CN102051366A - 鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法 - Google Patents

Abstract

鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的鸡脂肪候选基因lpin1基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，采用鸡脂肪候选基因lpin1基因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’-非翻译区，针对存在的变异，设计引物检测5’-UTR的变异，检测功能性突变位点所用引物，正向：5′-GATTTGATCTGCTTGGAGAC-3′；反向：5′-GTCATGATAGCAAAGAGCAAG-3′。利用该引物扩增后，用限制性酶切方法进行单核苷酸多态性检测，可以检测出lpin1编码序列5’UTR的碱基是T还是C等位基因。

Description

鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测动物脂肪性状技术领域，具体涉及一种鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法。

背景技术

动物每天从食物中摄取能量，并主要在肝脏和脂肪组织中把多余的能量转变成脂肪储存起来。动物脂肪沉积所需要的脂肪酸大多来自于脂肪酸的全程合成。动物脂肪的过度沉积是影响胴体品质和人类健康的重要问题之一。近年来，减少动物脂肪的过度沉积，阐明其调控的分子机制及建立相应的调控技术，已成为动物营养学研究的热点，并已取得许多重要的研究成果。

人Lipin1基因与酵母的PAH1基因为同源基因，PAH1基因编码酵母细胞的Mg²⁺依赖性的磷脂酸(PA)磷酸化酶，该酶活力与细胞膜和细胞液有关，酶的膜结合形式是盐溶性的，脂分析显示缺乏PAH1的突变导致磷脂酸的聚集，减少了甘油二酯和甘油三酯的量，缺少这种酶的酵母细胞，其酵母的脂肪细胞减少90％。人Lipin1基因在大肠杆菌的杂合表达表明该基因也是一种编码Mg²⁺依赖性的磷脂酸磷酸化酶(PAP酶)的基因。在对患有脂肪肝营养不良症小鼠的研究结果显示，Lipin1基因在脂肪组织和骨骼肌组织中可以发挥磷脂酸磷酸化酶(PAP酶)的所有功能。

目前研究发现，由Lipin1基因编码的哺乳动物Lipin-1蛋白家族不仅具有胞质定位信号区，而且还拥有核定位信号区。已经得到证实，由Lipin1基因编码的Lipin-1蛋白由于能够定位在脂肪细胞和肝脏细胞的细胞核中，Finck和他的同事们在鼠中研究发现，在空腹状态下，Lipin-1蛋白是激活肝脏内脂肪酸氧化相关基因并发挥作用所必须的因素。

在以前的研究中，Lipin-1蛋白具有重要的生理学功能，即自身代谢平衡的独特生理学功能，然而Lipin-1蛋白所具有的两种不同的细胞功能最近才被发现。首先，Lipin-1蛋白作为一种酶，参与甘油三酯和磷脂合成；其次，Lipin-1蛋白作为一个转录辅激活因子，直接与细胞核受体过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)和PPARα共活化物PGC-1α直接相互作用并形成复合物，以调节脂肪酸利用及脂类合成相关基因的表达。另外，Lipin-1蛋白还具有在脂肪、骨骼肌、肝脏等组织和外周神经中调节脂类自身代谢平衡的独特生理学功能。

Lindegaard在对两组均感染艾滋病病毒的男性(其中一组同时患有脂肪营养不良症)研究结果显示，在患有脂肪营养不良症的男性血清中总胆固醇含量显著高于没有患脂肪营养不良症的男性(p＜0.05)；血清中甘油三酯含量极其显著高于没有患脂肪营养不良症的男性(p＜0.001)。在患有脂肪营养不良症的男性脂肪组织中Lipin1基因表达水平显著高于没有患脂肪营养不良症的男性(p＜0.05)。在健康青年男性中，脂肪细胞当达到正常成熟脂肪细胞大小的时候，脂肪细胞中Lipin1基因表达水平会被削弱，但是此时，脂肪组织中甘油三酯的贮存能力达到最大，即甘油三酯含量最高。研究结果显示，Lipin1基因表达水平与血清中甘油三酯含量呈显著的负相关关系(R²＝-0.10；p＜0.05)。

Lipin1/LIPIN1是通过对fld小鼠突变体进行候选位置克隆获得的。fld突变小鼠患有脂肪营养不良症(1ipodystrophy，fld)，表现为脂肪组织数量的严重缺乏(80％)、胰岛素抗性及进程性的外周神经病。比较fld小鼠和野生型小鼠的基因组，发现fld小鼠的Lipin1的基因组序列出现了缺失、反转和复制现象，为一种无效突变。在fld小鼠体内既不表达Lipin1-α，也不表达Lipin1-β。不表达Lipin1的fld/fld小鼠与野生型小鼠相比，其脂肪组织、骨骼组织仅有很少的PAP酶活力。

Cao从脂肪营养不良患者和正常人群中未检测到Lipin1基因的特异变异，仅从外显子、外显子-内含子边界检测到5个变异位点。Suviolahti(2005)从瘦型对照人群及dyslipidemic Finnish家系和肥胖群体中，发现Lipin1基因内SNP及相应的等位基因单倍型与血清胰岛素水平和体重指数的关联，显示这个基因的等位基因变异体在人类代谢性状中有重要的作用。

Eun Seok Kang在人上研究表明，Lipin1基因的遗传变异能够影响降血糖药物匹格列酮(pioglitazone)对II型糖尿病的治疗作用，匹格列酮能够增强Lipin1基因在人脂肪细胞中中的表达量。Lipin1基因的变异能够引起儿童横纹肌溶解症复发，并成为引起与肌肉相关疾病诱因的携带者。

Phan等发现具有Lipin1缺陷的fld小鼠采食量正常，但饲料转化率降低，同样，在脂肪组织和骨骼肌组织过量表达Lipin1基因小鼠的采食量也正常，但小鼠的体重显著高于Lipin1正常表达的小鼠，其中骨骼肌过量表达小鼠的体重与正常小鼠体重差异最大，饲料转化率显著提高，尤其在高脂日粮的效应最显著，此外，骨骼肌和脂肪组织过量表达Lipin1的小鼠脂肪含量分别极显著和显著大于正常表达小鼠，表明LIPIN1水平应具有调控能量消耗的作用，LIPIN1缺陷阻止了日粮诱发肥胖和遗传性肥胖，并且需要上游的正常脂肪细胞分化基因PPARγ的协同作用。是否鸡的不同品种或不同个体中存在鸡Lipin1基因表达量的差异，表达量的差异与鸡只的采食量，饲料转化率，脂肪沉积是否有关？能否依据该基因的DNA变异或表达差异选择低脂系或高饲料转化率的鸡品系。这些都值得研究。

目前的研究表明，Lipin1基因表达具有强烈的影响脂肪沉积的效应，Lipin1的不表达、正常表达、过量表达均能引起脂肪沉积的剧烈变化，引起脂肪组织量增加，即从正常情况的10％到3倍的增加。在极端状态下，人和鼠Lipin1的无效突变会导致脂肪营养不良症。Lipin1对脂肪沉积的效应在转基因过量表达小鼠研究和自然人群的研究却有相反的结论。

在人和鼠的研究表明Lipin1基因能引起脂肪沉积的剧烈变化，Lipin1对脂沉积的效应在转基因过量表达研究和自然群体的研究却得到相反的结论，有必要以其它模式动物为对象进行该基因在自然群体中对脂肪沉积效应的进一步研究。比较基因组学的分析表明Lipin1也是影响鸡脂肪沉积的潜在候选基因，这已经为后继的研究工作打下坚实的基础。

Lipin1转基因过量表达增加了小鼠的肥胖程度。骨骼肌与脂肪组织过量表达Lipin1的转基因小鼠的脂肪垫分别极显著和显著大于Lipin1正常表达小鼠。在Lipin1过量表达的转基因小鼠研究表明，Lipin1表达水平的变异自身就已经足够引起肥胖的极端状态。但发现Lipin1基因在脂肪组织和骨骼肌组织中是通过不同的机制完成的，脂肪细胞的Lipin1基因影响脂肪细胞的脂肪储存能力，而骨骼肌中的Lipin1水平则是全身能量消耗和脂肪利用的决定因子。表明人类Lipin1基因不仅是脂肪沉积减少而且是脂肪沉积增加失调的候选基因。与其它脂肪相关组织不一样的是，Lipin1基因在外周组织优势表达并发挥作用，应是一个新的治疗肥胖和脂肪营养不良症的一个新的靶点。

自然体形人群中Lipin1基因表达与肥胖有呈负相关的报道。Lipin1基因的表达水平和肥胖的关系似乎比较复杂，尽管转基因小鼠的脂肪组织的过度表达促进了脂肪合成基因的表达并引起肥胖，但在遗传异质的人群中，Lipin1基因表达量与脂肪沉积的关系似乎并不是这样，这是否是因为大量的环境和遗传因子互作影响的效应还值得研究。在人和鼠脂肪组织中，Lipin1基因的表达水平与肥胖呈现负相关关系，而以前在aP2-Lipin1转基因小鼠研究中，研究结果是Lipin1基因的表达水平与肥胖呈现正相关关系。产生这种差异的基础，我们不太清楚，但是在aP2-Lipin1转基因小鼠中，由于增加了Lipin1基因的表达，通过异源调控元件的介入引起基因表达上调，没有对正常调节Lipin1基因表达水平所产生的分子的和生理学的信号作出反应，可能与这种情况有关。所以，在脂肪组织中Lipin1基因是PAP1酶合成甘油三酯所必须的，在转基因小鼠脂肪组织中由于外界强制作用使Lipin1基因表达量增强，结果就会增强甘油三酯的蓄积，然而在正常受试人群中，脂肪细胞当达到正常成熟脂肪细胞大小的时候，脂肪细胞中Lipin1基因表达水平会被削弱。有以下研究可以证实上述可能性：如果在人脂肪组织中没有达到正常甘油三酯的贮存能力的话，如患有脂肪营养不良的人群，那么，Lipin1基因表达水平与脂肪重呈正相关关系。

Yao-Borengasser和van Harmelen观察到人脂肪组织Lipin1基因的表达水平与脂肪沉积量呈负相关关系，肥胖者Lipin1基因的表达水平低于瘦者，而且在肥胖人群中随着肥胖程度的增加，脂肪组织Lipin1基因表达量呈下降趋势；vanHarmelen(2006)认为脂肪沉积应是脂肪组织Lipin1基因表达量的一个主要调控因素。Yao-Borengasser(2006)发现Lipin1总表达量、Lipin1-α、Lipin1-β表达量都呈随着肥胖程度的增加显著下降的特点，并随着胰岛素敏感性的增加而增加，脂肪组织Lipin1表达量与体型指数(BMI)、体脂比例、肌细胞内脂质(IMCLs)呈显著负相关。但Yao-Borengasser没有发现肌肉中Lipin1基因表达的变化与肥胖或胰岛素抗性的相关，包括从瘦子到胖子、从正常到葡萄糖耐性受损人群。

肉鸡脂肪相关性状已被定位在多个染色体区域，Jennen和Ikeobi都检测到3号染色体上有影响脂肪重和脂肪率的一个QTL位点，Jennen进一步确证了3号染色体的0-2cM处MCW0116-MCW0148区间有一个影响脂肪重，脂肪率和体重的QTL位点。而该区域与人的2P区域和鼠的12A区域为同源区间，人和鼠Lipin1基因正好位于这个区间。基因定位和比较基因组研究表明，Lipin1基因应是鸡脂肪性状的重要候选基因。

发明内容

本发明的目的在于是克隆出鸡脂肪性状的功能候选基因lpin1基因，并提供一种鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，即单核苷酸多态性(SNPs)来检测鸡脂肪性状的方法。并根据基因型进行相关性状的标记辅助选择。

本发明目的是通过以下技术方案实现的：

本发明采用电子克隆和RT-PCR方法克隆出鸡脂肪侯选基因LPin1的编码序列，并用该序列进一步搜索鸡基因组得到该基因5’-UTR，设计引物检测5’-UTR的变异，分析检测到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切位点PCR-RFLP法检测鸡脂肪性状侯选基因功能突变。

本发明的鸡脂肪候选基因lpin1基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

鸡脂肪候选基因lpin1基因，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

鸡脂肪候选基因lpin1功能突变检测方法，采用上述鸡脂肪候选基因lpin1基因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’-非翻译区，针对存在的变异，设计引物检测5’-UTR的变异，分析检测到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切位点PCR-RFLP法检测鸡脂肪性状侯选基因功能突变。

通过引入酶切位点，采用创造酶切位点PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，

正向引物：5’-AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3’；

反向引物：5’-TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3’。

采用创造酶切位点PCR-RFLP检测5’-UTR的多态，检测到5’-UTR存在一个C/T变异，包含创造酶切位点PCR-RFLP引物的一段5’-UTR序列如SEQ ID No.3所示，其中第290个核苷酸是变异位点处，引物序列区域为第23-47个核苷酸，()内为引入的错配碱基。检测到5′-UTR区域的一个C/T变异，采用Patch 1.0(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin /patch.cgi)预测该T→C变异可引起一个GR转录因子结合位点的丢失，显示该变异有潜在重要的效应。

设计一对特异引物并PCR扩增含LPin1多态位点的DNA片段，根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中反向引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入一个错配碱基，使引物3′端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个STYI酶切位点，并应用相应内切酶进行酶切鉴定，通过PCR-RFLP技术判断LPIN1基因SNP位点多态性。结果表明使用限制性内切酶STYI酶切判断LPIN1位点多态性，PCR和酶切效果均较好。然后用STYI酶进行单核苷酸多态性检测出鸡脂肪候选基因lpin1的5’-UTR是C还是T等位基因，C等位基因可被STYI酶切产生一个268和25碱基的片段，T等位基因不能被STYI酶切。这样，TT纯合基因型只产生一个293的片段，CC纯合基因型将产生268和25碱基的片段；CT杂合基因型将产生293、268和25碱基三种片段。

分析显示鸡LPIN1基因不同基因型对一些屠体性状有显著效应。对腹脂重、腹脂率的效应达到显著水平中，TT基因型的腹脂重和腹脂率最大，TC基因型的腹脂重和腹脂率显著和极显著地低于TT基因型，而TT基因型与CC基因型的差异未达到显著水平。血清中的甘油三酯水平在三种基因型间的差异达到P＜0.1的显著水平，也以TT基因型最高。显示LPIN1基因对脂肪相关性状有重要的效应，有望用于鸡的标记辅助选择。

本发明巧妙地利用创造酶切位点PCR-RFLP法检测SNPs，发现了影响鸡脂肪性状的功能基因和特异性突变位点。目前肉鸡的高腹脂含量影响了鸡肉的品质，采用标记辅助选择选择低腹脂含量的肉鸡是一大发展趋势。

具体实施方式

一.实验材料与方法

1.实验材料

1.1菌株和克隆载体

本发明所用菌株见表

本发明所用的克隆载体为：

pGEM 3zf(+/-)vectors

pGEM 7zf(+/-)vectors

PGEM-T Vectors均来自Promega公司。

1.2.实验动物组织样与血样

以固始鸡、安卡红肉鸡杂交产生的F₂代为实验素材，其中肉鸡做父本为正交系，固始鸡做父本为反交系，正反交各4个家系共860只鸡。13周龄宰杀，记录各项屠体指标。13周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝，酚仿抽提之后，TE溶解-20℃保存。

1.3.酶与试剂

各种酶、RNA试剂盒、RACE试剂盒等试剂分别购自华美生物工程公司、Biolab公司和Promega公司；PCR引物由上海生物工程公司和西安美联公司合成。其它常规试剂来自中国农业大学物资供应科。

1.4.DNA分析软件

同源性分析软件：DANMAN

PCR引物设计软件：OLIGO4.0，

数据分析软件：SAS(6.12版本).

2.实验方法

2.1电子克隆方法

以鼠LPIN1基因(accession Num.：NM_172950)编码序列的3’端约500bp序列为目的序列，在鸡EST数据库中搜索(http://chick.umist.ac.uk/)，获得与其高度同源的EST(603370770F1)，以该EST为模版，进一步搜索，三个EST拼接获得032876.2，两个位于鸡软骨细胞EST数据库，一个位于成年鸡肝脏。进一步以该EST为模版，搜索鸡相关数据库，获得一个预测mRNA序列XM 419957，该序列的注释为相似于KIAA0188，该序列与人、鼠LPIN1的同源性较高，应为鸡lpin1的预测序列，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。通过与人、鼠等物种的比较，初步确定其开放阅读框为2709bp。采用丝羽乌骨鸡和肉鸡从编码序列检测到10个错义突变(包括1个3碱基和12碱基的插入/缺失)，10个同义突变。

2.2设计引物

1)RT-PCR验证鸡Lpin1基因编码序列和检测编码序列多态的引物

表1  RT-PCR验证鸡Lpin1基因编码序列和检测编码序列多态的引物

2)检测5’-UTR多态的引物

F：5’-AGTGATAGGA GGAGATGTTC-3’

R：5’-TACCATCGGA GTCAAATCAC-3’

扩增片段长度为596bp。

3)创造酶切位点PCR-RFLP法检测位于5’-UTR变异的引物

F：5’-AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3’

R：5′-TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3’

扩增片段长度为293bp。

2.3缓冲液与常用试剂的配制

TE缓冲液：10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。高压灭菌条件为1.034×10⁵Pa，20min。

STE缓冲液：0.1M NaCl，10mM Tris·Cl，1mMEDTA pH8.0，高压灭菌。

50X TAE缓冲液：Tris碱242g，冰乙酸57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml，加水至1L。

5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH8.0)20ml，加水至1L。

质粒DNA提取溶液I：50mM葡萄糖，2.5mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌10磅15min，贮存于4℃。

质粒DNA提取溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，现配现用。

质粒DNA提取溶液III：5M乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。

IPTG溶液：IPTG 1g溶解于50ml双蒸水中，过滤除菌，分装贮存于-20℃。1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5M EDTA：EDTA 186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

3M NaAc(pH7.0)：NaAc·3H₂O 408.1g溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌。

3MNaAc(pH5.2)：NaAc·3H₂O 408.1g溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至5.2，定容至1000ml，高压灭菌。

1M CaCl₂：CaCl₂·6H₂O 27g加水至100ml，过滤灭菌，贮存于-20℃。

10％SDS：SDS 100g溶于900ml双蒸水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH值至7.2，定容至1000ml。

RNaseA溶液：100mg/ml溶于10mM Tris·Cl(pH7.5)，15mM NaCl中100℃煮沸10min，室温冷却后，贮存于-20℃。

血液DNA提取液：10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20μg/ml胰RNA酶，0.5％SDS。

组织DNA提取液：

2.4胶回收方法

1)将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入灭菌的小离心管中，称取重量。

2)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μL溶胶液)，55℃水浴放置10分钟，每两分钟摇动一下离心管，以确保胶块充分溶解。4)胶块完全熔解后，将降至室温的胶溶液(吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱)移入一个吸附柱CA2(吸附柱放入收集管中)，3000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。如果是少而贵重的物品，可将收集管中的液体重新吸到吸附柱中离心，以提高回收效率。

3)向吸附柱中加入500μL漂洗液PW(按要求使用前加入无水乙醇)，8000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。重复步骤此步骤一次以提高回收效率。

4)将收集管中的废液倒掉，10000rpm离心1min尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响回收率和DNA的质量。

5)将吸附柱放到一灭菌的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65～70℃水浴预热的30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。10000rpm离心1min收集DNA溶液。

2.5克隆测序流程

A、连接反应

①将纯化回收产物用pGEM-T Easy(promega)载体4℃连接24h，连接体系如下：

B、转化过程

取5ul连接产物转化到DH5α感受态细胞(天根公司)，具体操作如下(冰上操作)：

①取一管(100ul)DH5α感受态细胞，冰水浴溶解后取50ul，加入1.5ml离心管中，

在加入5ul连接产物，用移液枪头轻轻吹打几下混匀，冰水浴30分钟；

②将混合液42℃热激90秒(此过程需要严格操作，不要摇动离心管)，迅速冰水浴15分钟；

③再向离心管中加入950ulLB液体基(不含氨苄青霉素)，混匀后转入10ml的灭菌玻璃小试管中，于37℃摇床上培养45分钟(150转/分钟)，复苏菌液；

④将培养液再转入1.5ml离心管中，8000转/分钟离心30秒；

⑤弃上清，余留200ul，并用移液枪头吹打混匀菌液；

⑥取100ul菌液，用三角玻璃棒涂布于已经制好的固体培养基上(含有100mg/ml的氨苄青霉素钠、20mg/ml X-GAL和24mg/ml I100mg/ml PTG)，37℃培养箱中培养12到16小时。

⑦通过蓝白斑筛选，灭菌牙签挑选白色的阳性克隆，在新的固体培养基上划线，进行二次扩大培养，于37℃培养箱中培养8小时即可。同时挑选一个蓝斑进行培养作对照。用灭菌牙签挑取二次培养过的白色单菌落，分别接种于装有5mlLB液体培养基的灭菌玻璃试管中，含有60ug/ml的氨苄青霉素，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16小时)。

C、质粒DNA的提取

使用质粒小提试剂盒(天根)提取菌液的质粒DNA，具体步骤如下：

①将菌液离心，聚集沉淀，13000转/分钟离心30秒

②向沉淀中加入250ulP1溶液，用移液枪头轻轻吹打，使沉淀重悬于液体之中；

③再液体中加入250ulP2溶液，上下温和旋转离心管6到10次，裂解菌液；

④再液体中加入350ulP3溶液，立即混匀，上下翻转离心管6到10次；

⑤12000转/分钟离心1分钟，为了沉淀完全，可以进行二次离心。

⑥向CB3柱子中加入500ul的平衡液BL，12000转/分钟离心1分钟，待用。

⑦将(5)中上层清液转入处理好的CB3柱子中，静置2分钟，12000转/分钟离心50秒；

⑧向CB3柱子中加入700ul的PW，12000转/分钟离心50秒；

⑨向CB3柱子中加入500ul的PW，12000转/分钟离心50秒；

⑩向CB3柱子的底膜中央加60ulEB洗脱液，静置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，-20℃保存。

D、质粒DNA的酶切鉴定

取10ul质粒DNA进行双酶切鉴定，方法如下：

①酶切体系如下：

②混合均匀，旋混几秒钟；

③37℃水浴2个小时。

④取5ul产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

2.6用TRIZOL试剂盒提取总RNA

1)匀浆

在1ml的TRIZOL试剂中加50-100mg组织，样本体积不应超过TRIZOL的10％。用匀浆机高速匀浆2分钟。

2)(可选)

要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、脂肪组织，在匀浆后2-8℃12000g离心10分钟。将上清匀转移至一新的Eppendof管。

3)分相

15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置2-3分钟。小于12000g 2-8℃离心15分钟。

4)RNA的沉淀

转移水相于一新管。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟。4-8℃ 12000g离心10分钟(离心前RNA通常不可见，在管壁或管底形成胶样沉淀)。

5)RNA沉淀的洗涤

弃上清，每1ml TRIZOL至少加1ml 75％的乙醇洗涤RNA一次。2-8℃小于7500g离心5分钟。

6)RNA的重溶

倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥5-10分钟。加适当的DEPC处理水，吸打几次，放于55-60℃溶解10分钟。-70℃保存。

7)RNA变性电泳

在一灭菌微量离心管中混合下列液体，以制备RNA样品。

混匀后，65℃温育15min，取出置冰上。

加入RNA上样缓冲液，用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳buffer为1×TAE。

2.7细胞总RNA中DNA的去除

1)混合下列试剂以消化细胞总RNA中的DNA

37℃温育30分钟。

2)加入等体积酚/氯仿，剧烈混合后置冰上10分钟。12000g 4℃离心5分钟。

3)移上清于一新管，加5μl 3mol/L乙酸钠、200μl 100％乙醇，混匀，-70℃放置30分钟沉淀RNA。

4)4℃离心10分钟，弃上清。用500μl 70％的乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀。

5)用20μl的DEPC水溶解RNA，取1μl RNA样品于1ml水中，用分光光度计测定A260的吸光值，准确定量RNA的浓度。

6)3μg干净的RNA在6％的变性琼脂糖凝胶上进行电泳，检测RNA的完整性。其余RNA贮存于-80℃。

2.8反转录

1)取1μg不含DNA的RNA，用DEPC水稀释至0.1μg/μl，并置于冰浴。按下列方法建立RNA的反转录反应体系：

2)65℃温浴5分钟使mRNA二级结构变性；37℃温浴10分钟使引物退火。每管加1μl 100U/μl MMLV反转录酶。迅速混匀，37℃继续温育50分钟。75℃温育5分钟灭活反转录酶，离心收集液滴。将反应管置于冰上，立即用于PCR扩增，或贮存于-20℃用于以后的实验。

2.9.限制性酶切条件

1)25μl PCR反应体系：2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl₂，0.01％明胶)，2μl dNTPs(2.5mmol/L for each)，引物终浓度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。终体积25μl。

2)PCR反应条件：94℃5min，然后94℃ 30S，58℃30S，72℃40S，35个循环，最后72℃7min，4℃长时间保存。

3)酶切条件：37℃恒温水浴14小时左右，酶切产物采用2.5％琼脂糖电泳检测。酶切体系如下：

3.采用创造酶切位点PCR-RFLP检测5’-UTR的多态

采用创造酶切位点PCR-RFLP检测5’-UTR的多态，检测到5’-UTR存在一个C/T变异，包含创造酶切位点PCR-RFLP引物的一段5’-UTR序列如SEQ ID No.3所示，其中第290个核苷酸是变异位点处，引物序列区域为第23-47个核苷酸，()内为引入的错配碱基。检测到5′-UTR区域的一个C/T变异，采用Patch 1.0(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin /patch.cgi)预测该T→C变异可引起一个GR转录因子结合位点的丢失，显示该变异有潜在重要的效应。

设计一对特异引物并PCR扩增含LPin1多态位点的DNA片段，根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中反向引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入一个错配碱基，使引物3′端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个STYI酶切位点，并应用相应内切酶进行酶切鉴定，通过PCR-RFLP技术判断LPIN1基因SNP位点多态性。结果表明使用限制性内切酶STYI酶切判断LPIN1位点多态性，PCR和酶切效果均较好。然后用STYI酶进行单核苷酸多态性检测出鸡脂肪候选基因lpin1的5’-UTR是C还是T等位基因，C等位基因可被STYI酶切产生一个268和25碱基的片段，T等位基因不能被STYI酶切。这样，TT纯合基因型只产生一个293的片段，CC纯合基因型将产生268和25碱基的片段；CT杂合基因型将产生293、268和25碱基三种片段。

4.基因型和屠体性状的相关性分析

方差分析表明(表2，表3)，鸡lpin1基因不同基因型对一些屠体性状有显著效应。对腹脂重、腹脂率的效应达到显著水平中，TT基因型的腹脂重和腹脂率最大，TC基因型的腹脂重和腹脂率显著地低于TT基因型，而TT基因型与CC基因型的差异未达到显著水平。血清中的甘油三酯水平在三种基因型间的差异达到P＜0.1的显著水平，也以TT基因型最高。显示LPIN1基因对脂肪相关性状有重要的效应，有望用于鸡的标记辅助选择。

表2模型的显著性检验

表3不同基因型的生产性状最小二乘均数(LSM)比较结果

<110>河南农业大学

<120>

<160>3

<210>1

<211>2709

<212>RNA

<213>鸡(Gallus Gallus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)---(2709)

<223>同义突变(samesense mutatioms)

C735T；A924T；T933A；C948T；G969A；C1212T；T1362C；T1689C；A2220T；T2442C；

C2496T

错义突变(missense mutatioms)

C677T；C898T；A1112G；tgcttgctcagc1128-；A1237C；C1310T；C1439T；GCA1012-；A1532C；

T1567C

<400>1

atgaactacg ttggacagtt agcagggcaa gtgtttgtaa ctgtgaagga gctctataag  60

ggactaaacc cagccacgct gtcgggatgt atcgatataa ttgttgtacg tcagccagat  120

gggaatcttc agtgttctcc attccatgta cgctttggga aaatgggagt tctgcgttcc  180

agggagaaag tggttgacat agaaattaat ggagaggctg tagatttgca catgaagcta  240

ggagacaatg gagaagcctt tttcgtccag gagatggata acaatcagga ggtaattcct  300

tatcatctgt ctacgtcccc catcctgtct gagggaactg cgttaatgga agctcagctg  360

aagagaaact caattgacag gataagaaac ctggacagca gtgtatcttc acaagtacca  420

ccccaagctc atggatccca gcctggtact gaaacatctc cagcctgtag ctctgtgaaa  480

aagaggagga aaaagaggag gaagtctacc cacaaaatag acagcttaaa aagagaagac  540

attggagata catcagaaga tgaagacatg tttcctatag agattagctc agaggaagaa  600

aaggaacaat tggacaattc aaggattctt gttccagatg tgtttgttga tgaagtatct  660

gatataaagg ctcctgctgt ttctgcttat tctcagtctt catcttaccc tcgttcggat  720

ggagaatggt cacccattca aagcctgtca ggctcacgtc ctcctactcc tcaaagtgat  780

tcagaattag tcagtaaacc tacagacagg agtggactaa agaatccaca catgcactgg  840

gcatggggag agctaccaca ggctacaaag gcaagttcct tgatcaaagc taaggaaccc  900

aacacagtag atgtaaatcc ttcagaaagc actcactttc gggtcatcca gagtgctcct  960

atagaggagt ttaatggcgt gtctcctcta cctgcccttg gacagacaga tgcagcaact  1020

gctgatgaaa ctgagccctt gccagctgag acaaataagc cagagacaga atctgcagga  1080

gcagctgtac catcattgcc tgccaatgag gaaataaaac aagctgctgc ttgctcagcc  1140

caggcagttg gcaagacaga ttccccttcc agaaagaaag acaaacgaag ccggcatctt  1200

ggtgctgatg gcgtctattt agatgacctt actgacatgg atccagaagt tgctgcactt  1260

tatttcccca aaaatgggga taatgtacaa aacagaaaca caaatgacac agggccacgg  1320

tctgccactc attctccaca gtcttttggg agctcaggcg ctgacagtgg tgttgaaagc  1380

acctcagatg gaaccagaga tttgccttcg attgccatct ctctctgtgg aggcctcacg  1440

gacaacaaag agataaccaa agaagaattc ttagaacatg cagtaacgta tcaacagttt  1500

gtggacaatc ctgctatcat tgatgaccct aaccttgtgg ttaagattgg aaataagtac  1560

tacaactgga caacagctgg tccccttctg ctggcaatgc aggcattcca gaaacctttg  1620

ccaaaggcca ctgtggaatc tataatgaga gacaagatgc ccaaaaaagg tggaagatgg  1680

tggttctctt ggagagggag aaacagcact attaaagagg aaacaaaggc agaacaaggt  1740

atgagtggga gtagacttaa aggagaagac tcttcacaga tgaccatggc aaacagaata  1800

aaagatgaat cttcttcgag cgatgaagac cctagagctg ccaaacaaaa ccttgggtca  1860

ttacaagcca actcgagtca tctctcatta ttgtctggag tcagttacaa aaaaacactt  1920

cgactaactt ctgaccagct taaaagctta aagctgaaga atggtcccaa tgatgtgact  1980

ttcagtgtta caacgcaata tcaaggtact tgccgctgtg aaggcaccat ttacctatgg  2040

aattgggatg ataaggttat tatttctgat atcgatggaa caattacacg gtcagatact  2100

ttaggtcata ttttgcctac tctcggcaaa gactggacac accaagggat tgcaaagttg  2160

taccataaag tgagccaaaa tggatataag tttttgtatt gctcagcacg tgctattgga  2220

atggcagaca tgaccagagg atacttgcac tgggtcaatg aacgtggaac tgtgctgcca  2280

caggggccag tgttgctgag tccaagcagc ttattttcag ctttgcacag ggaagtgata  2340

gagaaaaagc cagaaaaatt caaagttcag tgtttgacag acataaaaaa tttgttttat  2400

cctaacacag aaccctttta tgctgctttt ggaaacagac ctgctgatgt ttattcatac  2460

aaacaagtgg gtgtttcttt aaaccgaata tttaccgtca accccaaagg agaacttata  2520

caagaacatg caaagacaaa tatctcatcc tatgtcagac tgtgtgaagt ggtagaccat  2580

attttccctt tgctgaaaag aagccattct tcagatttcc cttgttctga tacctacagt  2640

cagtttacct actggagaga acctctgcca ccttttgaaa ctcaggatgt acatccagat  2700

tcatcttaa                                                          2709

<210>2

<211>903

<212>PRT

<213>鸡种(Gallus Gallus)

<220>

<221>

<222>(1)---(902)

<223>mutations

Ala226Val；Pro300Ser；Ala339-；Glu371Gly；AlaCysSerAla377-；Met413Leu；Thr437Ile；Tyr480Met；Asn

511Tyr；Trp523Arg

<400>2

Met Asn Tyr Val Gly Gln Leu Ala Gly Gln Val Phe Val Thr Val Lys

1                5                  10                  15

Glu Leu Tyr Lys Gly Leu Asn Pro Ala Thr Leu Ser Gly Cys Ile Asp

            20                  25                  30

Ile Ile Val Val Arg Gln Pro Asp Gly Asn Leu Gln Cys Ser Pro Phe

        35                  40                  45

His Val Arg Phe Gly Lys Met Gly Val Leu Arg Ser Arg Glu Lys Val

    50                  55                  60

Val Asp Ile Glu Ile Asn Gly Glu Ala Val Asp Leu His Met Lys Leu

65                  70                  75                  80

Gly Asp Asn Gly Glu Ala Phe Phe Val Gln Glu Met Asp Asn Asn Gln

                85                  90                  95

Glu Val Ile Pro Tyr His Leu Ser Thr Ser Pro Ile Leu Ser Glu Gly

            100                 105                 110

Thr Ala Leu Met Glu Ala Gln Leu Lys Arg Asn Ser Ile Asp Arg Ile

        115                 120                 125

Arg Asn Leu Asp Ser Ser Val Ser Ser Gln Val Pro Pro Gln Ala His

    130                 135                 140

Gly Ser Gln Pro Gly Thr Glu Thr Ser Pro Ala Cys Ser Ser Val Lys

145                 150                 155                 160

Lys Arg Arg Lys Lys Arg Arg Lys Ser Thr His Lys Ile Asp Ser Leu

                165                 170                 175

Lys Arg Glu Asp Ile Gly Asp Thr Ser Glu Asp Glu Asp Met Phe Pro

            180                 185                 190

Ile Glu Ile Ser Ser Glu Glu Glu Lys Glu Gln Leu Asp Asn Ser Arg

        195                 200                 205

Ile Leu Val Pro Asp Val Phe Val Asp Glu Val Ser Asp Ile Lys Ala

    210                 215                 220

Pro Ala Val Ser Ala Tyr Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Arg Ser Asp

225                 230                 235                 240

Gly Glu Trp Ser Pro Ile Gln Ser Leu Ser Gly Ser Arg Pro Pro Thr

                245                 250                 255

Pro Gln Ser Asp Ser Glu Leu Val Ser Lys Pro Thr Asp Arg Ser Gly

            260                 265                 270

Leu Lys Asn Pro His Met His Trp Ala Trp Gly Glu Leu Pro Gln Ala

        275                 280                 285

Thr Lys Ala Ser Ser Leu Ile Lys Ala Lys Glu Pro Asn Thr Val Asp

    290                 295                 300

Val Asn Pro Ser Glu Ser Thr His Phe Arg Val Ile Gln Ser Ala Pro

305                 310                 315                 320

Ile Glu Glu Phe Asn Gly Val Ser Pro Leu Pro Ala Leu Gly Gln Thr

                325                 330                 335

Asp Ala Ala Thr Ala Asp Glu Thr Glu Pro Leu Pro Ala Glu Thr Asn

            340                 345                 350

Lys Pro Glu Thr Glu Ser Ala Gly Ala Ala Val Pro Ser Leu Pro Ala

        355                 360                 365

Asn Glu Glu Ile Lys Gln Ala Ala Ala Cys Ser Ala Gln Ala Val Gly

    370                 375                 380

Lys Thr Asp Ser Pro Ser Arg Lys Lys Asp Lys Arg Ser Arg His Leu

385                 390                 395                 400

Gly Ala Asp Gly Val Tyr Leu Asp Asp Leu Thr Asp Met Asp Pro Glu

                405                 410                 415

Val Ala Ala Leu Tyr Phe Pro Lys Asn Gly Asp Asn Val Gln Asn Arg

            420                 425                 430

Asn Thr Asn Asp Thr Gly Pro Arg Ser Ala Thr His Ser Pro Gln Ser

        435                 440                 445

Phe Gly Ser Ser Gly Ala Asp Ser Gly Val Glu Ser Thr Ser Asp Gly

    450                 455                 460

Thr Arg Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ile Ser Leu Cys Gly Gly Leu Thr

465                 470                 475                 480

Asp Asn Lys Glu Ile Thr Lys Glu Glu Phe Leu Glu His Ala Val Thr

                485                 490                 495

Tyr Gln Gln Phe Val Asp Asn Pro Ala Ile Ile Asp Asp Pro Asn Leu

            500                 505                 510

Val Val Lys Ile Gly Asn Lys Tyr Tyr Asn Trp Thr Thr Ala Gly Pro

        515                 520                 525

Leu Leu Leu Ala Met Gln Ala Phe Gln Lys Pro Leu Pro Lys Ala Thr

    530                 535                 540

Val Glu Ser Ile Met Arg Asp Lys Met Pro Lys Lys Gly Gly Arg Trp

545                 550                 555                 560

Trp Phe Ser Trp Arg Gly Arg Asn Ser Thr Ile Lys Glu Glu Thr Lys

                565                 570                 575

Ala Glu Gln Gly Met Ser Gly Ser Arg Leu Lys Gly Glu Asp Ser Ser

            580                 585                 590

Gln Met Thr Met Ala Asn Arg Ile Lys Asp Glu Ser Ser Ser Ser Asp

        595                 600                 605

Glu Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gln Asn Leu Gly Ser Leu Gln Ala Asn

    610                 615                 620

Ser Ser His Leu Ser Leu Leu Ser Gly Val Ser Tyr Lys Lys Thr Leu

625                 630                 635                 640

Arg Leu Thr Ser Asp Gln Leu Lys Ser Leu Lys Leu Lys Asn Gly Pro

                645                 650                 655

Asn Asp Val Thr Phe Ser Val Thr Thr Gln Tyr Gln Gly Thr Cys Arg

            660                 665                 670

Cys Glu Gly Thr Ile Tyr Leu Trp Asn Trp Asp Asp Lys Val Ile Ile

        675                 680                 685

Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ile Thr Arg Ser Asp Thr Leu Gly His Ile

    690                 695                 700

Leu Pro Thr Leu Gly Lys Asp Trp Thr His Gln Gly Ile Ala Lys Leu

705                 710                 715                 720

Tyr His Lys Val Ser Gln Asn Gly Tyr Lys Phe Leu Tyr Cys Ser Ala

                725                 730                 735

Arg Ala Ile Gly Met Ala Asp Met Thr Arg Gly Tyr Leu His Trp Val

            740                 745                 750

Asn Glu Arg Gly Thr Val Leu Pro Gln Gly Pro Val Leu Leu Ser Pro

        755                 760                 765

Ser Ser Leu Phe Ser Ala Leu His Arg Glu Val Ile Glu Lys Lys Pro

    770                 775                 780

Glu Lys Phe Lys Val Gln Cys Leu Thr Asp Ile Lys Asn Leu Phe Tyr

785                 790                 795                 800

Pro Asn Thr Glu Pro Phe Tyr Ala Ala Phe Gly Asn Arg Pro Ala Asp

                805                 810                 815

Val Tyr Ser Tyr Lys Gln Val Gly Val Ser Leu Asn Arg Ile Phe Thr

            820                 825                 830

Val Asn Pro Lys Gly Glu Leu Ile Gln Glu His Ala Lys Thr Asn Ile

        835                 840                 845

Ser Ser Tyr Val Arg Leu Cys Glu Val Val Asp His Ile Phe Pro Leu

    850                 855                 860

Leu Lys Arg Ser His Ser Ser Asp Phe Pro Cys Ser Asp Thr Tyr Ser

865                 870                 875                 880

Gln Phe Thr Tyr Trp Arg Glu Pro Leu Pro Pro Phe Glu Thr Gln Asp

                885                 890                 895

Val His Pro Asp Ser Ser

            900

<210>3

<211>349

<212>DNA

<213>鸡(Gallus Gallus)

<220>

<221>5’-UTR

<222>(1)---(349)

<400>2

1   agaaagcact ccaaagttca gaagctctga tgtgccaaac cataatacgt accttttgca  60

61  cacgtgcctt acaataatct tttaacagca gaaagctaag tgggagaata gtctttgtct  120

121 gtaatgcagt gaaaaaggag atctgcttag aaccatccct tgccctgccc ttaaaagtct  180

181 gtagaaatac acgagaaaaa tatattccat tttgagagca cagtaagtga taggaggaga  240

241 tgttctgttc tgcagtaatg ctttctcttc agtgataaag tagaaactcc tat(→g)gagctg  300

301 caatctgaaa gtctgactgt agttttgaat gcaactgatg ttagaaactt             349

注：第290个核苷酸是变异位点处，引物序列区域为第23-47个核苷酸，()内为引入的错配碱基。

Claims (4)

1.一种鸡脂肪候选基因lpin1基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的鸡脂肪候选基因lpin1基因，其特征在于：该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述的鸡脂肪候选基因lpin1基因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’-非翻译区，针对存在的变异，设计引物检测5’-UTR的变异，分析检测到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切位点PCR-RFLP法检测鸡脂肪性状侯选基因功能突变。

4.根据权利要求3所述的鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，其特征在于：通过引入酶切位点，采用创造酶切位点PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用STYI酶进行单核苷酸多态性检测出鸡脂肪候选基因lpin1的5’-UTR是C还是T是T等位基因，

正向引物：5’-AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3’；

反向引物：5’-TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3’。