CN105505962B - 一种功能化纳米配合物基因导入材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因导入材料技术领域，具体涉及一种功能化纳米配合物基因导入材料及其制备方法和应用。一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，包括：步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气；步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液；步骤三，超声；步骤四，静置；步骤五，离心并烘干。本发明制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料，该功能化纳米配合物基因导入材料与绿色荧光蛋白质粒基因pGFP结合，用于转染，具有转染效率高、细胞相容性好、细胞生存率高的优点；在人乳腺癌细胞中，该球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP‑C1的联合体的转染效率达到45%左右。

Description

一种功能化纳米配合物基因导入材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因导入材料技术领域，具体涉及一种功能化纳米配合物基因导入材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着人类基因图谱测定的完成，我们对人类疾病发病机制的认识在基因水平上取得了突破性的进展。目前研究表明，有许多疾病的发生及发展与基因密切相关。如果可以筛查出与疾病特异相关的基因片段或者基因突变，就可以有针对性地在基因水平上进行特异治疗，如通过导入相关缺失基因或沉默基因，以增强相关缺失功能或者沉默致病基因，从而达到彻底治疗的目的。将目的基因安全有效地导入生物体内是目前此研究领域中的关键和难点。
基因导入方法可以分为两类：第一类是病毒型基因导入方法，是以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；第二类是非病毒型基因导入方法，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及利用新兴的纳米基因导入材料进行基因转染。
病毒型基因导入方法存在许多严重的不足，例如病毒转染时有可能激活原癌基因。因此，非病毒型基因导入方法是目前的研究热点，但是，上述所述的非病毒型基因导入方法均存在不足：显微注射一次只能处理一个细胞，其转染效率非常低；基因枪的穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法的转染效率受温度、浓度、操作环境等众多因素影响，转染结果很不稳定；阳离子脂质体法虽然表现出良好的转染效率，但是阳离子脂质体因毒性高，使得阳离子脂质体法的应用受到了限制；现有技术中的纳米基因导入材料存在生产成本高、制备用原料不易得、难以普及推广应用的缺点。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种功能化纳米配合物基因导入材料。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供一种功能化纳米配合物基因导入材料的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在一定温度下搅拌一定时间，得到混合物；
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡一定时间；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置一定时间；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。
上述技术方案中，所述步骤一硫酸亚铁水溶液通氮气步骤中，所述硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为0.5g/L~5g/L。
上述技术方案中，所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.05mol/L~0.5 mol/L。
上述技术方案中，所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述硫酸亚铁水溶液与所述氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为1~5：1。
上述技术方案中，所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述搅拌温度为40℃~60℃，所述搅拌时间为20min~40min。
上述技术方案中，所述步骤三超声步骤中，所述超声震荡的时间为1h~4h；所述超声震荡的超声波的频率为30 kHz~50 kHz。
上述技术方案中，所述步骤四静置步骤中，所述静置的时间为10h~15h。
上述技术方案中，所述步骤五离心并烘干步骤中，所述烘干的温度为50℃~70℃，所述烘干时间为5h~7h。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
一种功能化纳米配合物基因导入材料，运用上述所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料，所述功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
提供一种功能化纳米配合物基因导入材料的应用，上述所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料在抗肿瘤药物中的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（一）本发明提供的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法具有制备方法简单的优点，所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料，且该纳米球状材料的粒径能够通过反应时间的控制进而控制纳米颗粒的粒径，从而扩大了粒径的选择范围。该功能化纳米配合物基因导入材料能和绿色荧光蛋白质粒基因pGFP以非共价方式结合，形成无机纳米基因导入系统，用于基因转染。该功能化纳米配合物基因导入材料与绿色荧光蛋白质粒基因pGFP结合后再与DNA中的氢氧化钙和磷酸离子的正电性根发生作用，能够达到稳定的转染效率，并且能够降低高浓度钙离子可能导致的活性，从而使得本发明所制得的功能化纳米配合物基因导入材料能够在人体内得到进一步应用。与现有技术相比，本发明所述制得的功能化纳米配合物基因导入材料具有以下优点：
（1）具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中转染效率能够达到45%左右；
（2）低毒性，因硫酸亚铁具有良好的生物相容性，使得所制得的球状的功能化纳米配合物基因导入材料具有良好的生物相容性，因此，使得细胞生存率很高；
（3）该功能化纳米配合物基因导入材料的分散性良好，符合对转染的要求；
（4）制备成本极低，因制备该功能化纳米配合物基因导入材料所用的原材料的价格低廉，且易得。
（5）材料制备反应简单，容易操作，可重复性好；
（6）应用前景良好，可以应用于制备抗肿瘤药物。
（二）本发明提供的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，其步骤一往硫酸亚铁水溶液中通入氮气，是为了去除硫酸亚铁水溶液中的氧气，从而防止硫酸亚铁水溶液中的二价铁发生氧化反应，并在步骤二和步骤三的全过程均保持通入氮气，进一步防止亚铁离子发生氧化反应。
附图说明
图1是本发明的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法的实施例1所制得的功能化纳米配合物基因导入材料的透射电镜图。
图2是本发明在转染实验中的功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体在转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图。
图3是本发明在转染实验中的功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体在转染后的细胞存活率图。
图4是本发明在转染实验中的功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体的转染效率图。
其中，在图3至图4中，cell viability（%）代表细胞存活率，transfectionefficiency(%)代表转染效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
其中，本发明提及的氟尿嘧啶水溶液也称作：2,4-二羟基-5-氟嘧啶或5-FU或5-氟-2,4（1H,3H）-嘧啶二酮。
实施例1。
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；本实施例中，硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为1g/L；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在50℃下搅拌30min，得到混合物；本实施例中，氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.1 mol/L；硫酸亚铁水溶液与氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为3：1。
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡2h；本实施例中，超声震荡的超声波的频率为40 kHz；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置12h；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物在60℃下进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。本实施例中，烘干时间为6h。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
实施例2。
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；本实施例中，硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为0.5g/L；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在40℃下搅拌40min，得到混合物；本实施例中，氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.05mol/L；硫酸亚铁水溶液与氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为1：1。
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡1h；本实施例中，超声震荡的超声波的频率为50 kHz；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置10h；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物在50℃下进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。本实施例中，烘干时间为7h。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
实施例3。
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；本实施例中，硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为5g/L；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在60℃下搅拌20min，得到混合物；本实施例中，氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.5 mol/L；硫酸亚铁水溶液与氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为5：1。
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡4h；本实施例中，超声震荡的超声波的频率为30 kHz；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置15h；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物在70℃下进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。本实施例中，烘干时间为5h。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
实施例4。
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；本实施例中，硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为3g/L；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在45℃下搅拌35min，得到混合物；本实施例中，氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.3 mol/L；硫酸亚铁水溶液与氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为4：1。
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡3h；本实施例中，超声震荡的超声波的频率为35 kHz；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置13h；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物在55℃下进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。本实施例中，烘干时间为6.5h。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
实施例5。
一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；本实施例中，硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为2g/L；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在55℃下搅拌25min，得到混合物；本实施例中，氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为02 mol/L；硫酸亚铁水溶液与氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为3：1。
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡1.5h；本实施例中，超声震荡的超声波的频率为45kHz；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置11h；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物在65℃下进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料。本实施例中，烘干时间为5.5h。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm左右的纳米球状材料。
本实施例的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于制作抗肿瘤药物的应用。
将上述实施例1制得的功能化纳米配合物基因导入材料用于以下实验。
结合性能的测定
1、主要材料
实施例1制得的功能化纳米配合物基因导入材料（见图1）；绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）；HEPES平衡盐溶液（自配）；电泳缓冲液（0.5×TBE，自配）；DNA上样缓冲液；溴化乙啶（EB）。
2、主要方法
1μL 球状功能化纳米配合物基因导入材料的溶液（5mg球状功能化纳米配合物基因导入材料溶解在500μL双蒸水中）与1μLpEGFP-C1水溶液（0.1μg /μL）以及8 μL双蒸水（pH=7.4）在1.5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的质量比分别为100:1，50:1，30:1，10:1，1:1。在5000rpm的速度下离心5min，得到沉淀物。将沉淀物加载到1%的琼脂糖（EB0.1 μg/mL）中，并在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。
3、结果
结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-C1有多种构型所致。在质量比30:1，10:1，1:1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和功能化纳米配合物基因导入材料颗粒结合不是很好，到了100:1，50:1条带消失，说明DNA和功能化纳米配合物基因导入材料颗粒结合完全了。
上述结果表明：带正电荷的pEGFP-C1和功能化纳米配合物基因导入材料存在一个最佳的结合比，当功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的质量比大于50:1，继续添加功能化纳米配合物基因导入材料，绿色荧光蛋白质粒也不会再与多余的功能化纳米配合物基因导入材料结合，因此，本实验结果得出，以功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的质量比为50:1的结合比进行转染。
转染实验
1、主要材料
人乳腺癌细胞；球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1联合体（上述制备）；DMEM培养基；胎牛血清FBS；6孔培养板。
2、主要方法
（1）细胞的培养：将人乳腺癌细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中（5×106/孔），用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%～70%的融合度。
（2）细胞转染实验：将培养好的细胞上清除去，并换上新的培养液，然后分成三份，分别为第一样品、第二样品和第三样品，第一样品中不添加任何其它物质，往第二样品中加入质量比为50:1的球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体，往第三样品中加入脂质体 2000和 pEGFP-C1的联合体，然后对第一样品、第二样品和第三样品分别培养48小时，然后对第二样品进行荧光测定（见图2），并对第一样品、第二样品和第三样品分别进行细胞存活率测定（见图3）、转染效率测定（见图4）。其中，细胞存活率测定时，是用碘化吡啶进行标识，并使用流式细胞仪进行检测。转染效率测定是使用流式细胞仪进行检测。
3、结果分析
从图2中的荧光图可以看出有明显的绿色荧光，并且绿色荧光的覆盖面较大，说明球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体在人乳腺癌细胞中转染成功。
图3的细胞存活率图片中，由左到右分别代表第一样品（control）、第二样品（ACCnanoparticles）和第三样品（lipofectamine 2000）的存活率，其中，第一样品的存活率为98%，第二样品的存活率约为95%，第三样品的存活率为88%。因此，从图3中可以看到，质量比为50:1的球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的影响是很小的，相比之下，脂质体 2000和 pEGFP-C1的联合体对人乳腺癌细胞的存活率的影响较大。
图4的转染效率图片中，由左到右分别代表第一样品（control）、第二样品（ACCnanoparticles）和第三样品（lipofectamine 2000）的转染效率。由图4中可以看到，球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体可以达到约45%的转染效率，这是在保证了人乳腺癌细胞存活率约为95%的前提下达到的转染效率。虽然球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体的转染效率不及脂质体2000的转染效率高，但是，球状功能化纳米配合物基因导入材料和pEGFP-C1的联合体的高细胞相容性是脂质体2000所无法比拟的。
终上所述，由上述实验结果和分析可知，球状功能化纳米配合物基因导入材料作为转染试剂具有巨大的潜力。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，硫酸亚铁水溶液通氮气：往硫酸亚铁水溶液中通入氮气；
步骤二，加入氟尿嘧啶水溶液：往步骤一中持续通入氮气的硫酸亚铁水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在一定温度下搅拌一定时间，得到混合物；
步骤三，超声：对步骤二中得到的混合物继续通入氮气，然后对步骤二得到的混合物进行超声震荡一定时间；
步骤四，静置：对步骤三完成超声震荡后的混合物进行静置一定时间；
步骤五，离心并烘干：对步骤四完成静置的混合物进行离心，得到沉淀物，然后对沉淀物进行烘干，即制得功能化纳米配合物基因导入材料；
所述步骤一硫酸亚铁水溶液通氮气步骤中，所述硫酸亚铁水溶液的质量体积浓度为0.5g/L～5g/L；
所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述氟尿嘧啶水溶液的摩尔浓度为0.05mol/L～0.5mol/L；
所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述硫酸亚铁水溶液与所述氟尿嘧啶水溶液的摩尔比为1～5：1；
所述步骤二加入氟尿嘧啶水溶液步骤中，所述搅拌温度为40℃～60℃，所述搅拌时间为20min～40min；
所述步骤三超声步骤中，所述超声震荡的时间为1h～4h；
所述步骤四静置步骤中，所述静置的时间为10h～15h。
2.根据权利要求1所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，其特征在于：所述超声震荡的超声波的频率为30kHz～50kHz。
3.根据权利要求1所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法，其特征在于：所述步骤五离心并烘干步骤中，所述烘干的温度为50℃～70℃，所述烘干时间为5h～7h。
4.一种功能化纳米配合物基因导入材料，其特征在于：运用权利要求1至3任意一项所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料，所述功能化纳米配合物基因导入材料为一种平均直径为150nm的纳米球状材料。
5.一种功能化纳米配合物基因导入材料的应用，其特征在于：权利要求1至3任意一项所述的一种功能化纳米配合物基因导入材料的制备方法所制得的功能化纳米配合物基因导入材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
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