CN102071209B - 一种纳米基因导入材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米基因导入材料，由HAuCl4和N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其中HAuCl4为50微升0.1M，N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为3.6微升。本发明具有良好的细胞相容性、低毒、稳定且较高的转染效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因导入材料。
背景技术
基因导入系统或方法可以分为两类：病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。由于病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如病毒转染有可能激活原癌基因等，故非病毒型转染方式是目前的研究热点，在上述非病毒式转染中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结果不稳定；仅阳离子脂质体法表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种纳米基因导入材料，具有良好的细胞相容性、低毒、稳定且较高的转染效率。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为:一种纳米基因导入材料，由HAuCl4和N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其中HAuCl4为50微升0.1M，N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为3.6微升。
与现有技术相比，本发明具有以下的优越性：（1）具有较高的转染效率，在人血管平滑肌细胞中可以达到40％左右；（2）低毒性，因AuNPs/氨基硅烷纳米的复合材料具有良好的生物相容性，细胞生存率很高；（3）材料分散性良好，符合对转染的要求；（4）非常低的成本，氨基是食品添加剂，成本很低，另外实验中使用的化学药品，氨水都是常见廉价试剂；（5）材料制备反应简单易操作，可重复性好。
附图说明
图1为AuNPs/氨基硅烷纳米的扫描电镜图片。
图2为AuNPs/氨基硅烷纳米的投射电镜图片。
图3为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。
图4为转染后的细胞生存率图片。
图5为转染效率图。
具体实施方式
一、材料的制备
1、主要材料
四水合氯金酸（HAuCL4·4H2O）,N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为分析纯，为上海国药集团化学试剂有限公司生产。N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为Alfa Aesar，公司生产，纯度为90%。所有试剂使用前没有进行进一步的纯化。
2、材料的制备
10mL具塞锥形瓶中加5mL DMF，加50微升0.1M HAuCl4水溶液加3.6微升SiEN【即N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺】，搅拌均匀后放入60°烘箱中加热20h。冷至室温后，产品离心（15000rpm，5min），EtOH洗3次。
二、结合性能的测定
1、主要材料
绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）；HEPES平衡盐溶液（自配）；电泳缓冲液（0.5×TBE，自配）；DNA上样缓冲液；溴化乙啶（EB）。
2、主要方法
1μL AuNPs/氨基硅烷纳米溶液（5mg AuNPs/氨基硅烷纳米溶解在500μL双蒸水中）与1μLpEGFP-C1水溶液（0.1μg/μL）以及8μl双蒸水（pH=7.4water）在1.5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。AuNPs/氨基硅烷纳米和pEGFP-C1的质量比分别用100:1，50:1，30:1，10:1，1:1。在5000rpm的速度下离心5min。将沉淀物加载到1%的琼脂糖（EB0.1μg/mL）在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。
3、结果
请参阅图1和图2，结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-C1有多种构型所致。在质量比10:1，1:1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结合不是很好，到了100:1，50:1，30：1条带消失，说明结合完全了。
这些结果表明：带正电荷的pEGFP-C1和AuNPs/氨基硅烷纳米有一个最佳的结合比，超出30:1以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以使用30:1进行转染。
三、转染
1、主要材料
人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）；AuNPs/氨基硅烷纳米pEGFP-C1联合体（上述制备）；DMEM培养基；胎牛血清FBS；6孔培养板。
2、主要方法
（1）细胞的培养：将HUVEC用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中（5×106/孔）,用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%～70%的融合度。
（2）细胞转染实验：将培养好的细胞上清除去，换新的培养液并加入质量比30:1的AuNPs/氨基硅烷纳米pEGFP-C1联合体。请参阅图3、图4和图5，培养48小时后分别对其荧光、细胞存活率（碘化吡啶标识，流式细胞仪检测）、转染效率（流式细胞仪检测）进行测定。
3、结果分析
荧光图可以看出有明显绿色荧光，并且覆盖面比较大。细胞生存率图分别为无添加物、AuNPs/氨基硅烷纳米pEGFP-C1联合体、lipofectamine 2000pEGFP-C1联合体的生存率，可以看到AuNPs/氨基硅烷纳米pEGFP-C1联合体对细胞生存率的影响是很小的。比lipofectamine 2000pEGFP-C1联合体的影响小很多。转染效率图可以看到AuNPs/氨基硅烷纳米pEGFP-C1联合体可以达到约55%的转染效率，这是在保证了细胞生存率的前提下达到了一个如此的转染效率。虽然不及lipofectamine 2000高，但是其高细胞相容性是lipofectamine2000所无法比拟的，表现出了AuNPs/氨基硅烷纳米做为转染试剂的巨大潜力。
Claims (1)
1.一种纳米基因导入材料，由HAuCl4和N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺为原料合成AuNPs/氨基硅烷纳米球复合材料，其是通过在10毫升具塞锥形瓶中加5毫升 DMF，加50微升0.1M HAuCl4水溶液加3.6微升纯度为90%的N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-1,2-乙二胺，搅拌均匀后放入60℃烘箱中加热20h；冷至室温后，15000rpm离心5min，用乙醇洗3次制备的。
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