CN102080271B

CN102080271B - 一种双光子荧光生物丝材料及其制备方法

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Publication number: CN102080271B
Application number: CN2010105645847A
Authority: CN
Inventors: 刘向阳; 徐洪耀; 林乃波
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102080271A

Abstract

本发明涉及一种双光子荧光生物丝材料及其制备方法，该材料由双光子无机荧光物与生物丝蛋白材料均匀复合构成，其质量比为0.001-50∶100；该材料激发波长位于近红外，荧光波长小于激发波长。制备包括：将蚕丝蛋白溶液加入含双光子无机荧光物的溶液中，搅拌得混合溶液，通过干燥、静置或纺丝即得；或在室温下将经过前处理的蚕丝加入到含双光子无机荧光物的蚕丝蛋白溶液中浸泡，搅拌，洗涤，干燥即得。本发明的材料具有在近红外激光照射下有较强的双光子吸收和可调双光子荧光性能，激发光源波长为生物光学透明，并对生物组织无损伤，材料具有良好的生物相容性，强的力学性能，易制备，经济效益好，适用于工业化生产。

Description

一种双光子荧光生物丝材料及其制备方法

技术领域

本发明属双光子荧光生物丝材料及其制备领域，特别是涉及一种双光子荧光生物丝材料及其制备方法。

背景技术

生物丝是由生物可降解的高分子形成的生物纤维。生物丝的种类繁多，研究较多的包括蜘蛛丝和蚕丝。蜘蛛丝具有其他各种合成纤维所无法比拟的，比模量优于钢，而韧性优于Kevlar纤维。作为优异的能量吸收纤维，蜘蛛丝被认为是用作降落伞、防弹衣的理想材料，在纺织业、生物技术、医疗、精细化工及军用材料等领域具有广泛的应用前景。人们研究蜘蛛丝已经有一个多世纪，研究内容涉及到蛛丝丝蛋白基因识别、表达、结构与性能、仿生、氨基酸组成等。

蚕丝是我国古代文明产物之一，相传黄帝之妃螺祖始教民育蚕，甲骨文中就有很多丝字及丝旁之字。蚕丝分为家蚕丝与野蚕丝，其中以家蚕丝(即桑蚕丝)为主，约占整个丝绸原料总产量的95％。天然蚕丝是典型的蛋白质纤维，它是两根由丝胶粘结而成的丝心蛋白长丝，丝心蛋白的横截面积呈近三角形或椭圆形。除了丝心蛋白和丝胶蛋白以外，一般还含有少量的其他物质，如蜡、脂肪酸、无机物和色素。蚕丝蛋白是由重复氨基酸序列单元构成的结晶部分和无序氨基酸构成的无定形部分组成。蚕丝不仅用作制备服饰，作为手术缝合线已经有几个世纪的历史了。蚕丝也可以通过修饰得到不同种性能的功能蚕丝品及材料，如制备高强度的组织支架材料，与TiO₂复合制备杀菌功能材料以及与磁性纳米氧化铁复合制备磁性蚕丝。此外，可以根据丝素溶液这种特性制成粉、纤维、膜和凝胶等小量需要的形状生物材料。最近蚕丝溶液也被用来制备凝胶，生物海绵体和薄膜生物材料，被成功的应用在伤口愈合，骨头，软骨，腱和韧带修复等组织工程上。蚕丝具有独特的生相容和可降解性，许多原细胞和细胞系在蚕丝中培养出来，并具有优异的性能。

荧光纤维是指在普通光或特殊光照射下能够发光的功能材料，可应用于安全领域、装饰服饰领域，防伪领域和生物探针等领域。根据发光的激发光源不同，荧光纤维可以分为单光子荧光纤维和双光子荧光纤维。以短波长激发光(如紫外等)照射而发出长波长荧光的纤维，称为单光子荧光纤维；以长波长激发光(如近红外等)照射而发出短波长荧光的纤维，称为双光子荧光纤维。

单光子荧光纤维已有报道，双光子荧光纤维则未曾报道。CN1328177A用稀土元素铕和铝酸锶的混合物作紫外线荧光材料，制成紫外线荧光母粒，然后用常规纺丝设备纺制成圆截面皮芯型复合丝，荧光母粒形成芯丝，而常规聚酯形成皮层。CN1299888A专利报道，以聚丙烯纤维、聚乙烯纤维、聚氯乙烯纤维、醋酸纤维、聚醋纤维为纤维原料，溶于有机溶剂中溶胀，如在每100毫升溶剂中溶入0.5～8.0克紫外有机荧光物质，有机荧光物质在该溶剂中的溶解度为每100毫升溶剂大于等于0.5克，以所形成的有机荧光物质溶液为″染液″，然后按照纺织工业的常规染色过程进行“染色”，得到紫外荧光纤维。CN101177799A专利报道，将3～4份荧光纳米颗粒与7～6份高聚物，再加入0.15～0.2份分散剂进行均匀混合，以此混合物造粒，作为复合纤维中具有荧光作用的主体部分，混合的聚合物中纳米荧光材料含量不大于40％，再与成纤高聚物按照一定比例混合，作为纤维皮芯结构的芯层，最后在皮芯结构的复合纺丝机上，将上述了混合有荧光材料的高聚物为芯层进行纺丝，制备了具有环境警报作用的纳米荧光纤维织物。CN101440591A将铕和钒(磷)酸盐制备成荧光纤维后，能够在自然光和365nm紫外光激发下呈现无色，254nm紫外光激发下呈现鲜艳红色，同时，具有性能稳定、耐性好、高发光量子效率等优点，可用于文件防伪的荧光纤维。CN101735801A采用苯乙烯吡啶盐衍生物为荧光染料，与聚乙烯醇(PVA)共混制成纺丝原液并进行静电纺的方法，得到荧光橙色纤维膜。纤维膜具有良好的线性光学性能，水溶性好，与PVA水溶液有很好的相容性。CN2290465Y采用粘合剂技术将含有荧光纤维的涂料均匀地制成涂布胶层，得到了具有和荧光纸张同样的防伪效果的双层或三层结构复合塑料膜。CN101519857A利用荧光纤维制备了“激发光光角变化致荧光纤维变色的防伪纤维及防伪材料”。CN 2731620Y将表面信息层、基材层、不干胶层和硅油纸层多层叠置复合，并可在表面信息层与基材层之间或基材层与不干胶层之间设置有隐含信息层，得到了防伪功能的有色纤维和/或荧光纤维的荧光纤维纸。CN 201395744Y提供了一种具有光角变色荧光纤维的邮资票品专用纸，该邮资票品专用纸，包括有基纸层，在有基纸层内分布有光角变色荧光纤维，该光角变色荧光纤维的视觉特征随激发光照射角度的改变而变化。

具有单光子荧光的蚕丝纤维不仅具有普通荧光纤维的特性，而且具有良好的生物相容性，可以用作生物探针材料。日本宇都工业大学的科学家采用基因技术培养出了绿色荧光蚕丝，使蚕丝蛋白中含有水母的绿色荧光蛋白质，蚕丝成为一种能够在黑暗中发出绿色荧光的纤维。CN 101275362A以蚕丝为核，在蚕丝表面通过静电吸附的方法连接一层含有机高分子，再在有机高分子表面通过静电吸附的方法连接一层量子点纳米粒子，或多次交替重复上述步骤，然后在量子点纳米粒子表面通过静电吸附的方法连接一层有机高分子，构成一次或多次量子点包覆的荧光蚕丝。CN 101008150A采用天然蚕丝纤维作为基体材料，先后将其在一定浓度的金属盐溶液和硫源溶液中进行浸渍处理，通过对浸渍液浓度，反应时间的调节来控制半导体纳米颗粒的形貌、大小及在基体上的分布情况，得到纳米半导体粒子增强蚕丝纤维基复合材料，这种生物相容性好的蚕丝复合材料在光化学催化、光致发光、生物检测和标记等领域具有重大的应用价值。

然而，现有单光子荧光蚕丝蛋白材料的激发光源为短波长紫外光等，光损伤性大。在生物探针监测应用时，检测清晰度和深度低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种双光子荧光生物丝材料及其制备方法，该材料具有在近红外激光照射下有较强的双光子吸收和可调双光子荧光性能，激发光源波长为生物光学透明，并对生物组织无损伤，材料具有良好的生物相容性，强的力学性能，易制备，经济效益好，适用于工业化生产。

本发明的一种双光子荧光生物丝材料，该材料由双光子无机荧光物与生物丝蛋白材料均匀复合构成，其质量比为0.001-50∶100；该材料激发波长位于近红外600-1300nm，荧光波长小于激发波长600-1300nm。

所述的双光子无机荧光物包括：贵金属量子点Au，Ag，或半导体ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、As₂O₃、HgS、HgTe、GaAs、InP和InAs等。其形状为纳米颗粒，纳米线，纳米管，介孔材料，微孔材料，大孔材料，荧光微球，纳米层和纳米带。

所述的双光子荧光生物丝材料的形态包括：生物丝纤维，生物丝纤维，再生生物丝薄膜，再生生物丝凝胶和再生生物丝泡沫。

所述的双光子荧光生物丝材料的荧光波长可调。方法如：改变荧光材料分子结构；改变纳米材料尺寸或掺杂半导体种类。

所述的双光子荧光生物丝材料的荧光物质均匀混合并埋入生物丝材料体相及/或表面相。

本发明的一种双光子荧光生物丝材料的制备方法，包括：

将蚕丝蛋白溶液加入含双光子无机荧光物的水溶液中，搅拌得混合溶液，通过干燥、静置或纺丝即得，其中双光子无机荧光物与蚕丝蛋白的质量比为0.001-50∶100。

或在室温下将经过前处理的蚕丝加入到含双光子无机荧光物的蚕丝蛋白溶液中浸泡，搅拌，洗涤，干燥即得，其中双光子无机荧光物与蚕丝蛋白的质量比为0.001-50∶100。

所述的蚕丝蛋白溶液的制备方法包括：将碎蚕茧用0.05％(w/v)NaHCO₃的溶液洗涤去除丝胶，然后用去离子水洗涤，自然干燥；在40℃将所得的干燥蚕丝纤维溶解在9.3mol/L的LiBr溶液中，再用透析的方法在蒸馏水中析出LiBr，得到浓度为2.0-4.0wt.％蚕丝蛋白溶液。

所述的含双光子无机荧光物的溶液的制备方法包括：将NaBH₄与Te粉按摩尔比为2∶1混合，加入纯净水，在氮气条件下搅拌，制得NaHTe水溶液；配制1.25mM的CdSO₄水溶液，加入3-巯基丙酸，用NaOH调节pH至11.4，在氮气条件下，加入制得的NaHTe水溶液，反应2h，得CdTe量子点初溶液；Cd²⁺/MPA/HTe^-的摩尔比控制在1∶1.5∶0.2；将量子点初溶液加入到水热反应釜中，180℃水热晶化不同时间(30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，和47分钟)，冷却至室温得到不同粒径大小的CdTe量子点溶液。

所述的混合溶液在湿度(10～60％)和温度(20～80℃)条件下干燥得到双光子荧光蚕丝薄膜；混合溶液在-85～-58℃和真空条件，冷冻干燥2天得到双光子荧光蚕丝泡沫；在室温条件下，静置混合溶液得到双光子荧光蚕丝蛋白凝胶；采用溶液纺丝的方法或者静电纺丝的方法，得到不同纤度的再生双光子荧光蚕丝纤维。

设计表面含有反应基团的无机材料，通过一部反应或修饰的方法得到表面含有功能团的无机材料，利用反应基团与蚕丝蛋白上羟基之间进行化学反应形成共价键，使无机材料组装并均匀分布在蚕丝蛋白中。

技术路线：

本发明制备双光子荧光生物丝材料的方法：1.物理组装的方法是修饰得到含有极性基团的有机/无机双光子荧光材料与生物丝蛋白分子发生强相互作用；2.化学反应的方法是合成具有反应基团的有机/无机双光子荧光材料与生物丝蛋白分子发生化学反应生成共价键。所得生物丝材料具有良好的双子荧光性和力学性能。双光子荧光材料与生物丝蛋白分子相互作用稳定，双光子荧光材料在生物丝蛋白中的分布均匀。该双光子荧光生物丝材料可广泛用于荧光服饰、标签、防伪和生物探针等领域。

本发明制备双光子荧光生物丝，以生物质透明近红外光为光源，消除毒性，提高检测深度和清晰度。另外，在无机/有机荧光材料上修饰可与生物丝蛋白相互作用的极性基团，或者修饰上可与生物丝蛋白上羟基反应的基团，使荧光材料固定并均匀分散在在生物丝蛋白内，避免了双光子荧光材料在生物丝蛋白之间分布不均匀，引起双光子荧光性能因材料聚集而淬灭，影响双光子荧光生物丝整体发光性能以及力学性能。

有益效果

(1)本发明的双光子荧光生物丝材料激发波长在近红外区域，对环境、生物组织均具有优良的穿透性，提高检测深度和灵敏度；

(2)本发明通过物理组装或化学反应的方法，得到系列生物相容的无机复合的双光子荧光生物丝蛋白材料，双光子荧光材料与生物丝蛋白分子之间通过强相互作用力或共价键联系，提高了材料的稳定性；

(3)通过强相互作用力合化学键将双光子荧光材料引入到有生物丝蛋白材料中，得到双光子荧光生物丝蛋白材料，双光子荧光材料在复合材料中分散均匀，双光子生物丝荧光复合材料具有良好的双光子荧光性能和力学性能。

附图说明

图1为量子点复合蚕丝薄膜，凝胶和泡沫；

图2为为直径最小量子点组装蚕丝薄膜的双光子荧光显微照片，激发光源波长为800nm，接收波段为450-600nm；

图3为高分辨透射电镜的照片；

图4为五种不同粒径大小的量子点复合的蚕丝蛋白的双光子荧光谱图；

图5为量子点组装蚕丝薄膜在不同激光能量下荧光光谱；

图6为泡沫的扫描电镜；

图7为泡沫的双光子荧光显微镜图；

图8为量子点复合蚕丝纤维和织布；

图9为量子点复合蚕丝纤维双光子显微镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

采用蚕丝来自于两广2号家蚕品种的蚕茧，把茧剪成碎片，用0.05％(w/v)NaHCO₃的溶液在100℃洗涤50分钟去除丝胶，然后用去离子水洗涤数次，自然干燥。在40℃将所得的干燥蚕丝纤维溶解在9.3mol/L的LiBr溶液中，再用透析的方法在蒸馏水中析出LiBr，得到蚕丝蛋白溶液。用称重法测定蚕丝蛋白的浓度为～4.0wt.％。

采用水热法制备系列水溶性CdTe量子点溶液。将NaBH₄与Te粉按摩尔比为2∶1混合，加入纯净水，在氮气条件下搅拌，制得NaHTe水溶液。配制1.25mM的CdSO₄水溶液，加入3-巯基丙酸，用NaOH调节pH至11.4，在氮气条件下，加入新制的NaHTe水溶液，反应2h，得CdTe量子点初溶液。Cd²⁺/MPA/HTe^-的摩尔比控制在1∶1.5∶0.2。将量子点初溶液加入到水热反应釜中，180℃水热晶化不同时间(30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，和47分钟)，冷却至室温得到不同粒径大小的CdTe量子点溶液。

将蚕丝蛋白溶液0.5mL与上述量子点溶液2mL混合均匀，得到微红色的透明荧光蚕丝蛋白溶液。混合溶液平铺于直径为，于湿度是20～45％，温度为25～45℃的环境箱干燥，经12h后得透明荧光蚕丝薄膜(图1a)。图2为直径最小量子点组装蚕丝薄膜的双光子荧光显微照片，激发光源波长为800nm，接收波段为450-600nm，可以发现双光子荧光均匀分布。图3为其高分辨透射电镜的照片，可以看出量子点均匀的分布在蚕丝薄膜中，这是由于量子点表面的羧酸基团与蚕丝蛋白的酰胺基相互作用的结果。图4为五种不同粒径大小的量子点复合的蚕丝蛋白的双光子荧光谱图，在相同的800nm激光下，其发射不同颜色的双光子荧光。图5为直径最小量子点组装蚕丝薄膜在不同激光能量下荧光光谱，激光能量的对数与荧光强度的对成正比，比值1.81为，进一步证明此过程属双光子机理。

将蚕丝蛋白溶液4mL与上述量子点溶液4mL混合均匀，置于2cm平圆底聚苯乙烯培养皿中，经过3天得到荧光蚕丝蛋白凝胶(图1b)。

将蚕丝蛋白溶液4mL与上述量子点溶液4mL混合均匀，置于2cm平圆底聚苯乙烯培养皿中，于温度为-58～-85℃冷冻干燥器，真空条件下24h后得荧光蚕丝泡沫(图1c)。图6为泡沫的扫描电镜，图7为泡沫的双光子荧光显微镜图。

实施例2

蚕丝来自于两广2号家蚕品种。蚕丝原丝用含有肥皂(10g·L^-1)和碳酸钠(5g·L^-1)的溶液在85℃的条件下浸泡45分钟，然后用蒸馏水洗涤脱胶，自然干燥。由于分子两端的硝基基团有强极性，可以与蛋白质分子链上羰基形成氢键。在60～110℃，1g蚕丝纤维/织物与0.04g上述双光子荧光有机分子在20mL二甲基亚砜(DMSO)溶液密封搅拌30～100分钟。取出蚕丝用蒸馏水超声波洗涤，晾干，得双光子荧光蚕丝。

将实施例1中蚕丝蛋白溶液4mL与实施例1中量子点溶液4mL混合均匀，将0.5g蚕丝纤维(已脱胶)浸泡在上述混合溶液中6～12h取出，用蒸馏水冲洗3遍，自然干燥，得系列不同荧光发光波长的蚕丝纤维(图8a)。图9为无机复合蚕丝的双光子荧光显微镜图

将上述混合溶液2mL铺布于3×3cm的蚕丝织布(已脱胶)上，自然干燥2～4天，得系列不同荧光发光波长的蚕丝织布(图8b)。

Claims

1.一种双光子荧光生物丝材料的制备方法，包括：

将蚕丝蛋白溶液加入含双光子无机荧光物的水溶液中，搅拌得混合溶液，通过干燥、静置或纺丝即得，其中双光子无机荧光物与蚕丝蛋白的质量比为0.001-50∶100；

或在室温下将经过前处理的蚕丝加入到含双光子无机荧光物的蚕丝蛋白溶液中浸泡，搅拌，洗涤，干燥即得，其中双光子无机荧光物与蚕丝蛋白的质量比为0.001-50∶100；所述的蚕丝蛋白溶液的制备方法包括：将碎蚕茧用0.05％w/v NaHCO₃的溶液洗涤去除丝胶，然后用去离子水洗涤，自然干燥；在40℃将所得的干燥蚕丝纤维溶解在9.3mol/L的LiBr溶液中，再用透析的方法在蒸馏水中析出LiBr，得到浓度为2.0-4.0wt.％蚕丝蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的一种双光子荧光生物丝材料的制备方法，其特征在于：所述的含双光子无机荧光物的溶液的制备方法包括：将NaBH₄与Te粉按摩尔比为2∶1混合，加入纯净水，在氮气条件下搅拌，制得NaHTe水溶液；配制1.25mM的CdSO₄水溶液，加入3-巯基丙酸，用NaOH调节pH至11.4，在氮气条件下，加入制得的NaHTe水溶液，反应2h，得CdTe量子点初溶液；Cd²⁺/MPA/HTe^-的摩尔比控制在1∶1.5∶0.2；将量子点初溶液加入到水热反应釜中，180℃水热晶化30分钟-47分钟，冷却至室温得到CdTe量子点溶液。

3.根据权利要求1所述的一种双光子荧光生物丝材料的制备方法，其特征在于：所述的混合溶液在湿度10～60％和温度20～80℃条件下干燥得到双光子荧光蚕丝薄膜；混合溶液在-85～-58℃和真空条件，冷冻干燥2天得到双光子荧光蚕丝泡沫；在室温条件下，静置混合溶液得到双光子荧光蚕丝蛋白凝胶；采用溶液纺丝的方法或者静电纺丝的方法，得到再生双光子荧光蚕丝纤维。