH5的α型和反向型本发明的探针的Tm-靶的数值(左侧前两列)以及具有完整靶(cH5)的探针与具有错配的靶(cAH5、cGH5、cTH5)(ΔTmcAH5；ΔTm cGH5；ΔTm cTH5)的探针的Tm-靶之间的获得的差异
这个表结合了从获得图中测量的Tm值。图10示出这些图的两个实例。在图上清晰可见具有其完全互补靶序列的Tm与具有错配的靶序列的Tm之间的差异，对于探针HOi6d和HOi7d可达到9℃。
结论
本发明的探针是指定靶的特异性探针，在这方面其性能甚至超过参考的分子信标HIV-1A相似。主要感兴趣的是检测相应于指定基因中单核苷酸变异的SNP或者单核苷酸多态性。
目的
这个实验的目的是证实本发明的探针比分子信标探针更特异性杂交靶核酸。
通常地，当设计分子信标探针时，Tm是从识别序列中计算的，所述识别序列是与靶序列互补的序列(计算的Tm)。事实上，形成分子信标的“茎”部分的链的序列被认为不与靶核酸杂交。由于形成分子信标的“茎”部分的链的序列与靶序列的相互作用，因此分子信标探针的实际Tm可略高于计算值。此外，形成“茎”部分的链可以非特异性地与靶序列杂交，具有增加分子信标与靶杂交的整体稳定性的作用(实际Tm-靶高于计算的Tm-靶)，并因此降低这种杂交的特异性。
实验设计
使用的探针如下所示：
Opa6d探针(SEQ ID No.1)：
5′-gaccgtctg(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAC-3′Da 
分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)：
5′-(FAM)-CGATCGGGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCG-3′Da 
下划线处的节段相应于本发明探针的闭合序列，或者相应于分子信标的“茎”部分的链。
探针中小写字母表示的核苷酸相应于α型核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶Bioa2I(SEQ ID No.28)：
5′-TTT TTTTCCAATT-3′
靶6Ba2I(SEQ ID No.29)：
5′-TTT AATT-3′
靶10Pa2I(SEQ ID No.30)：
5′-TTT -3′
靶6Pa2I(SEQ ID No.31)：
5′-TTT AATT-3′
靶1Ba2I(SEQ ID No.32)：
5′-TTT TTTCCAATT-3′
靶1Pa2I(SEQ ID No.33)：
5′-TTT TTTCCAATT-3′
靶2Ba2I(SEQ ID No.34)：
5′-TTT TTCCAATT-3′
靶2Pa2I(SEQ ID No.35)：
5′-TTT TTCCAATT-3′
虚线下划线处序列相应于分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)或者本发明探针Opa6d(SEQ ID No.1)的可以与识别序列杂交的那部分。
序列Bioa2I(SEQ ID No.28)相应于B型流感病毒的生物靶序列的片段。
靶序列6Ba2I(SEQ ID No.29)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)含有在用虚线下划线示出的序列3′端的6个核苷酸。用双下划线标示的这6个核苷酸与分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列10Pa2I(SEQ ID 30)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线强调的序列3′端含有10个核苷酸。双下划线示出的这10个核苷 酸与本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)的闭合序列之一互补。
靶序列6Pa2I(SEQ ID No.31)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线示出的序列3′端含有6个核苷酸。双下划线示出的这6个核苷酸与本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)的闭合序列之一互补。
靶序列1Ba2I(SEQ ID No.32)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线示出的序列3′端含有1个核苷酸。双下划线示出的这个核苷酸与分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列的核苷酸互补。
靶序列1Pa2I(SEQ ID No.33)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线示出的序列3′端含有1个核苷酸。双下划线示出的这个核苷酸与本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)的闭合序列之一互补。
靶序列2Ba2I(SEQ ID No.34)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线强调的序列3′端含有2个核苷酸。双下划线示出的这2个核苷酸与分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列2Pa2I(SEQ ID No.35)相对于靶序列Bioa2I(SEQ ID No.28)在用虚线下划线示出的序列3′端含有2个核苷酸。双下划线示出的这2个核苷酸与本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)的闭合序列之一互补.
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释剂(bioMérieux B.V，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm，
终体积为20μl。
使用水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至68℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。探针/靶双链体的热稳定性通过“Tm-靶”的数值给出，其相应于曲线荧光转折点＝f(温度)。Tm-靶以这个曲线的一阶导数最小值计算。
结果
结果在表5和图7中示出。表5集合了使用这个实施例中描述的探针和靶获得的Tm-靶(℃)的数值。Tm-靶相对于参考Tm-靶增加表示在靶与探针之间发生额外的相互作用。在这个实施例中，参考Tm-靶值相应于在分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)与靶Bioa2I(SEQ ID No.28)之间测量的Tm-靶值，以及相应于在本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)与靶Bio2aI(SEQID No.28)之间测量的Tm-靶值。这两个值分别等于57.3℃和56.4℃。
表5：使用不同探针获得的Tm-靶的数值
当分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)在存在各种合成的靶序列条件下在溶液中存在中，其与靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与分子信标CPinfB的“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸时，观测到该分子信标的Tm-靶增加。这种增加与分子信标的茎部分的一条链的序列互补的核苷酸数目成正比，并表明在CPinfB探针的“茎”部分的一条链的序列的核苷酸与和靶杂交的序列相邻的互补核苷酸之间存在碱基配对。
当本发明的探针Opa6d(SEQ ID No.1)(α型探针)在各种合成的靶序列存在条件下在溶液中时，其与靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与本发明探针Opa6d的闭合序列之一互补的核苷酸时，观测到本发明的探针的Tm-靶值保持稳定，不论所述互补核苷酸的数目如何。这表明在本发明探针的闭合序列之一的核苷酸与和靶序列杂交的序列相邻的互补核苷酸之间无碱基配对。
结论
本发明的探针Opa6d比分子信标探针CPinfB更具特异性，因为在所述 探针的闭合序列之一与靶序列的核苷酸之间无额外的相互作用，即使这些核苷酸彼此互补也如此。仅本发明探针与靶核酸序列杂交的那部分相应于Opa6d探针的分子识别序列。这种探针的设计大大地降低了本发明探针与靶序列接近的序列非特异性杂交的可能性。
目的
这个实施例的目的与实施例9描述的目的相同，只是靶模型不同。
实验设计
使用的探针如下所示：
HOa8探针(SEQ ID No.2)：
5′-accctatctc(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-
3′Da
分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)：
5′-(FAM)CTATCCCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG-3′Da 
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列，或者分子信标的“茎”部分的链。
探针中小写字母表示的核苷酸相应于α型核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶BioH(SEQ ID No.36)：
TTT TCTCTTTTAAC
靶5BH(SEQ ID No.37)：
TTT TTTAAC
靶11PH(SEQ ID No.38)：
TTT 
靶5PH(SEQ ID No.39)：
TTT TTTAAC
靶1BH(SEQ ID No.40)：
TTT CTCTTTTAAC
靶1PH(SEQ ID No.41)：
TTT CTCTTTTAAC
靶2BH(SEQ ID No.42)：
TTT TCTTTTAAC
靶2PH(SEQ ID No.43)：
TTT TCTTTTAAC
虚线下划线所示序列相应于分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)或者本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)的可以与识别序列杂交的那部分。
靶序列BioH(SEQ ID No.36)相应于HIV病毒的生物靶序列的片段。其可以含有与本发明探针的闭合序列或者分子信标的“茎”部分的一条链序列互补的核苷酸。
靶序列5BH(SEQ ID No.37)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的5个核苷酸。用双下划线标示的这5个核苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列11PH(SEQ ID No.38)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线强调的序列3′端的11个核苷酸。用双下划线标示的这11个核苷酸与本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)的闭合序列之一互补。
靶序列5PH(SEQ ID No.39)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的5个核苷酸。用双下划线标示的这5个核苷酸与本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)的闭合序列之一互补。
靶序列1BH(SEQ ID No.40)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列1PH(SEQ ID No.41)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)的闭合序列之一互补。
靶序列2BH(SEQ ID No.42)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的2个核苷酸。用双下划线标示的这些核苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列2PH(SEQ ID No.43)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线示出序列3′端的2个核苷酸。用双下划线标示的这2个核苷酸与本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)的闭合序列之一互补。
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至68℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。探针/靶双链体的热稳定性通过“Tm-靶”的数值给出，其相应于曲线荧光转折点＝f(温度)。Tm-靶以这个曲线的一阶导数最小值计算。
结果
结果在表6和图8中示出。下表6集合了使用这个实施例中描述的探针和靶获得的Tm-靶(℃)的数值。Tm-靶相对于参考Tm-靶增加表示在靶与探针之间发生额外的相互作用。在这个实施例中，参考Tm-靶值相应于在分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)与靶BioH(SEQ ID No.36)之间测量的Tm-靶值，以及相应于在本发明的探针Hoa8(SEQ ID No.2)与靶BioH(SEQID No.36)之间测量的Tm-靶值。这两个值分别等于60.6℃和60.2℃。
表6：使用各种探针获得的Tm-靶的数值
*：分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)与互补靶5BH(SEQ ID No.37)之间的Tm值高于68℃最大可测值。对于实验目的而言，我们示出可以测量的最大可能值。
NA：不适用。本发明探针HOa8(SEQ ID No.2)与互补靶1BH(SEQ ID No.40)之间的Tm 值不能被测量，因为该图与使用我们的方法可测的标准不相应。这个值是从图中根据经验读取确定的，为60℃。
当分子信标探针HIV-1A(SEQ ID No.21)在存在各种合成的靶序列条件下在溶液中存在时，其与靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与分子信标HIV-1A的“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸时，观测到该分子信标的Tm-靶增加。这种增加与分子信标的茎部分的一条链的序列互补的核苷酸数目成正比，并表明这些核苷酸与和靶杂交的序列相邻的互补核苷酸之间存在碱基配对。
当本发明的探针HOa8(SEQ ID No.2)(α型探针)在各种合成的靶序列存在条件下在溶液中时，其与靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与探针HOa8的闭合序列之一互补的核苷酸时，α型本发明的探针的Tm-靶值保持稳定，这表明在本发明探针的闭合序列之一的核苷酸与和靶序列杂交的序列相邻的互补核苷酸之间无碱基配对。
结论
本发明的探针HOa8比分子信标探针HIV-1A更具特异性，因为在所述探针的闭合序列之一与靶序列的核苷酸之间无额外的相互作用，即使这些核苷酸彼此互补也如此。仅本发明探针与靶核酸序列杂交的那部分相应于HOa8探针的分子识别序列。这种探针的设计大大地降低了本发明探针与靶序列接近的序列非特异性杂交的可能性。
目的
这个实施例的目的与实施例9描述的目的相同，只是本发明探针的设计不同。
实验设计
使用的探针如下所示：
Opi6d探针(SEQ ID No.5)：
5′-Da-GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGA-3′(dT-FAM)3′- -5′
分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)：
5′-CGATCGGGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGACGATCG-3′Da 
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列或者相应于分子信标的“茎”部分的链。
探针中小写字母和粗体字所示核苷酸相应于反向型核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶BioiI(SEQ ID No.44)：
TTGCAGCTCT TTT
靶6BiI(SEQ ID No.45)：
TTGC TTT
靶10PiI(SEQ ID No.46)：
TTT
靶6PiI(SEQ ID No.47)：
TTGC TTT
靶1BiI(SEQ ID No.48)：
TTGCAGCTC TTT
靶1PiI(SEQ ID No.49)：
TTGCAGCTC TTT
虚线下划线所示序列相应于分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)或者本发明探针HOa8(SEQ ID No.5)的可以与识别序列杂交的那部分。
靶序列BioiI(SEQ ID No.44)相应于B型流感病毒的生物靶序列的片段。其可以含有与本发明探针的闭合序列或者分子信标的“茎”部分的链序列互补的核苷酸。
靶序列6BiI(SEQ ID No.45)相对于靶序列BioiI(SEQ ID No.44)含有在用虚线下划线所示序列5′端的6个核苷酸。用双下划线标示的这6个核苷酸与分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列10PiI(SEQ ID No.46)相对于靶序列BioiI(SEQ ID No.44)含有在用虚线下划线所示序列5′端的10个核苷酸。用双下划线标示的这10个核苷酸与本发明探针Opi6d(SEQ ID No.5)的闭合序列之一互补。
靶序列6PiI(SEQ ID No.47)相对于靶序列BioiI(SEQ ID No.44)含有在用虚线下划线所示序列5′端的6个核苷酸。用双下划线标示的这6个核苷酸与本发明探针Opi6d(SEQ ID No.5)的闭合序列之一的序列互补。
靶序列1BiI(SEQ ID No.48)相对于靶序列BioiI(SEQ ID No.44)含有在用虚线下划线所示序列5′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列1PiI(SEQ ID No.49)相对于靶序列BioiI(SEQ ID No.44)含有在用虚线下划线所示序列5′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与本发明探针Opi6d(SEQ ID No.5)的闭合序列之一互补。
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至68℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。探针/靶双链体的热稳定性通过“Tm-靶”的数值给出，其相应于曲线的转折点。Tm-靶以这个曲线的一阶导数最小值计算。
结果
结果在表7和图9中示出。下表7集合了使用这个实施例中描述的探针和靶获得的Tm-靶(℃)的数值。Tm-靶相对于参考Tm-靶增加表示在靶与探针之间发生额外的相互作用。在这个实施例中，参考Tm-靶值相应于在分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)与靶BioiI(SEQ ID No.44)之间测量的Tm-靶值，以及相应于在本发明的探针Opi6d(SEQ ID No.5)与靶BioiI(SEQID No.44)之间测量的Tm-靶值。这两个值分别等于62℃和62.9℃。
表7：使用各种探针获得的Tm-靶数值
*：分子信标CP2infB(SEQ ID No.13)与互补靶6BiI(SEQ ID No.45)之间的Tm值高于68℃最大可测值。对于实验目的而言，我们示出可以测量的最大可能值。
当分子信标探针CP2infB(SEQ ID No.13)在存在各种合成的靶序列条件下在溶液中存在时，其与这些合成的靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与分子信标探针CP2infB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸时，观测到该分子信标探针的Tm-靶数值相对于与“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸数目成正比地增加。这表明在探针CP2infB(SEQ ID No.13)的“茎”部分的一条链的序列的核苷酸与和靶杂交的序列相邻的互补核苷酸之间存在碱基配对。
当本发明的探针Opi6d(反向探针)(SEQ ID No.5)在各种合成的靶序列存在条件下在溶液中时，其与这些合成的靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与本发明探针Opi6d(SEQ ID No.5)的闭合序列之一的互补的核苷酸时，反向型本发明的探针的Tm-靶值保持稳定，这表明在本发明探针的闭合序列之一的核苷酸与和靶序列相邻的互补核苷酸之间无碱基配对。
结论
本发明的探针Opi6d比分子信标探针CPinfB更具特异性，因为在所述探针的闭合序列之一与靶序列的核苷酸之间无额外的相互作用，即使这些核苷酸彼此互补也如此。仅本发明探针与靶核酸序列杂交的那部分相应于探针Opi6d的分子识别序列。这种探针的设计大大地降低了本发明探针与靶序列接近的序列非特异性杂交的可能性。
目的
这个实施例的目的与实施例9描述的目的相同，不同之处是本发明探针的设计和靶模型不同。
实验设计
使用的探针如下所示：
HOi8探针(SEQ ID No.50)：
3′- -5′-5′-(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-3′Da 
HIV-1A参考分子信标(SEQ ID No.21)：
5′-(FAM)-CTATCCCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG-3′Da 
下划线处节段相应于本发明探针的闭合序列或者分子新标的“茎”部分的链。
探针中小写字母和粗体字所示核苷酸相应于反向型核苷酸。
使用的合成的靶序列如下所示：
靶BioH(SEQ ID No.36)：
5′-TTT TCTCTTTTAAC-3′
靶5BH(SEQ ID No.37)：
5′-TTT TTTAAC-3′
靶11PH(SEQ ID No.38)：
5′-TTT -3′
靶5PH(SEQ ID No.39)：
5′-TTT TTTAAC-3′
靶1BH(SEQ ID No.40)：
5′-TTT CTCTTTTAAC-3′
靶1PH(SEQ ID No.41)：
5′-TTT CTCTTTTAAC-3′
靶2BH(SEQ ID No.42)：
5′-TTT TCTTTTAAC-3′
靶2PH(SEQ ID No.43)：
5′-TTT TCTTTTAAC-3′
虚线下划线所示序列相应于分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)或者本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的可以与识别序列杂交的那部分。
靶序列BioH(SEQ ID No.36)相应于HIV病毒的生物靶序列的片段。其可以含有与本发明探针的闭合序列或者分子信标的“茎”部分的链序列互补的核苷酸。
靶序列5BH(SEQ ID No.37)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的5个核苷酸。用双下划线标示的这5个核 苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列11PH(SEQ ID No.38)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的11个核苷酸。用双下划线标示的这11个核苷酸与本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的闭合序列之一互补。
靶序列5PH(SEQ ID No.39)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的5个核苷酸。用双下划线标示的这5个核苷酸与本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的闭合序列之一互补。
靶序列1BH(SEQ ID No.40)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列1PH(SEQ ID No.41)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的1个核苷酸。用双下划线标示的这个核苷酸与本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的闭合序列之一互补。
靶序列2BH(SEQ ID No.42)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的2个核苷酸。用双下划线标示的这2个核苷酸与分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补。
靶序列2PH(SEQ ID No.43)相对于靶序列BioH(SEQ ID No.36)含有在用虚线下划线所示序列3′端的2个核苷酸。用双下划线标示的这2个核苷酸与本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的闭合序列之一互补。
探针被导入含有如下材料的溶液中：
-基本试剂盒稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands，ref.70352)，
-探针，浓度为0.1μm，
-合成的靶序列，浓度为1.25μm。
终体积为20μl。
使用MilliQ超纯水代替靶序列制备阴性对照。这样使得可以观测到单独的探针的作用。
将该溶液在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，theNetherlands)中加热至68℃，并冷却5小时。在冷却期间测量每个溶液在520nm的荧光。探针/靶双链体的热稳定性通过“Tm-靶”的数值给出，其相应于曲线的转折点。Tm-靶以这个曲线的一阶导数最小值计算。
结果
结果在表8和图10中示出。下表8集合了使用这个实施例中描述的探针和靶获得的Tm-靶(℃)的数值。Tm-靶相对于参考Tm-靶增加表示在靶与探针之间发生额外的相互作用。在这个实施例中，参考Tm-靶值相应于在分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)与靶BioH(SEQ ID No.36)之间测量的Tm-靶值，以及相应于在本发明的探针HOi8(SEQ ID No.50)与靶BioH(SEQ ID No.36)之间测量的Tm-靶值。这两个值分别等于60.6℃和61.1℃
表8：使用各种探针获得的Tm-靶的数值
*：分子信标HIV-1A与互补靶5BH之间的Tm值高于68℃最大可测值。对于实验目的而言，我们示出可以测量的最大可能值。
当分子信标探针HIV-1A(SEQ ID No.21)在存在各种合成的靶序列条件下在溶液中存在时，其与这些合成的靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与分子信标探针HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸时，观测到该分子信标探针的Tm-靶数值相对于与“茎”部分的一条链的序列互补的核苷酸数目成正比地增加。这表明在探针HIV-1A(SEQ ID No.21)的“茎”部分的一条链的序列的核苷酸与和靶杂交的序列相邻的互补核苷酸之间存在碱基配对。
当本发明的探针HOi8(反向型)(SEQ ID No.50)在各种合成的靶序列存在条件下在溶液中时，其与这些合成的靶序列杂交并产生可测荧光信号。当合成的靶含有与本发明探针HOi8(SEQ ID No.50)的闭合序列之一的互补的核苷酸时，反向型本发明的探针的Tm-靶值保持稳定，这表明在本发明探针的闭合序列之一的核苷酸与和靶序列相邻的互补核苷酸之间无碱基 配对。
结论
本发明的探针Hoi8比分子信标探针HIV-1A更具特异性，因为在所述探针的闭合序列之一与靶序列的核苷酸之间无额外的相互作用，即使这些核苷酸彼此互补也如此。仅本发明探针与靶核酸序列杂交的那部分相应于探针Hoi8的分子识别序列。这种探针的设计大大地降低了本发明探针与靶序列接近的序列非特异性杂交的可能性。
总的结论
这些实施例证实不论本发明探针的设计如何，其均呈现出高于分子信标探针的杂交特异性。本发明探针的核苷酸的性质(α核苷酸或者反向核苷酸)以及其相对于探针的第二片段的位置(位于3′端或者位于5′端)不影响本发明探针的设计质量或者其与靶核酸的杂交特异性。
目的
这个实施例的目的是研究本发明探针相对于不希望的所述探针的提前打开现象的敏感。
实验设计
将探针与NASBA中使用的T7 RNA聚合酶在反应混合物中一起在荧光检测仪(EasyQ reader，bioMérieux B.V.，Boxtel，the Netherlands)中在41℃保温4小时，所述反应混合物的成分是：
·10μL“试剂混合物”，根据NucliSens EQ Basic Kit reagent sphere(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，art.No.60085110)提供的指导制备，将其在64μL Basic Kit reagent sphere稀释液(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.70352)中稀释，
·3.76μL的山梨醇(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.60085192)，
·0.2μL的酶T7 RNA聚合酶，浓度为80单位/μL(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.72236)，
·2μL探针，初始浓度为2μM，
·对于终体积20μL足够数量的“酶混合物溶液”。
制备参考反应混合物，其含有除了酶之外的所有成分，所述酶用等体积的“酶混合物溶液”代替。
“酶混合物溶液”通过混合一些其它溶液制备，如下所述：
80μL的RT贮存缓冲液(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.60085341)，
114μL的T7贮存缓冲液(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.60085337)，
20μL的RH贮存缓冲液(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.60085339)，
411μL的Premix溶液(bioMérieux B.V.，Boxtel，NL，Art.No.60085335)，
625μL的MilliQ超纯水。
记录4小时在41℃在荧光素发射波长的荧光信号。
使用的探针如下所示：
Opi6d探针(SEQ ID No.5)：
5′-Da-GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGA-3′(dT-FAM)3′- -5′
Opa6d探针(SEQ ID No.1)：
5′-gaccgtctg(dT-FAM)GGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAC-3′Da 
HOi8探针(SEQ ID No.50)：
3′- -5′-5′-(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-3′Da 
HOa8探针(SEQ ID No.2)：
5′-accctatctc(dT-FAM)CCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAG-3′Da 
分子信标HIV-1A(SEQ ID No.21)：
5′-(FAM)-CTATCCCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG-3′Da 
分子信标CpinfB(SEQ ID No.13)：
5′-(FAM)-CGATCGGGAGAAGACGTCCAAAAACTCGATCG-3′Da 
下划线处核苷酸序列相应于本发明探针的闭合序列或者形成分子信标“茎”部分的链的序列。
探针中小写字母表示的核苷酸相应于α型核苷酸。探针中小写字母和粗体字所示核苷酸相应于反向核苷酸。
结果
测量各种探针在存在(图11a)或者不存在(图11b)T7 RNA聚合酶的条件下保温期间的荧光发射。
在不存在靶核酸及不存在T7 RNA聚合酶的条件下(图11b)，对于本发明探针和分子信标探针均检测到无荧光信号。这意味着在这些实验条件中，荧光团和猝灭剂彼此靠近，使得荧光“猝灭”。所述分子信标探针因此是闭合的构象，即具有发夹形的二级结构。
本发明的探针是称作环状构象的闭合构象。
在存在T7 RNA聚合酶及不存在任何靶核酸的条件下，本发明探针发射的荧光与在不存在T7 RNA聚合酶及不存在任何靶核酸的条件下测量的结果相同。在此也观测到荧光的“猝灭”。本发明探针即使在存在所述酶的条件下仍是其原始构象，即环状构象。
相反，当将T7 RNA聚合酶加入含有分子信标探针的反应混合物中时，观测到荧光信号增加。这意味着荧光团与猝灭剂之间的距离增加。在加入T7 RNA聚合酶期间分子信标的构象发生改变。分子信标探针打开。即使其与靶核酸杂交也其具有线性构象。
结论
结果示出分析的两个分子信标CpinfB和HIV-1A在存在T7 RNA聚合酶条件下保温期间产生增加的信号，而在相同条件下分析的本发明的探针不产生这种相同的信号增加。所有检测的本发明探针均证实这个结果，无论其在3′或者5′端是否具有闭合序列以及无论其是否含有α型或者反向型核苷酸。因此，本发明探针对于污染物如T7 RNA聚合酶的作用不敏感。不存在不希望的本发明探针的自主打开，因此没有非特异性信号发射。

Claims (21)

1.检测靶核酸的探针，其由包含三个片段的标记的核苷酸链组成：
-具有第一闭合序列的第一片段，
-第二片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列，
-具有第二闭合序列的第三片段，以及
-至少两个标记，所述检测探针的链的末端之一无任何标记，
其中，当所述第一和第二闭合序列杂交在一起时，所述检测探针具有完整的环状形状，所述闭合序列因此将所述探针保持于在不存在所述靶核酸的条件下不能被检测的构象，
其中第一或者第二闭合序列的全部或者一部分在杂交条件下与靶序列可以杂交。
2.权利要求1的检测探针，特征在于所述至少两个标记中的第一个由第一片段的一核苷酸携带，所述至少两个标记中的第二个由第二或者第三片段的一核苷酸携带，当所述第一和第二闭合序列杂交时这两个核苷酸相邻。
3.权利要求1的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列的全部或者一部分是平行杂交的。
4.权利要求2的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列的全部或者一部分是平行杂交的。
5.权利要求1的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一的全部或者一部分是由α核苷酸组成的序列。
6.权利要求2的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一的全部或者一部分是由α核苷酸组成的序列。
7.权利要求3的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一的全部或者一部分是由α核苷酸组成的序列。
8.权利要求4的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一的全部或者一部分是由α核苷酸组成的序列。
9.权利要求1的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列的全部或者一部分经历反平行杂交。
10.权利要求2的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列的全部或者一部分经历反平行杂交。
11.权利要求1的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一通过5'-5'或者3'-3'反向键结合于所述识别序列。
12.权利要求2的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一通过5'-5'或者3'-3'反向键结合于所述识别序列。
13.权利要求9的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一通过5'-5'或者3'-3'反向键结合于所述识别序列。
14.权利要求10的检测探针，特征在于所述第一和第二闭合序列之一通过5'-5'或者3'-3'反向键结合于所述识别序列。
15.权利要求1-14任一项的检测探针，特征在于至少一个标记是荧光团，及至少一个其它标记是荧光猝灭剂。
16.权利要求1-14任一项的探针，特征在于一核苷酸序列附着于所述闭合序列之一的末端。
17.权利要求15的探针，特征在于一核苷酸序列附着于所述闭合序列之一的末端。
18.检测样品中可能存在的靶核酸序列的方法，包括如下步骤：
-将所述样品与权利要求1-17任一项的检测探针接触，
-检测所述检测探针与靶核酸序列之间杂交体的形成，所述杂交体的形成表示所述样品中存在所述靶核酸序列。
19.权利要求18的方法，特征在于所述检测是与靶核酸序列的扩增反应联合进行的。
20.权利要求18的方法，特征在于所述检测是在靶核酸序列的扩增反应之后进行的。
21.检测靶序列的试剂盒，其包含权利要求1-17任一项的至少一种检测探针。
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