CN102071225A - 一种提高细胞酶活性发酵生产1,3丙二醇的方法 - Google Patents

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汪德林
任俊虎
张墩明
黄绪民
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Abstract

本发明公开了一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法，本发明以工业甘油为碳源，进行发酵培养，当培养液中甘油的浓度降低到一定数值时，添加甘油继续发酵一段时间后，再同时添加氨基酸盐和渗透剂，从而提高发酵培养基中细胞酶活性，减少副产物的产生，提高1，3-丙二醇浓度、生产强度和转化率，本发明操作简单，不增加额外的设备，仅通过较低的附加投入，就可显著提高1，3-丙二醇的生产强度、转化率和在最终发酵液中的浓度，降低了生产成本，易于工业化应用。

Description

一种提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法
技术领域
本发明涉及1，3-丙二醇生物催化合成技术领域，具体涉及一种提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法。
背景技术
1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的重要单体，以及合成杂环、药物等的中间体，还可作为溶剂用于油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等。
目前，规模工业化生产1，3-丙二醇的方法为化学合成法，主要的生产厂家为Dupont和Shell两家跨国公司，分别以环氧乙烷或丙烯醛为原料生产1，3-丙二醇，用于合成PTT纤维。然而，化学合成的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源，且使用的原料如环氧乙烷或丙烯醛具有一定的危险性。另外，1，3-丙二醇还可以经淀粉、葡萄糖或甘油等生物发酵法得到，生物发酵法具有选择性高，操作条件温和等特点，使用的原料为淀粉、葡萄糖或甘油等可再生资源。近年来，随着石油、煤、天然气等石化资源的日趋紧缺以及地球环境的日益恶化，以生物质工程技术为核心的绿色合成技术和生态材料的发展日益受到人们的重视，因此，用生物发酵法合成1，3-丙二醇是大势所趋。
在用甘油发酵生产1，3-丙二醇的过程中，甘油作为唯一碳源和能源沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，能将甘油转化为1，3-PDO的微生物主要包括克雷伯杆菌属、柠檬菌属及梭状芽孢杆菌属等。在甘油转化为1，3-PDO的厌氧发酵途径中，甘油除一部分形成生物量外，其余沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD的甘油脱氢酶(GDH)的作用下形成二羟基丙酮(DHA)，磷酸化后进入糖酵解途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B12为铺酶的甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的作用下形成产物1，3-PDO。在1，3-PDO的形成过程中，GDH、GDHt和PDOR是关键酶，它们的活力与1，3-PDO的产率密切相关。另一部分被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，而乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸。在发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程中，乳酸和乙酸是两种最主要的副产物，它们的形成不但消耗有效的碳源，使得甘油转化率降低，更由于它们在发酵液中的积累会对细胞的正常生理代谢形成毒害作用，获得产酸突变株对于提高1，3-PDO的发酵产量也将有一定的积极意义。
目前生物合成生产1，3-丙二醇存在产物浓度低、甘油转化率低以及生产周期长生产强度低等问题，因而缺失市场竞争力。要提高1，3丙二醇的转化率，减少副产物的生成，分别采取不同的发酵调控策略：添加铺因子，双底物发酵等发酵工艺，提高1，3丙二醇的转化率、产量、生产强度、降低发酵成本。
现有的方法有：两段双底物发酵生产1，3丙二醇(过程工程学报.20033：269-273)；采用外源添加维生素C或维生素E等还原剂的方法促进1，3丙二醇生产(李春等，外源添加还原剂促进菌体合成1，3丙二醇的方法，专利公开号：CN1446919A)；底物流加策略对发酵法生产1，3丙二醇的影响(食品与发酵工业.2004.30：398-400)；克雷伯杆菌生产1，3丙二醇关键酶发酵条件研究(高校化学工程学报.2004.18：621-627)；一种改变细胞膜通透性有效生产1，3-丙二醇的方法(吴敏等，专利公开号：CN101230362A)。
目前已有的发酵工艺都存在产物、副产物对细胞生长和细胞酶活性的抑制，导致整个发酵过程中产物浓度低，生产周期较长，生产强度偏低。
本发明通过代谢和酶学分析发现，影响1，3-丙二醇合成的关键因素为关键酶活性的大小。实验结果表明，在发酵过程中添加氨基酸盐和渗透剂可以有效的提高关键酶的活性，从而使得1，3-丙二醇浓度、生产强度、转化率显著提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法。通过添加氨基酸盐和渗透剂的方法以提高酶活性，一方面提高了酶催化的活性构象和维持细胞稳定生长，另一方面可掩蔽亲核剂，减少副产物的产生，同时消除了产物与副产物的抑制作用，从而有利于1，3-丙二醇产出。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)菌种的选择：选择克雷伯杆菌作为菌种，先接种到LB培养机进行斜面培养；
(2)LB培养基的配制：按配方比例分别称取下列物质：甘油28-31g、蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏1.5-2.5g、琼脂粉13-16g、NaCl 18-12g，放入烧杯中，加入1000ml蒸馏水并加热溶解，用NaOH溶液或HCl溶液调整溶液pH至7.0-7.5；然后高温灭菌、搁置斜面，在温度为28-32℃下，培养24-48小时后，转入3-4℃冰箱里保存备用；
(3)种子培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏1.5-2.5g、MgSO4·7H2O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH2PO42.5-3.5g，NH4Cl 1.5-2.5g、CaCl20.08-0.12g、甘油28-32kg、无机离子溶液1.5-2.5ml进行混合作为种子培养基；
(4)发酵培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏0.5-1.5g、MgSO4·7H2O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH2PO4 0.5-1.5g、NH4Cl 5.3-5.5g、CaCl20.08-0.12g、甘油38-42g、无机离子溶液1.5-2.5ml、MnCl2 0.01-0.012g混合制得发酵培养基；
所述的无机离子溶液为：在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成：ZnCl20.65-0.70g、MnCl210.10-10.20g、H3BO3 0.05-0.07g、CuCl2 0.45-0.50g、FeCl35.2-5.6g、CoCl2 11-15g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.23-0.27g、3mol/LH2SO4 18-22ml；
(5)种子制备：取经过斜面培养的克雷伯杆菌适量接入到步骤(3)培养的种子培养基中进行摇床培养，培养液的温度为30～40℃，转速80～110rpm，培养8～15小时，转入二代培养基中，培养0～12小时后加入氨基酸盐和渗透剂，调节pH为7.5～9.0，30～40℃培养5～12小时，制备二级种子备用，要求氨基酸盐和渗透剂的浓度均为0.001-10g/L；
(6)发酵培养、生产1，3-丙二醇：将工业甘油、发酵培养基装入培养容器中，甘油的装入量为培养容器的体积的50～85％，再将步骤(5)培养的二级种子接入到该容器中，接种量为所述容器体积的2～20％，进行摇床培养，培养温度30～40℃，转速80～150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵0～25h后加入氨基酸盐和渗透剂，氨基酸盐和渗透剂浓度范围均为0.001-10g/L。
所述的提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法，其特征在于：步骤(6)所述的氨基酸盐为选自甘氨酸锌、甘氨酸钴、或甘氨酸锰的一种或几种；所述的渗透剂选自LC-SG50氨基酸表面活性剂、硬脂酸聚氧乙烯醚SG中的一种或几种。
所述的提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法，其特征在于：所述的方法适用于1，3丙二醇的厌氧和有氧发酵过程。
本发明的有益效果：同时添加氨基酸盐和渗透剂提高了催化作用表现为：
1、可接受或供出电子，激活亲电剂或亲核剂；
2、可掩蔽亲核剂，以减少不需要的副反应产生；
3、可使酶稳定于催化活性构象。
本发明提高了菌体细胞内1，3-丙二醇合成关键酶的活性，减少了副产物的产生，同时消除了产物与副产物的抑制作用，显著提高了1，3-丙二醇的生产强度、转化率和在最终发酵液中的浓度。操作简单，不增加额外的设备，仅通过较低的附加投入，就可显著提高1，3-丙二醇的生产强度、转化率和在最终发酵液中的浓度，降低了生产成本，易于工业化应用。
具体实施方式
选择菌种：克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)
LB斜面培养基的配制：按配方比例分别称取下列物质：甘油30g、蛋白胨1g、酵母膏2g、琼脂粉15g、NaCl 10g，放入烧杯中，加入1000ml蒸馏水加热溶解，用NaOH溶液或HCl溶液调整溶液pH至7，然后高温灭菌、搁置斜面，在温度为30℃下，培养24-48小时后，转入4℃冰箱里保存备用；
种子培养基配制：在1000ml水里，分别加入酵母膏2g，MgSO4·7H2O 0.2g，柠檬酸0.42g，KH2PO43g，NH4Cl 2g，CaCl20.1g，甘油30g，无机离子溶液2ml，混合配置而成。
发酵培养基：在1000ml水里，分别加入酵母膏1g，MgSO4·7H2O 0.2g，柠檬酸0.42g，KH2PO41g，NH4Cl 5.4g，CaCl20.1g，甘油40g，无机离子溶液2ml，MnCl2 0.01g混合配置而成。
无机离子溶液为：ZnCl20.68g/L，MnCl210.17g/L，H3BO30.06g/L，CuCl20.47g/L，FeCl35.4g/L，CoCl213g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.25g/L，3mol/L  H2SO420ml。
种子制备：取经过LB斜面培养基进行斜面培养的克雷伯杆菌适量接入种子培养基中，温度35℃，90rpm培养10小时，转入二代培养基中，12小时后加入氨基酸盐和渗透剂，pH7.5～9.0，30～40℃培养5～12h，制备二级种子备用，要求。
发酵培养：以工业甘油为碳源，加入发酵培养基，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气或者空气，通气量为0.3vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，120rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵20小时后加入氨基酸盐和渗透剂，要求氨基酸盐和渗透剂的浓度均为0.001-10g/L。
在于发酵生产中添加的氨基酸盐为甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰，渗透剂LC-SG50(氨基酸表面活性剂)、或SG(硬脂酸聚氧乙烯醚)系列渗透剂，浓度范围0.001～10g/L。
比较例一：
种子制备：取经过斜面培养的1，3-丙二醇菌种(克雷伯杆菌)接入种子培养基中，30℃，8110rpm培养15h，转入二代培养基中，pH7.5，30℃培养12h，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.5vvm，接种量为8％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇50g/L、乳酸17g/L、乙酸11g/L、乙醇12g/L，生产强度1.8g/L.h和摩尔转化率47％。
实例一：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30℃，110rpm培养15小时，转入二代培养基中，pH7.5，32℃培养8小时，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.5vvm，接种量为8％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂LC-SG501g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇70g/L、乳酸11g/L、乙酸8g/L、乙醇9g/L，生产强度3.0g/L.h和摩尔转化率60％。
实例二：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30℃，110rpm培养9h，转入二代培养基中，pH9.0，30℃培养12h，1h同时加入各甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰0.001g/l，和渗透剂LC-SG501g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为50-85％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.3vvm，接种量为15％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂LC-SG501g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3内二醇80g/L、乳酸7g/L、乙酸8g/L、乙醇7g/L，生产强度3.2g/L.h和摩尔转化率71％。
实例二：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，35℃，80rpm培养15h，转入二代培养基中，pH8.0，34℃培养12h，1h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG1g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG10g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇82g/L、乳酸9g/L、乙酸7g/L、乙醇12g/L，生产强度2.9g/L.h和摩尔转化率65％。
实例四：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30℃，100rpm培养10h，转入二代培养基中，pH7.5，34℃培养12h，5h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.5g/l，和渗透剂SG1g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为85％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.1～0.5vvm，接种量为20％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.5g/l，和渗透剂SG1g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇75g/L、乳酸5g/L、乙酸11g/L、乙醇12g/L，生产强度2.8g/L.h和摩尔转化率69％。
实例五：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，40℃，80rpm培养8h，转入二代培养基中，pH8.0，38℃培养12h，1h同时加入各甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰0.001g/l，和渗透剂LC-SG50 1g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG2g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇90g/L、乳酸5g/L、乙酸7g/L、乙醇6g/L，生产强度3.6g/L.h和摩尔转化率75％。
实例六：
种子制备：取1，3-内二醇菌种接入种子培养基中，30℃，110rpm培养8h，转入二代培养基中，pH7.5，30℃培养12h，1h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG1g/L制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为85％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，120rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。发酵3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂LC-SG502g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇88g/L、乳酸6g/L、乙酸8g/L、乙醇9g/L，生产强度3.4g/L.h和摩尔转化率74％。
比较例二：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30℃，110rpm培养15h，转入二代培养基中，pH7.5，35℃培养12h，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入空气，通气量为0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇55g/L、乳酸19g/L、乙酸9g/L、乙醇12g/L，生产强度1.9g/L.h和摩尔转化率49％。
实例七：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30℃，110rpm培养15h，转入二代培养基中，pH7.5，35℃培养12h，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为70％，初始甘油为40g/L，通入空气，通气量为0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，温度37℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂LC-SG501g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇70g/L、乳酸10g/L、乙酸8.5g/L、乙醇9g/L，生产强度3.0g/L.h和摩尔转化率63％。
实例八：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，40℃，110rpm培养15h，转入二代培养基中，pH9.0，40℃培养12h，1h同时加入各甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰0.001g/l，和渗透剂LC-SG50 1g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为85％，初始甘油为40g/L，通入空气，通气量为0.5vvm，接种量为20％的二级种子接入其中，温度40℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂LC-SG50 1g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3丙二醇81g/L、乳酸8g/L、乙酸6g/L、乙醇7g/L，生产强度3.2g/L.h和摩尔转化率70％。
实例九：
种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，35℃，110rpm培养15h，转入二代培养基中，pH7.5，40℃培养5h，1h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG1g/L，制备二级种子备用。
发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为85％，初始甘油为40g/L，通入空气，通气量为0.5vvm，接种量为5％的二级种子接入其中，温度40℃，150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油。3h同时加入甘氨酸锌、甘氨酸钴、甘氨酸锰各0.001g/l，和渗透剂SG5g/L，最终色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇86g/L、乳酸9g/L、乙酸7g/L、乙醇6g/L，生产强度2.9g/L.h和摩尔转化率73％。

Claims (3)

1.一种提高酶活性发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)菌种的选择：选择克雷伯杆菌作为菌种，先接种到LB培养机进行斜面培养；
(2)LB培养基的配制：按配方比例分别称取下列物质：甘油2831g、蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏1.5-2.5g、琼脂粉13-16g、NaCl 18-12g，放入烧杯中，加入1000ml蒸馏水并加热溶解，用NaOH溶液或HCl溶液调整溶液pH至7.0-7.5；然后高温灭菌、搁置斜面，在温度为28-32℃下，培养24-48小时后，转入3-4℃冰箱里保存备用；
(3)种子培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏1.5-2.5g、MgSO4·7H2O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH2PO42.5-3.5g，NH4Cl 1.5-2.5g、CaCl20.08-0.12g、甘油28-32kg、无机离子溶液1.5-2.5ml进行混合作为种子培养基；
(4)发酵培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏0.5-1.5g、MgSO4·7H2O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH2PO4 0.5-1.5g、NH4Cl 5.3-5.5g、CaCl20.08-0.12g、甘油38-42g、无机离子溶液1.5-2.5ml、MnCl20.01-0.012g混合制得发酵培养基；
所述的无机离子溶液为：在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成：ZnCl20.65-0.70g、MnCl210.10-10.20g、H3BO30.05-0.07g、CuCl20.45-0.50g、FeCl35.2-5.6g、CoCl211-15g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.23-0.27g、3mol/LH2SO418-22ml；
(5)种子制备：取经过斜面培养的克雷伯杆菌适量接入到步骤(3)培养的种子培养基中进行摇床培养，培养液的温度为30～40℃，转速80～110rpm，培养8～15小时，转入二代培养基中，培养0～12小时后加入氨基酸盐和渗透剂，调节pH为7.5～9.0，30～40℃培养5～12小时，制备二级种子备用，要求氨基酸盐和渗透剂的浓度均为0.001-10g/L；
(6)发酵培养、生产1，3-丙二醇：将工业甘油、发酵培养基装入培养容器中，甘油的装入量为培养容器的体积的50～85％，再将步骤(5)培养的二级种子接入到该容器中，接种量为所述容器体积的2～20％，进行摇床培养，培养温度30～40℃，转速80～150rpm培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，发酵0～25h后加入氨基酸盐和渗透剂，氨基酸盐和渗透剂浓度范围均为0.001-10g/L。
2.根据权利要求书1所述的提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法，其特征在于：步骤(6)所述的氨基酸盐为选自甘氨酸锌、甘氨酸钴、或甘氨酸锰的一种或几种；所述的渗透剂选自LC-SG50氨基酸表面活性剂、硬脂酸聚氧乙烯醚SG中的一种或几种。
3.根据权利要求书1、2所述的提高细胞酶活性发酵生产1，3丙二醇的方法，其特征在于：所述的方法适用于1，3丙二醇的厌氧和有氧发酵过程。
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